Summary
En cell kultur modell av motstånd artärer beskrivs, vilket möjliggör dissektion av signalering vägar i endotel, glatt muskulatur, eller mellan endotel och glatt muskulatur (myoendothelial korsningen). Selektiv tillämpning av agonister eller protein isolering, elektronmikroskopi eller immunofluorescens kan utnyttjas med hjälp av denna cell kultur modell.
Abstract
Myoendothelial korsningen (MEJ), en unik signalering microdomain i liten diameter motstånd artärer, uppvisar lokalisering av specifika proteiner och signalering processer som kan styra kärltonus och blodtryck. Eftersom det är en projektion från antingen cellen endotelceller eller glatt muskulatur, och på grund av dess liten storlek (i genomsnitt, ett område med ~ 1 µm2), MEJ är svåra att studera i isolering. Vi har emellertid utvecklat en cell kultur modell som kallas vaskulär samtidig cellkulturen (VCCC) som möjliggör i vitro MEJ bildandet, endotelceller polarisering och dissektion av signalering proteiner och processer i kärlväggen av motstånd artärer. VCCC har en mängd applikationer och kan anpassas till olika celltyper. Modellen består av två typer av celler som odlas på motsatta sidor av ett filter med 0,4 µm porer där den i vitro MEJs kan bilda. Här beskriver vi hur du skapar VCCC via plätering av celler och isolering av endotelceller, MEJ, och glatt muskulatur fraktioner, som sedan kan användas för protein isolering eller aktiviteten analyser. Filtret med intakt cell lager kan vara fast, embedded och sektionerad för Immunofluorescerande analys. Många av upptäckterna från denna modell har allt bekräftats med intakt motstånd artärer, vilket understryker dess fysiologiska betydelse.
Introduction
I liten diameter motstånd artärer avskiljer en tunna intern elastisk lamina (IEL) endotelceller (EG) och glatta muskelceller (SMC). Cellerna kan projektet genom hål i denna elastiska matris och göra direkta cytoplasmiska anslutningar via gap junction kanaler1,2. Denna unika struktur som kallas myoendothelial korsningen (MEJ). MEJ är en liten (cirka 0,5 µm x 0,5 µm, beroende på vaskulär sängen), cellulär projektion består huvudsakligen av endothelial celler men kan härröra från glatt muskulatur samt3,4. Ett antal utredare har visat enorma komplexitet signalering nätverk som sker selektivt på det MEJ, gör den ett särskilt viktigt läge för att underlätta dubbelriktad signalering mellan endotel och glatt muskulatur5 ,6,7,8,9,10.
En mekanistisk dissekering av signalvägar vid MEJ är dock svårt i en intakt artär. Eftersom MEJ är en cellulär projektion, är det inte för närvarande möjligt att isolera en i vivo MEJ från kärlväggen. Därför utvecklades till VCCC modell1 . Ännu viktigare, VCCC replikerar fysiologiska endothelial morfologi11 och polarisering av signalering mellan den apikala och MEJ delar av cellen12. Det var denna unika modell som underlättat upptäckten att alfa hemoglobin är i endothelial cellen, polariserade till MEJ. Detta är i motsats till konventionellt odlade endotelceller som inte uttrycker alfa hemoglobin13. För forskares mikrovaskulära endotelet, kan det lämpligare att använda endotelceller som har varit odlade i VCCC, särskilt om avsikten är att dissekera signalvägar som förekommer i liten diameter motstånd artärer.
Med en robust plastinsats som innehåller ett filter med liten diameter porer (0,4 µm i diameter) till samtidig kultur två distinkta celltyper hindrar cellerna från att migrera mellan lager. Det resulterar i en 10 µm avståndet mellan cellerna, vilket är betydligt längre än i vivo, men fortfarande replikerar många egenskaper i vivo MEJs, inklusive protein lokalisering och andra messenger signalering1 , 14. VCCC kan dessutom för inriktning av cell typspecifika signalering via tillägg av en agonist eller antagonist till den specifika mobilfack. Till exempel lastning EG med BAPTA-AM till kelat kalcium och stimulera SMC med fenylefrin14. I motsats till andra beskrivningar av samtidig kultur modeller15,16,17,18,19,20,21ger detta instruktioner om isolera de olika fraktionerna för mRNA och protein, inklusive den distinkta MEJ fraktionen inom filter porerna. Tillägg av denna teknik till VCCC möjliggör specifika undersökningar av förändringar i mRNA lokalisering eller transkription22, protein fosforylering12,23och protein aktivitet12. Denna artikel kommer att beskriva plätering av EG ovanpå filtret och SMC på botten, även om det är möjligt att kultur de två celltyper i olika konformationer11,18,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. plätering celler för VCCC
- kultur stora 225 cm 2 kolvar EG och SMC under sterila förhållanden vid 37 ° C, tills 70-90% konfluenta. Säkerställa att används mer EG än SMC; Om du använder primära mänskliga EG och SMC, vanligtvis 3 stora kolvar i EG till 1 stor kolv av SMC.
- Använda primära celler på lägre passager och Använd inte förbi passagen 10. Välja kultur media utifrån celler vara tillsammans odlade. För primära mänskliga kranskärl EG, använda EBM-2 EG basala media med EGM2 MV tillväxtfaktorer. För primära mänskliga koronar SMC, använda SmBM SMC basala media med SmGM-2 tillväxtfaktorer. Före användning med odlade celler, lägga till tillväxtfaktorer i media.
- Konstruktion av VCCC dag 1: Spraya stora (150 mm) petriskålar och lock med desinfektionsmedel (t.ex., Cavicide) och torka bort med en pappershandduk eller luddfria servetter. Sedan spraya Petriskålarna med 70% etanol (EtOH) och placera dem i huven att luften torr.
- Öppna plätera av filter skär (se Tabell för material) under sterila förhållanden och bestryka den SMC sidan (nedtill på filtret) av insatsen med Fibronektin lösning. Att hålla skäret i den medföljande 6-väl-plattan, Pipettera Fibronektin lösningen genom sidan slitsar till botten av plattan, att se att den nedre hälften av filtret är täckt (mer än 1 mL).
- Efter 30 min behandling med Fibronektin lösning vid rumstemperatur i cell kultur huven, ta skär ur plattan, vakuum någon överflödig lösning och Invertera, placera i botten hälften av ren petriskål. Ställ åt sidan. Glöm inte att störa infoga filtermembranet när sugning överflödig lösning; Detta kan undvikas genom att försiktigt luta plattan, och dammsugning lösningen utanför kanten på skäret.
- Trypsinize en 225 cm 2 kolv av SMC med 3 mL före värmde 2 X Trypsin-EDTA-lösning, och när cellerna har lyfte plattan, lägga till 9 mL SMC media att neutralisera trypsin (3:1, media: trypsin). Överföra till ett koniskt rör, blanda väl och Pipettera 10 µL till en hemocytometer att bestämma antalet celler.
- Räkna antalet celler i 5 x 5 rutor (dvs. 18), multiplicera detta med 10 000 för att få antalet celler i 1 mL (180 000). Multiplicera sedan med 12 mL (totala mängden cellsuspension, 2,16 miljoner SMC). Säkerställa att det finns tillräckligt SMC att plattan önskat antal brunnar.
Obs: till exempel 1 väl bör ha 75.000 SMC och därmed 18 brunnar skulle ha 1,35 miljoner totala SMC. Dela 1,35 miljoner celler behövs av 180 000 celler per 1 mL och detta resulterar i 7,5 mL cellsuspension som kommer att behövas för plätering. Sedan beräkna den slutliga volymen som behövs (18 brunnar x 750 µL = 13,5 mL). Således ta 7,5 mL cellsuspension, föra volymen upp till 13,5 mL före värmde SMC medier och blanda väl.
- Räkna antalet celler i 5 x 5 rutor (dvs. 18), multiplicera detta med 10 000 för att få antalet celler i 1 mL (180 000). Multiplicera sedan med 12 mL (totala mängden cellsuspension, 2,16 miljoner SMC). Säkerställa att det finns tillräckligt SMC att plattan önskat antal brunnar.
- Plattan 750 µL cellsuspension innehållande cirka 75.000 SMC på undersidan av varje filter, var noga med att inte spilla någon av media och cell lösningen. Placera locket på toppen och noggrant överföra petriskål med skär in i inkubatorn vid 37 ° C över natten.
Obs: Optimal cell densiteten för andra celltyper behöver bestämmas empiriskt. - Dag 2, Fyll ren 6-bra rätter med 2 mL färsk, pre värmde SMC media. Ta bort plattorna från inkubatorn. Ta skären ut en i taget och ta bort media genom sug, sedan placera in 6-väl skålen med SMC media.
- Coat den motsatta sidan av filtret (EG sida) med 1 mL av en lösning 0,5% bovint gelatin under minst 30 minuter vid 37 ° C.
- Trypsinize de 225 cm 2 flask(s) i EG med 3 mL före värmde 2 X Trypsin-EDTA (10 x utspätt i sterila Dulbecco ' s PBS) lösning med mild avlyssning av kolven för att lyfta cellerna utanför plattan.
Obs: Det kan vara nödvändigt att placera kolven tillbaka in i inkubatorn vid 37 ° C i 1-3 min.- En gång cellerna har lyfte plattan, lägga till 9 mL EG media att neutralisera trypsin (3:1). Överföra till en konisk tube, pool tillsammans, blanda väl och Pipettera 10 µL till en hemocytometer att bestämma antalet celler.
- Räkna antalet celler i 5 x 5 rutor (dvs 60), multiplicera detta med 10 000 för att få antalet celler i 1 mL (600.000). Multiplicera sedan med 12 mL (totala mängden cellsuspension, 7,2 miljoner EG). Säkerställa att det finns tillräckligt EG till tallrik önskat antal brunnar.
Anmärkning: Cirka 360.000 EG behövs per brunn. Till exempel kräva 18 brunnar 6,48 miljoner EC. Dela 6,48 miljoner celler behövs av 600.000 EG per 1 mL och detta resulterar i 10,8 mL cellsuspension som kommer att behövas för plätering. Sedan beräkna den slutliga volymen som behövs (18 brunnar x 1 mL = 18 mL). Således ta 10,8 mL cellsuspension, föra volymen upp till 18 mL med pre värmde EG media och försiktigt Omsuspendera.
- Räkna antalet celler i 5 x 5 rutor (dvs 60), multiplicera detta med 10 000 för att få antalet celler i 1 mL (600.000). Multiplicera sedan med 12 mL (totala mängden cellsuspension, 7,2 miljoner EG). Säkerställa att det finns tillräckligt EG till tallrik önskat antal brunnar.
- En gång cellerna har lyfte plattan, lägga till 9 mL EG media att neutralisera trypsin (3:1). Överföra till en konisk tube, pool tillsammans, blanda väl och Pipettera 10 µL till en hemocytometer att bestämma antalet celler.
- Tallrik 1 mL 360.000 EG på ovansidan av varje infoga filter. Låt cellerna Inkubera ostört vid 37 ° C under 24 h. Ersätt medium på dag 4. Skörd på dag 5.
2. Skörda fraktioner från VCCC
- utföra isoleringen i ett rum med 4 ° C och hålla alla instrument på ice.
- Tänk på antalet enskilda skär isoleras och lägga lyseringsbuffert till en 50 mL tub märkt MEJ (för isolerade filtren). Sedan etikett två 10 mm rätter; en för EG och en för SMC.
- Justera volymen lyseringsbuffert beroende på hur koncentrerad den lysate behöver vara, för 15 infogar, 500 μl lyseringsbuffert för MEJ röret och 250 µL per petriskål rekommenderas.
- Arbete med en 6-well platta med skär i taget. Sug bort mediet i cell kultur huven och sedan transport till ett kallt rum på ice.
Obs: Följande instruktioner är för 1 Infoga isolering. - Pipettera 10 µL av 1 x PBS på SMC sidan av skäret.
- Använd cellen lyften att skrapa ner celler till ena änden av insatsen, och överför cellerna från lyften till SMC petriskål som har lyseringsbuffert i den.
- När cellen lyften har berört lyseringsbuffert i skålen, låt inte det röra filtret infoga tills det har varit helt torkas och torkat bort på hushållspapper. Upprepa det skrapning av SMC filtret minst en till två gånger att helt ta bort den återstående SMC cellfragment.
- Sätt infoga över och Pipettera 10 µL av 1 x PBS i övre/EG sidan av filtret infoga. Upprepa steg 2.6 och 2.7 med en cell skrapa och EG petriskål.
- Samla återstående cell och PBS flytgödsel från EG sida av filtret med en pipett och överföring till EG petriskål med lyseringsbuffert. Vara mycket noggrann i skrapning cellerna av båda sidor av filtret att lämna minimal EG/SMC kontaminering i MEJ fraktionen.
- Noga använda en skalpell skära ut filtret från plastinsats. Gör detta genom styckning 70-80% av det från plasten och använda pincett för att dra filtret helt off plastinsats struktur. Placera filtret i 50 mL koniska röret MEJ med lyseringsbuffert och att den sitter i lyseringsbuffert och är fortfarande våt.
- Upprepa isolering steg, i grupper om 6, tills alla skären har bearbetats.
- Se till att olika behandlingsgrupperna hålls i separata rör och rätter.
- Vortex 50 mL MEJ koniska röret på full styrka för 15 s eller tills blandas väl. Ta bort filter från den koniska MEJ med pincett, dra dem längs sidoväggarna av röret att lämna den maximala mängden proteiner och vätska i röret. Efter denna punkt kassera filtren.
- När alla filter har tagits bort från MEJ koniska röret, gör en snabb spinn (10-15 s vid max hastighet ~ 16 000 x g) i en centrifug att dra alla vätska och proteiner till botten av röret. Överför innehållet i MEJ röret och EG och SMC Petri rätter till separata, mindre centrifugrör.
- Tillval: Sonikera innehållet i MEJ/SMC/EG rören på inställning 4 för tre 10 s pulser på is eller homogenisera försiktigt för hand.
- Centrifugera vid max hastighet (~ 16 000 x g) 15 min vid 4 ° C. Pipettera ut supernatanten och assay den lysate för proteininnehåll som använder metoden bicinchoninic assay.
3. Skörd på VCCC för En Face immunofluorescens
- på dag 5 av VCCC inkubation, ta bort skären från inkubatorn. Arbetar i cell kultur huven, sug från SMC media från alla lägre brunnarna på Infoga filter och skölj två gånger med 1 x PBS. Upprepa med EG.
- Att hålla skären intakt och i plattan, tillsätt 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) för 10-20 min i en walk-in 4 ° C rum på en mild shaker. Tvätta båda sidor av filtret infoga med 1 x PBS för 5 min och upprepa två gånger.
FÖRSIKTIGHET: PFA är giftigt och måste hanteras försiktigt. - Utför de blockerande, primär och sekundär antikropp inkubationer i plattan, att säkerställa att båda sidor av filtret hålls i antikroppen + blockering lösning (9 mL PBS, 25 µL Triton X100, 50 mg bovint serumalbumin, 500 µL normalt serum)
- Att montera filtret på en bild, cut filtret ur plast insatsen med en skalpell monterad på ett handtag och plats på ett objektglas med monteringsmedium.
4. Skörd på VCCC för tvärgående immunofluorescens
- på dag 5 av VCCC inkubation, ta bort skären från inkubatorn. Sug av media från båda sidor av filtret infoga i cell kultur huven och skölj varje sida av filtret två gånger med 1 x PBS.
- Att hålla skären intakt och i 6-väl plattan, tillsätt 4% PFA och inkubera över natten i en walk-in 4 ° C rum på en mild shaker.
FÖRSIKTIGHET: PFA är giftigt och måste hanteras försiktigt.
5. Inbäddning av VCCC för tvärgående immunofluorescens
- efter filter skär har åtgärdats ungefärligt för 24 h i 4% PFA, överföring till 70% EtOH under minst 24 h, men upp till flera veckor.
- Bearbeta filter på en lång (över natten) kör på en automatiserad vävnadsprocessor. Använda programmet enligt följande: 70% EtOH för 30 min, 85% EtOH 30 min, 95% EtOH 30 min, 100% EtOH 30 min, 100% EtOH 45 min, 100% EtOH 45 min, xylen 30 min, xylen 30 min, xylen 45 min, 60 ° C paraffin 30 min, 60 ° C paraffin 30 min , 60 ° C paraffin 45 min.
- Efter bearbetning, överföra de skördade filter till inbäddning stationen i flytande paraffin, hålla filtret i kassett.
- Ta bort filtret från kassett, försiktigt med pincett för att hålla den precis vid kanten. Med sax, halvera filtret, bildar två semi cirkulär formade halvor. Lay varje av de 2 halvorna på den kalla platta delen av inbäddning stationen bara länge nog att fylla för inbäddning mögel med flytande paraffin.
- En gång fyllt med flytande paraffin, mycket kortfattat touch inbäddning mögel till kalla plattan och sedan bädda in varje halva av filtret i inbäddning mögel (skära sida), Detta säkerställer att vid snittning, man kommer att skära från mitten av filtret mot kanten .
- Under inbäddning, använda pincett för att hålla filtret för att förhindra att halvorna hamnar i varandra tills paraffinet är cool nog för dem att stå ensam. Flytta inbäddning mögel på en kall tallrik tills helt stelnat.
Obs: Kylning block på isbrickor hjälper till att förebygga rynkig sektioner.
6. Snittning och färgning på VCCC för tvärgående immunofluorescens
- för paraffinblock snittning och skjut montering: skär 5 µm sektioner, placera avsnitten till 42 ° C vattenbad och plocka upp avsnitten med positivt laddade diabilder. Sedan hålla presentationer över natten i en 42 ° C ugn torka.
- Innan du börjar stegen rehydrering, baka bilderna vid 60 ° C att smälta paraffinet och hjälpa följer avsnitten VCCC till bild. Svalna kort, sedan rehydrera bilderna genom två ändringar av xylen, 100% EtOH, 95% EtOH, en förändring av 70% EtOH och två ändringar av destillerat vatten.
- Undvika antigen retrieval metoder som involverar mikrovågsugnen eller värme som sektioner kan falla utanför bilden.
- Utför standard blockering för 1 h i rumstemperatur, sedan den natten inkubationen med primära antikroppen vid 4 ° C, följt av tvättning steg och sekundär antikropp för 1 h i rumstemperatur. Montera med montering media och täckglas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De filter skär som används för VCCC har små, 0,4 µm hål. Figur 1A, en sv ansikte syn på den VCCC filter infällt, visar porerna där MEJ kan bildas i vitro. Schematiskt skildrar glatta muskelceller pläterade på den nedre sidan av filtret en dag innan endotelceller är pläterade på motsatta sidan (figur 1B). När cellerna är förgylld, kan EG, MEJ och SMC fraktioner vara isolerade tre dagar senare. Ett exempel på detta visas i figur 2A, där plasminogen aktivator inhibitor 1 (PAI-1) uttrycks mycket i MEJ fraktionen i förhållande till resten av gemenskapen och ses också i vivo MEJs25. Dessa data visar nyttan av VCCC i går igenom intakt arteriolär blodet kärlväggen.
Nästa demonstreras VCCC immunofluorescens och elektronmikroskopi. VCCC lämnas intakt och fast med PFA för tvärgående immunofluorescens. Figur 3A visar glatt muskulatur specifika alfa-1 adrenerga receptorn och endotel specifika bradykinin receptorn. Phalloidin färgning av F-aktin visar aktin broarna i MEJ (vit pil) mellan de två cellerna, som replikerar uttrycket sett i en intakt artär26. I figur 3Bdemonstreras ett tvärsnitt av VCCC som ses av transmissionselektronmikroskopi, som återges i 3D i figur 3 c. Dessa vyer av VCCC Visa förmåga att lokalisera specifikt proteiner, receptorer och ultrastruktur till in vitro- MEJs.
Figur 1: plätering av vaskulära samarbete cellkultur (VCCC). (A) En face ljus Mikrograf av porerna i filtret infoga. Svarta pilar beteckna enskilda hål. (B) Schematisk bild av plätering på VCCC. Dag 1 visar inversion av filtret infoga och plätering SMC på botten. Dag 2, EG är pläterade på motsatt sida av filtret och VCCC förblir i detta konformation i en 6-well platta till skörd. Vita pilar visar sidan av filtret där cellerna är förkromad och kommer att växa. Skalstapeln = 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: Protein anrikning i MEJ. (A) Immuno-överföring elektronmikroskop bild av mus artär med uttryck av alfa-globin på MEJ (guld pärlor som visas som svarta prickar). (B) Western blot visar plasminogen aktivator inhibitor 1 (PAI-1) uttryck är berikad i MEJ fraktionen kontra EG eller SMC fraktioner. Plast EG anger EG odlas på en plast maträtt, som utgör inte MEJ. Skalstapeln = 1 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: tvärgående immunofluorescens och elektronmikroskopi i tvärgående delar av VCCC. (A) färgningen för muskulatur och endotel specifika proteiner. F-aktin färgning är hela både celltyper och in vitro- MEJ (vit pil). Ett exempel på elektronmikroskopi som används för att studera ultrastruktur i vitro MEJs både i 2D (B) och 3D (C),. Skalstapeln = 10 µm (A). 2,5 µm (B). och cirka 2,5 µm vertikala och 0,5 µm horisontella (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
VCCC har ett antal fördelar i form av går igenom MEJs i vitro, men det finns diskussionspunkterna vid fastställandet av om VCCC kan utnyttjas för specifika program. Till exempel om olika celltyper ska användas med denna modell, kommer att det behöva optimeras. Vi har använt primära mänskliga celler men det är möjligt att isolera cellerna från nötkreatur artärer24eller vildtyp eller knockout möss, och använda dem i VCCC1,5,14.
Om du använder VCCC för MEJ isolering, är den viktigaste tekniken att bemästra grundlig skrapning av filtret för att säkerställa att renheten i bråket som MEJ inte ändras av överskjutande endotelceller eller muskulatur celler. Vi har visat via Western blotting att alfa hemoglobin är den bästa markören i en ”ren” MEJ isolering13, som det starkt bör uttryckas i MEJ fraktionen kontra endotelceller fraktionen. En annan är PAI-1, som reglerar bildandet av MEJ (figur 2)25. Vi anser att dessa kan vara speciellt bra markörer för en robust MEJ isolering. För extra förtroende i skörden tekniken, kan filtren hålls efter skrapningen för skörd, och färgas för EG/SMC markörer25.
Imaging proteinuttryck i VCCC kan utföras på två sätt: sv ansikte (figur 1A) eller tvärgående (figur 3). Båda preparat möjliggör visualisering av proteiner inom hålen i filtret från två olika perspektiv. Sv ansikte tekniken innebär artärer som skärs öppna längdriktningen och sedan fästa sig platt, med EG uppåt, för att visualisera både den EG enskiktslager och hålen i IEL, den enda plats där MEJ kan bilda. En fluorescerande signal inom hålen i IEL anger lokalisering av proteinet inom MEJ10,27. Samma princip kan översättas till VCCC imaging den EG enskiktslager från ovan, utan att behöva bädda in det i paraffin eller göra sektioner. Tvärgående metoden är mer komplicerat att bemästra men är kritiska för tydlig visualisering av proteiner i EG kontra de SMC enskiktslager (figur 3).
Avsaknaden av flödet eller stretch i systemet är en potentiell begränsning, men det är möjligt att lägga till flödet i en endothelial-smidig muskel cell samarbete kultur16,19. Det verkar att de statiska förhållandena som fortfarande tillåter för fysiologiskt korrekt proteinuttryck och aktivering, så det kan vara att den heterocellular kontakten är den viktigaste faktorn i dissekering av MEJ signalering vägar.
I området i närheten finns det flera tillämpningar av denna teknik utöver motstånd artär signalering som VCCC inte är nödvändigtvis begränsat till specifika celltyper. Andra co kultur-modeller har utnyttjas utväxt endotelceller och osteoblaster17, eller modelleras blod-hjärnbarriären med endothelial och pericyt/Astrocyten kulturer tillsammans21. Metastas av tumörceller genom endotelet kan också kvantifieras med hjälp av denna modell21. Det är också möjligt att odla cellerna på filtret och kultur en annan cell skriver i botten av skålen 6-väl att testa parakrin signalering eller växa endotelceller på den övre delen av membranet att titta på polarisering av cellen (våra opublicerade observationer). Leukocyter eller andra cirkulerande celler kan läggas till EG media och vidhäftningen av celler kan vara kvantifierade12. VCCC kan dessutom användas för att undersöka patologier som glatt muskulatur migration24 och spridning som svar på endoteliala skador15,18.
Sammanfattningsvis har vi presenterat en metod för att isolera MEJ från en in vitro- cellodlingssystem, som gör det möjligt för utredning av signalering processer mellan två kopplade celltyper. Ännu viktigare, samtidig kultur systemet är inte begränsat till studiet av MEJ och kan vara värdefullt att besvara ett antal frågor, speciellt de som involverar heterocellular kommunikation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Heart, beviljar Lung- och Blood Institute R01088554, T32HL007284 och American Heart Association pre gemenskap 14PRE20420024. Vi tackar särskilt St. Jude Cellular Imaging delade forskning kärnan, inklusive Randall Wakefield och Linda Horner för elektronmikroskopi bilder, Adam Straub för hjälp med representativa immunofluorescens bilder och Pooneh Bagher för henne värdefulla synpunkter på protokollet manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 mm diameter, 0.4 µm Transwell Polyester membrane filter insert | Corning | 3450 | This is one 6 well plate of inserts |
| 225 cm flask | Corning | 431082 | |
| 6 well plates (without filter inserts) | Corning | 3506 | |
| Primary human coronary artery endothelial cells | Lonza | CC-2585 | |
| Primary human coronary artery smooth muscle cells | Lonza | CC-2583 | |
| EBM-2 EC Basal media | Lonza | CC-3156 | |
| EC growth factors (EGM2 MV Single quots) | Lonza | CC-4147 | Add to basal media before use |
| SmBM SMC basal media | Lonza | CC-3181 | |
| SMC growth factors (SmGM-2 SingleQuot) | Lonza | CC-4149 | Add to basal media before use |
| 0.5% Trypsin-EDTA 10X | Gibco | 15400-054 | Dilute to 2X with sterile dPBS |
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| large petri dishes for SMC Plating (150mm) | Corning | 353025 | |
| Bovine gelatin | Sigma | G-9382 | |
| Human fibronectin | Corning | 356008 | 5µg/ml of fibronectin and store at -20 |
| 10x Hanks' Buffered salt solution (HBSS) | Gibco | 14065-056 | Dilute to 1x with sterile water |
| 10x Dulbecco's Phosphate buffered saline (dPBS) | Gibco | 14200-075 | Dilute to 1x with sterile water |
| Disposable Curved Scalpel (30mm cutting edge) with handle | Amazon | MDS15210 | |
| Forceps | Fisher | 17-467-201 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353085 | |
| 50 mL conical tube | Corning | 352070 | |
| 10 mm petri dishes | Falcon | 35-1008 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| RNA lysis reagent | Qiagen | 79306 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | Make 4% solution with dPBS |
| 70% ethanol | Fisher | 04-355-305 | |
| Cavicide disinfectant | Fisher | 131000 | |
| RIPA protein lysis buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic dismembranator | Fisher | Model 50 | |
| 1x PBS for harvesting EC/SMC and immunocytochemistry | Gibco | 10010023 | does not need to be sterile |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embedding/Sectioning/Staining | |||
| Paraffin | Fisher | P31-500 | |
| Automated tissue processer | Excelsior | ES | |
| Embedding station + cold plate | Leica | HistoCore Arcadia | |
| Tissue Tek Accu-Edge Microtome blade | VWR | 25608-961 or 25608-964 | |
| Microscope slides | Thermo Fisher | 22-230-900 | |
| Coverslips | Thermo Fisher | 12-548-5E | |
| Prolong Gold mounting medium | Thermo Fisher | P36931 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other Solutions | **Perform all steps in sterile conditions if using the solution on live cells | ||
| Sterile dPBS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make DPBS (450mL sterile water: 50mL 10X DPBS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| sterile HBSS | Autoclave water to sterilize. Using the sterile water make HBSS (450mL sterile water: 50mL 10X HBSS), mix and filter sterilize (0.2µm filter). Final concentration: 1X |
||
| Fibronectin stock solution | Use 50mL of sterile water to fibronectin to make stock of 1mL aliquots, then freeze until needed Final concentration: 100µg/mL |
||
| Fibronectin to coat SMC side of VCCC | thaw one aliquot and add 1mL of fibronectin (100µg/mL) to 19mLs of 1X HBSS to reach a final concentration of 5µg/mL. Final concentration: 5µg/mL |
||
| 2x Trypsin EDTA solution | Dilute the 10X 0.5% Trypsin-EDTA to 2X with 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Trypsin) . Final concentration: 2X |
||
| Blocking/antibody solution | (9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg bovine serum albumin, 500mL normal serum) | ||
| Bovine gelatin to coat EC VCCC | Mix 0.5g bovine gelatin into 100mL distilled water. Autoclave prior to first use and store at room temperature. Keep in sterile conditions. Final concentration: 0.50% |
||
| 1x PBS for harvesting cells | does not need to be sterile |
References
- Isakson, B. E., Duling, B. R. Heterocellular contact at the myoendothelial junction influences gap junction organization. Circ Res. 97 (1), 44-51 (2005).
- Little, T. L., Xia, J., Duling, B. R. Dye tracers define differential endothelial and smooth muscle coupling patterns within the arteriolar wall. Circ Res. 76 (3), 498-504 (1995).
- Heberlein, K. R., Straub, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: breaking through the matrix? Microcirculation. 16 (4), 307-322 (2009).
- Straub, A. C., Zeigler, A. C., Isakson, B. E. The myoendothelial junction: connections that deliver the message. Physiology (Bethesda). 29 (4), 242-249 (2014).
- Isakson, B. E., Ramos, S. I., Duling, B. R. Ca2+ and inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated signaling across the myoendothelial junction. Circ Res. 100 (2), 246-254 (2007).
- Dora, K. A., Doyle, M. P., Duling, B. R. Elevation of intracellular calcium in smooth muscle causes endothelial cell generation of NO in arterioles. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (12), 6529-6534 (1997).
- Sonkusare, S. K., et al. Elementary Ca2+ signals through endothelial TRPV4 channels regulate vascular function. Science. 336 (6081), 597-601 (2012).
- Ledoux, J., et al. Functional architecture of inositol 1,4,5-trisphosphate signaling in restricted spaces of myoendothelial projections. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9627-9632 (2008).
- Boerman, E. M., Everhart, J. E., Segal, S. S. Advanced age decreases local calcium signaling in endothelium of mouse mesenteric arteries in vivo. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310 (9), H1091-H1096 (2016).
- Toussaint, F., Charbel, C., Blanchette, A., Ledoux, J. CaMKII regulates intracellular Ca(2)(+) dynamics in native endothelial cells. Cell Calcium. 58 (3), 275-285 (2015).
- Truskey, G. A. Endothelial Cell Vascular Smooth Muscle Cell Co-Culture Assay For High Throughput Screening Assays For Discovery of Anti-Angiogenesis Agents and Other Therapeutic Molecules. Int J High Throughput Screen. 2010 (1), 171-181 (2010).
- Biwer, L. A., et al. Two functionally distinct pools of eNOS in endothelium are facilitated by myoendothelial junction lipid composition. Biochim Biophys Acta. 1861 (7), 671-679 (2016).
- Straub, A. C., et al. Endothelial cell expression of haemoglobin alpha regulates nitric oxide signalling. Nature. 491 (7424), 473-477 (2012).
- Isakson, B. E. Localized expression of an Ins(1,4,5)P3 receptor at the myoendothelial junction selectively regulates heterocellular Ca2+ communication. J Cell Sci. 121 (Pt 21), 3664-3673 (2008).
- Axel, D. I., et al. Induction of cell-rich and lipid-rich plaques in a transfilter coculture system with human vascular cells. J Vasc Res. 33 (4), 327-339 (1996).
- Hastings, N. E., Simmers, M. B., McDonald, O. G., Wamhoff, B. R., Blackman, B. R. Atherosclerosis-prone hemodynamics differentially regulates endothelial and smooth muscle cell phenotypes and promotes pro-inflammatory priming. Am J Physiol Cell Physiol. 293 (6), C1824-C1833 (2007).
- Herzog, D. P., Dohle, E., Bischoff, I., Kirkpatrick, C. J. Cell communication in a coculture system consisting of outgrowth endothelial cells and primary osteoblasts. Biomed Res Int. , 320123 (2014).
- Jacot, J. G., Wong, J. Y. Endothelial injury induces vascular smooth muscle cell proliferation in highly localized regions of a direct contact co-culture system. Cell Biochem Biophys. 52 (1), 37-46 (2008).
- Scott-Drechsel, D., et al. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
- van Buul-Wortelboer, M. F., et al. Reconstitution of the vascular wall in vitro. A novel model to study interactions between endothelial and smooth muscle cells. Exp Cell Res. 162 (1), 151-158 (1986).
- Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
- Heberlein, K. R., et al. A novel mRNA binding protein complex promotes localized plasminogen activator inhibitor-1 accumulation at the myoendothelial junction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (5), 1271-1279 (2012).
- Straub, A. C., et al. Compartmentalized connexin 43 s-nitrosylation/denitrosylation regulates heterocellular communication in the vessel wall. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (2), 399-407 (2011).
- Cucina, A., et al. Vascular endothelial growth factor increases the migration and proliferation of smooth muscle cells through the mediation of growth factors released by endothelial cells. J Surg Res. 109 (1), 16-23 (2003).
- Heberlein, K. R., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates myoendothelial junction formation. Circ Res. 106 (6), 1092-1102 (2010).
- Isakson, B. E., Best, A. K., Duling, B. R. Incidence of protein on actin bridges between endothelium and smooth muscle in arterioles demonstrates heterogeneous connexin expression and phosphorylation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2898-H2904 (2008).
- Biwer, L. A., Isakson, B. E. Endoplasmic reticulum-mediated signalling in cellular microdomains. Acta Physiol (Oxf). 219 (1), 162-175 (2017).
