Summary
Anläggningen defensins spela en viktig roll i växten försvar mot patogener. För effektiv användning av dessa svampdödande peptider som antimykotika, förstå deras verkningssätt (MOA) är kritisk. Här, beskrivs en live-cell bildgivande metod för att studera kritiska aspekter av MOA av dessa peptider.
Abstract
Liten cystein-rika defensins är en av de största grupperna av värd försvar peptider finns i alla växter. Många växt defensins uppvisar potent i vitro antifungal aktivitet mot ett brett spektrum av svamp patogener och har därför potential att användas som antimykotika i transgena grödor. För att utnyttja den fulla potentialen av växten defensins för sjukdomar kontroll, är det viktigt att belysa deras verkningsmekanismer (MOA). Med tillkomsten av avancerad mikroskopi tekniker, har live-cell imaging blivit ett kraftfullt verktyg för att förstå dynamiken i den svampdödande MOA av växten defensins. Här, beskrivs en konfokalmikroskopi baserat live-cell imaging metoden med två fluorescently märkt växt defensins (MtDef4 och MtDef5) i kombination med vitala fluorescerande färgämnen. Denna teknik möjliggör realtid visualisering och analys av dynamiska händelser av MtDef4 och MtDef5 internalisering in svampceller. Viktigast av allt, genererar denna analys en mängd information, inklusive internalisering kinetik, funktionsläget av posten och subcellulär lokalisering av dessa peptider. Tillsammans med andra cell biologiska verktyg, har dessa metoder gett viktiga insikter om dynamiken och komplexiteten i MOA av dessa peptider. Dessa verktyg kan också användas för att jämföra MOA av dessa peptider mot olika svampar.
Introduction
Växter har utvecklats en sofistikerad medfödda immunsystemet för försvar mot mikrobiell växt patogener1. De uttrycker många gen-kodade värden försvar peptider med förmodad antimikrobiell aktivitet2. Faktiskt, många av dessa peptider Visa antimikrobiell aktivitet in vitro-3. Defensins utgör en av de största grupperna av värd försvar peptider i växt riket4. Dessa cystein-rika, katjoniska peptider uppvisar potent tillväxt hämmande aktivitet mot svamp och oomycete patogener på mikromolära koncentrationer och utgör en av de första raderna i försvar mot dessa patogener5,6. På grund av deras potent antifungal aktivitet, kan defensins utnyttjas i agribiotechnological applikationer att generera sjukdomsresistenta grödor. Konstituerande överuttryck av flera växt defensins har visat sig förbättra motståndskraft mot sjukdomar i växthus och fältet test av transgena grödor6. Det är viktigt att nysta verkningsmekanismer (MOA) av dessa svampdödande peptider för att fullt ut utnyttja deras potential som effektiva verktyg för växtskydd. Dock är MOA av dessa växt-defensins dåligt känd. Aktuella bevis tyder på att de uppvisar olika MOA5,6,7,8. Vissa defensins agera extracellularly på svampar och rikta specifika cellväggen platt membran bosatt Sfingolipider, störa membran integritet och aktivera cellulär toxicitet vägar9,10,11. Nyligen, svampdödande defensins som translocate in svampceller har dock upptäckt12,13,14. Några av dessa defensins binder till membran-resident bioaktiva fosfolipider, bildar Oligomera komplex och permeabilize plasma membran15,16,17. Alltså, vissa aspekter av MOA av växten defensins har klargjorts. Dock innebära MOA av växten defensins sannolikt en komplex uppsättning händelser som ännu inte har identifierats och integreras i en omfattande modell. I synnerhet fortfarande finns det en stor lucka i vår förståelse av de cellulära målen i dessa peptider.
Senaste framstegen inom mikroskopi teknik och utveckling av nya fluorescerande sonder används live-cell avbildningstekniker nu ofta för att studera MOA av antimikrobiella peptider (ampere). Dessa tekniker komplettera allmänt använda metoder såsom immunolocalization, elektronmikroskopi, atomic force microscopy eller röntgen datortomografi18, som har använts mest för att analysera effekterna av svampdödande peptider på Morfologi och tillväxten av svamp celler inklusive studien av cellväggen integritet, förändringar i cell tillväxt/förgrening mönster, liksom plasmamembranet vilket och döda. Dessa studier har dock begränsats till imaging celler vid en viss tid efter behandling med peptiderna i stället för att utföra time-lapse imaging på samma celler att övervaka deras dynamiska förändringar i svar på defensin utmaning. Under de senaste åren har användningen av fluorescently märkt peptider i samband med levande cell imaging använder konfokalmikroskopi aktiverat realtid visualisering av dynamiken i AMP – mikrobinteraktioner. Både naturligt renat och kemiskt syntetiserade svampdödande peptider kan vara märkta med fluorescerande etiketter (t.ex., DyLight, rodamin, BODIPY eller Alexa Fluor baserat färgämnen) och direkt observeras under deras interaktion med celler av time-lapse Live-cell imaging. Användning av dessa märkt peptider har ökat vår förståelse av de olika aspekterna av deras MOA inklusive läge av posten, subcellulär lokalisering, intracellulära människohandel och platser av svampdödande åtgärder inom levande svampceller avsevärt 18.
Nyligen har visat flera studier att olika svampdödande peptider inklusive växt defensins är internaliserad av living svampceller12,14,19,20. MOA av dessa defensins sannolikt innebär interaktion med intracellulära mål. Vi har nyligen rapporterat svampdödande effekten av en växt som defensin MtDef4 i två ascomycete svampar, Neurospora crassa och Fusarium graminearum. MtDef4 visades att använda olika vägar för svamp cellinmatning och subcellulär lokalisering i dessa svampar14. Denna studie använde kemiskt syntetiserade tetrametyl rodamin (TAMRA)-märkt MtDef4 i kombination med vitala fluorescerande färgämnen (membran selektiv färga, FM4-64, membran-diffusionskoefficient dye, SYTOX Green, cell death reporter färgämnet, propidium jodid) och metaboliska hämmare. Dessa analyser visat kineticsen av internalisering av MtDef4, dess mekanismer av intracellulära transport och dess subcellulär mål14.
Här, presenteras ett protokoll för live-cell bildåtergivning med konfokalmikroskopi. Protokollet använder tredjeparts fluorescently märkt peptider i kombination med vitala fluorescerande färgämnen att studera växt defensin-svamp interaktioner, i synnerhet, vägarna i flyttning och de intracellulära mål av defensins i svampceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. märkning av Defensins med Fluorophores
- Välj en fluorophore som har minsta effekt på de antimikrobiella egenskaperna samt upptag och lokalisering av defensin inuti den levande cellen.
Obs: Att välja optimala fluorophore beror på särskilda experimentella mål. Den spektrala och kemiska egenskaper, photostability, storlek och kostnad av fluorophore bör också övervägas. - Etiketten defensin med valda fluorophore med en lämplig peptid märkning kit finns från kommersiella leverantörer. Alternativt kemiskt syntetisera fluorophore-märkt defensins. I denna studie etikett MtDef5 defensin med DyLight550 använder en kommersiell märkning kit enligt tillverkarens protokollet och tetrametyl rodamin (TAMRA)-märkt MtDef4 defensin var kemiskt syntetiserade kommersiellt.
Obs: Det rekommenderas att kemiskt syntetiserade fluorophore taggade peptider (särskilt för korta peptider 50 aminosyror eller mindre) användas eftersom fluorophore kan kopplas till N - eller C-terminal återstoden av peptiden för att säkerställa lägsta effekt på dess Antimikrobiell aktivitet. Syntesen av långa peptider med mer än tre disulfide obligationer är utmanande. I detta fall rekommenderas det att peptid märkas med en optimal fluorophore med en lämplig kommersiellt tillgängliga peptid märkning kit. - Testa i vitro antimikrobiell aktivitet av den märkta defensin och bestämma den minsta hämmande koncentrationen (MIC) mot svampen för utredas.
Obs: I denna studie bestämdes MIC för DyLight550-MtDef5 och TMR-MtDef4 mot Neurospora crassa och Fusarium graminearum.
2. svamp kulturer och odlingsmedium
- Överföra conidia från en N. crassa lager kultur till slant tube innehållande Vogel's agar medium21 och inkubera vid rumstemperatur under ljus i 5 dagar.
- Kultur F. graminearum PH-1 stam på plåtar som innehåller komplett medium (CM)22 vid 28 ° c i 5 dagar. För produktion av conidia, Inokulera 4 (10 mm diameter) pluggar av 5 dagar gamla kultur av F. graminearum PH-1 till 50 mL natriumkarboximetylcellulosa cellulosa (CMC) medium (15 g natriumkarboximetylcellulosa cellulosa, 1 g jäst extrakt, 0,5 g MgSO4.7 H2O, 1 g NH 4 INGEN3och 1 g KH2PO4) och kultur för 4-7 dagar vid 28 ° c i en roterande skak vid 180 rpm.
3. förberedelse av Conidial fjädring
- F. graminearum conidial fjädring
- Vortex F. graminearum flytande kulturen och samla conidia genom filtrering 1,5 mL svamp kultur genom två lager av filtrering material (t.ex. Miracloth) i en 2 mL mikrocentrifug rör. Centrifugera conidial fjädringen på 13,226 x g hastighet i en mikrocentrifug för 2 min.
- Avlägsna supernatanten och tillsätt 1 mL sterilt vatten att tvätta pelleten.
- Centrifugera conidial fjädringen på 13,226 x g hastighet i en mikrocentrifug för 2 min. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 mL av 2 X SFM (syntetisk svamp Media)23.
- Räkna de conidia med hjälp av en hemocytometer under ett ljusmikroskop.
- Justera conidial suspensionen 105 conidia/ml med 2 X SFM.
- Subst. crassa conidial fjädring
- Överföra en liten mängd växande kultur (5 dagar gamla) av N. crassa använder en inympning loop i en mikrocentrifug rör innehållande 2 mL Vogels flytande medium.
- Vortex conidial upphävande och filtrera genom filtrering material till en ny mikrocentrifug rör.
- Centrifugera conidial suspensionen med maximal hastighet i en mikrocentrifug för 2 min. Kassera supernatanten och återsuspendera conidial pelleten i 1 mL av Vogels flytande medium.
- Räkna de conidia med hjälp av en hemocytometer under ett ljusmikroskop.
- Justera conidial suspensionen 105 conidia/ml med Vogels flytande medium.
4. prov förberedelse och konfokalmikroskopi
- Subcellulär lokalisering av MtDef4 defensin in svampceller
- Överför med pipett 50 μl av varje conidial suspension (105 conidia/mL) till de 10 mm mikrobrunn 35 mm glas botten mikrobrunn rätter. För observationen av conidia, direkt gå vidare till nästa steg, eller för germlings beredning, pipett 50 μl av N. crassa och F. graminearum conidia in 35 mm kultur rätter och låt gror för 3-6 h i rumstemperatur.
- Tillsätt 50 µL av fluorescently märkt defensin på MIC till varje mikrobrunn maträtt och inkubera i 2,5 h. MIC för den fluorophore-märkt defensins används här (steg 1.3) är 3 µM för både N. crassa och F. graminearum och MIC för TMR-MtDef4 för N. crassa och F. graminearum var 1 µM respektive 12 µM.
- Lägg till 2 µL av membran-selektiv färga FM4-64 (slutlig koncentration: 5 µM) i kultur skålen och inkubera i 30 min och montera omedelbart på mikroskopet confocal för avbildning.
- Välj vitt ljus laser (WLL). Använda de två laser källor 488 nm och 550 nm att excitera TMR-MtDef4 och FM4-64 dye, respektive. Upptäcka fluorescens av TMR-MtDef4 på 580-700 nm och upptäcka FM4-64 dye vid 690-800 nm.
Obs: Utföra konfokalmikroskopi i det mörka rummen.
- Time lapse avbildning av internalisering av MtDef5 defensin
- Överför med pipett 50 μl N. crassa och F. graminearum conidial suspension (105 conidia/mL) till 10 mm mikrobrunn 35 mm glas botten mikrobrunn rätter. De 10 mm mikrobrunn är obestruket och har en nr 1,5 skyddsglaset längst ned. För observationen av conidia, direkt vidare till nästa steg. För observation av germlings, inkubera conidia för 3-6 h i rumstemperatur innan du fortsätter med microscopyen.
- Slå på WLL. Välj laserlinjen vid 550 nm att excitera de fluorophore-märkt defensins används här (steg 1.3) och FM4-64 med 1,00% intensitet och aktivera motsvarande detektorerna. Den fluorophore-märkt defensins används här (steg 1.3) upptäcktes vid 560-600 nm och den FM4-64dye upptäcktes vid 690-800 nm.
Obs: Använd låg laser intensitet för levande cell imaging som hög laser intensitet kan orsaka skador på levande svamp cellerna. - Montera mikrobrunn skålen på mikroskopet. Hitta celler med 10 x mål från början och sedan växla till 100 x / 1,44 olja mål för högre förstoring.
Obs: Ställ in skanningsläge till xyzt (kombination av Z-stack och time-lapse lägen), Z position, Zoom, frekvensen av Bildinsamling, etc.
Obs: Lägga till defensin och fluorophore efter montering mikrobrunn maträtt i mikroskopet kan skapa oskärpa regionen av intresse. Efter att defensin och fluorophore till mikrobrunn, måste regionen av intresse därför inriktas som kan orsaka försening i bild förvärv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Levande cellen imaging genomfördes att spåra och jämföra internalisering och subcellulär lokalisering av två defensins, MtDef4 och MtDef5, från Medicago truncatula; i svampceller. TMR-MtDef4 var kemiskt syntetiserade medan MtDef5 var märkt med Dylight550 (Dylight550-MtDef5). Conidia inkuberades med antingen defensin i kombination med membran selektiv färga FM4-64. Figur 1 visar att TMR-MtDef4 har olika människohandel vägar i N. crassa jämfört med F. graminearum. I N. crassa, i FM4-64 samtidig lokalisera inte med den defensin men snarare fläckar membranen i vakuoler inom vilken den defensin är binds. I F. graminearum, däremot, TMR-MtDef4 är inte lokaliserad inom någon viss aluminiummembran bunden organeller men sprids i cytoplasma (figur 1).
Time lapse avbildning av N. crassa celler märkta med både fluorophore-märkt defensins används här (steg 1.3) och FM4-64 visar att den defensin ska kunna ange svampceller inom 30 till 40 minuters behandling (figur 2). Vid inträde i cellerna, den fluorophore-märkt defensins används här (steg 1.3) lokalisera inte inom någon viss organell men diffunderar lätt in i cytoplasman. Detta är i motsats till TMR-MtDef4 som kommer in N. crassa celler och förblir instängd inom de vesikulära organ även efter 3hrs behandling (figur 1).
Figur 1: MtDef4 har olika människohandel vägar i N. crassa och F. graminearum. TMR-MtDef4 lokaliserar till vesikulär kroppar i N. crassa (A) men sprids in i cytoplasman av F. graminearum (B). Conidia N. crassa och F. graminearum var samtidig märkta med 1 µM och 12 µM TMR-MtDef4 (röd), respektive, och med FM4-64 (grön). Bilder togs efter 3 timmars behandling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: MtDef5 är internaliseras av N. crassa och diffunderar inne i cellerna. DyLight550-MtDef5 är internaliseras i N. crassa celler och diffunderar in i cytoplasman. Subst. crassa celler var samtidig märkt med 3 µM DyLight550-MtDef5 (röd) och FM4-64 (grön). Videon spelades in för 2 tim och 30 min. Fördröjningen mellan tillägg av MtDef5 och start bild förvärv var 5 min. skala bar = 4 µm. vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie beskrevs en tillförlitlig live-cell bildgivande metod med användning av fluorescently märkt svampdödande defensins att studera kinetiken för internalisering av dessa peptider i svampceller och bestämma deras subcellulär mål. Denna metod är ett kraftfullt verktyg för att visualisera dynamiken i samspelet mellan defensins och svampceller temporally och rumsligt.
Olika metoder har använts för att studera internalisering och intracellulära lokalisering av anläggningen defensins i svampceller. I dessa metoder, är defensin-behandlade celler oftast fasta och sedan bearbetas för immunolocalization, elektronmikroskopi eller röntgen datortomografi15,24,25. Dessutom har de flesta av dessa tekniker begränsats till imaging celler vid en specifik tidpunkt i stället för i realtid med time-lapse avbildning av samma levande celler för att övervaka de dynamiska förändringar som sker som svar på defensin utmaning. Förmågan att visualisera, analysera och jämföra de dynamiska händelser som äger rum i svampceller i realtid under svampdödande effekten av defensins gör denna teknik effektivt och spännande. Dessutom ger det bättre förståelse för hur den dynamiska intracellulära lokaliseringen av peptiden påverkar morfogenes av enskilda svamp celler med tiden.
En av de viktiga aspekterna av denna metod är att fastställa subcellulär målen med fluorescently märkta peptider tillsammans med vital fluorescerande färgämnen (e.g. FM4-64; SG). Subcellulär lokalisering bestämmer miljön där en peptid verksam, och utgör ett viktigt steg mot klarlägga dess interaktion partners, funktion och potentiella roller i det cellulära maskineri26,27.
En mindre begränsning av denna teknik är att den fluorescerande peptiden ofta uppvisar minskad antifungal aktivitet jämfört med omärkt peptiden. Om peptiden är märkt med en kommersiellt tillgänglig peptid märkning kit och visar fullständig förlust av antifungal aktivitet, rekommenderas en kemiskt syntetiserade peptid märkt med en liten fluorophore på dess N - eller C-terminus.
I sammanfattning, levande cell är avbildning av svampceller utmanas med en fluorophore-taggade defensin ett effektivt verktyg som ger en direkt, hög plats-temporal upplösning av MOA av en svampdödande defensin. För mer exakt MOA studien, kan denna teknik kombineras med fluorescens livstid imaging mikroskopi (FLIM)28 vilket gör att mäta interaktion kineticsen av en peptid med andra peptider, eller med andra märkta molekyler eller cellular väljare i realtid. Detta kommer att berika vår förståelse av de sätt som antimikrobiella peptider fungerar därmed påskynda sin utveckling som antimykotika för användning inom jordbruk och medicin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. R. Howard Berg, direktör för integrerad mikroskopi anläggningen på Donald Danforth Plant Science Center, för hans vägledning och hjälp med konfokalmikroskopi. Författarna har ingen intressekonflikt att deklarera.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FM4-64 Dye | Life Technologies | T13320 | |
| DyLight 550 Antibody Labeling Kit | Thermo Scientific | 84530 | |
| Glass Bottom Microwell Dishes | Mat TeK | P35G-1.5-10-C | |
| Mira cloth | EMD Millipore Corp | 475855-1R | |
| SP8-X confocal microscope | Leica | ||
| ImageJ software | FiJi | For Image analysis | |
| Imaris software | Bitplane | For Image analysis |
References
- Jones, J. D. G., Dangl, J. L. The plant immune system. Nature. 444 (7117), 323-329 (2006).
- Tavormina, P., De Coninck, B., Nikonorova, N., De Smet, I., Cammue, B. P. A. The Plant Peptidome: An expanding repertoire of structural features and biological functions. Plant cell. 27 (8), 2095-2118 (2015).
- Van Der Weerden, N. L., Bleackley, M. R., Anderson, M. A. Properties and mechanisms of action of naturally occurring antifungal peptides. Cell. and Mol. Life Sci. 70 (19), 3545-3570 (2013).
- Van der Weerden, N. L., Anderson, M. A. Plant defensins: Common fold, multiple functions. Fungal Biol Rev. 26 (4), 121-131 (2013).
- De Coninck, B., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Modes of antifungal action and in planta functions of plant defensins and defensin-like peptides. Fungal Biol Rev. 26 (4), 109-120 (2013).
- Kaur, J., Sagaram, U. S., Shah, D. Can plant defensins be used to engineer durable commercially useful fungal resistance in crop plants? Fungal Biol. Rev. 25 (3), 128-135 (2011).
- Vriens, K., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Antifungal plant defensins: Mechanisms of action and production. Molecules. 19 (8), 12280-12303 (2014).
- Sagaram, U. S., Kaur, J., Shah, D. Antifungal plant defensins: Structure-activity relationships, modes of action, and biotech applications. ACS Symp. Ser. 1095, 317-336 (2012).
- Thevissen, K., Francois, I. E. J. A., Aerts, A. M., Cammue, B. P. A. Fungal sphingolipids as targets for the development of selective antifungal therapeutics. Curr. Drug Targets. 6 (8), 923-928 (2005).
- Thevissen, K., Kristensen, H. H., Thomma, B. P. H. J., Cammue, B. P. A., Francois, I. E. J. A. Therapeutic potential of antifungal plant and insect defensins. Drug Discov. Today. 12 (21-22), 966-971 (2007).
- Aerts, A. M., François, I. E. J. A., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. The mode of antifungal action of plant, insect and human defensins. Cell. Mol. Life Sci. 65 (13), 2069-2079 (2008).
- Van Der Weerden, N. L., Lay, F. T., Anderson, M. A. The plant defensin, NaD1, enters the cytoplasm of Fusarium oxysporum hyphae. J. Biol. Chem. 283 (21), 14445-14452 (2008).
- Lobo, D. S., Pereira, I. B., et al. Antifungal Pisum sativum Defensin 1 Interacts with Neurospora crassa Cyclin F Related to the Cell Cycle. Biochemistry. 46 (4), 987-996 (2007).
- El-Mounadi, K., Islam, K. T., Hernandez-Ortiz, P., Read, N. D., Shah, D. M. Antifungal mechanisms of a plant defensin MtDef4 are not conserved between the ascomycete fungi Neurospora crassa and Fusarium graminearum. Mol. Microbiol. 100 (3), 542-559 (2016).
- Baxter, A. A., et al. The Tomato Defensin TPP3 Binds Phosphatidylinositol (4,5)-Bisphosphate via a Conserved Dimeric Cationic Grip Conformation To Mediate Cell Lysis. Mol. and Cell. Biol. 35 (11), 1964-1978 (2015).
- Kvansakul, M., et al. Binding of phosphatidic acid by NsD7 mediates the formation of helical defensin-lipid oligomeric assemblies and membrane permeabilization. Proc. Natl. Acad. Sci. 113, 11202-11207 (2016).
- Poon, I. K. H., et al. Phosphoinositide-mediated oligomerization of a defensin induces cell lysis. eLife. 3, e01808 (2014).
- Muñoz, A., Read, N. D. Live-cell imaging and analysis shed light on the complexity and dynamics of antimicrobial Peptide action. Front. Immunol. 3, 248 (2012).
- Hayes, B. M. E., et al. Identification and mechanism of action of the plant defensin NaD1 as a new member of the antifungal drug arsenal against candida albicans. Antimicrob. Agents Chemother. 57 (8), 3667-3675 (2013).
- Muñoz, A., Marcos, J. F., Read, N. D. Concentration-dependent mechanisms of cell penetration and killing by the de novo designed antifungal hexapeptide PAF26. Mol. Microbiol. 85 (1), 89-106 (2012).
- Eaton, C. J., et al. The guanine nucleotide exchange factor RIC8 regulates conidial germination through Gα proteins in Neurospora crassa. PLoS One. 7 (10), e48026 (2012).
- Leslie, J. F., Summerell, B. A. The Fusarium. laboratory manual. , Blackwell Professional. Ames, IA, USA. (2006).
- Broekaert, W. F., Terras, F. R. G., Cammue, B. P. A., Vanderleyden, J. An automated quantitative assay for fungal growth inhibition. FEMS Microbiol.Lett. 69 (1-2), 55-59 (1990).
- Sagaram, U. S., et al. Structural and functional studies of a phosphatidic acid-binding antifungal plant defensin MtDef4: Identification of an RGFRRR motif governing fungal cell entry. PLoS One. 8 (12), 1-22 (2013).
- Uchida, M., et al. Soft X-ray tomography of phenotypic switching and the cellular response to antifungal peptoids in Candida albicans. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (46), 19375-19380 (2009).
- Nair, R., et al. Better prediction of sub-cellular localization by combining evolutionary and structural information. Proteins Struct. Funct. Bioinform. 53 (4), 917-930 (2003).
- Scott, M. S., Calafell, S. J., Thomas, D. Y., Hallett, M. T. Refining protein subcellular localization. PLoS Comput. Biol. 1 (6), e66 (2005).
- Shagaghi, N., Bhave, M., Palombo, E., Clayton, A. Revealing the sequence of interactions of PuroA peptide with Candida albicans cells by live-cell imaging. Sci. Rep. 7, 43542 (2017).
