Summary
詳細な手順と機械的性質および原子間力顕微鏡を用いた単一タンパク質分子のアンフォールディング経路を機械的に測定するための戦略について述べる。また選択と良い単一蛋白質分子の録音の正当化のための参照として代表的な結果を述べる.
Abstract
ネイティブ 3 D 構造にそのアミノ酸配列からのタンパク質の折り畳み過程の定量生物学の重要な問題では。原子間力顕微鏡 (AFM) ストレッチと特定のアンフォールディングとリフォールディング特性の直接証拠を与える単一タンパク質分子の弛緩を有効にしてこの問題に対処することができます。原子間力顕微鏡による単一分子力分光 (原子間力顕微鏡 SMF) は、高エネルギーは従来のばら積み (生化学) 測定不可能なタンパク質立体を一貫して測定するための手段を提供します。AFM SMF の原則を示すため、公開された多数の論文じゃない簡単に網羅的なプロトコルの不足のための SMF 実験を実施できます。本研究では、AFM の原理を簡単に説明して SMF の実験からのよい結果を達成するためにガイドラインとしてプロトコル、手順、およびデータ分析の詳細を広く。単一蛋白質機械的展開測定の代表的な SMF 結果を示すし、一般的、いくつかの戦略をトラブルシューティング問題が発生いたします。
Introduction
原子間力顕微鏡による単一分子力分光 (SMF) の進歩は、機械操作と単一タンパク質分子の正確な評価に有効にしています。この特性は、タンパク質力学1,2,3タンパク質-リガンド相互作用4、蛋白質蛋白質の相互作用5、フォールディングについて知見を生産している、タンパク質ベース設計材料6,7,8。SMF は特にタンパク質を調べる場合に役立ちます AFM によるストレッチとして展開、継続的に増加輪郭線長を生じ、その剛性によると徐々 に拡張するタンパク質分子内における化学的および物理的債をできます。このタンパク質分子の overstretching 破裂イベントの結果力拡張曲線の急激な遷移を生成 (したり強制的にピーク)。力ピーク値は、力学の展開プロセス中にタンパク質の展開力と構造変化に関する直接的な情報を提供します。AFM を用いた最初の研究の一つは、タイチン1を測定し、タンパク質のアンフォールディングとリフォールディング集中化学薬品、極端な温度のような不自然な変性剤を使用せず生理条件下での新しい側面を発見します。
ここで原子間力顕微鏡だけを考えても SMF 実験をさまざまな楽器に行った.AFM は、4 つの主要な要素で構成されます: プローブ、検出器、試料ホルダー、圧電スキャナー。プローブは、片持ちの揺れる端に鋭い先端です。キャリブレーション後フックの法則を使用して力を正確に判断するカンチレバーの背面から反射されるレーザー光を用いた測定接続されている分子のストレッチ中に、片持ち梁の曲げ。ダイオード センターからのレーザービームの変位に比例した電圧を作り出す象限フォト ダイオード検出器に反射レーザー ビーム プロジェクト。流体の蛋白質のサンプルの基板は、サブナノ精度で制御することができます 3 D 圧電ステージ上にマウントされます。フォト ダイオード検出器からの電圧を読み取り、コンピューター制御の電圧供給を通じて 3 D ステージを制御コンピューター。これらの圧電アクチュエータの段階通常容量が装備されているまたは歪みゲージ センサー位置正確に測定圧電変位してフィードバック制御システムを通じて正しい履歴。圧電コント ローラーからセンサー信号出力は、工場出荷時校正は、ピエゾの電圧定数を使用して距離に変換されます。引っ張る実験例力拡張曲線は図 2に示します。
AFM SMF 実験の 2 つのタイプがある: 一定速度、一定力測定を引っ張るします。Oberhauserらのコンスタントフォース SMF 測定値の説明します。9、ここで我々 は一定速度の測定に焦点を当てる一方。典型的な原子間力顕微鏡等速引張実験は、カンチレバー先端に対して基板をゆっくり移動するピエゾに電圧を提供することによって行われます。典型的な実験は最初表面に対して押すとヒントです。引きの測定は、接触の引き出すため先端から基板を移動によって開始されます。場合蛋白質の最初の接触は先端、それが取得され、変位に対する力の展開のトレースで測定されます。先端と接触し、基板を戻され、タンパク質の折り畳みを決定力変位からことができます、リラックスしたトレースを測定します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 蛋白質の準備
- DNA のクローニング。
- 興味、例えば NI10C10、DNA シーケンスの DNA シーケンスの合成または経由でPCR 標準分子生物学技術11を使用してホストの有機体から分離します。合成中にまたは (Addgene #74888)12プラスミド pEMI91 のモジュールに対応する PCR プライマーの 5' 末端にサイトを配置することによって、制限のサイトと興味の遺伝子を逃げ。
- 別にプラスミド pEMI9112と制限のサイトのペアを持つ興味の DNA シーケンスの両方は、タンデム I91 を繰り返します (図 1参照) で両側の興味のシーケンスになりますのでダイジェストします。制限のサイトの標準的なプロトコルに従います。
- ゲル電気泳動を使用して消化、製品を浄化し、T4 DNA リガーゼ、次の標準的なプロトコルを使用している製品を縛る。結紮、プラスミッドの浄化のためのエシェリヒア属大腸菌のセルにプラスミッドを変換し、標準的なプロトコルを使用してプラスミッドの浄化します。T7 プライマーまたは内部 pEMI91 プライマーを使用して、シーケンスが正常に変換を確認するシーケンス。
- 変換です。
- C41 などのタンパク質発現細胞を削除 (DE3) pLysS 細胞、-80 ° C のフリーザー アイスで完全に雪解けから。
- セルに DNA のプラスミッドの 1 μ L を追加し、簡単にかき混ぜるそれは気泡を導入し、細胞を温めると、上下にピペッティングは勧められません。
- セルと 30 分間氷の上プラスミドを含む培養管を孵化させなさい。
- 熱衝撃 45 42 ° C の水浴中で細胞 s。
- 2 分間氷にチューブを返します。
- セル内流体培養基 LB の 950 μ L を置き、37 ° C で 1 時間 250 rpm で振る
- 100 μ g/mL アンピシリン含有 LB プレートに変換の約 200 μ L を配置します。PEMI91 以外のプラスミドを使用している場合は、そのプラスミッドのため適切な抗生物質を使用します。37 ° C でインキュベーターで一晩プレートを配置します。次の日、インキュベーターから削除板パラフィルム、ラップし、ストア冷凍 1 ヶ月。
- 蛋白質の表現。
- プレートに単一の細菌のコロニーを滅菌ピペット チップを触れると、LB の上下にピペッティングで一晩成長 37 ° C で 50 mL のチューブに 100 μ g/mL アンピシリンと LB ブイヨン培地 15 mL を接種します。
- 100 μ g/mL アンピシリンと LB ブイヨン培地 1 L に 15 mL 文化を転送し、37 ° C で 4-12 h に振る (まで外径600 > 0.8)。
- プラスミッドの準備の文化の 10 mL を収集します。
- 0.2-1 mM イソプロピル-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) を追加し、一晩式室温に温度を下げます。
- 次の日 4 本のチューブに分割し、40 分間 4,000 × gで遠心分離によって細胞を収穫し、数時間-80 ° C でペレットを凍結します。
- タンパク質12の挿入されたカセットに対応するプライマー配列の細胞から抽出したプラスミドを送信し、挿入 DNA の忠実度を確認します。
- 蛋白質の浄化。
- 室温で 30 分間凍結細胞の 1 つの管を解凍します。
- 解凍細胞換散バッファー (38 mL の水、グリセリン、50 mM トリス塩酸 pH 7.6, 150 mM の NaCl、1 mM の CaCl2、10 μ g/mL DNase、1 mM PMSF、1 mM TCEP、500 μ G/ml リゾチーム 2 mL) を中断し、1 時間氷の上を振る。
- いくつかの時間-80 ° C で分離細胞を凍結し、再室温で解凍。
- 4 ° C で 30 分間 13,100 × gでダウン ライセート スピンします。
- 特定のタグ (例えば、連鎖球菌タグまたはタグ) の重力流列を上清を実行します。
- 連鎖球菌性タグまたはタグと使用前に 4 ° C でストアの適切なバッファーを用いた遠心フィルターを使用してバッファー交換を実行します。
2. サンプル準備のためをスライドします。
- ピラニア溶液を用いたガラス スライドを準備します。
- 場所 10-30 個の 40 mL ガラス製ビーカーにガラス カバー スリップ (半径 7.5 mm) のラウンドします。
注:フードでは、この手順と次の手順を実行します。このステップの間に危険な化学物質に対処するための標準的な手順に従います。 - (18.4 M) の濃硫酸 30 mL を追加します。
- 30% 過酸化水素の 10 mL を追加します。
- 95 ° C に 10-30 分のための混合物を熱します。
- (再使用または破棄) を別の廃棄物容器にデカント ピラニア ソリューションが慎重に。
- ピラニア ソリューションを削除する脱イオン水でスライドをすすいでください。
- 40 mL のアセトンにスライドを中断します。
- 廃棄物容器にアセトンを捨て、再 40 mL のエタノールにスライドを停止します。
- 慎重に、時に 1 つのスライドを抽出し、アルゴンまたは浄化された空気と乾燥きれいな鉗子を使用します。
- 場所きれいな、乾燥したスライド金蒸着まで真空下でまたは長期保管のためのアルゴン中。
- 場所 10-30 個の 40 mL ガラス製ビーカーにガラス カバー スリップ (半径 7.5 mm) のラウンドします。
- (省略可能) ゴールド コーティング スライドを準備します。
注:この手順には、主要な大学で多くのクリーン ルーム設備で利用できる真空 (電子ビーム) 蒸発器の使用が必要です。- 5 つの顕微鏡スライド (25 mm × 75 mm の長方形) を glasscutter を使用して半分にカットします。
- それぞれの 10 の中央に両面粘着テープを適用半分顕微鏡スライド。
- 付箋の粘着面をカットし、両面テープに適用されるように、メモの粘着面です。付箋は、一般的に以下の接着剤はまだしっかりと将来の破損を防ぐためにスライドに添付します。その後、それらの半分の顕微鏡スライド ガラス スライド ホルダーとして処理できます。
- ホルダーの粘着面の各コーナーに (セクション 2.1.10) から 4 つのきれいなガラス スライドを慎重に押します。
- 電子ビーム蒸発器にガラス スライドを移動します。70 を適用する蒸発器の仕様に従うクロムと 300 nm の表面に金の nm。
- アルゴン中ゴールド コーティング スライドを保存します。
3. サンプル準備
-
スライドを準備します。
- きれいな鉄のディスク (直径 15 mm) を選択し、粘着タブを添付します。
- 粘着タブのカバー作品の品をはずします。
- (セクション 2.1.10) からきれいなガラスまたは (セクション 2.2.7) から金の一部を選択、しっかりと鉄のディスクの粘着面に配置このサンプル スライドになります。
- スライド上にタンパク質を沈殿物します。
- ポリプロテインを dialyze 実験 (25 mM トリス-HCl、150 mM の NaCl と pH 7.6) のバッファーにバッファー交換カラム 0.5 mL 遠心フィルターなどを用いるします。13,000 rpm で 10 分間の列でタンパク質をスピン列を逆にし、2 分間 1,000 rpm で回転して新しいバッファーにタンパク質を溶出します。
- 280 で吸光度を測定することによりおおよそのタンパク質濃度を決定する nm、分光光度計を使用しています。
- 10-100 μ g/ml 100 μ L の最終巻にタンパク質を希釈します。
- スライドの中央にタンパク質溶液の 60 μ L を適用します。これは実験と制御されていないサンプルの動きの間に接着剤の膨張を引き起こす可能性がある任意の液体ガラスと鉄スライド間のギャップに下入力をさせないこの段階でつけてください。
注:ゴールドのスライド、疎水性の球状液滴を形成、スライド ガラスは親水性、タンパク質溶液が広がる可能性があります。 - 10-60 分間室温で放置サンプルを聞かせてください。この間、原子間力顕微鏡のセットアップを開始する次の手順に進みます。
4. 原子間力顕微鏡 (AFM) セットアップ
注:以下は、原子間力顕微鏡をセットアップするための一般的な説明およびある特定の細部が使用特定の機器によって異なる場合があります。器械使用は部分的に家造られた、ショル13で詳細に記述されています。
- 原子間力顕微鏡セルにカンチレバーをマウントします。
- アプリケーションの適切なプロパティを持つ片持梁を選択します。使用は 4-10 pN/nm 低展開力のバネ定数とカンチレバー (10 〜 50 pN)、バネ定数と使用のカンチレバー 15 100 pN/nm 高い展開力の。
- 慎重に端から片持ち梁をピックアップし、セルを保持するプローブに配置。
- 場所でしっかりと保持細胞は、カンチレバーを保持続行する前に確認してください。
- レーザーの配置のための AFM ヘッドに保持セルを配置します。
- AFM ヘッドにレーザーを合わせます。
- 倒立顕微鏡上に頭を置き、頭にレーザーを駆動するための AFM ヘッドにバッテリー パックを接続します。
- 顕微鏡検出器にカメラを接続して、テレビまたはモニターの上にレーザー光を視覚化できます。
- カンチレバーの先端にあるので、レーザーを位置します。
- サンプル ヘッドをマウントします。
- 各セルを保持するプローブのポートに 10 μ L のバッファーをフラッシュします。
- 培養されているサンプルのスライドと培養液からの流体の 40 μ L をデカントします。スライド上のバッファーの 40 μ L を追加します。上記の圧電磁石にサンプル スライドを配置します。
- 原子間力顕微鏡ステージが高い位置にあることを確認します。AFM カンチレバーがサンプル液滴になるので、ステージ上に AFM ヘッドを配置します。
- センター フォト ダイオード上に反映されたレーザー ビーム。
- 紙の小片をカットし、AFM フォト ダイオードの前に置きます。
- ノブを使用して用紙にレーザー スポットになる集中的かつ明るい原子間力顕微鏡レーザーの位置を変更します。
- レーザーがゼロ (A + B ・ C ・ D) を 2 つの領域をヒットすべての象限 (A + B + C + D) で全信号を最大にするフォト ダイオードと上の 2 つの間の差信号を発生上下ように AFM ヘッド ミラーを調整します。
5. 原子間力顕微鏡校正
- パワー スペクトルを測定します。
- AFM に接続されているフィルター、帯域幅をフルに AFM ヘッド信号のフィルター設定を有効にします。
- 自体 AFM に関する信号にノイズが追加されますこの圧電が消灯していることを確認します。
- AFM ソフトウェア14を使用して、パワー スペクトルの計算ごとの 1,024 データ ポイントからの 512 の計算の平均値を測定します。
- カンチレバーの振動の主要なモードに対応する最初のピークの間でパワー スペクトル密度を統合するのに AFM ソフトウェア15を使用します。
- フォト ダイオードの感度を計算します。
- 自体 AFM、圧電コント ローラーをオンし、500 Hz (低域通過フィルター) にフィルター設定を変更します。
- AFM ソフトウェアでゼロの周り変動すべき差信号を監視します。迅速 micropositioners を使用して数百マイクロメートル下 AFM ヘッドを移動します。頭を下へ移動を繰り返し、一貫性のあるジャンプの差信号を監視します。表面は非常に近くのとき信号がジャンプを開始高さで増加しています。
- すぐに偏向信号は表面から頭がわずかに動いて、表面との接触時に飽和します。
- Afm によるソフトウェアの入力コントロールを使用して、100 5,000 nm の上下を移動することによって、表面を見つけるにピエゾ電圧を調整します。それでも表面が到達しない場合は、手動で頭とサンプル間の距離を減らすために続けます。
- AFM ソフトウェアでスキャン サイズ約 500 の引き抜き実験を行う nm 先端は、約 100 の連絡先、ピエゾ旅行の nm。
- AFM の先端が基板表面と接触して残る圧電変位曲線とフォト ダイオード信号の線形領域の勾配を測定します。
- ばね定数と斜面と統合されたパワー スペクトルを用いた感受性を計算 (
)。
)。6. データ集録
- 準備。
- AFM に接続されているフィルター、フィルター設定をサンプリング周波数は、少なくとも 2 倍の帯域 (ナイキスト基準)、低域カットオフの上限を与えるに設定します。
- 測定。
- スキャン サイズを展開ポリタンパク質 (アミノ酸 × 0.365 数) に加えて基板に対して押すことを許可する約 40% の総理論的なサイズに設定します。たとえば、9 x I91 構築を引いて約 300 の理論展開長さを必要がのでスキャン サイズ、約 420 nm nm。
- AFM ソフトウェア表面かスキャン サイズの 80% にあるカンチレバーを位置 (340 についてこの場合、サーフェスから nm)。
- AFM ソフトウェアで 300 nm/秒に最初のスキャン速度を設定します。
注:この速度は、低速または高速の用途に変更できます。 - 引き抜き実験を実行し、圧電、フォト ダイオードの信号の位置を測定します。原子間力顕微鏡のソフトウェアを使用すると、スキャンを開始します。
- AFM ソフトウェアで約 10,000 の録音まで測定を実行し続けます。
注:通常、肯定的な制御分子のピックアップ率は 0.516、だから 10,000 は、分析するのに十分なデータを収集できるようにする必要の周りです。
7. データ解析
- データを正規化します。
- 各記録のための拡張機能を使用して、拡張子を計算 = 変位 - F/kc (kc は 5.2.7 から)。
- 力ピークが存在しない力拡張トレースの前後いずれかの平均を取ることによってベースライン力レベルを決定し、カンチレバーが表面に対して押していません。全体の力拡張曲線は、この平均値で、シフトことができます。
- ゼロの y 軸に沿って拡張機能が揃うようにデータを変換します。これは分子を拡張トレースの先頭をゼロに設定する必要がありますのでです。
- 興味の蛋白質を識別します。
- 単一分子の指紋を提供する少なくとも 4 つの I91 イベントが付いている録音を識別します。これらの録音は、真の「単一分子測定」をキャプチャします。
- さらなる分析のための印の単一分子イベント イベントを保存します。
- 輪郭の長さの増分を決定します。
- 録音ごとに展開イベントにワームのようなチェーン モデルに合うよう
、 
、室温でpは永続化長さ (通常 0.4 を 1 nm)、 xはナノメートルの拡張子、 Lは輪郭線長ナノメートル。
注:ワームのようなチェーンのフォームは正確に補間されたソリューション、Bouchiatらのより厳密な数値解法を発見17. 蘇らに代替のフィッティング モデルを見つけることができます18。 - L は、2 つの連続した展開イベントの決定し、この違いは鋳造の値の差を計算「輪郭の長さの増分」.
- 録音ごとに展開イベントにワームのようなチェーン モデルに合うよう
- 破断力を決定します。
- 展開曲線に最大の低下の前に最高点を取ることによって特定の展開イベントの破断力を計算します。
、 
、室温でpは永続化長さ (通常 0.4 を 1 nm)、 xはナノメートルの拡張子、 Lは輪郭線長ナノメートル。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
この議定書から代表的な結果は、図 2のとおりです。両方のパネルは、タンパク質から代表的な力-伸長曲線を示します。上部下部 I91 蛋白質、蛋白質の金利、NI10C 分子の側面を示しています I91 エンベロープタンパク質の結果を示しています。これらの録音は I91 の特徴的な力を表示 (200 pN) と長さの増減値を輪郭 (28 nm) の配置および AFM の較正が成功したことを示します。これらの力伸長曲線は、ワームのような鎖 (破線) 分子の力に依存しない長さを決定して展開の残基の数を決定することによって分析できます。解析されると、輪郭の長さ単位 (後続の輪郭線長さの差)、展開力は展開速度とアンフォールディング経路19は蛋白質の安定性を決定する使用できます。
図 1: エンベロープタンパク質のプラスミド マップします。このポリプロテイン プラスミド マップ シーケンスおよび物理的な DNA Addgene リポジトリ (www.addgene.org/74888) を通じて可能です。興味 (赤) の蛋白質の側面 I91 蛋白質 (グレーのボックス) の 8 の同じ繰り返しのポリタンパク質を構成する原子間力顕微鏡の原型のエンベロープタンパク質の設計を示しています。各モジュールには、カスタマイズを可能にするユニークな制限サイトが含まれています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 代表 SMF の結果します。A.ポリ I91 タンパク質の代表的な力伸長。ピーク間の輪郭線長インクリメントって 〜 28 nm と展開力、100-200 pN の間。B.代表力拡張曲線 (I91)3-NI10C-(I91)3蛋白質のため。アンキリン反復の輪郭線長増分は ~10.5 nm と展開力、8-25 pN の間を意味します。アンキリンののこぎりの歯の定期的パターンは I91 展開ピークが続きます。引き抜き速度両方の (A) と (B) が 0.02 nm/さんこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
プロトコルの重要なステップは、単一分子イベント「指紋」をポジティブ コントロールとして機能する 1.1.2、の手順に従って、エンベロープタンパク質の使用です。一般に、ある必要があります開くポリタンパク質蛋白質のイベント (I91、つまり約 28 約 200 pN と輪郭線長さ増分の展開力 nm) 興味の蛋白質が折り畳まれたされていることを明確に締結します。たとえば、興味の蛋白質は、どちらの側から 3 つの I91 ドメインが並ぶがとき、必要がありますそれは単一分子のイベントでは積極的に締結する少なくとも 4 つの I91 イベント。ポリタンパク質、または他の手段によって肯定的な制御がない場合、任意のデータは誤解する責任を負うです。
プラスミッドのクローニング法は遺伝子と関心のプラスミドに依存します。利用可能にした使用できるポリプロテイン プラスミドと共にこのプロトコル12。20,21のクローン作成のユニークな制限のサイトを含むこのステップのプラスミドがあります。これらのプラスミドのみ簡単にプラスミッドに興味の蛋白質のクローンを作成する制限のサイトの一意のセットが必要です。このプラスミドを簡単に興味の蛋白質を挿入しながら剥離の蛋白質の変更の利点を持っているギブソン アセンブリ22を使用して最初から作成する方法もあります。また、シャッフル コドン ドメイン興味、21の忠実度を確保するために支援の全体蛋白質の効率的なシーケンスに単純な方法を提供するモジュール式のコロナとプラスミドがあります。
金やガラスの蛋白質が利用できる特定の添付ファイルをあるかどうかによって決まります。金基板エンベロープタンパク質と表面の Au システイン結合を形成を可能にします。エンベロープタンパク質の終わりに、システインを付加すると場合、これは具体的には表面に蛋白質を添付する方法として使用できます。ガラス基板使用できます、自分でゴールドによく吸着はない、またを生成する簡単ないくつかの蛋白質のために便利であります。スライド ガラスは、特定の添付ファイルを使用して特別に作られたコロナ23の前駆体としても使用できます。マイカ基板も使用できます、負荷電の表面にバインドすることができます特定の請求サイトがあるいくつかの蛋白質のために役に立つ可能性があります。
タンパク質の原子間力顕微鏡分光には、いくつか重要な制限があります。サンプル準備ポリタンパク質に蛋白質をスプライスすることができない場合があります。測定可能な輪郭線長さ単位を生成する小さすぎるか、または力に抵抗するのには弱すぎるタンパク質も AFM によって解決することができません。のみ最近の進歩が高度な計測24で利用できるより良い解像度に、AFM 実験で典型的な解決が AFM カンチレバーの典型的な RMS ノイズによる 10-15 pN 並みの力を解決できます。一定速度実験の速度も約 4 nm/秒25に限られた、達成される最高の解像度は通常 10 μ s24よりも短い状態を検出できます。タンパク質が少ない場合は機械的に安定したより良い特徴です力範囲の下限と通常より高い時間分解能を持っている光学ピンセットを使用しています。まだ改善今後に利用できるある AFM、フレット26蛋白質の位置27と特別に設計されたカンチレバー28で高解像度化を決定するイメージング可能な afm とを組み合わせることのような。
AFM 技術は、展開速度と遷移状態距離単一分子レベル29のようなの速度論的パラメーターを抽出できるので既存のメソッドに関して重要なです。他の従来の生化学的方法 (NMR、化学変性蛍光ストップト フロー) は、速度論的パラメーターに関する情報を取得することも、これらのメソッドの結果が蛋白アンサンブルとない単一分子の機能。こう場合の重要な違いが 1 つの蛋白質のまったく異なるアンサンブル。原子間力顕微鏡は、一緒に30を平均化ではなく、集団を区別することができますを示しています。
上記タンパク質分子の SMF 実験の詳細な説明はまだ経験で解決できる可能性のある問題を予想していません。次の一般的な問題を議論してトラブルシューティング等速実験のための原子間力顕微鏡の操作に関連付けられています。
正弦波型力覚ベースライン。正弦波の形状は、ベースラインを計算することは困難ですので、正しい力のピーク値を決定するのに有害です。問題は、カンチレバーから反射されるレーザの干渉が原因です。この問題を軽減するに新しい位置はまだフォト ダイオードからよい合計信号を保持する限りにカンチレバーのレーザ スポットの位置を少し移すことができます。問題が引き続き発生する場合は、セルを保持するプローブでカンチレバーを再配置することを検討してください。
表面に初めて触れたとき、ワンステップでフォト ダイオードの信号が飽和しない。表面に触れる、飽和値に達するまで複数のステップでフォト ダイオードの信号がジャンプします。これは先端が AFM ヘッドとプローブ チップのいくつかの他の場所の最も低いポイントは、カンチレバーの先端の前にサンプル表面を触れる可能性がありますではないことを意味します。この問題は、SMF 測定を継続し、正しい力拡張曲線を得るために修正されます。問題を修正、前後セルを保持するプローブのカンチレバーの位置を移動してみてください、場所でカンチレバーを握るフックの堅さを調整します。それでも問題が解決しない場合同じチップで異なる片持ちに切り替えてみてくださいまたは新しいカンチレバー チップに変更も。
後退、後に多くのイベントまたはすべてのイベントはありません。これは、実験のため正しい蛋白質の集中を見つけることに関連します。常に、単一の大きな力の伸張のトレースに現れるピーク (> 500 pN)、ゴールド塗装面の実験を行いながら他のピークは表示されませんが場合、に、サンプル分子以来の金-金相互作用を実際に測定はカンチレバー表面があまりに貧弱です。この場合、金の表面に堆積した蛋白質のサンプルの濃度を増やす必要があります。ただし、各引きのサイクルのすべてのストレッチのトレースに表示される複数の不規則な形をしたピークが存在する場合、表面にレイヤーまたは複雑なネットワークを形成するサーフェスに夢中になってあまりにも多くの分子があることを示します。この場合、サンプルは、過剰なタンパク質分子を削除するために使用するバッファーで洗浄する必要があります。時々 低濃度タンパク質の新しいサンプルを準備する必要があるこの問題の解消を取得するには新しいサンプルでも問題が解決できない場合は、AFM の細胞を保持しているかどうか任意の液体の侵入それを参照してくださいに曇らされた環状溝を確認します。溝は、溝に液体だろうカップルの持株のセルに試料の振動と異常、カンチレバー、表面がタッチを変更するフォト ダイオードの信号を引き起こすので、実験中に乾燥べき。
フォト ダイオードの信号、ランプ間のスプリアス変調します。これは前後、通常流体チャンネルを通過する気泡によるカンチレバーをプッシュすることができますフローを表しています。この種の問題は、巨大な信号の増加または減少の測定が中断されます。この問題を解決するには、カンチレバーの周囲の流体基板の周囲の流体が接触しないように、基板から頭を上げます。一緒に、それらを戻すし、水面に落として頭を移動します。改革 AFM 細胞の液柱の通常場合はないが、流体チャンネルからバブルを破壊する十分繰り返している必要があります。
フォト ダイオードの信号で体系的な増減します。ドリフトは、各実験を通して、カンチレバーと先端が常にサンプル表面の液滴に触れる時に非常に高速ドリフトがある現象です。ドリフトは、温度による膨張やカンチレバーの収縮が信号で振動を引き起こす温度の平衡によって引き起こされることができます。最初の実験を行なうことで、漂流速度を大幅に低下させます。 前に 10 分以上待っています。漂流の速度に対応し、到達するための追加の時間を必要とする引きのサイクルの 2 つの半分の間にヒステリシスがあるし、ストレッチとリラックスしたトレースが互いに一致しない場合、引き抜き試験を行う場合平衡。力ベースラインは、小さな角度で上向きに傾く場合漂流速度は引きの速度よりも速く、先端の低振動を待つ実験を中断することをお勧め。
力拡張曲線初期領域は垂直ではありません。録音の力拡張プロットを見て新しく校正セットアップから取得されてした後に便利です。これらの録音は、カンチレバーを表面に対して押したとき垂直領域を表示しない場合、キャリブレーションが問題になるし、 5の手順から繰り返す必要があります。
いくつかの時間後にフォト ダイオードの信号が消えます。流体セル内のバッファーを蒸発させる可能性があります。水分補給を適用することによって細胞はより毎時間バッファーまたはので、乾くとメーカーからサンプルを維持するためにそれを使用できない実験、さらに重要です。
固有雑音が高い (> 30 pN).大量のノイズ (校正フォト ダイオード変動の RMS として測定) は、外部からのノイズを表しています。建物への結合の量を減らすために空気テーブルに AFM 実験を行う必要がありますが、外部からのノイズも可能性があります安全でない段階で、聴覚ノイズ、近くまたは近くの静的オブジェクト (例えば椅子) に空気テーブルの結合。ノイズは、原子間力顕微鏡 (電子システムで不安定な接続など) の電子制御システムからも来るかもしれない。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、全米科学財団助成金 MCB 1244297 と PEM に MCB 1517245 によって支持されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM Specimen Discs, 15mm diameter | Ted Pella, Inc. | 16218 | Serve as base for glass substrate |
| Round Glass Coverslips, 15mm diamiter No.1 Thick | Ted Pella, Inc. | 26024 | serve as glass substrate and base for gold coating |
| Adhesive Tabs | Ted Pella, Inc. | 16079 | Paste on AFM Specimen Discs to provide a sticky face for attaching glass coverslips |
| STD Multimode head assembly | Bruker Nano Inc. | 1B75C | AFM head |
| Glass probe holder | Bruker Nano Inc. | MTFML-V2 | Glass probe holder for scanning in fluid with the MultiMode AFM. |
| Microlever AFM probes | Bruker Nano Inc. | MLCT | Silicon Nitride cantilevers with Silicon Nitride tips, ideal for contact imaging modes |
| AFM probes with Au coated tips | Bruker Nano Inc. | OBL-10 | Cantilevers for pulling on proteins with low unfolding force |
| Multifunction Data Acquisition (DAQ) Card,16-Bit, 1 MS/s (Multichannel), 1.25 MS/s (1-Channel), 32 Analog Inputs | National Instruments | PCI-6259 | Data Acquisition for signals from AFM head and Piezo Actuators |
| LISA Linear Piezo Stage Actuators | Physik Instrumente LP | P-753.11C | Piezo Actuator to control the position of substrate and perform pulling measurements |
| XY Piezo Stage | Physik Instrumente LP | P-541.2CD | Piezo Actuator to control the position of substrate and scan on substrate surface |
References
- Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible Unfolding of Individual Titin Immunoglobulin Domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
- Fisher, T. E., Oberhauser, A. F., Carrion-Vazquez, M., Marszalek, P. E., Fernandez, J. M. The study of protein mechanics with the atomic force microscope. Trends in Biochemical Sciences. 24 (10), 379-384 (1999).
- Ng, S., Rounsevell, R., Steward, A., Randles, L., Clarke, J. Single molecule studies of protein folding by atomic force microscopy(AFM). Abstracts of Papers of the American Chemical Society. 227, U545-U545 (2004).
- Rico, F., Chu, C., Moy, V. T. Methods in Molecular Biology. Braga, P. C., Ricci, D. 736, Humana Press. 331-353 (2011).
- Muller, D. J., Dufrene, Y. F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nature Nanotechnology. 3 (5), 261-269 (2008).
- Lv, S., et al. Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles. Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).
- Kim, M., et al. Nanomechanics of Streptavidin Hubs for Molecular Materials. Advanced Materials. 23 (47), 5684-5688 (2011).
- Gonzalez, M. A., et al. Self-Adhesive Hydrogels from Intrinsically Unstructured Proteins. Advanced Materials. , (2017).
- Oberhauser, A. F., Hansma, P. K., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. M. Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (2), 468-472 (2001).
- Li, Q., Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. Capturing the Mechanical Unfolding Pathway of a Large Protein with Coiled-Coil Probes. Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13429-13433 (2014).
- Davis, L. Basic methods in molecular biology. , Elsevier. (2012).
- Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. A Modular, Non-Degenerate Polyprotein Scaffold for Atomic Force Spectroscopy. Biomacromolecules. , (2016).
- Scholl, Z. N. The (Un) Folding of Multidomain Proteins Through the Lens of Single-molecule Force-spectroscopy and Computer Simulation. , Duke University. (2016).
- Pawlak, K., Strzelecki, J. Nanopuller-open data acquisition platform for AFM force spectroscopy experiments. Ultramicroscopy. 164, 17-23 (2016).
- Nanopuller. , https://sourceforge.net/projects/nanopuller/ (2018).
- Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. Improving single molecule force spectroscopy through automated real-time data collection and quantification of experimental conditions. Ultramicroscopy. 136, 7-14 (2014).
- Bouchiat, C., et al. Estimating the persistence length of a worm-like chain molecule from force-extension measurements. Biophysical journal. 76 (1), 409-413 (1999).
- Su, T., Purohit, P. K.
- Steward, A., Toca-Herrera, J. L., Clarke, J. Versatile cloning system for construction of multimeric proteins for use in atomic force microscopy. Protein science. 11 (9), 2179-2183 (2002).
- Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. Modular, Nondegenerate Polyprotein Scaffolds for Atomic Force Spectroscopy. Biomacromolecules. 17 (7), 2502-2505 (2016).
- Hoffmann, T., et al. Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of β-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains. ACS. 9 (9), 8811-8821 (2015).
- Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).
- Popa, I., Berkovich, R., Alegre-Cebollada, J., Rivas-Pardo, J. A., Fernandez, J. M. Halotag Tethers to Study Titin Folding at the Single Molecule Level. Biophysical journal. 106 (2), 391a (2014).
- Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355 (6328), 945-950 (2017).
- Rico, F., Gonzalez, L., Casuso, I., Puig-Vidal, M., Scheuring, S. High-speed force spectroscopy unfolds titin at the velocity of molecular dynamics simulations. Science. 342 (6159), 741-743 (2013).
- He, Y., Lu, M., Cao, J., Lu, H. P. Manipulating protein conformations by single-molecule AFM-FRET nanoscopy. ACS nano. 6 (2), 1221-1229 (2012).
- Fotiadis, D., Scheuring, S., Müller, S. A., Engel, A., Müller, D. J. Imaging and manipulation of biological structures with the AFM. Micron. 33 (4), 385-397 (2002).
- Edwards, D. T., Faulk, J. K., LeBlanc, M. A., Perkins, T. T. Force Spectroscopy with 9-μs Resolution and Sub-pN Stability by Tailoring AFM Cantilever Geometry. Biophysical journal. 113 (12), 2595-2600 (2017).
- Dudko, O. K., Mathe, J., Szabo, A., Meller, A., Hummer, G. Extracting kinetics from single-molecule force spectroscopy: Nanopore unzipping of DNA hairpins. Biophysical. 92 (12), 4188-4195 (2007).
- Scholl, Z. N., Li, Q., Yang, W., Marszalek, P. E. Single-molecule Force Spectroscopy Reveals the Calcium Dependence of the Alternative Conformations in the Native State of a βγ-Crystallin Protein. Journal of Biological Chemistry. 291 (35), 18263-18275 (2016).
