Summary
ديفينسينس النباتية دوراً هاما في الدفاع عن النبات ضد العوامل الممرضة. للاستخدام الفعال لهذه الببتيدات المضادة للفطور كوكلاء المضادة للفطور، فهم أساليب العمل (MOA) أمر بالغ الأهمية. هنا، يتم وصف أسلوب تصوير خلية يعيش لدراسة الجوانب الحرجة لوزارة الزراعة من هذه الببتيدات.
Abstract
الصغيرة الغنية سيستين ديفينسينس واحدة من أكبر مجموعات من المضيف الدفاع الببتيدات موجودة في جميع النباتات. العديد من النباتات defensins المعرض قويا في المختبر نشاط مضاد ضد واسعة الطيف من مسببات الأمراض الفطرية وبالتالي القدرة على استخدامها كعامل مضاد للفطريات في المحاصيل المعدلة وراثيا. من أجل تسخير الإمكانات الكاملة لمصنع ديفينسينس لمراقبة الأمراض، من الأهمية بمكان توضيح آلياتها للعمل (وزارة الزراعة). مع ظهور تقنيات متقدمة في الفحص المجهري، أصبح التصوير خلية يعيش أداة قوية لفهم ديناميات MOA مضاد فطري من نبات ديفينسينس. هنا، يرد وصف أسلوب تصوير خلية يعيش [كنفوكل] مجهرية على أساس استخدام اثنين defensins النبات المسمى فلوريسسينتلي (MtDef4 و MtDef5) في تركيبة مع الأصباغ الفلورية الحيوية. ويتيح هذا الأسلوب التصور في الوقت الحقيقي وتحليل الأحداث الحيوية لاستيعاب MtDef4 و MtDef5 في الخلايا الفطرية. الأهم من ذلك، ينشئ هذا التحليل على ثروة من المعلومات بما في ذلك استيعاب حركية، طريقة الدخول والتعريب سوبسيلولار من هذه الببتيدات. جنبا إلى جنب مع غيرها من أدوات الخلية البيولوجية، وفرت هذه الأساليب الحاسمة ثاقبة بديناميات وتعقد وزارة الزراعة من هذه الببتيدات. يمكن أيضا استخدام هذه الأدوات لمقارنة وزارة الزراعة من هذه الببتيدات ضد الفطريات المختلفة.
Introduction
وتطورت محطات نظام المناعة فطرية متطورة للدفاع ضد مسببات الأمراض الميكروبية النباتية1. وهم يعربون عن ترميز الجينات المضيف الدفاع الببتيدات العديدة مع نشاط مضادات الميكروبات المفترضة2. والواقع أن العديد من هذه الببتيدات عرض نشاط مضادات الميكروبات في المختبر3. ديفينسينس يضم واحدة من أكبر مجموعات من الببتيدات الدفاع المضيف في المملكة النباتية4. هذه الببتيدات الغنية سيستين، الموجبة يحمل النشاط المثبطة نمو قوية ضد الفطريات ومسببات الأمراض أووميسيتي في تركيزات micromolar وتمثل واحدة من أول خطوط الدفاع ضد هذه العوامل الممرضة5،6. بسبب نشاطها المضادة للفطور قوية، يمكن استغلال defensins في تطبيقات أجريبيوتيتشنولوجيكال لتوليد المحاصيل المقاومة للمرض. لقد ثبت overexpression المكونة من عدة مصنع ديفينسينس لتعزيز مقاومة المرض في اختبارات الدفيئة والحقل من المحاصيل المعدلة وراثيا6. من المهم كشف آليات العمل (MOA) من هذه الببتيدات المضادة للفطور من أجل تسخير كامل إمكاناتهم كأدوات فعالة لحماية المحاصيل. ومع ذلك، هي غير مفهومة وزارة الزراعة من هذه ديفينسينس النباتية. الأدلة الحالية تشير إلى أنها تظهر مختلفة وزارة الزراعة5،6،،من78. بعض ديفينسينس التصرف اكستراسيلولارلي على الفطريات واستهداف sphingolipids المقيم غشاء البلازما/جدار الخلية المحددة والإخلال بسلامة الغشاء وتنشيط السمية الخلوية مسارات9،،من1011. ، ومع ذلك، ديفينسينس المضادة للفطور التي ترانسلوكاتي داخل الخلايا الفطرية في الآونة الأخيرة اكتشفت12،،من1314. بعض من هذه ديفينسينس ربط المقيم في غشاء فوسفوليبيدات النشطة بيولوجيا وتشكيل مجمعات oligomeric بيرميبيليزي الأغشية البلازمية15،،من1617. وهكذا، وقد تم توضيح بعض الجوانب لوزارة الزراعة من نبات ديفينسينس. إلا أن وزارة الزراعة من نبات defensins المحتمل تنطوي على مجموعة معقدة من الأحداث التي لم يتم تحديدها وإدماجها في نموذج شامل. على وجه الخصوص، لا تزال هناك فجوة كبيرة في فهمنا للأهداف الخلوية من هذه الببتيدات.
مع التطورات الحديثة في تقنيات الفحص المجهري ووضع المسابر نيون الجديدة، تقنيات التصوير خلية يعيش الآن كثيرا ما تستخدم لدراسة وزارة الزراعة الببتيدات المضادة للميكروبات (الامبير). تكمل هذه التقنيات الأساليب المستخدمة على نطاق واسع مثل إيمونولوكاليزيشن والمجهر الإلكتروني ومجهر القوة الذرية أو التصوير المقطعي بالأشعة السينية18، التي استخدمت أساسا لتحليل آثار الببتيدات المضادة للفطور في مورفولوجية و نمو الخلايا الفطرية بما في ذلك دراسة سلامة جدار الخلية، تغييرات في أنماط النمو/المنطق التفريعي الخلية، فضلا عن بيرميبيليزيشن غشاء البلازما وقتل. ومع ذلك، كانت هذه الدراسات محدودة للتصوير الخلايا عند نقطة معينة من الزمن بعد العلاج مع الببتيدات بدلاً من أداء الوقت الفاصل بين التصوير في نفس الخلايا لرصد هذه التغيرات الدينامية في الاستجابة للتحدي ديفينسين. في السنوات الأخيرة، وقد مكن استخدام الببتيدات فلوريسسينتلي المسمى بالاقتران مع الخلايا الحية التصوير باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل] التصور في الوقت الحقيقي لديناميات التفاعل أمبير – ميكروب. كلاهما بطبيعة الحال تنقيته ويمكن الموسومة مركباً كيميائيا الببتيدات المضادة للفطور مع تسميات الفلورسنت (مثلاً، ديلايت، والرودامين، بوديبي، أو فلور أليكسا أساس الأصباغ) والملاحظة المباشرة أثناء تفاعلها مع الخلايا بمرور الزمن خلية يعيش التصوير. استخدام هذه المسمى الببتيدات زاد إلى حد كبير فهمنا لمختلف جوانب بها وزارة الزراعة بما في ذلك وضع الإدخال، والترجمة سوبسيلولار، الاتجار داخل الخلايا، ومواقع عمل مضاد فطري داخل الخلايا الحية الفطرية 18.
في الآونة الأخيرة، أظهرت العديد من الدراسات أن يتم استيعاب الببتيدات المضادة للفطور المختلفة بما في ذلك مصنع defensins تعيش الخلايا الفطرية12،14،،من1920. وزارة الزراعة من هذه ديفينسينس قد تنطوي على التفاعل مع أهداف داخل الخلايا. ونحن قد أبلغت مؤخرا بعمل مصنع ديفينسين MtDef4 في اثنين من الفطريات أسكوميسيتي، نيوروسبورا crassa و جرامينيروم مغزلاويهالمضادة للفطور. وأبدى MtDef4 باستخدام مسارات مختلفة لدخول الخلية الفطرية والتعريب سوبسيلولار في هذه الفطريات14. هذه الدراسة تستخدم كيميائيا توليفها رباعي ميثيل والرودامين (طمره)-المسمى MtDef4 في تركيبة مع الأصباغ الفلورية الحيوية (صبغ الغشاء الانتقائي، FM4-64؛ صبغ الغشاء بيرمينت، "الأخضر سيتو" خلية موت مراسل الصبغة، يوديد propidium) و مثبطات الأيض. هذه التحاليل أثبتت الحركية استيعاب MtDef4 وآلياتها للنقل داخل الخلايا ولها أهداف سوبسيلولار14.
ويرد هنا، بروتوكولا للتصوير خلية يعيش باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]. ويستخدم البروتوكول المسمى فلوريسسينتلي الببتيدات في تركيبة مع الأصباغ الفلورية الحيوية لدراسة التفاعلات ديفينسين الفطرية النباتية، لا سيما والممرات من إزفاء والأهداف داخل الخلايا من ديفينسينس في الخلايا الفطرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-وضع العلامات من ديفينسينس مع فلوروفوريس
- حدد fluorophore يحتوي على الحد الأدنى من تأثير على خصائص مضادات الميكروبات، فضلا عن استيعاب وتوطين ديفينسين داخل الخلية الحية.
ملاحظة: تحديد fluorophore الأمثل يعتمد على أهداف تجريبية محددة. ينبغي أيضا النظر الخصائص الطيفية والكيميائية، فوتوستابيليتي، وحجم والمسؤول فلوروفوري. - قم بتسمية ديفينسين مع فلوروفوري المحدد باستخدام ببتيد مناسبة وسم طقم المتاحة من الموردين التجاريين. وبدلاً من ذلك، كيميائيا توليف defensins المسمى فلوروفوري. في هذه الدراسة، قم بتسمية MtDef5 ديفينسين مع DyLight550 باستخدام العلامات التجارية كيت وفقا للبروتوكول ورباعي ميثيل والرودامين الشركة المصنعة (طمره)-المسمى MtDef4 ديفينسين وكان كيميائيا تصنيعه تجارياً.
ملاحظة: من المستحسن أن تستخدم الببتيدات مركباً كيميائيا فلوروفوري معلم (لا سيما بالنسبة الببتيدات قصيرة من الأحماض الأمينية 50 أو أقل) حيث يمكن إرفاق فلوروفوري بقايا الطرفي ن أو ج الببتيد لضمان الحد الأدنى من التأثير على ما نشاط مضادات الميكروبات. توليف الببتيدات طويلة مع أكثر من ثلاثة ثنائي كبريتيد السندات يمثل تحديا. وفي هذه الحالة، من المستحسن أن الببتيد يكون المسمى مع fluorophore أمثل استخدام ببتيد متاحة تجارياً مناسبة وسم طقم. - الاختبار في المختبر نشاط مضادات الميكروبات من ديفينسين المسمى وتحديد تركيز الحد الأدنى المثبطة (MIC) ضد الفطريات يتعين التحقيق فيها.
ملاحظة: في هذه الدراسة، تقرر هيئة التصنيع العسكري DyLight550-MtDef5 وجمهورية ترانسنيستريا المولدوفية-MtDef4 ضد كراسا نيوروسبورا وتحزز جرامينيروم.
2-الفطرية الثقافات والمتوسطة النمو
- نقل كونيديا من ثقافة أسهم كراسا أ انحدار الأنبوبة المحتوية على فوغل لاجار متوسطة21 واحتضان في درجة حرارة الغرفة تحت الضوء لمدة 5 أيام.
- الثقافة جرامينيروم واو 1 درجة الحموضة ضغطاً على لوحات تتضمن كاملة متوسطة الحجم (سم)22 في 28 درجة مئوية لمدة 5 أيام. لإنتاج كونيديا، تطعيم 4 المقابس (10 مم) من الثقافة القديمة يوم 5 PH جرامينيروم واو -1 إلى 50 مل من كاربوكسيميثيل السليلوز (CMC) متوسطة (السليلوز كاربوكسيميثيل ز 15، 1 ز الخميرة استخراج، 0.5 ز مجسو4.7 ح2س، NH ز 1 4 لا3، و 1 ز خ2ص4) والثقافة لمدة 4-7 أيام في 28 درجة مئوية في شاكر روتاري 180 لفة في الدقيقة.
3-إعداد تعليق كونديل
- تعليق كونديل جرامينيروم ف.
- دوامة ثقافة السائل جرامينيروم واو وجمع كونيديا بتصفية الثقافة الفطرية 1.5 مل من خلال طبقتين من مادة الترشيح (مثل ميراكلوث) في أنبوب ميكروسينتريفوجي 2 مل. الطرد المركزي بتعليق كونيديال في 13,226 س ز السرعة في ميكروسينتريفوجي لمدة 2 دقيقة.
- تجاهل المادة طافية، وإضافة 1 مل الماء المعقم لغسل بيليه.
- الطرد المركزي من تعليق كونيديال في 13,226 س ز السرعة في ميكروسينتريفوجي لدقيقة 2 تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 1 مل 2 X SFM (وسائل الإعلام الفطرية الاصطناعية)23.
- عد كونيديا استخدام هيموسيتوميتير تحت مجهر خفيفة.
- ضبط تعليق conidial إلى 105 كونيديا/مل مع 2 X SFM.
- تعليق conidial كراسا أ.
- نقل كمية صغيرة من ثقافة المتنامية (القديمة يوم 5) كراسا أ. استخدام حلقة تطعيم إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي الذي يحتوي على 2 مل المتوسطة فوجل للسائل.
- دوامة تعليق كونيديال والتصفية من خلال مواد الترشيح في أنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة.
- الطرد المركزي من تعليق كونيديال بأقصى سرعة ممكنة في ميكروسينتريفوجي لدقيقة 2 تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه كونيديال في 1 مل المتوسطة فوجل للسائل.
- عد كونيديا استخدام هيموسيتوميتير تحت مجهر خفيفة.
- ضبط تعليق conidial إلى 105 كونيديا/مل مع السائلة المتوسطة فوغل.
4-عينة من الإعداد والفحص المجهري [كنفوكل]
- تعريب سوبسيلولار من MtDef4 ديفينسين داخل الخلايا الفطرية
- "الماصة؛" 50 ميليلتر من كل تعليق كونديل (5 10 كونيديا/mL) إلى ميكروويل 10 ملم من 35 ملم الزجاج السفلي ميكروويل الأطباق. لمراقبة كونيديا، مباشرة المضي قدما إلى الخطوة التالية، أو لإعداد جيرملينجس، ماصة 50 ميليلتر من كراسى أ و جرامينيروم ف. كونيديا في أطباق الثقافة 35 ملم واسمحوا تنبت على ح 3-6 في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة 50 ميليلتر من ديفينسين المسمى فلوريسسينتلي في هيئة التصنيع العسكري لكل طبق ميكروويل واحتضانها ح 2.5. هيئة التصنيع العسكري للمسمى فلوروفوري ديفينسينس المستخدمة هنا (الخطوة 1، 3) 3 ميكرومتر كراسا أ و جرامينيروم ف. وكانت هيئة التصنيع العسكري لجمهورية ترانسنيستريا المولدوفية-MtDef4 أ كراسا و واو جرامينيروم 1 ميكرومتر و 12 ميكرومتر، على التوالي.
- إضافة 2 ميليلتر من الغشاء الانتقائي صبغ FM4-64 (التركيز النهائي: 5 ميكرومتر) في الثقافة طبق واحتضان لمدة 30 دقيقة وجبل فورا على المجهر [كنفوكل] للتصوير.
- حدد الليزر "الضوء الأبيض" (ذ). استخدام nm مصادر 488 الليزر اثنين و 550 نانومتر لإثارة صبغ MtDef4 جمهورية ترانسنيستريا المولدوفية و FM4-64، على التوالي. كشف الأسفار لجمهورية ترانسنيستريا المولدوفية-MtDef4 في 580-700 نانومتر والكشف عن صبغ FM4-64 في 690-800 نانومتر.
ملاحظة: إجراء الفحص المجهري [كنفوكل] في غرفة مظلمة.
- تصوير مرور الوقت لاستيعاب ديفينسين MtDef5
- "الماصة؛" 50 ميليلتر من تعليق كونديل أ. كراسى و. جرامينيروم (5 10 كونيديا/mL) إلى ميكروويل 10 ملم من 35 ملم الزجاج السفلي ميكروويل الأطباق. ميكروويل 10 ملم غير المصقول وزجاج غطاء رقم 1.5 في الجزء السفلي. لمراقبة كونيديا، مباشرة انتقل إلى الخطوة التالية. لمراقبة جيرملينجس، احتضان كونيديا ح 3-6 في درجة حرارة الغرفة قبل الشروع الفحص المجهري.
- قم بتشغيل WLL. حدد السطر ليزر عند 550 نانومتر لإثارة ديفينسينس المسمى فلوروفوري المستخدمة هنا (الخطوة 1، 3) و FM4-64 مع كثافة 1.00% وتنشيط كاشفات المقابلة. تم الكشف عن المسمى فلوروفوري ديفينسينس المستخدمة هنا (الخطوة 1، 3) في شمال البحر الأبيض المتوسط 560-600 وتم اكتشاف FM4-64dye في 690-800 نانومتر.
ملاحظة: استخدام الليزر منخفض الشدة للخلية الحية التصوير الليزر عالية الكثافة يمكن أن يسبب الضرر للخلايا الفطرية الحية. - جبل صحن ميكروويل في المجهر. العثور على الخلايا باستخدام 10 x أهداف في بادئ الأمر، ثم قم بالتبديل إلى 100 x/1.44 هدف النفط لأعلى التكبير.
ملاحظة: تعيين وضع المسح الضوئي إلى إكسيزت (خليط من Z-المكدس والوقت الفاصل بين وسائط)، موقف Z، التكبير، تردد لالتقاط الصور، إلخ.
ملاحظة: إضافة ديفينسين وفلوروفوري بعد تركيب صحن ميكروويل في المجهر يمكن أن يزيل التباؤر منطقة الفائدة. ولذلك، بعد إضافة ديفينسين وفلوروفوري إلى ميكروويل، المنطقة ذات الأهمية يحتاج إلى إعادة تركيز الذي يمكن أن يسبب التأخير في الحصول على الصور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يعيش أجرى تصوير خلية لتتبع ومقارنة باستيعاب وتوطين سوبسيلولار هما ديفينسينس، MtDef4، و MtDef5، من فصة برميلية؛ في الخلايا الفطرية. جمهورية ترانسنيستريا المولدوفية-MtDef4 تم تصنيعه كيميائيا بينما كان المسمى MtDef5 مع Dylight550 (Dylight550-MtDef5). كانت المحتضنة كونيديا مع أما ديفينسين في تركيبة مع صبغ الغشاء الانتقائي FM4-64. ويبين الشكل 1 أن جمهورية ترانسنيستريا المولدوفية-MtDef4 بمختلف مسارات الاتجار كراسا أ. ف. جرامينيرومبالمقارنة. في كراسى أ، تعريب لا يشترك مع ديفينسين FM4-64 لكن بدلاً من البقع أغشية vacuoles داخله ديفينسين هو المعزول. في ف. جرامينيروم، من ناحية أخرى، جمهورية ترانسنيستريا المولدوفية-MtDef4 غير مترجمة داخل أي العضيات الغشاء محددة ملزمة بل هي منتشرة في السيتوبلازم (الشكل 1).
تصوير مرور الوقت crassa أ الخلايا المسماة مع كل من ديفينسينس المسمى فلوروفوري المستخدمة هنا (الخطوة 1، 3) ويظهر FM4-64 أن ديفينسين يكون قادراً على إدخال الخلايا الفطرية خلال 30 إلى 40 دقيقة من العلاج (الشكل 2). عند دخول الخلايا، لا تعريب داخل أي عضية محددة المسمى فلوروفوري ديفينسينس المستخدمة هنا (الخطوة 1، 3) لكن سهولة ينشر في السيتوبلازم. هذا على النقيض من جمهورية ترانسنيستريا المولدوفية-MtDef4 التي تدخل خلايا كراسى أ. ويظل المحاصرين داخل الهيئات حويصلية حتى بعد 3hrs للعلاج (الشكل 1).
الشكل 1: MtDef4 قد مختلف مسارات الاتجار في كراسى أ و ف. جرامينيروم. جمهورية ترانسنيستريا المولدوفية-MtDef4 يموضع إلى الهيئات حويصلية في كراسا أ (A)، بل هي منتشرة في السيتوبلازم من جرامينيروم واو (ب). كانت كونيديا كراسا أ و واو جرامينيروم المشترك المسمى مع 1 ميكرومتر و 12 ميكرومتر ترانسنيستريا-MtDef4 (أحمر)، على التوالي، ومع FM4-64 (أخضر). صور أخذت بعد 3 ح للعلاج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: MtDef5 متغللة بواسطة كراسا أ وينشر داخل الخلايا. DyLight550-MtDef5 متغللة في خلايا كراسى أ وينشر في السيتوبلازم. كانت المسماة الخلايا كراسى أ. شارك مع 3 ميكرومتر DyLight550-MtDef5 (أحمر) و FM4-64 (الأخضر). وكان تسجيل الفيديو لمدة 2 ساعة و 30 دقيقة. وكان التأخير بين إضافة MtDef5، وابتداء من الحصول على الصور دقيقة 5 مقياس بار = 4 ميكرومتر. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة، وصف لدراسة الحركية استيعاب هذه الببتيدات داخل الخلايا الفطرية وتحديد أهدافها سوبسيلولار بخلية يعيش موثوقة منهجية تصوير باستخدام المسمى فلوريسسينتلي ديفينسينس المضادة للفطور. هذا الأسلوب أداة قوية لتصور ديناميات التفاعل بين ديفينسينس والخلايا الفطرية زمنياً ومكانيا.
وقد استخدمت أساليب مختلفة لدراسة الاستيعاب والتعريب داخل الخلايا من مصنع ديفينسينس في الخلايا الفطرية. في هذه الأساليب، عادة ثابتة ديفينسين-تعامل الخلايا ومعالجتها ثم إيمونولوكاليزيشن، والمجهر الإلكتروني، أو الأشعة السينية التصوير المقطعي15،،من2425. وباﻹضافة إلى ذلك، اقتصرت معظم هذه التقنيات للتصوير الخلايا عند نقطة زمنية محددة وليس في الوقت الحقيقي باستخدام الوقت الفاصل بين التصوير من نفس الخلايا الحية لرصد التغيرات الديناميكية التي تحدث استجابة للتحدي ديفينسين. القدرة على تصور وتحليل ومقارنة الأحداث الحيوية التي تجري في الخلايا الفطرية في الوقت الحقيقي أثناء إجراء مضاد فطري من ديفينسينس يجعل هذه التقنية فعالة ومثيرة. وباﻹضافة إلى ذلك، فإنه يوفر فهم كيف يؤثر التعريب داخل الخلايا الحيوية من الببتيد morphogenesis الخلايا الفطرية الفردية مع مرور الوقت.
أحد الجوانب الهامة لهذا الأسلوب هو تحديد الأهداف سوبسيلولار استخدام الببتيدات المسمى فلوريسسينتلي جنبا إلى جنب مع الأصباغ الفلورية الحيوية (مثل FM4-64؛ سان جرمان). تعريب سوبسيلولار يحدد البيئة التي يعمل فيها ببتيد، ويمثل خطوة هامة نحو توضيح التفاعل شركائها، وظيفة، والأدوار المحتملة في ال26،الأجهزة الخلوية27.
حد طفيفة لهذا الأسلوب أن الببتيد نيون يسلك غالباً انخفاض النشاط المضادة للفطور مقارنة مع الببتيد غير مسمى. إذا كان الببتيد هو المسمى باستخدام مجموعة أدوات التوسيم ببتيد متاحة تجارياً ويظهر فقدان كامل للنشاط المضادة للفطور، من المستحسن من ببتيد مركباً كيميائيا يسمى مع فلوروفوري صغيرة في ن-أو ج-نهايته.
في الخلية موجز، ويعيش هو تصوير الخلايا الفطرية وتحدي مع المعلمة فلوروفوري ديفينسين أداة فعالة يمكن أن تقدم مباشرة، وارتفاع القرار الزمانية لوزارة الزراعة من ديفينسين المضادة للفطور. لدراسة وزارة الزراعة أكثر دقة، هذا الأسلوب يمكن دمجها مع عمر fluorescence التصوير المجهري (فليم)28 التي سوف تسمح لقياس حركية التفاعل من الببتيد مع الببتيدات الأخرى، أو مع غيرها من الجزيئات المسماة أو الخلوية المكونات في الوقت الحقيقي. هذا سوف يثري فهمنا لطرق العمل الببتيدات المضادة للميكروبات وبالتالي تسريع تنميتها كعامل مضاد لاستخدامها في الزراعة والطب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونشكر الدكتور ر. هوارد بيرغ، مدير مرفق مجهرية المتكاملة في مركز علوم النبات دانفورث دونالد، لقيادته ويساعد مع [كنفوكل] مجهرية. الكتاب قد لا يوجد تضارب في إعلان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FM4-64 Dye | Life Technologies | T13320 | |
| DyLight 550 Antibody Labeling Kit | Thermo Scientific | 84530 | |
| Glass Bottom Microwell Dishes | Mat TeK | P35G-1.5-10-C | |
| Mira cloth | EMD Millipore Corp | 475855-1R | |
| SP8-X confocal microscope | Leica | ||
| ImageJ software | FiJi | For Image analysis | |
| Imaris software | Bitplane | For Image analysis |
References
- Jones, J. D. G., Dangl, J. L. The plant immune system. Nature. 444 (7117), 323-329 (2006).
- Tavormina, P., De Coninck, B., Nikonorova, N., De Smet, I., Cammue, B. P. A. The Plant Peptidome: An expanding repertoire of structural features and biological functions. Plant cell. 27 (8), 2095-2118 (2015).
- Van Der Weerden, N. L., Bleackley, M. R., Anderson, M. A. Properties and mechanisms of action of naturally occurring antifungal peptides. Cell. and Mol. Life Sci. 70 (19), 3545-3570 (2013).
- Van der Weerden, N. L., Anderson, M. A. Plant defensins: Common fold, multiple functions. Fungal Biol Rev. 26 (4), 121-131 (2013).
- De Coninck, B., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Modes of antifungal action and in planta functions of plant defensins and defensin-like peptides. Fungal Biol Rev. 26 (4), 109-120 (2013).
- Kaur, J., Sagaram, U. S., Shah, D. Can plant defensins be used to engineer durable commercially useful fungal resistance in crop plants? Fungal Biol. Rev. 25 (3), 128-135 (2011).
- Vriens, K., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Antifungal plant defensins: Mechanisms of action and production. Molecules. 19 (8), 12280-12303 (2014).
- Sagaram, U. S., Kaur, J., Shah, D. Antifungal plant defensins: Structure-activity relationships, modes of action, and biotech applications. ACS Symp. Ser. 1095, 317-336 (2012).
- Thevissen, K., Francois, I. E. J. A., Aerts, A. M., Cammue, B. P. A. Fungal sphingolipids as targets for the development of selective antifungal therapeutics. Curr. Drug Targets. 6 (8), 923-928 (2005).
- Thevissen, K., Kristensen, H. H., Thomma, B. P. H. J., Cammue, B. P. A., Francois, I. E. J. A. Therapeutic potential of antifungal plant and insect defensins. Drug Discov. Today. 12 (21-22), 966-971 (2007).
- Aerts, A. M., François, I. E. J. A., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. The mode of antifungal action of plant, insect and human defensins. Cell. Mol. Life Sci. 65 (13), 2069-2079 (2008).
- Van Der Weerden, N. L., Lay, F. T., Anderson, M. A. The plant defensin, NaD1, enters the cytoplasm of Fusarium oxysporum hyphae. J. Biol. Chem. 283 (21), 14445-14452 (2008).
- Lobo, D. S., Pereira, I. B., et al. Antifungal Pisum sativum Defensin 1 Interacts with Neurospora crassa Cyclin F Related to the Cell Cycle. Biochemistry. 46 (4), 987-996 (2007).
- El-Mounadi, K., Islam, K. T., Hernandez-Ortiz, P., Read, N. D., Shah, D. M. Antifungal mechanisms of a plant defensin MtDef4 are not conserved between the ascomycete fungi Neurospora crassa and Fusarium graminearum. Mol. Microbiol. 100 (3), 542-559 (2016).
- Baxter, A. A., et al. The Tomato Defensin TPP3 Binds Phosphatidylinositol (4,5)-Bisphosphate via a Conserved Dimeric Cationic Grip Conformation To Mediate Cell Lysis. Mol. and Cell. Biol. 35 (11), 1964-1978 (2015).
- Kvansakul, M., et al. Binding of phosphatidic acid by NsD7 mediates the formation of helical defensin-lipid oligomeric assemblies and membrane permeabilization. Proc. Natl. Acad. Sci. 113, 11202-11207 (2016).
- Poon, I. K. H., et al. Phosphoinositide-mediated oligomerization of a defensin induces cell lysis. eLife. 3, e01808 (2014).
- Muñoz, A., Read, N. D. Live-cell imaging and analysis shed light on the complexity and dynamics of antimicrobial Peptide action. Front. Immunol. 3, 248 (2012).
- Hayes, B. M. E., et al. Identification and mechanism of action of the plant defensin NaD1 as a new member of the antifungal drug arsenal against candida albicans. Antimicrob. Agents Chemother. 57 (8), 3667-3675 (2013).
- Muñoz, A., Marcos, J. F., Read, N. D. Concentration-dependent mechanisms of cell penetration and killing by the de novo designed antifungal hexapeptide PAF26. Mol. Microbiol. 85 (1), 89-106 (2012).
- Eaton, C. J., et al. The guanine nucleotide exchange factor RIC8 regulates conidial germination through Gα proteins in Neurospora crassa. PLoS One. 7 (10), e48026 (2012).
- Leslie, J. F., Summerell, B. A. The Fusarium. laboratory manual. , Blackwell Professional. Ames, IA, USA. (2006).
- Broekaert, W. F., Terras, F. R. G., Cammue, B. P. A., Vanderleyden, J. An automated quantitative assay for fungal growth inhibition. FEMS Microbiol.Lett. 69 (1-2), 55-59 (1990).
- Sagaram, U. S., et al. Structural and functional studies of a phosphatidic acid-binding antifungal plant defensin MtDef4: Identification of an RGFRRR motif governing fungal cell entry. PLoS One. 8 (12), 1-22 (2013).
- Uchida, M., et al. Soft X-ray tomography of phenotypic switching and the cellular response to antifungal peptoids in Candida albicans. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (46), 19375-19380 (2009).
- Nair, R., et al. Better prediction of sub-cellular localization by combining evolutionary and structural information. Proteins Struct. Funct. Bioinform. 53 (4), 917-930 (2003).
- Scott, M. S., Calafell, S. J., Thomas, D. Y., Hallett, M. T. Refining protein subcellular localization. PLoS Comput. Biol. 1 (6), e66 (2005).
- Shagaghi, N., Bhave, M., Palombo, E., Clayton, A. Revealing the sequence of interactions of PuroA peptide with Candida albicans cells by live-cell imaging. Sci. Rep. 7, 43542 (2017).
