Summary
Hier beschreiben wir eine neuartige diabetische Mausmodell nutzt haarlose Mäusen für Echtzeit-, nicht-invasive Überwachung der Biofilm Wundinfektionen der Biolumineszenz Pseudomonas Aeruginosa. Diese Methode lässt sich die Infektion anderer Bakterienarten und genetisch veränderten Mikroorganismen, einschließlich Multi-Spezies Biofilme und testen die Wirksamkeit von Antibiofilm Strategien anpassen.
Abstract
Das Vorhandensein von Bakterien als strukturierte Biofilme bei chronischen Wunden, insbesondere bei Diabetikern, wird gedacht, um die Wundheilung und Auflösung zu verhindern. Chronische Wunden Mausmodellen wurden verwendet, die zugrundeliegenden Wechselwirkungen zwischen Mikroorganismen und dem Host zu verstehen. Die bisher entwickelten Modelle setzen auf kurzhaarige Tiere und terminal Sammlung von Wundgewebe zur Bestimmung der lebensfähigen Bakterien. Während mit diesen Modellen erhebliche Einblick gewonnen wurde, dieses experimentelle Verfahren erfordert eine große Anzahl von Tieren und Probenahme ist zeitaufwendig. Haben wir eine neuartige Mausmodell, das beinhaltet mehrere optimale Innovationen um Biofilm Progression bei chronischen Wunden zu bewerten: ein) es nutzt haarlose Mäusen, wodurch die Notwendigkeit für die Haarentfernung; (b) bezieht sich auf die Wunden ermöglicht die sofortige Auswertung der Persistenz und Wirkung dieser Gemeinschaften auf Host vorgeformte Biofilme; (c) überwacht die Biofilm Fortschreiten durch leichte Produktion durch eine gentechnisch Biolumineszenz Belastung von Pseudomonas Aeruginosa, ermöglicht Echtzeit-Überwachung von der Infektion, wodurch die Anzahl der Tiere pro Studie zu quantifizieren. In diesem Modell eine einzelne ganzer Tiefe Wunde auf der Rückseite des STZ-induzierte diabetischen haarlosen Mäusen produziert und mit Biofilmen von p. Aeruginosa Biolumineszenz Stamm Xen 41 geimpft. Lichtleistung von den Wunden ist in ein in-Vivo imaging-System, so dass für die in Vivo und in Situ schnelle Biofilm-Visualisierung und Lokalisierung von Biofilm-Bakterien in die Wunden täglich aufgezeichnet. Diese neuartige Methode ist flexibel, es kann verwendet werden, um andere Mikroorganismen, einschließlich gentechnisch veränderter Arten und Multi-Spezies Biofilme zu studieren und möglicherweise von besonderem Wert in Anti-Biofilm Prüfstrategien einschließlich antimikrobielle okklusiven Dressings.
Introduction
Biofilme sind komplexe Gemeinschaften von Mikroorganismen eingebettet in eine Matrix aus Polymeren Substanzen, die als Faktor für die schlechte Auflösung von chronischen Wunden1hervorgehoben worden sind. Die Studie dieser hoch organisierten, anhaltende mikrobiellen Populationen ist besonders wichtig für Diabetes-Patienten schlechter Durchblutung der Gliedmaßen und geänderten peripheren sensorischen Mechanismen führen zu unerkannten Läsionen2. In den Vereinigten Staaten wird geschätzt, dass 15 % der Diabetes-Patienten im Laufe ihres Lebens mindestens ein Geschwür entwickeln wird. Dies führt zu einem wirtschaftlichen Aufwand von rund 28 Milliarden Dollar in Behandlung3,4, um ganz zu schweigen von unschätzbarem emotionale und soziale Belastung. Verständnis der Faktoren, die es mikrobielle Gemeinschaften ermöglichen bestehen in das Wundbett und die Auswirkungen, die diese Biofilme an den heilenden Veranstaltungen unbedingt bessere Betreuung für die betroffenen Patienten fahren und treiben die Entwicklung neuer Therapieansätze. Daher ist die Einrichtung von reproduzierbar und übersetzbar in Vivo Modellen für die Erkundung von Bakterien-Wirt Interaktionen von größter Bedeutung.
Murinen Modelle wurden erfolgreich entwickelt, um die Auswirkungen von Biofilmen bei chronischen Wunden zu untersuchen. Diese Modelle jedoch oft behaarte Arten nutzen und bewerten Biofilm Abstand von Platte Grafen für tragfähige Bakterienzellen von ausgeschnittenen Gewebe von geopferten Tiere, wodurch sie Zeit- und kostenintensiv.
Eine biophotonische Alternative zum Endpunkt Probenahme von Tieren bei der Bewertung von Infektion wurde zuerst von Contag Et al.vorgeschlagen. (1995) 5 , , entwickelt eine Methode, Lumineszenz von konstitutiv Biolumineszenz Salmonella Typhimurium zur Messung der Wirksamkeit der antibiotischen Behandlung zu erfassen. Andere Studien, die unter Ausnutzung der Biolumineszenz-emittierende Bakterien gefolgt. Z. B. Rocchetta Et Al. (2001) 6 validiert eine Infektionsmodell Oberschenkel Escherichia coli -Infektionen bei Mäusen durch die Messung der Lumineszenz, die mit einer verstärkten Coupled Ladegerät – studieren und später, Kadurugamuwa Et Al. (2003) 7 nutzten das Photon emittierenden Eigenschaften ein veränderter Stamm von Staphylococcus Aureus , die Wirksamkeit der verschiedenen Antibiotika in einem Katheter-Wunde-Modell bei Mäusen zu untersuchen.
Die Methode zeichnet sich hier stellt eine einfache Protokoll um Diabetes in haarlosen Mäusen zu induzieren, produzieren und Wunden mit vorgeformten Biolumineszenz Biofilmen von p. Aeruginosa, impfen und biophotonische Überwachung der Infektion mit Hilfe einer in-Vivo imaging-System. Es bietet eine direkte, Rapid, in Situ, nicht invasiv und quantitativen Prozess, Biofilme bei chronischen Wunden zu bewerten und darüber hinaus für die zusätzliche Analyse ermöglicht, wie mikroskopische Bildgebung des Heilens Wunden, intermittierende Blutentnahme für Zytokin-Messungen und terminal Gewebe Kollektion für Histologie.
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Protocol
Tierversuche wurden genehmigt durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Ausschuss der Michigan State University.
1. Vorbereitung der okklusiven Dressings und Silikon Spacer
- schneiden die transparenten okklusiven Verband zu ca. 1 cm x 1 cm mit der Schere Quadrate.
- Schneiden 10 mm Kreise auf einem 0,5 mm dicken Silikon-Blatt mit einem 10 mm Biopsie Punsch. Center eine 5 mm-Biopsie in der Mitte des Kreises 10 mm Stanzen und drücken Sie fest um ein Loch zu bilden eine " Donut "-wie Scheibe, die als eine Schiene verwendet werden.
2. Versuchstieren
- Verwendung 8 Woche alt (22-26 g) männlichen SKH-1 Mäusen von einem kommerziellen Züchter. Halten Sie Mäuse im standard-Bedingungen von 21 ° C und einem 12 h hell-dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Nahrungsmitteln und Trinkwasser.
- Um Diabetes zu induzieren, injizieren Mäuse Intraperitonially mit 13 mg/ml Streptozocin (STZ) Solutionand 25 % Glucose (250 µl pro / Maus) an 5 aufeinander folgenden Tagen.
- Machen die STZ-Lösung durch Verdünnung 65 µg der STZ in 5 µL 100 mm Zitronensäure, pH 4,5.
- Lautstärke für jede Maus zu einer endgültigen Masse von 65 mg STZ pro 1 kg Körpergewicht Maus injiziert. Kontroll-Mäusen mit 100 mM Zitronensäure Lösung pH 4.5 zu injizieren, an den gleichen Tagen.
- Hyperglykämie durch Blutzucker-monitoring mit einem Blutzuckermessgerät 14 Tage nach der letzten Injektion STZ bestätigen. Diabetische Mäusen möglicherweise Polyurie und so ihre Bettwäsche müssen häufiger gewechselt werden, um Feuchtigkeit zu beseitigen und ihre Gewichte sollten 3 Mal pro Woche überwacht werden.
3. Biofilme
- Biofilm Vorbereitung
- wachsen Kolonie Biofilme 8, um die Wunden zu impfen. Zwei Tage vor Beginn der Operation eine Nacht Kultur der Biolumineszenz p. Aeruginosa Xen 41 in tryptic Soy Bouillon (TSB) bei 37 ° C inkubiert und schütteln bei 200 u/min und sterilisieren Polycarbonat Membranfilter mit 0,2 µm Porengröße von UV-Exposition Licht in eine biologische Schutzhaube für 15 min pro Seite.
- Einen Tag vor der Operation über Nacht Kultur bei 20.000 x g für 2 min Zentrifugieren und wasche 3 Mal mit 1 mL Dulbelcco ' s Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) von oben und unten pipettieren.
- Verdünnen Aufhängung in DPBS eine Extinktion von 0,05 bei 600 nm.
- Pipette 10 µL der verdünnte Kultur auf jede Membran ruhen auf einem tryptic Soy Agar (TSA) Teller. Nach dem Trocknen erlauben, brüten die Membranen bei 35 ° C für 72 h, Biofilmen auf frischen TSA Platten übertragen alle 24 Std. zu wachsen
- Standardkurve
- vor Beginn des Experiments machen eine Standardkurve Biolumineszenz und bakterielle zählt korrelieren.
- Biofilme vorbereiten, wie unter 3.1 beschrieben.
- Machen Verdünnungsreihen von Biofilmen von ½ bis 1/24 Biofilm mit DPBS und vortexen vermischen, bis eine optisch homogene Lösung entsteht. Pipette 200µL der verdünnten Lösungen in einem schwarzen 96-Well-Platte und Bild mit der in-Vivo imaging-System.
- Platte Verdünnungen auf TSA Platten verteilt und inkubieren Sie bei 35 ° C für 24 h.
- Zählen Koloniebildenden Einheiten (KBE) auf Platten und erstellen eine Standardkurve um Biolumineszenz und bakterielle zählt korrelieren.
4. Wunde Chirurgie
- induzieren allgemeinen Anästhesie mit Isofluran in 95 % oxygen/5% CO 2 (um Tod von einer Ketoazidose zu verhindern) bei einer Durchflussmenge von 1 L/min und Anästhesie mit 1-3 % Isofluran zu erhalten. Tiere auf Heizmatten während der Operation zu erhalten.
- Gewährleisten die tief Pedal Reflexe der Maus werden durch Kneifen den Fuß mit einer Pinzette unterdrückt und platzieren Sie den Mauszeiger in die Bauchlage.
- Verwalten Sie Meloxicam (0,2 mg/kg) durch subkutane Injektion (30 µl) zur Schmerzbekämpfung.
- Wischen Sie die Haut des Rückens mit 10 % Povidon-Jod dreimal und einer Isopropanol-Pad.
- Benutzen einen sterile 4 mm Biopsie-Punch um ein kreisförmiges Muster für die Wunde auf der einen Seite der Maus zu markieren ' s Mittellinie auf der Ebene der Schultern. Skizzieren Sie das Muster mit einem Permanentmarker.
- Gezahnte Pinzette anheben die Haut in der Mitte der Kontur und Iris Schere erstellen eine voll-dicke Wunde, die durch das subkutane Gewebe einschließlich der Panniculus Carnosus erstreckt und Verbrauchsteuern kreisförmige Stück des Gewebes verwenden.
- Kleber eine medizinische wasserdichte Haut Kleber auf der Haut der Mäuse und positionieren Sie die Silikon-Schiene mit leichten Druck. Decken Sie die Wunde mit einem transparenten okklusiven Dressing. Nach der Operation individuell Käfig Tiere.
5. Die Nachbehandlung
- verwalten Meloxicam (0,2 mg/kg) einmal täglich durch subkutane Injektion für postoperative Schmerzlinderung für die nächsten 2 Tage.
- Monitor Tiere täglich für Manifestationen von Schmerzen und Gewichtsverlust. Diabetische Tiere brauchen Insulin-Injektionen, wenn sie mindestens 15 % des Körpergewichts verloren haben.
6. Biofilm Inokulum Vorbereitung und Infektion
- impfen Mäuse 48 h nach der Operation, wie in den folgenden Schritten beschrieben.
- Kratzen 72 h Biofilme aus den Membranen mit einem sterilen Spatel, legen Sie sie in einem Microcentrifuge Schlauch und verdünnen 1:2 in DPBS. Mix von kurz auf und ab pipettieren.
- Ausbreitung Platte Inokulum auf TSA Platten insgesamt KBE berechnen. Um sicherzustellen, dass zählt korrekt sind, brechen die Biofilm-Inokulum weiter durch eine Reihe von 1 min vortexen zweistufig Zwischenspiele durch ein 2 min Beschallung Schritt bei 40 kHz in einem Ultraschallreiniger.
- Dressing-Abdeckung der Wunde und Silikon-Schiene und nehmen ein Schliffbild der Wunde mit einem Mikroskop mit angeschlossene Kamera mit einem Lineal zu Referenzzwecken entfernen.
- Schneiden die Spitzen von 200 µL Pipettenspitzen und pipette 10 µL des Inokulums Biofilm auf jede Wunde.
- Bild-Maus mit dem in-Vivo imaging-System mit Auto-Einstellungen: Belichtungszeit 5-300 s, mit mittlerer binning, 1 f/Stop und offene Filter und Sichtfeld C (12,9 x 12,9 cm).
- Abdeckung Wunde mit frischen Dressing.
7. Wunde Mess- und Imaging
- bewerten die klinischen Symptome der Tiere täglich 9.
- Nahrung, Wasser und Käfige nach Bedarf ändern.
- Überprüfen die Integrität des Dressings täglich. Wenn das Dressing vorhanden ist, kann nur die Biolumineszenz durch Verschluss der Wunde gemessen werden. Am Tag 8, Dressings werden entfernt und nicht ersetzt ermöglicht Messung der Wundverschluss.
- Wiegen Tiere jeden zweiten Tag.
- Mäuse Platz für alle Tage, einzeln in eine Isolationskammer ausgestattet mit einem HEPA-Filter und Image mit dem in-Vivo imaging-System täglich oder jeden zweiten Tag bis Hintergrundkonzentration Lumineszenz Werte unterschreiten.
- Nach Tag 8, induzieren Vollnarkose und nehmen Mikrographen der Wunde mit einem Mikroskop mit angeschlossene Kamera mit einem Lineal zu Referenzzwecken jeden zweiten Tag bis Wunden geheilt sind.
8. Histologische Analyse
- einschläfern die Mäuse mit einem Flow von 2 l/min von CO 2 in eine Euthanasie Kammer nach Lumineszenz Hintergrundkonzentrationen unterschreitet und die Wunden sind geheilt. Tod durch zervikale Dislokation als eine zweite Methode der Euthanasie bestätigen.
- Iris Schere verwenden, um eine breite, vollständige Exzision um und unter dem Wundgebiet (ca. 1 cm im Durchmesser) zu schaffen und zu erhalten das Gewebe in 4 % Paraformaldehyd für histologische Analyse.
- Andere Analyse: Zytokin-Erkennung
- Blut von Tieren unter Narkose mit einer Kapillare Glasröhre Retro-Orbital zu sammeln und überträgt es auf EDTA-behandelten Rohre.
- Blut bei 2.000 u/min für 20 min bei 4 ° C zentrifugiert und Plasma für Zytokin-Erkennung einfrieren.
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Representative Results
Bei der Entwicklung dieses neuen Modells, beobachteten wir viele Vorteile bei der Nutzung von haarlosen SKH-1 über C57BL/6J Mäuse, die wir in der Vergangenheit benutzt haben. STZ-Injektionen normalerweise ausgesetzt Tiere erleben schrittweise Gewichtsabnahme mit den Ausbruch von Diabetes; jedoch durchgeführt in Wunde Heilung Experimente bisher von unseren Laboratorien reproduzieren von Dunn Et al.vorgestellte Modell. (2012) 9 mit C57BL/6J, drastischen Gewichtsverlust beobachtet werden (Abbildung 1). Im Gegensatz dazu wenn mit dieser Wunde Modell mit SKH-1 Mäusen ein statistisch signifikant niedriger Gewichtsverlust beobachtet (P < 0,0001, Mann-Whitney U-Test). Darüber hinaus traten keine Todesfälle in der diabetischen SKH-1 Mäusen Kohorte mit p. Aeruginosa Xen 41 Biofilme infiziert, während eine Mortalitätsrate von 40 % für C57BL/6J infizierte Mäuse in früheren Experimenten (Abbildung 2) beobachtet wurde.
Ein weiterer Vorteil der hier vorgestellte Modell ist, dass das experimentelle Verfahren für das Haar Entfernung Schritt obligatorisch für Mäuse C57BL/6J für SKH-1 Mäusen nicht erforderlich. Obwohl in unseren vorherigen Experimenten mit Mäusen, dunkelhaarige besonderes Augenmerk wurde auf Reizungen der Haut zu minimieren, ist einige Schäden zwangsläufig (Abbildung 3) aufgetreten. Der größte Vorteil bei der Nutzung von haarloser Mäusen in diesem Modell ist jedoch vor allem die Beseitigung des Problems der Haarwachstum in langfristige Wundheilung Studien beobachtet. Nach unserer Erfahrung mit Mäusen C57BL/6J Haarwachstum variiert von Tier zu Tier, aber angesichts die Langfristigkeit der Studien, es immer kam und mischte sich mit Wunde Flächenmaße oder ausgerenkt Wunde Schienen und/oder Dressings zur Deckung infiziert Wunden, was zu trocknen der Wunde (Abbildung 4).
Im SKH-1 Wunde heilende Modell nachdem Diabetes bestätigt wird, kann Chirurgie leicht ausgeführt werden um eine kreisförmige voll-dicke Wunde auf dem Rücken des Tieres zu erstellen. Die Silikon-Schiene ist an Ort durch einen medizinischen wasserfesten Hautkleber und vermeidet den direkten Kontakt von den okklusiven Verband mit der neu erstellten Wundbett (Abbildung 5).
P. Aeruginosa Xen 41 biolumineszente Biofilmen auf Polycarbonat Membranen (Abbildung 6) angebaut werden leicht und aseptisch in eine Spritze bereit für die Auslieferung an die Wunden und die beimpften Mäuse werden täglich überwacht, für klinische Anzeichen einer Infektion (Abbildung 7). Für dieses Modell haben wir zwei Phasen implementiert. In der ersten Phase nach der Inokulation des Biofilms die Wunde eine Schiene bedeckt mit einem transparenten okklusiven Dressing umgab. Dies führt zu Eiter-Ansammlung, die die Wunde verschlossen. Biofilm-haltigen Wunden wurden täglich abgebildet, mit dem in-Vivo imaging-System um Infektion Entwicklung beobachten und beurteilen Biofilm Evolution (Abbildung 8 und Abbildung 9). Biolumineszenz, als Gesamtfluss (p/s), kann mit bakterielle Dichte mithilfe einer standard-Kurve (Abbildung 10) korreliert werden.
Am Tag 8 wurden die Schiene und Verband entfernt, um die Visualisierung der Wundheilung zu ermöglichen. Biolumineszenz fällt anschließend durch den Verlust von der Umgebung der Wunde Eiter; jedoch blieb Bakterien verbunden mit der Wunde durch Histologie bestimmt. Dieser Ansatz zur Beseitigung des Verband zur Messung der Wundheilung ist bei anderen chronischen Wunden heilen Studien (REFs) verwendet worden. Verlauf der Wundheilung kann bestimmt werden, indem Sie Aufnahmen mit einer Kamera angeschlossen an ein Mikroskop (Abbildung 11).
Abbildung 1: vergleichende Prozentsatz Gewichtsverlust von SKH-1 und C57BL/6J diabetischen Mäusen. Tag Null entspricht Gewicht am Tag der letzten (5th) STZ-Injektion. n = 10 Mäuse für SKH-1 und n = 12 Mäuse für C57BL/6J. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: prozentuale Überlebensraten von SKH-1 und C57BL/6J diabetischen Mäusen nach p. Aeruginosa Xen 41 Biofilm Anwendung (Tag 1). n = 5 Mäusen für SKH-1 und n = 10 Mäuse für C57BL/6J. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Haut Risswunden verwundet in Zukunft Bereich nach der Rasur und mit Enthaarungscreme an Mäusen C57BL/6J. (A): Tag des Verfahrens; (B): 4 Tage nach der Prozedur. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: (A) C57BL/6J Maus mit einer teilweise entfernten Wunde Schiene. (B) heben die Schiene offenbart eine geheilte Wunde vollständig nachgewachsenen Haare umgeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: chirurgische Verfahren für Verwundung SKH-1 Mäusen. (A) Abgrenzung mit Biopsie-Punch; (B) die Grundzüge der Abgrenzung; (C) Verwundung abgeschlossen; (D) Anwendung von medizinischen wasserfesten Hautkleber; (E) kleben Schiene; (F) Wunde bedeckt mit okklusiven Dressing. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Vorbereitung der Biofilm-Inokulum. (A) 72 h Kolonie Biofilmen von Pseudomonas Aeruginosa Xen 41 auf Polycarbonat Membranen angebaut; (B) Messung der Biofilm mit einem syringe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: SKH-1 Diabetiker Maus 6 Tage nach der Wunde mit p. Aeruginosa Xen 41 Biofilm geimpft wurde. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 8: Überwachung der Biofilm-Infektionen durch Verfolgung Biolumineszenz Entwicklung im Laufe der Zeit bei diabetischen Mäusen SKH-1. (A) Tag der Biofilm Anwendung; (B) 5 Tage Post-Biofilm; (C) 8 Tage Post-Biofilm; (D) 12 Tage Post-Biofilm; (E) 16 Tage Post-Biofilm; (F) 20 Tage Post-Biofilm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 9: Total Flux von Wunden bei diabetischen Mäusen SKH-1 infiziert mit p. Aeruginosa Xen 41 Biofilme im Verlauf des Experiments. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 10: KBE pro Wunde mit eine Standardkurve von Biolumineszenz pro KBE mit p. Aeruginosa Xen 41 Biofilme produziert geschätzt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 11: Schliffbild Timeline von Wunden infiziert mit p. Aeruginosa Xen 41 Biofilme in diabetischen SKH-1 Maus zeigt der Verlauf der Heilung. Die Tage nach der Infektion Biofilm sind in der unteren linken Ecke von jedem Bild angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Hier beschreiben wir ein neue Mausmodell für die Untersuchung von Biofilmen bei diabetischen chronischen Wunden, das viele Vorteile um eine reproduzierbare, übersetzbar und flexible Modell zu erstellen.
Die erste Neuerung ist die Verwendung von haarlosen Mäusen. Andere Mausmodelle wurden entwickelt, um diabetische Chronische Wundheilungsstörungen10,11studieren, aber alle haben stützte sich auf die Verwendung von Haaren Mäuse, die Entfernung von Pelz von Prozessen, bei denen weder wachsen noch Haare abschneiden in Kombination mit Enthaarungscremes. Dieser Schritt ist nicht nur zeitraubend und chaotisch aber potentiell verletzt die Haut der Tiere in der Gegend, wo die Wunde platziert wird. Während haarlose Mäuse in einer Reihe von Karzinogenese Studien12,13eingesetzt wurden, wurden diese Mäuse nicht zur Biofilm Persistenz bei chronischen Wunden zu bewerten. Ein weiteres häufiges Problem gelöst, indem die Verwendung von haarlosen Tieren, vor allem in Langzeitstudien, ist Haarwachstum in das Wundgebiet, die Bewertung der Wundheilung gefährden und Bandagierung zu stören.
SKH-1 Tiere auch bewiesen zu STZ-induzierte Diabetes Typ I und im Vergleich zu den Mäusen C57BL/6J, statistisch signifikant niedriger Gewichtsverlust hatte im Verlauf des Experiments, Dosierung mit Insulin überflüssig machen. Dies ist ein besonders interessantes Merkmal, wie Behandlung mit Insulin potenziell auswirken, kann das Ergebnis der Infektion wie von Watters Et Al. (2014)14 belegt, die Zunahme von bakteriellen zählt bei Insulin-behandelten diabetischen Tieren infiziert mit beschrieben P. Aeruginosa Biofilme im Vergleich zu keine Insulin-Gegenstücke. Darüber hinaus gab es in unserem Modell, eine drastische Reduktion der Sterblichkeit in der haarlosen Kohorte, die darauf hinweist, dass die Tiere im Umgang mit der Infektion möglicherweise widerstandsfähiger sind.
Ein weiteres Merkmal dieses Modells ist die Anwendung von gemessenen vorgeformte Biofilm Inokulum Gülle, die Wunden im Gegensatz zu planktonischen gewachsenen Zellen zu infizieren. Durch die Bereitstellung einer bereits metabolisch komplexen und strukturierten Bakteriengemeinschaft auf die Wunde, die Bakterienzellen sind in der Lage, das Immunsystem zu umgehen und die unmittelbaren Auswirkungen der Biofilme auf die Läsionen ermittelt werden.
Der dritte Vorteil dieses neuen Modells Wunde ist die Verwendung eine mikrobielle Belastung Biolumineszenz, die gemessen werden kann, mit einer in-Vivo imaging-System um räumlich zu lokalisieren und zu quantifizieren die Bakterien produzieren. Dies ermöglicht Echtzeit-Tracking der Biofilm Evolution im Laufe der Zeit. P. Aeruginosa Xen 41 Stamm besitzt eine stabile Einzelkopie der p. Luminescences LuxCDABE -Operon auf dem bakteriellen Chromosom, das Ergebnisse in die konstitutive Emission von Lumineszenz, die von der äußerst sensiblen Kamera erfasst werden können in der imaging-System. Dieses Echtzeit-, nicht-invasive, in Situ -Feature ermöglicht Messung der Biofilm von Biolumineszenz, sogar während die Schiene und die Abdeckung vorhanden sind. Dieses Feature sinkt drastisch die Anzahl der Tiere pro Studie benötigt, da es keine Notwendigkeit, Tiere zu bestimmten Zeitpunkten für die Überwachung der Biofilm zu opfern. Allerdings verdeckt das Vorhandensein von Biofilm und Eiter Mess Wundheilung. In dieser Studie wir entfernt das Dressing am Tag 8 um Visualisierung der Wundheilung zu ermöglichen, aber dieser Parameter kann geändert werden, je nach Fragestellung in Angriff genommen.
Zu guter Letzt ist das Abbildungssystem Erkennung von Biolumineszenz bis zu 2,5 cm in der Tiefe, das neu vorgeschlagene Modell zu testen von antimikrobiellen Therapien sei es in Form von Gels oder Lösung oder integriert, okklusive Wundauflagen. Ein Echtzeit-monitoring-Infektionsmodell ermöglicht größere Flexibilität, die Auswirkungen der unterschiedlichen Dosierung Konzentrationen und Laufzeiten im Gegensatz zu einem statischen Endpunkt-Assay zu messen. Dieses Modell kann zur Validierung von potenziellen neuen Behandlungsmethoden zur Beseitigung von Biofilmen in chronischen Wunden beitragen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Autoren möchte der American Diabetes Association für die Unterstützung dieser Arbeit (Grant # #7-13-BS-180), der Michigan State Universität Technologie Unterstützung Forschungseinrichtung für die Bereitstellung von Ausbildung und Zugang zu den in-Vivo imaging-System und die Michigan State University Investigative Histopathologie Lab für die Verarbeitung der Maus Biopsien zur histopathologischen Untersuchung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Opsite | Smith & Nephew | Model 66000041 | Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards |
| SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr | Charles River Breeding Laboratories | SKH1 | Hairless mice, 8 weeks old |
| Streptozotocin (STZ) | Sigma Aldrich | S0130-1G | Streptozocin powder, 1g |
| AccuChek glucometer | Accu-Chek Roche | Art No. 05046025001 | ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit |
| Pseudomonas aeruginosa Xen 41 | Perkin Elmer | 119229 | Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa |
| Polycarbonate membrane filters | Sigma Aldrich | P9199 | Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size |
| Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS) | Sigma Aldrich | D8537 | PBS |
| Tryptic soy agar | Sigma Aldrich | 22091 | Culture agar |
| Meloxicam | Henry Schein Animal Health | 49755 | Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection |
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Purdue Products LP | 301879-OA | Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | AAJ61899AK | Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS |
| Capillary glass tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes |
| Silicone to make splints | Invitrogen Life Technologies Corp | P-18178 | Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets |
| Tryptic soy broth | Sigma Aldrich | 22092 | Culture broth |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| IVIS Spectrum Isolation chamber | Perkin Elmer | 123997 | XIC-3 animal isolation chamber |
| HEPA filter | Teleflex | 28022 | Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022 |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-142 | Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50. |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-140 | Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50. |
| Glucose | J.T.Baker | 1916-01 | Dextrose, Anhydrous, Powder |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | Citric Acid |
| Mastisol | Eloquest Healthcare | HRI 0496-0523-48 | Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48 |
| Corning 96-well black plates | Fisher Scientific | 07-200-567 | 96-well clear bottom black polysterene microplates |
| 25 gauge 5/8 inch needle | BD | 305122 | Regular bevel needle |
| Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath | Branson Ultrasonics | N/A | Ultrasonic Cleaner |
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