Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Приходите в сторону света: В Vivo мониторинг Pseudomonas aeruginosa биопленки инфекций, хронических ран в диабетической голые мышиных модели

13.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55991

⸱

10 октября 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University, 2Department of Physiology, Michigan State University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем Роман Диабетическая мышиных модель, используя лысых мышей мониторинга в реальном времени, неинвазивный, биопленки раневые инфекции биолюминесцентных синегнойной палочки. Этот метод может быть адаптирована к инфекции других бактериальных видов и генетически измененных микроорганизмов, в том числе многовидового биопленки, оценить и протестировать эффективность стратегий antibiofilm.

Аннотация

Считается, что наличие бактерий как структурированных биопленки в хронических ран, особенно у больных сахарным диабетом, предотвращения заживление ран и резолюции. Хронический мыши раны модели были использованы для понимания основных взаимодействий между микроорганизмы и принимающей. Модели, разработанные к настоящему времени полагаются на использование волосами животных и терминал сбора ткани раны для определения жизнеспособных бактерий. В то время как значительное понимание был накоплен с этими моделями, эта экспериментальная процедура требует большое количество животных и выборки отнимает много времени. Мы разработали Роман мышиных модель, которая включает несколько оптимальных инноваций для оценки биопленки прогрессирования хронической раны:) он использует лысых мышей, устраняя необходимость удаления волос; b) применяет предварительно сформированных биопленки на раны, позволяя для непосредственной оценки стойкости и эффект этих общин на узле; c) контролирует биопленки прогрессии, количественного определения света производства путем генной инженерии биолюминесцентных штамм Pseudomonas aeruginosa, позволяя мониторинг в реальном времени заражения, тем самым уменьшая количество животных, требуется для каждого исследования. В этой модели одной полную глубину раны производится на задней части СТЗ индуцированной сахарным диабетом лысых мышей и привиты с биопленки биолюминесцентных штамм P. aeruginosa Xen 41. Ежедневно в в естественных условиях изображений системы, позволяющие в естественных условиях и в situ быстрого биопленки визуализации и локализации биопленки бактерий в пределах раны записывается светоотдачи от ран. Этот новый метод является гибким, как он может использоваться для изучения других микроорганизмов, в том числе генетически модифицированных видов и многовидового биопленки и может иметь особое значение в тестировании анти биопленки стратегий, включая антимикробной окклюзионной повязки.

Введение

Биоплёнки являются сложные сообществ микроорганизмов, внедренные в матрицу, полимерных веществ, которые выделены в качестве фактора для бедных решения хронических ран1. Изучение этих высокоорганизованных, постоянные микробного населения особенно важно для больных сахарным диабетом, где плохое кровообращение конечностей и изменены периферической сенсорной механизмы привести к незамеченными поражений2. Согласно оценкам, в Соединенных Штатах, что 15% больных сахарным диабетом будет развиваться по крайней мере один из желудка в течение их жизни. Это приводит к экономических расходов около 28 млрд долларов на лечение3,4, не упоминать immensurable эмоциональное и социальное бремя. Понимание факторов, которые позволяют микробных сообществ упорствовать в рану кровать и то влияние, которое эти биоплёнки имеют в лечебных мероприятий необходимо управлять лучший уход для пострадавших пациентов и стимулирования разработки новых подходов к лечению. Таким образом создание воспроизводимых и переводимых в vivo моделей для изучения взаимодействия бактерий хост имеет первостепенное значение.

Мышиных моделях была успешно разработана для изучения влияния биопленки в хронических ран. Однако, эти модели, часто используют волосатая видов и оценивать биопленки Распродажа, плиты счетчики для жизнеспособных бактериальных клеток подакцизным ткани от жертвенных животных, делая их трудоемким и дорогостоящим.

Биофотонный альтернативой конечной точки выборки животных в оценке инфекции была впервые предложена КОНТАГ и др. (1995) 5 , кто разработал метод для захвата люминесценции от конститутивно биолюминесцентных Salmonella typhimurium для измерения эффективности лечения антибиотиками. Другие исследования, воспользовавшись биолюминесценции излучающих бактерий последовали за. К примеру, предлагает и др. (2001) 6 проверка инфекции модель для изучения бедра инфекции Escherichia coli у мышей путем измерения люминесценции с помощью активизации зарядовой и позднее, Kadurugamuwa и др. (2003) 7 воспользовался фотон, излучающие свойства инженерии штамма золотистого стафилококка , чтобы исследовать эффективность нескольких антибиотиков в катетер рану модели мышей.

Этот метод характеризуется здесь представляет простой протокол вызвать диабет в лысых мышей, производить и прививать раны с предварительно сформированных биолюминесцентных биоплёнки P. aeruginosa, и проводить мониторинг Биофотонный инфекции использование в vivo imaging системы. Он предлагает прямой, быстрого, в месте, неинвазивная и количественный процесс оценки биопленки в хронических ран и Кроме того, позволяет для дополнительного анализа, такие как микроскопических изображений заживление раны, прерывистый крови коллекции для цитокинов измерения и терминал ткани коллекции для гистологии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

эксперименты на животных были утверждены институциональный уход животных и использование Комитета Мичиганского государственного университета.

1. Подготовка окклюзионной повязки и силиконовые прокладки

  1. Вырезать прозрачный окклюзионной повязки сделать квадраты примерно 1 см x 1 см ножницами.
  2. Вырезать 10 мм круги на 0,5 мм толщиной силиконовые листа с помощью биопсии 10 мм Панч. центра биопсии 5 мм punch в середине круг 10 мм и нажмите твердо для создания отверстия в форме " пончик "-как диск, который будет использоваться в качестве шины.

2. подопытных животных

  1. использования 8 неделя старый (22-26 g) мышей-самцов SKH-1 от коммерческих заводчика. Держите мышь в стандартных условиях 21 ° C и 12 h свето тени цикл с свободный доступ к продовольствию и воде.
  2. Вызвать диабет, придать intraperitonially мышей с 13 мг/мл Стрептозотоцин (СТЗ) решениеИ 25% глюкозы (250 мкл в / мышь) на 5 дней подряд.
    1. Сделать СТЗ решения путем разбавления 65 мкг СТЗ в 5 мкл, 100 мм лимонной кислоты, pH 4.5.
    2. Вводят громкости для каждой мыши для окончательного массой 65 мг СТЗ на 1 кг массы тела мыши. Внедрить контроль мышей с 100 мм лимонной кислоты раствор pH 4.5 в те же дни.
  3. Крови глюкозы с глюкометр 14 дней после последнего введения СТЗ для подтверждения гипергликемии. Диабетических мышей может иметь полиурия и поэтому их постельные принадлежности может потребоваться более часто менять для ликвидации влаги и их весов должно контролироваться 3 раза в неделю.

3. Биоплёнки

  1. биопленки подготовки
    1. растут колонии биоплёнки 8 для инокуляции раны. За два дня до начала операции на ночь культуры биолюминесцентных P. aeruginosa Xen в tryptic соевый бульон (TSB) 41 инкубировали при 37 ° C и тряски на 200 об/мин и стерилизовать поликарбоната мембранные фильтры с 0,2 мкм поры под воздействием УФ свет в капюшоне биологической безопасности 15 мин в стороне.
    2. За один день до хирургии центрифуга ночь культуры на 20000 x g на 2 мин и мыть 3 раза с 1 мл Dulbelcco ' s фосфат буфер солевой раствор (DPBS), закупорить вверх и вниз.
    3. Развести подвеска в DPBS для поглощения 0,05 на 600 Нм.
    4. Пипетки 10 мкл разбавленного культуры на каждом мембраны, отдыхая на плите tryptic соевый агар (TSA). После позволяя высохнуть, инкубации мембран при 35 ° C для 72 h расти биоплёнки передачи свежие TSA тарелки каждые 24 ч.
  2. Калибровочной кривой
    1. до начала эксперимента сделать стандартной кривой соотнести биолюминесценции и бактериальных графов.
    2. Подготовить биопленки, как описано в пункте 3.1.
    3. Сделать серийных разведений биоплёнки, начиная от ½ до 1/24, смешивая биопленки с DPBS и vortexing до тех пор, пока производится визуально однородных решений. Дозатор 200µL разбавленных растворов в черный 96-луночных пластины и изображения с в vivo imaging системы.
    4. Распространения пластины разведений на TSA пластин и Инкубируйте на 35 ° C в течение 24 ч.
    5. Рассчитывать колонии, образуя единиц (CFU) на тарелках и создания стандартной кривой соотнести биолюминесценции и бактериальных графов.

4. Ранение хирургии

  1. вызвать общий наркоз, используя изофлюрановая в 95% oxygen/5% CO 2 (для предупреждения смерти от кетоацидоз) со скоростью потока 1 Л/мин и поддержания анестезии, с помощью изофлюрановая 1-3%. Сохранить животных на циновках тепла во время хирургии.
  2. Обеспечить глубокий педали рефлексы мыши подавляются путем сжимать ноги с помощью пинцета и поместите указатель мыши в лежачем положении.
  3. Администрирование мелоксикам (0,2 мг/кг) через подкожной инъекции (30 мкл) для управления боли.
  4. Протрите кожу спины с 10% повидон йод три раза и площадку изопропаноле.
  5. Использовать стерильные 4 мм биопсии удар наметить один круговой узор для раны на одной стороне мыши ' s срединной линии на уровне плеч. Определить шаблон с постоянным маркером.
  6. Использовать зубчатый щипцы подтянуть кожу в середине наброски и Ирис ножницы для создания полного толщина рану, которая простирается через подкожной клетчатки, включая carnosus подкожной и акцизный круговой кусочек ткани.
  7. Медицинский водонепроницаемый кожи клей клей наносится на кожу мышей и положение силиконовые шину, применяя мягкое давление. Покрывают рану с прозрачной окклюзионной повязки. После операции, индивидуально клетки животных.

5. Послеоперационное управление

  1. Администрирование мелоксикам (0,2 мг/кг) один раз в день через подкожной инъекции для послеоперационной боли в течение 2 дней.
  2. Монитор животных ежедневно для проявления боль и потерю веса. Диабетической животных нужно инъекции инсулина, когда они потеряли 15% или более от веса тела.

6. Подготовка посевным материалом биопленки и инфекции

  1. инокуляции мышей 48 ч после операции, как описано в следующих шагах.
  2. Скрип 72 h биопленок от мембраны, с помощью стерильных шпателя, поместите его в пробки microcentrifuge и разбавить 1:2 в DPBS. Микс, кратко закупорить вверх и вниз.
  3. Распространение пластины посевным материалом на TSA пластин для вычисления общей кое. Чтобы гарантировать точное количество, сломать биопленки посевным материалом далее, ряд двух шагов 1 мин vortexing, интеркалированного sonication шаг 2 мин 40 кГц в ультразвуковой очистки.
  4. Удаление Туалетная покрытие раны и силиконовые шину и принять Микрофотография раны с помощью микроскопа с подключенной камеры с помощью линейки для справки.
  5. Сократить советы 200 мкл наконечники и Пипетка 10 мкл биопленки посевным материалом на каждой раны.
  6. Изображение мыши, используя в vivo imaging системы с помощью автоматической настройки: Выдержка времени s 5-300, с среднего биннинга, 1 f/stop и открыть фильтр и поле зрения C (12,9 x 12,9 см).
  7. Крышка раны с соусом из свежей.

7. Рану измерения и визуализации

  1. оценивать клинические признаки животных ежедневно 9.
  2. Предоставления продовольствия, воды и при необходимости измените клетки.
  3. Проверки целостности повязок ежедневно. Когда соус присутствует, только биолюминесценции может быть измерена вследствие окклюзии раны. На 8 день, удаляются и не заменил позволяет измерение закрытия ран.
  4. Весят животных каждый день.
  5. Для всех дней, место мышей индивидуально в камеру изоляции оснащен фильтром HEPA и изображения с помощью в vivo imaging системы, ежедневно или через день, до тех пор, пока значения свечения падает ниже уровня фона.
  6. После 8 день, вызвать общий наркоз и взять микроскопии раны с помощью микроскопа с подключенной камеры с помощью линейки для ссылки каждый день до заживления раны.

8. Гистологический анализ

  1. Euthanize мышей с потоком 2 л/мин CO 2 в эвтаназии камеры после свечения падает ниже фоновых уровней и раны полностью исцелен. Подтвердить смерть шейки матки дислокации как второй метод эвтаназии.
  2. Использовать Ирис ножницы для создания широкого, полное иссечение вокруг и под области раны (около 1 см в диаметре) и сохранить ткани в параформальдегида 4% для гистологического анализа.
  3. Другие анализа: определение цитокинов
    1. ретро орбитально сбор крови от животных под наркозом с использованием капиллярной стеклянной трубки и перенести его на лечение ЭДТА трубы.
    2. Центрифуга крови при 2000 об/мин в течение 20 минут при температуре 4 ° C и замораживания плазмы для обнаружения цитокина.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В разработке этой новой модели, мы наблюдали много преимуществ в использовании голые SKH-1 над мышей C57BL/6J, которые мы использовали в прошлом. Животные обычно подвергается СТЗ инъекции опыт постепенного похудения с наступлением диабета; Однако в рану исцеление эксперименты ранее проведенного нашей лаборатории, воспроизводя модель, представленная Данн и др. (2012) 9 с использованием C57BL/6J, резкое потеря веса было отмечено (рис. 1<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы опишем новую модель мыши для изучения биопленки в диабетической хронических ран, который имеет много преимуществ для создания воспроизводимых, переводимые и гибкие модели.

Первый инновации является использование лысых мышей. Другие мыши модели были разработаны для изучения Диабетическая хронический заживления ран10,11, но все полагались на использование волосатая мышей, требующих удаления меха процессов, которые связаны с воск...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить за поддержку этой работы (Грант # #7-13-BS-180), Мичиганского государственного университета исследования технологии фонда поддержки для профессиональной подготовки и доступа к в vivo imaging системы американской ассоциации диабета и Мичиган государственного университета следственных гистопатология лаборатория для обработки мыши биопсии для гистопатологические осмотра.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ОпсайтСмит и Племянникмодели 66000041Smith & Nephew Flexfix Opsite Прозрачная клейкая пленка в рулоне 4" x 11 ярдов
мыши SKH-1 Crl:SKH1-HrhrCharles River Breeding LaboratoriesSKH1Голые мыши, 8-недельный
стрептозотоцин (STZ)Sigma AldrichS0130-1Gпорошок стрептозоцина, 1г
глюкометр AccuChekAccu-ChekArt No. 05046025001ACCU-CHEK CompactPlus Набор для мониторинга диабета
Pseudomonas aeruginosa Xen 41Perkin Elmer119229Биолюминесцентные Pseudomonas aeruginosa
Поликарбонатные мембранные фильтрыSigma AldrichP9199Millipore поликарбонатные мембранные фильтры с 0,2 мкм; m размер пор
Dulbelcco фосфатный буферный раствор (DPBS)Sigma AldrichD8537
PBS Триптический соевый агарSigma Aldrich22091Культуральный агар
MeloxicamHenry Schein Animal Health49755Eloxiject (Meloxicam) 5 мг/мл, раствор для инъекций
10% повидон-йод (Бетадин)Purdue Products LP301879-OAТампон, раствор бетадина. Антисептический. Индивидуум. Обернутый, 200/ящик
4% параформальдегидFisher ScientificAAJ61899AKАльфа Аэсар Параформальдегид, 4% в
капиллярной стеклянной трубкеFisher Scientific22-362-566Гепаринизированный микрогематокрит Капиллярные трубки
Силикон для изготовления шинInvitrogen Life Technologies CorpP-18178Силиконовый лист с пресс-печатью, 13 см x 18 см, толщина 0,5 мм, набор из 5 листов
Триптический соевый бульонSigma Aldrich22092Культуральный бульон
IVIS SpectrumPerkin Elmer124262Система визуализации in vivo
IVIS Spectrum Изоляционная камераPerkin Elmer123997XIC-3 Камера изоляции животных
HEPA фильтрTeleflex28022Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022
Биопсийные пробивкиVWR International Inc21909-142Одноразовый пуансон для биопсии, 5 мм, стерильный, упаковка 50 шт.
Биопсийные пуансоныVWR International Inc21909-140Одноразовый биопсийный пуансон, 4 мм, стерильный, упаковка 50 штук.
ГлюкозаJ.T.Baker1916-01Декстроза, безводная, порошок
Лимонная кислотаSigma AldrichC2404-100GЛимонная кислота
МастизолEloquest HealthcareHRI 0496-0523-48Mastisol Медицинский жидкий клей 2/3 мл флакон, коробка из 48
черных пластин Corning 96-луночные черные пластиныFisher Scientific07-200-56796-луночные черные полистироловые микропластины
Игла 25 калибра 5/8 дюймаBD305122Обычная игла со скосом
Bransonic M Ультразвуковая чистящая ваннаBranson UltrasonicsN/AУльтразвуковой очиститель
PBS

Ссылки

  1. James, G. A., et al. Biofilms in chronic wounds. Wound Repair Regen. 16 (1), 37-44 (2008).
  2. Gordois, A., Scuffham, P., Shearer, A., Oglesby, A., Tobian, J. A. The health care costs of diabetic peripheral neuropathy in the US. Diabetes Care. 26 (6), 1790-1795 (2003).
  3. Reiber, G. E., McDonell, M. B., Schleyer, A. M., Fihn, S. D., Reda, D. J. A comprehensive system for quality improvement in ambulatory care: assessing the quality of diabetes care. Patient Educ Couns. 26 (1-3), 337-341 (1995).
  4. Driver, V. R., Fabbi, M., Lavery, L. A., Gibbons, G. The costs of diabetic foot: The economic case for the limb salvage team. J Vasc Surg. 52 (Suppl 3), 17S-22S (2010).
  5. Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).
  6. Rocchetta, H. L., et al. Validation of a noninvasive, real-time imaging technology using bioluminescent Escherichia coli in the neutropenic mouse thigh model of infection. Antimicrob Agents Chemother. 45 (1), 129-137 (2001).
  7. Kadurugamuwa, J. L., et al. Rapid direct method for monitoring antibiotics in a mouse model of bacterial biofilm infection. Antimicrob Agents Chemother. 47 (0066-4804), 3130-3137 (2003).
  8. Anderl, J. N., Franklin, M. J., Stewart, P. S. Role of antibiotic penetration limitation in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 44 (7), 1818-1824 (2000).
  9. Morton, D. B. A systematic approach for establishing humane endpoints. ILAR J. 41 (2), 80-86 (2000).
  10. Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. J Vis Exp. (75), e50265(2013).
  11. Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge - a model for the study of chronic wounds. Wound Repair Regen. 18 (5), 467-477 (2010).
  12. Holley, A. K., Xu, Y., Noel, T., Bakthavatchalu, V., Batinic-Haberle, I., St. Clair, D. K. Manganese superoxide dismutase-mediated inside-out signaling in HaCaT human keratinocytes and SKH-1 mouse skin. Antioxid Redox Signal. 20 (15), 2347-2360 (2014).
  13. Abbas, S., Alam, S., Pal, A., Kumar, M., Singh, D., Ansari, K. M. UVB exposure enhanced benzanthrone-induced inflammatory responses in SKH-1 mouse skin by activating the expression of COX-2 and iNOS through MAP kinases/NF-ĸB/AP-1 signalling pathways. Food Chem Toxicol. 96, 183-190 (2016).
  14. Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infect Immun. 82 (1), 92-100 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Модель диабетической раныбиолюминесцентная Pseudomonasвизуализация in vivoмониторинг биопленочной инфекциимодель на безволосых мышахстрептозотоцин-индуцированный диабетоценка заживления рантестирование антимикробных повязокотслеживание инфекции в режиме реального времениисследование хронических ран
Приходите в сторону света: В Vivo мониторинг Pseudomonas aeruginosa биопленки инфекций, хронических ран в диабетической голые мышиных модели
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.