Summary
כאן נתאר מודל מאתר סוכרתית הרומן ניצול עכברים שיער ניטור בזמן אמת, לא פולשנית, זיהומים בפצע biofilm של ביולומנאסן Pseudomonas aeruginosa. בשיטה זו ניתן להתאים כדי להעריך את זיהום של אחרים חיידקים ומיקרואורגניזמים מהונדסים, כולל biofilms מינים רב, ולבדוק את היעילות של אסטרטגיות antibiofilm.
Abstract
הנוכחות של חיידקים כמו biofilms מובנית בלפצעים כרוניים, במיוחד בחולים סוכרתיים, נחשב למנוע ריפוי הפצע והרזולוציה. מודלים פצעים כרוניים העכבר שימשו כדי להבין את האינטראקציות הבסיסית בין המיקרואורגניזמים לבין המארח. המודלים שפותחו כדי תאריך מסתמכים על השימוש בבעלי חיים עם שיער ואוסף מסוף רקמת הפצע על הנחישות של חיידקים קיימא. בעוד תובנה משמעותית צבר עם מודלים אלה, הליך ניסיוני זה דורש מספר רב של בעלי חיים, הדגימה הוא זמן רב. פיתחנו מודל מאתר רומן המשלב מספר חידושים אופטימלית כדי להעריך את התקדמות biofilm לפצעים כרוניים:) הוא מנצל עכברים שיער, ומבטלת את הצורך עבור הסרת שיער; ב) מחיל את biofilms הקבועים מראש על הפצעים ומאפשר את הערכה מיידית של התמדה ותוצאה של קהילות אלה במחשב מארח; ג) מפקח על התקדמות biofilm מאת לכימות ייצור אור על ידי זן ביולומנאסן מהונדס גנטית של Pseudomonas aeruginosa, המאפשר ניטור בזמן אמת של הזיהום ובכך להפחית את מספר בעלי חיים נדרש לכל מחקר. במודל זה, פצע מלא-עומק יחיד המיוצר על גב STZ-induced בעכברים שיער סוכרתיים, מחוסן עם biofilms של המתח ביולומנאסן aeruginosa פ Xen 41. פלט אור מהפצע נרשם מדי יום אין ויוו מערכת הדמיה, המאפשר ויזואליזציה biofilm מהירה ב- vivo וב -באתרו ולוקליזציה של חיידקים biofilm שבתוך הפצעים. שיטה חדשנית זו הוא גמיש כמו זה יכול לשמש כדי ללמוד מיקרואורגניזמים אחרים, כולל מינים מהונדסים biofilms מינים רב, וייתכן ערך מיוחד בבדיקות אסטרטגיות אנטי-biofilm כולל רטבים ריטלין מיקרוביאלית.
Introduction
Biofilms הן קהילות מורכבים של מיקרואורגניזמים מוטבע בתוך מטריצה של חומרים פולימריים הודגשו כגורם תורם לפתרון המסכן לפצעים כרוניים1. המחקר של אוכלוסיות חיידקים אלה מאורגן, מתמיד חשוב במיוחד לחולי הסוכרת לאן מובילה במחזור עניים על איבריו ואת מנגנוני חישה היקפיים שינו נגעים מבלי שיבחינו2. בארצות הברית, ההערכה היא כי 15% של חולי סוכרת יפתחו כיב אחד לפחות במהלך חייהם. זה מתורגם הוצאה כלכלית של-28 מיליארד דולר טיפול3,4, שלא להזכיר את הנטל הרגשי והחברתי immensurable. הבנת הגורמים המאפשרים קהילות מיקרוביאלי להמשיך להעמיד את מיטת הפצע ואת ההשפעה ש-biofilms אלה יש באירועים הריפוי הכרחי כדי לנהוג לטיפול טוב יותר בחולים המושפעת להניע הפיתוח של גישות טיפול חדשות. לכן, הקמת לתרגום הדירים ויוו מודלים עבור חקר אינטראקציות וקרקע הוא בעל חשיבות עליונה.
מודלים מאתר פותחו בהצלחה לחקור את ההשפעה של biofilms הפצעים כרונית. מודלים אלה, עם זאת, לעיתים קרובות לנצל מינים שיער והערכת biofilm אישור מאת צלחת ספירות עבור תאים חיידקיים קיימא של רקמת נכרת מחיות שהקריבה עצמה, שהופך אותם זמן רב ויקר.
אלטרנטיבה biophotonic הדוגמאות נקודת הקצה של חיות הערכת זיהום הועלתה לראשונה על ידי Contag et al. (1995) 5 , מי שפיתח שיטה ללכידת הפריה חוץ גופית של ביולומנאסן צורונים סלמונלה typhimurium כדי למדוד את יעילות טיפול אנטיביוטי. מחקרים אחרים ניצול של חיידקים פולטי ביולומינסנציה בעקבות. לדוגמה, Rochetta et al. (2001) 6 לאמת מודל זיהום ללמוד Escherichia coli זיהומים הירך בעכברים על ידי מדידת הפריה חוץ גופית באמצעות של והחרפת תשלום מצמידים מכשיר, Kadurugamuwa מאוחר יותר, ואח. (2003) 7 ניצלו הפוטון פולטות מאפייני זן שעברו הנדסה לאחור של Staphylococcus aureus כדי לחקור את היעילות של אנטיביוטיקה מספר במודל הפצע קטטר בעכברים.
השיטה מאופיין כאן מציג פרוטוקול פשוטה לגרום סוכרת בעכברים שיער, לייצר ואת לחסן פצעים עם הקבועים מראש biofilms ביולומנאסן של פ aeruginosa, התנהגות biophotonic ניטור הזיהום באמצעות יישום ויוו מערכת הדמיה. הוא מציע ישיר, מהירה, בחיי עיר, תהליך פולשני כמותיים להערכת biofilms לפצעים כרוניים, בנוסף, מאפשרת לניתוח נוספים כגון הדמיה מיקרוסקופיים של ריפוי פצעים, איסוף דם לסירוגין במשך ציטוקין מדידות, אוסף רקמה מסוף עבור כפפות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של אוניברסיטת מישיגן.
1. הכנה של רטבים ריטלין, מפרידי סיליקון
- לחתוך את הרוטב ריטלין שקופים כדי להפוך ריבועים כ 1 ס"מ על 1 ס"מ עם מספריים.
- 10 לחתוך עיגולים מ מ על גיליון סיליקון בעובי 0.5 מ מ באמצעות 10 מ מ ביופסיה אגרוף. מרכז ביופסיה 5 מ מ אגרוף במרכז העיגול 10 מ מ ולחץ בחוזקה כדי ליצור חור לטופס " סופגניות "-כמו דיסק זה ישמש בתור סד.
2. חיות ניסוי
- שימוש בת שבוע 8 (22-26 גרם) עכברים SKH-1 זכר מ תרבית מסחרי. לשמור על עכברים בתנאים סטנדרטיים של 21 ° C ו- 12 שעות אור-כהה מחזור עם גישה חופשית מזון ומים.
- לזירוז סוכרת, להזריק עכברים intraperitonially solutionand streptozotocin (STZ) 13 מ"ג/מ"ל 25% גלוקוז (µl 250 לכל / עכבר) על 5 ימים רצופים.
- להפוך את הפתרון STZ על-ידי µg 65 המדללת של STZ ב µL 5 מ"מ חומצה ציטרית, pH 4.5-
- לכוונן את העוצמה מוזרק עבור כל עכבר למסה הסופית של 65 מ ג STZ לק"ג משקל גוף העכבר. להזריק בקרת עכברים עם 100 מ מחומצה ציטרית-פתרון-pH 4.5 באותם ימים-
- לאשר את היפרגליקמיה הדם ניטור גלוקוז עם סוכר 14 ימים לאחר הזריקה STZ האחרון. בעכברים סוכרתיים ייתכן polyuria אז מצעים שלהם ייתכן שתצטרך להשתנות בתדירות גבוהה יותר כדי למנוע רטיבות ו שלהם משקולות צריך להיות במעקב במשך 3 פעמים בשבוע.
3. Biofilms
- Biofilm הכנה
- לגדול המושבה biofilms 8 כדי לחסן את הפצעים. יומיים לפני תחילת הניתוח תרבות לילה של ביולומנאסן aeruginosa פ Xen 41 ב ציר סויה tryptic (TSB) מודגרות ב 37 מעלות צלזיוס, רועדת במהירות של 200 סל ד ולחטא פוליקרבונט מסננים קרום עם גודל הנקבוביות מיקרומטר 0.2 בחשיפה לאור אולטרא אור בשכונה בטיחות ביולוגית למשך 15 דקות בכל צד.
- יום אחד לפני הניתוח צנטריפוגה תרבות לילה ב g x 20,000 למשך 2 דקות ולשטוף 3 פעמים עם 1 מ"ל של Dulbelcco ' s פוספט buffered תמיסת מלח (DPBS) על ידי pipetting למעלה ולמטה.
- לדלל ההשעיה ב DPBS כדי ספיגת 0.05-600 nm.
- פיפטה 10 µL של התרבות מדולל על כל קרום נח על צלחת אגר (TSA) סויה tryptic. לאחר מתן אפשרות לייבוש, דגירה על הממברנות ב 35 מעלות צלזיוס במשך 72 h לגדול biofilms העברת ללוחות TSA טריים כל ה 24
- עיקול רגיל
- לפני תחילת הניסוי תעשה סיבוב סטנדרטי לתאם ספירות ביולומינסנציה ובקטריאלי.
- להכין biofilms כמתואר ב- 3.1.
- להפוך דילולים טורי של biofilms החל ½ עד 1/24 על ידי ערבוב biofilm עם DPBS ו- vortexing עד פתרון הומוגני מבחינה ויזואלית מופק. פיפטה 200µL של פתרונות מדולל שחור צלחת 96-ובכן, התמונה עם ה-ויוו מערכת הדמיה-
- התפשטה דילולים צלחת על גבי לוחות TSA, דגירה ב 35 ° C עבור 24h.
- נחשב המושבה יוצרי יחידות (CFU) על צלחות וליצור עיקול רגיל לתאם ספירות ביולומינסנציה ובקטריאלי.
4. פצע הניתוח
- לגרום הרדמה כללית באמצעות איזופלוריין ב 95% oxygen/5% CO 2 (כדי למנוע מוות של בחמצת) בספיקה של 1 ליטר/דקה ולתחזק הרדמה באמצעות 1-3% איזופלוריין. לשמור על החיות על מחצלות חום במהלך הניתוח.
- להבטיח הרפלקסים עמוק פדלים של העכבר מדוכאים על ידי התכווצות כף הרגל עם פינצטה ומקם את העכבר במצב שכיבה.
- לניהול meloxicam (0.2 מ ג/ק ג) באמצעות הזרקה תת עורית (30 μl) לניהול כאב.
- לנגב את העור של האחורי עם 10% povidone-יוד שלוש פעמים, רכיב pad אלכוהול איזופרופיל.
- להשתמש אגרוף ביופסיה 4 מ מ סטרילית חלוקה לרמות אחד בתבנית מעגלית על הפצע על צד אחד של העכבר ' קו האמצע s ברמה של הכתפיים. חלוקה לרמות את התבנית עם סמן קבוע.
- להשתמש מלקחיים משוננות כדי להרים את העור באמצע המספריים חלוקה לרמות ואיריס כדי ליצור פצע מלא-עובי המשתרע דרך רקמת השומן התת עורית כולל את carnosus panniculus בלו מעגלית פיסת הרקמה.
- להחיל דבק דבק רפואי עור עמיד למים על העור של העכברים ומקם את הסד סיליקון הפעלת לחץ מתון. לכסות את הפצע עם ההלבשה ריטלין שקוף. לאחר הניתוח, בנפרד בכלוב החיות.
5. ניהול לאחר הניתוח
- לניהול meloxicam (0.2 מ"ג/ק"ג) פעם ביום באמצעות הזרקה תת עורית לשיכוך כאבים לאחר הניתוח למשך 2 הימים.
- צג חיות מדי יום עבור גילויי כאבים וירידה במשקל. בעלי חיים סוכרתיים צריך זריקות אינסולין כאשר הם איבדו 15% או יותר של משקל הגוף-
6. הכנה Inoculum Biofilm ולדלקת
- לחסן עכברים 48 שעות לאחר הניתוח כפי שתואר בשלבים הבאים-
- לגרד 72 h biofilms של הממברנות בעזרת מרית סטרילי, למקם אותו צינור microcentrifuge ו לדלל 1:2 ב- DPBS. מיקס על ידי בקצרה pipetting למעלה ולמטה. Inoculum
- צלחת כפולה על גבי צלחות TSA לחישוב CFU הכולל. כדי להבטיח כי סעיפים מדויק, לשבור את biofilm inoculum עוד יותר על ידי סדרה של שני שלבים vortexing של 1 דקות, intercalated על ידי צעד sonication 2 דקות ב 40 קילו-הרץ בניקוי אולטראסוני.
- להסיר את כיסוי ההלבשה הפצע, סיליקון תקבע ולקחת מיקרוסקופ של הפצע עם מיקרוסקופ עם המצלמה המצורפת בעזרת סרגל לעיון.
- לחתוך את קצות 200 µL פיפטה טיפים, פיפטה 10 µL של inoculum biofilm על גבי כל אחד מהפצעים.
- העכבר תמונה באמצעות ה-ויוו מערכת באמצעות הגדרות אוטומטית הדמיה: חשיפה זמן 5-300 s, עם binning בינוני, 1 f/להפסיק, פתח מסנן שדה ראייה C (12.9 ס"מ x 12.9 ס"מ).
- המכסה פצע טרי ברוטב.
7. הפצע מדידה והדמיה
- להעריך את הסימנים הקליניים של חיות יומי 9.
- לספק מזון, מים, לשנות את הכלובים כנדרש.
- בדיקת התקינות של תחבושות מדי יום. כאשר הרוטב קיים, ניתן למדוד רק ביולומינסנציה עקב חסימה של הפצע. יום 8, רטבים יוסרו and not הוחלף המאפשר מדידה של סגירת הפצע.
- שוקל חיות בכל יום אחר.
- עבור כל הימים, מקום עכברים בנפרד בחדר בידוד החדרים מצויידים מסנן HEPA, התמונה באמצעות ה-ויוו מערכת הדמיה כל יום או כל יום אחר עד הפריה חוץ גופית ערכים ליפול מתחת לרמת הרקע.
- לאחר יום 8, זירוז הרדמה כללית ולקחת micrographs של הפצע עם מיקרוסקופ עם המצלמה המצורפת בעזרת סרגל לעיון בכל יום עד הפצעים הגלידו.
8. ניתוח היסטולוגית
- Euthanize העכברים עם זרם של 2 ל'/דקה של CO 2 המתת חסד קאמרית לאחר הפריה חוץ גופית יורד מתחת רקע רמות הפצעים הגלידו לחלוטין. לאשר את מותו על ידי נקע בצוואר הרחם כשיטה נוספת המתת חסד-
- להשתמש במספריים איריס ליצור כריתה רחבה, מלאה מסביב ותחת אזור הפצע (בערך 1 ס מ קוטר) ולשמר את הרקמה ב 4% paraformaldehyde לבדיקה היסטולוגית.
- ניתוח אחרים: זיהוי ציטוקינים
- לאסוף דם רטרו-orbitally מחיות בהרדמה באמצעות שפופרת זכוכית נימי ולהעביר אותו צינורות שטופלו EDTA.
- פלזמה לגילוי ציטוקין צנטריפוגה דם ב-2000 סל ד כעשרים דקות ב 4 ° C ומקפיאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פיתוח המודל החדש, הבחנו יתרונות רבים תוך ניצול SKH שיער-1 על C57BL/6J עכברים, שבו השתמשנו בעבר. חיות נתון STZ זריקות בדרך כלל חווים ירידה הדרגתית במשקל עם תחילת סוכרת; עם זאת, בפצע ריפוי ניסויים בעבר שנערך על ידי מעבדות שלנו לשחזר את מודל שהוצגו על ידי דן ואח. (2012) 9 באמצעות C57BL/6J, דרסטית במשקל נצפתה (איור 1). לעומת זאת, כאשר שימוש זה פצע דגם עם עכברים SKH-1 נצפתה במשקל נמוך יותר משמעותית מבחינה סטטיסטית (P < 0.0001, מבחן מאן-ויטני U). יתר על כן, מותם לא אירעה במדגם סוכרת SKH-1 עכברים נגועים biofilms פ aeruginosa Xen 41 בעוד 40% שיעורי התמותה נצפתה עבור עכברים נגועים C57BL/6J בניסויים קודמים (איור 2).
יתרון נוסף על המודל המוצג כאן הוא כי הנוהל ניסיוני עבור השלב להסרת שיער הכרחית עבור עכברים C57BL/6J אינו מיותר עבור עכברים SKH-1. למרות בניסויים הקודמים שלנו עם עכברים עם שיער תשומת לב מיוחדת ניתנה כדי למזער את גירוי לעור, נזק התרחש באופן בלתי נמנע (איור 3). ראוי לציין, אך היתרון הגדול ביותר של ניצול עכברים שיער במודל זה היא חיסול של הבעיה של re-צמיחת השיער שנצפתה ריפוי מחקרים הפצע לטווח ארוך. הניסיון שלנו עם C57BL/6J עכברים, re-צמיחת שיער מגוונות חיה חיה אבל בהתחשב באופי לטווח ארוך של המחקרים, זה תמיד אירעה התערב עם מדידות שטח הפצע או פצע פריקת סדים ו/או רטבים נהגו לכסות נגוע פצעים, פוטנציאל וכתוצאה מכך ייבוש הפצע (איור 4).
במודל ריפוי פצע SKH-1, אחרי סוכרת הוא אישר, ניתוח שניתן בקלות לבצע כדי ליצור מעגלי מלא-עובי פצע בצד האחורי של החיה. סד סיליקון נשמרים במקום על ידי דבק רפואי עור עמיד למים ולא מונע מגע ישיר מן הרוטב ריטלין עם מיטת הפצע שנוצר (איור 5).
פ aeruginosa Xen 41 biofilms ביולומנאסן גדל על ממברנות פוליקרבונט (איור 6) בקלות, גילוח ורחיצה כירורגית של העברת מזרק להיות מוכן למסירה הפצעים ואת חוסנו עכברים מנוטרים מדי יום עבור קליני סימנים של זיהום (איור 7). עבור דגם זה, נוכל ליישם בשני שלבים ברורים. בשלב הראשון, לאחר חיסון של biofilm הפצע היה מוקף על ידי סד מכוסה ההלבשה ריטלין שקוף. התוצאה היא הצטברות מוגלה זה occluded את הפצע. פצעים המכיל Biofilm היו עם תמונה מדי יום עם ה- ויוו הדמיה המערכת כדי לעקוב אחר התפתחות זיהום ולהעריך האבולוציה biofilm (איור 8 ואיור 9). ביולומינסנציה, רשמה השטף הכולל (p/s), ישויך עם צפיפות חיידקי באמצעות עיקול רגיל (איור 10).
יום 8, הוסרו סד של ההלבשה כדי לאפשר ויזואליזציה של ריפוי הפצע. ביולומינסנציה בהמשך מתנתק בשל האובדן של המוגלה סביב הפצע; עם זאת, חיידקים נשאר מזוהה עם הפצע כפי שנקבע על ידי כימיקלים. גישה זו של הסרת החבישה למדוד ריפוי הפצע יש כבר מנוצל לפצעים כרוניים אחרים ריפוי מחקרים (השופט). התקדמות ריפוי הפצע יכול להיקבע על ידי לקיחת micrographs עם מצלמה מחוברת מיקרוסקופ (איור 11).
איור 1: האחוז היחסי במשקל של SKH-1 ו- C57BL/6J בעכברים סוכרתיים. אפס יום מקביל משקל-היום האחרון (5th) STZ הזרקה. n = 10 עכברים SKH-1, n = 12 עכברים בשביל C57BL/6J. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: אחוז ההישרדות של SKH-1 ו- C57BL/6J בעכברים סוכרתיים לאחר היישום biofilm aeruginosa פ Xen 41 (יום 1). n = 5 עכברים SKH-1, n = 10 עכברים בשביל C57BL/6J. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: חתכים בעור בעתיד פצועים באזור לאחר גילוח, השימוש בקרם depilatory על C57BL/6J עכברים. (א): יום של שגרה; (B): 4 ימים לאחר ההליך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: (א) C57BL/6J עכבר עם סד הפצע שהוסר חלקית. (B) הרמת של הסד חשף פצע נרפא מוקף שיער בוגר לגמרי מחדש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: הליך כירורגי ופצע עכברים SKH-1- (א) התיחום עם ביופסיה אגרוף; (B)-מונחים להבחנה; (ג) ופצע הושלמה; (ד) יישום של דבק רפואי עור עמיד למים; סד הדבקה (E); הפצע (F) מכוסה ברוטב ריטלין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: הכנת inoculum biofilm. (א) 72 h biofilms המושבה של Xen Pseudomonas aeruginosa 41 גדל על פוליקרבונט ממברנות; (B) מדידה של biofilm באמצעות syrinג ' נרל אלקטריק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7: SKH-1 סוכרת העכבר 6 ימים לאחר הפצע היה מחוסן עם biofilm aeruginosa פ Xen 41. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 8: פיקוח של biofilm זיהום על-ידי מעקב אחר התפתחות ביולומינסנציה לאורך זמן בעכברים סוכרתיים SKH-1- היום (א') של היישום biofilm; פוסט 5 ימים (B)-biofilm; (ג) 8 ימים פוסט-biofilm; פוסט 12 ימים (D)-biofilm; פוסט 16 ימים (E)-biofilm; (F) 20 ימים פוסט-biofilm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 9: סך השטף מפצעי בעכברים סוכרתיים SKH-1 נגוע biofilms פ aeruginosa Xen 41 במהלך הניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 10: המשוער CFU הפצע באמצעות עיקול רגיל של ביולומינסנציה לכל CFU מיוצר עם biofilms פ aeruginosa Xen 41. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 11: ציר הזמן Micrograph של פצעים נגועים aeruginosa פ Xen biofilms 41 סוכרתית עכבר SKH-1 מציג את התקדמות הריפוי. הימים לאחר זיהום biofilm יצוינו בפינה השמאלית התחתונה של כל תמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן נתאר מודל עכבר חדש לחקר biofilms סכרת הפצעים כרונית בעלת יתרונות רבים כדי ליצור מודל גמיש, לתרגום הדירים.
החידוש הראשון הוא השימוש של עכברים חסרי־השיער שמסתובבים באזור. דגמים אחרים העכבר פותחו כדי ללמוד סוכרת פצע כרוני ריפוי10,11, אבל כולנו צריכים לסמוך על השימוש של עכברים עם שיער המצריך ההסרה של פרווה על-ידי תהליכים המערבות או שעווה או מסיכה לשיער בשילוב עם קרמים depilatory. שלב זה הוא לא רק זמן רב מבולגן, אבל פוטנציאל פצעה את העור של בעלי החיים באזור שבו יוצב על הפצע. בעוד עכברים שיער השתמשו בסדרה של carcinogenesis מחקרים12,13, עכברים אלה לא שימשו כדי להעריך את ההתמדה biofilm הפצעים כרונית. עוד בעיה נפוצה נפתרה על ידי שימוש שיער בעלי חיים, במיוחד במחקרים לטווח ארוך, הוא שיער מחדש את הצמיחה באזור הפצע, אשר עלול לסכן את הערכה של ריפוי הפצע ולשבש אורטופדיה.
SKH-1 הוכיח גם נוטה STZ-induced סוג של סוכרת ובעלי החיים, בהשוואה C57BL/6J עכברים, הייתה ירידה במשקל נמוך יותר משמעותית מבחינה סטטיסטית במהלך הניסוי, ביצוע מינון עם אינסולין מיותרים. זוהי תכונה מעניינת במיוחד טיפול עם אינסולין עשויה להשפיע על תוצאות הזיהום כעדות על ידי ווטרס et al. (2014)14 שתיאר עלייה ספירת חיידקים שטופלו אינסולין סוכרת בעלי חיים נגועים Aeruginosa פ biofilms בהשוואה לעמיתיהם ללא אינסולין. בנוסף, המודל שלנו, היתה ירידה דרסטית בשיעורי התמותה במדגם שיער המציין כי החיות הן פוטנציאל גמיש יותר בהתמודדות עם זיהום.
תכונה נוספת של מודל זה הוא היישום של slurry inoculum נמדד biofilm הקבועים מראש כדי להדביק את הפצעים בניגוד פלנקטוניים תאים בוגרים. על-ידי מסירת הקהילה חיידקי כבר סמויה מורכבת ומובנים על הפצע, תאי חיידקים מסוגלים להתחמק ממערכת החיסון ועל השפעת biofilms מיידית על נגעים יכול להיקבע.
היתרון השלישי של המודל הפצע החדש הוא השימוש של זן חיידקים מסוגל לייצר ביולומינסנציה שניתן למדידה עם של ויוו מערכת כדי להתאים לשפה ולכמת את החיידקים במרחב הדמיה. דבר זה מאפשר מעקב בזמן אמת אחר biofilm אבולוציה לאורך זמן. המתח Xen 41 פ aeruginosa מחזיק יציב עותק יחיד של אופרון luminescences פ luxCDABE בכרומוזום החיידק שתוצאתו הפליטה המכונן של הפריה חוץ גופית, אשר יכול להיות בשבי את המצלמה לאולטרה רגישות במערכת דימות. תכונה זו בזמן אמת, לא פולשנית, בחיי עיר מאפשרת מדידה של biofilm מאת ביולומינסנציה אפילו בזמן סד ולכסות נמצאים במקום. תכונה זו פוחתת באופן דרסטי את מספר בעלי החיים זקוקים לכל המחקר, כפי שאין צורך להקריב חיות בנקודות זמן מסוימות לניטור biofilm. עם זאת, הנוכחות של biofilm ומוגלה occluded ריפוי הפצע מדידה. במחקר זה, הסרנו את הרוטב-יום 8 כדי לאפשר ויזואליזציה של ריפוי הפצע, אבל פרמטר זה יכול להיות שונה בהתאם השאלות נותרים ללא מענה.
לבסוף, כמו מערכת ההדמייה היא מסוגלת לאתר ביולומינסנציה עד 2.5 ס מ לעומק, הדגם החדש המוצע הוא לבצע בדיקה של טיפולים מיקרוביאלית בין אם בצורת פתרון או ג'לים או incorporated כדי רטבים ריטלין. מודל ניטור זיהום בזמן אמת מאפשר יותר גמישות רבה יותר למדוד את השפעת ריכוזים שונים מינון ומשכי בניגוד assay מובילים סטטי. מודל זה יכול לתרום האימות של טיפולים חדשניים פוטנציאליים כדי למגר biofilms הפצעים כרונית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
המחברים רוצה להודות האגודה האמריקנית לסוכרת לתמיכה עבודה זו (גרנט # #7-13-BS-180), מישיגן סטייט אוניברסיטת טכנולוגיה תמיכה במתקן המחקר למתן הכשרה וגישה אל ה- ויוו מערכת הדמיה ו מישיגן המדינה אוניברסיטת חקירה Histopathology מעבדה לעיבוד והביופסיות העכבר לבדיקה histopathological.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Opsite | Smith & Nephew | Model 66000041 | Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards |
| SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr | Charles River Breeding Laboratories | SKH1 | Hairless mice, 8 weeks old |
| Streptozotocin (STZ) | Sigma Aldrich | S0130-1G | Streptozocin powder, 1g |
| AccuChek glucometer | Accu-Chek Roche | Art No. 05046025001 | ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit |
| Pseudomonas aeruginosa Xen 41 | Perkin Elmer | 119229 | Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa |
| Polycarbonate membrane filters | Sigma Aldrich | P9199 | Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size |
| Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS) | Sigma Aldrich | D8537 | PBS |
| Tryptic soy agar | Sigma Aldrich | 22091 | Culture agar |
| Meloxicam | Henry Schein Animal Health | 49755 | Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection |
| 10% povidone-iodine (Betadine) | Purdue Products LP | 301879-OA | Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case |
| 4% paraformaldehyde | Fisher Scientific | AAJ61899AK | Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS |
| Capillary glass tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes |
| Silicone to make splints | Invitrogen Life Technologies Corp | P-18178 | Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets |
| Tryptic soy broth | Sigma Aldrich | 22092 | Culture broth |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| IVIS Spectrum Isolation chamber | Perkin Elmer | 123997 | XIC-3 animal isolation chamber |
| HEPA filter | Teleflex | 28022 | Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022 |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-142 | Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50. |
| Biopsy punches | VWR International Inc | 21909-140 | Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50. |
| Glucose | J.T.Baker | 1916-01 | Dextrose, Anhydrous, Powder |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C2404-100G | Citric Acid |
| Mastisol | Eloquest Healthcare | HRI 0496-0523-48 | Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48 |
| Corning 96-well black plates | Fisher Scientific | 07-200-567 | 96-well clear bottom black polysterene microplates |
| 25 gauge 5/8 inch needle | BD | 305122 | Regular bevel needle |
| Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath | Branson Ultrasonics | N/A | Ultrasonic Cleaner |
References
- James, G. A., et al. Biofilms in chronic wounds. Wound Repair Regen. 16 (1), 37-44 (2008).
- Gordois, A., Scuffham, P., Shearer, A., Oglesby, A., Tobian, J. A. The health care costs of diabetic peripheral neuropathy in the US. Diabetes Care. 26 (6), 1790-1795 (2003).
- Reiber, G. E., McDonell, M. B., Schleyer, A. M., Fihn, S. D., Reda, D. J. A comprehensive system for quality improvement in ambulatory care: assessing the quality of diabetes care. Patient Educ Couns. 26 (1-3), 337-341 (1995).
- Driver, V. R., Fabbi, M., Lavery, L. A., Gibbons, G. The costs of diabetic foot: The economic case for the limb salvage team. J Vasc Surg. 52 (Suppl 3), 17S-22S (2010).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).
- Rocchetta, H. L., et al. Validation of a noninvasive, real-time imaging technology using bioluminescent Escherichia coli in the neutropenic mouse thigh model of infection. Antimicrob Agents Chemother. 45 (1), 129-137 (2001).
- Kadurugamuwa, J. L., et al. Rapid direct method for monitoring antibiotics in a mouse model of bacterial biofilm infection. Antimicrob Agents Chemother. 47 (0066-4804), 3130-3137 (2003).
- Anderl, J. N., Franklin, M. J., Stewart, P. S. Role of antibiotic penetration limitation in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin. Antimicrob Agents Chemother. 44 (7), 1818-1824 (2000).
- Morton, D. B. A systematic approach for establishing humane endpoints. ILAR J. 41 (2), 80-86 (2000).
- Dunn, L., et al.
- Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge - a model for the study of chronic wounds. Wound Repair Regen. 18 (5), 467-477 (2010).
- Holley, A. K., Xu, Y., Noel, T., Bakthavatchalu, V., Batinic-Haberle, I., St. Clair, D. K. Manganese superoxide dismutase-mediated inside-out signaling in HaCaT human keratinocytes and SKH-1 mouse skin. Antioxid Redox Signal. 20 (15), 2347-2360 (2014).
- Abbas, S., Alam, S., Pal, A., Kumar, M., Singh, D., Ansari, K. M. UVB exposure enhanced benzanthrone-induced inflammatory responses in SKH-1 mouse skin by activating the expression of COX-2 and iNOS through MAP kinases/NF-ĸB/AP-1 signalling pathways. Food Chem Toxicol. 96, 183-190 (2016).
- Watters, C., Everett, J. A., Haley, C., Clinton, A., Rumbaugh, K. P. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms. Infect Immun. 82 (1), 92-100 (2014).
