Summary
植物のディフェンシンは、病原体に対する植物の防衛のために重要な役割を果たします。アクション (MOA) の彼らのモードについての抗真菌剤としてこれらの抗真菌ペプチドの有効利用は重要なです。ここでは、これらのペプチドの MOA の重要な側面を研究する生細胞イメージング法を説明します。
Abstract
小さなシステイン豊富なディフェンシンは、ホストの防衛ペプチドすべて植物で、現在の最大のグループの一つです。多くの植物のディフェンシンは、病原糸状菌の広域スペクトルに対する抗真菌活性が強力な体外を展示し、したがって作物の抗真菌剤として使用される可能性があります。植物のディフェンシンの疾病の可能性を活用するために、アクション (MOA) のメカニズムを解明することが重要です。高度の顕微鏡検査の技術の出現で、住セルイメージ投射は植物のディフェンシンの抗真菌の MOA のダイナミクスを理解するための強力なツールになりました。ここでは、共焦点顕微鏡を用いた生細胞イメージング法は生体の蛍光染料との組み合わせで 2 つの蛍光に分類された植物のディフェンシン (MtDef4 と MtDef5) を使用して説明します。このテクニックは、リアルタイムで可視化および真菌細胞に MtDef4 と MtDef5 の内面化の動的イベントの分析に使用できます。重要なは、この試金は内面化動力学、エントリのモードとこれらのペプチドの細胞内局在性を含む情報の富を生成します。他の細胞生物学的ツールと一緒にこれらのメソッドは、ダイナミクスとこれらのペプチドの MOA の複雑さに重要な洞察力を提供しています。これらのツールは、別の菌に対するこれらのペプチドの MOA を比較する使用できます。
Introduction
植物は微生物植物病原体1に対する防衛のための洗練された自然免疫系進化してきました。彼らは多数の遺伝子でエンコードされたホスト防衛ペプチド推定抗菌2の表現します。確かに、これらのペプチドの多くは抗菌活性の in vitro3を表示します。ディフェンシンは、植物王国4のホストの防衛ペプチドの最も大きいグループの 1 つを構成します。これらのシステインに富む、カチオン性ペプチド真菌に対して強力な成長抑制活性を示す、マイクロモル濃度でこれら病原体5,6に対する防御の最初の行の 1 つを表す oomycete の病原体。彼らの強力な抗真菌活性のためディフェンシンを agribiotechnological 耐病性作物を生成するアプリケーションで利用できます。いくつかの植物のディフェンシンの構成過剰発現トランスジェニック作物6温室効果とフィールド テストでの耐病性を強化する示されています。作物保護のための効果的なツールとしての可能性を完全に活用するためにこれらの抗真菌ペプチドの作用 (MOA) のメカニズムを解明することが重要です。しかし、これらの植物のディフェンシンの MOA はよくわかっていません。現在の証拠は、異なる MOA5,6,7、8を示す示唆しています。いくつかのディフェンシン、細胞外菌に関する法律、特定細胞壁/プラズマ スフィンゴ脂質膜居住者を対象、膜の完全性を中断させ、細胞毒性経路9,10,11をアクティブにします。最近では、ただし、真菌細胞に若し抗真菌のディフェンシンは、発見された12,13,14をされています。いくつかのこれらのディフェンシンは膜居住者生理活性脂質をバインド、オリゴマー複合体を形成し、permeabilize 血しょう膜15,16,17。したがって、植物のディフェンシンの MOA のいくつかの側面が解明されました。しかし、可能性があります植物のディフェンシンの MOA は複雑な一連のイベントはまだ識別されてし、包括的なモデルに統合を伴います。特に、これらのペプチドの細胞内標的への理解に大きなギャップが残っています。
顕微鏡技術と新規蛍光プローブの開発における最近の進歩と、抗菌ペプチド (アンペア) のモアを勉強する生細胞イメージング技術が多用されます今。これらの技術は、抗真菌ペプチドの形態に及ぼす影響を分析するためにほとんど採用されているタバコプロトプ、電子顕微鏡、原子間力顕微鏡や x 線トモグラフィー18など広く使われている方法を補完して真菌細胞細胞壁の完全性、膜透過と同様、細胞成長/分岐パターンの変化の調査を含むと殺害の成長。それにもかかわらず、これらの研究は治療を実行するのではなくペプチド ディフェンシンの挑戦への応答で動的な変更を監視する同じセルでイメージの時間経過後特定の時点でのセルの画像に限られています。近年、生きているセルの共焦点顕微鏡を用いたイメージングと組み合わせて蛍光標識ペプチドの使用はアンプ-微生物間相互作用のダイナミクスの実時間可視化を有効にしています。両方で自然浄化し、蛍光ラベルでタグを化学的に合成された抗真菌ペプチドできます (例えばDyLight、ローダミン、BODIPY、または Alexa Fluor 基づく染料) および時間経過で細胞との相互作用の中に直接観察住セルイメージ投射。これらのペプチドの標識の使用は、エントリ、細胞内局在、細胞内輸送、および真菌細胞内抗真菌作用のサイトのモードを含む、MOA のさまざまな側面の理解を増加している大幅18。
最近では、いくつかの研究は、植物のディフェンシンを含む様々 な抗真菌ペプチドが住んでいる真菌細胞12,14,19,20で内面が示されています。可能性が高いこれらのディフェンシンの MOA は、細胞内ターゲットとの相互作用を含みます。我々 は最近、2 つ子嚢菌の菌類、アカパンカビとムギ類赤かび病菌の MtDef4 をディフェンシン植物の抗真菌作用を報告しています。MtDef4 は、真菌細胞のエントリと14これらの菌類の細胞内局在性に様々 な経路を使用する示されました。この研究化学合成テトラメチル ローダミン (耽羅)-重要な蛍光染料 (膜の選択的色素、FM4 64; 膜側の透過物染料、SYTOX グリーン propidium ヨウ化細胞死レポーター色素) との組み合わせで MtDef4 というラベルの付いた、代謝阻害剤。これらの分析は、MtDef4、その細胞内輸送機構とその細胞内ターゲット14の内面化の動態を示した。
ここでは、共焦点顕微鏡を用いた住セルイメージ投射のためのプロトコルが表示されます。プロトコルは、特に植物のディフェンシンと菌類の関係を研究する重要な蛍光染料、転流の経路および真菌細胞ディフェンシンの細胞内ターゲットとの組み合わせで蛍光標識ペプチドを利用しています。
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Protocol
1. fluorophores が付いているディフェンシンのラベリング
- 生きている細胞の中の抗菌特性吸収、ディフェンシンの局在に最小限の影響を持つ蛍光体を選択します。
注: 最適な蛍光を選択する特定の実験的な目的によって異なります。スペクトル的性質、光安定性、サイズ、蛍光体の充電も考慮する必要があります。 - ラベルは、ラベリング キット商用ベンダーから利用できる適切なペプチドを使用して選択した蛍光のディフェンシン。また、蛍光標識ディフェンシンを化学合成します。本研究では DyLight550 と MtDef5 がディフェンシン ラベル製造元のプロトコルとテトラメチル ローダミン (タムラ) によるとキット商業ラベリングを使用-商業的化学的に合成されたラベル付き MtDef4 ディフェンシンします。
注: お勧め (特に短いペプチド アミノ酸 50 以下) の化学的合成蛍光タグ付きペプチドを使用し、それらが蛍光体に最小限の影響をようにペプチドの N 末端または C 末端残基に付けることができるので、抗菌作用。以上の 3 つのジスルフィド結合を持つ長鎖ペプチドの合成は困難です。この場合、そのペプチド ラベリング キット適切な市販ペプチドを用いた最適な蛍光でラベルを付けることをお勧めします。 - ラベル付きのディフェンシンの抗菌活性の in vitroテストし、調査する菌類に対する最小発育阻止濃度 (MIC) を決定します。
注: 本研究では、DyLight550 MtDef5 と TMR MtDef4 のマイクはアカパンカビとかび決定しました。
2. 真菌培養、培
- フォーゲルの寒天培地21を有するチューブを傾斜し、5 日間の光の下で室温で孵化させなさいn. の crassaの株式文化から分生子を転送します。
- 5 日間の完全な媒体 (CM)22 28 ° C でを含むプレートf. 麦類PH 1 ひずみの文化.分生胞子の生産、カルボキシメチル セルロース (CMC) 媒体 (15 g カルボキシメチル セルロース、酵母エキス、0.5 g MgSO4.7 H2O、1 g NH 1 g の 50 mL にf. 麦類PH 1 の 5 日間の古い文化の 4 (直径 10 mm) プラグを接種します。4ない3および 1 g KH2PO4) 文化 180 rpm で回転式シェーカーで 28 ° C で 4-7 日間。
3 胞子懸濁液の準備
- F. 麦類胞子懸濁液
- 渦・ f ・麦類の液体培養と 2 mL 遠心チューブに 1.5 mL (Miracloth) などのろ過材の 2 つの層を介して培養菌糸をフィルタ リングによって収集分生胞子。2 分間遠心 g 速度 x 13,226 分生子懸濁液を遠心します。
- 、上澄みを廃棄し、ペレットを洗浄する滅菌水 1 mL を加えます。
- 上澄み 13,226 g 倍速 2 分破棄の遠心機での分生胞子懸濁液を遠心し、2 X SFM (合成真菌メディア)23の 1 mL にペレットを再懸濁します。
- 光学顕微鏡の下で検定を使用して分生子をカウントします。
- 2 X SFM と 10 の5分生胞子/mL に胞子懸濁液を調整します。
- N. の crassa胞子懸濁液
- 少量のn. の crassaのフォーゲルの液体培地 2 mL を含む微量遠心チューブに接種ループを使っての成長文化 (5 日古い) を転送します。
- 渦胞子懸濁液および新しい微量遠心チューブにろ過材を介してフィルター。
- 遠心分離機の 2 分破棄の遠心機で最高速度で胞子懸濁液上清とフォーゲルの液体培地 1 mL で分生胞子のペレットを再懸濁します。
- 光学顕微鏡の下で検定を使用して分生子をカウントします。
- フォーゲルの液体培地と 10 の5分生胞子/mL に胞子懸濁液を調整します。
4. 試料調製及び共焦点顕微鏡
- MtDef4 は、真菌細胞にディフェンシンの内局
- 35 mm ガラス底マイクロウェル培養皿の 10 mm マイクロウェルに各胞子懸濁液 (105分生胞子/mL) の 50 μ L をピペットします。分生胞子の観察のため直接胞子準備、 n. の crassaのF. 麦類ピペット 50 μ L、次のステップに 35 mm の培養皿に分生胞子を続行させ室温で 3-6 h の発芽します。
- マイクロウェル皿ごとにマイクに蛍光に分類されたディフェンシンの 50 μ L を追加し、2.5 時間孵化させなさい。蛍光標識ディフェンシンここで使用 (手順 1.3) のマイクはn. の crassaのF. 麦類3 μ M およびn. の crassaのF. 麦類TMR MtDef4 のマイクはそれぞれ 1 μ M と 12 μ M。
- 2 μ L 膜選択的色素 FM4 64 を追加 (最終濃度: 5 μ M) 文化の料理し 30 分間インキュベートし、共焦点顕微鏡イメージングのためにすぐにマウントします。
- ホワイト ライト レーザー (WLL) を選択します。使用して、2 つのレーザー ソース 488 nm、550 nm それぞれ TMR MtDef4 と FM4 64 色素を励起します。TMR MtDef4 の 580-700 nm の蛍光を検出し、690-800 nm FM4 64 染料を検出します。
注: は、暗い部屋で共焦点顕微鏡を実行します。
- MtDef5 ディフェンシンの内面化のタイムラプス イメージング
- 35 mm ガラス底マイクロウェル培養皿の 10 mm マイクロウェルにn. の crassaとf. 麦類胞子懸濁液 (105分生胞子/mL) の 50 μ L をピペットします。10 mm マイクロウェルでコーティングではない、下部に 1.5 号カバー ガラス。分生胞子の観察、直接次の手順に進みます。胞子の観察、顕微鏡検査を行う前に室温で 3-6 h の分生胞子を孵化させなさい。
- WLL を入れます。550 でレーザー ラインを選択、1.00% の強度と蛍光標識ディフェンシンここで使用 (手順 1.3) と FM4 64 をエキサイトして対応する検出器をアクティブにする nm。560 600 nm での蛍光ラベル ディフェンシンここで使用 (手順 1.3) が検出されましたし、690-800 nm で FM4 64dye が検出されました。
注: は、ライブセル イメージング ライブ真菌細胞への損傷を引き起こす可能性があるため、高いレーザー強度の低いレーザー強度を使用します。 - 顕微鏡をマイクロウェル皿をマウントします。当初は、10 倍の目標を使用してセルを検索し、100 倍に切り替える/1.44 高倍率を石油目的。
メモ: 設定スキャン モード xyzt (Z スタックとタイムラプス モードの組み合わせ)、Z 位置、ズーム、イメージ キャプチャ等の周波数。
注: 追加のディフェンシンと蛍光顕微鏡に取り付けマイクロウェル皿関心領域、焦点がぼけることができます後。したがって、ディフェンシンと蛍光体をマイクロウェルに追加する、関心領域必要がありますが再度焦点画像収集の遅延が発生することができます。
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Representative Results
ライブを追跡および比較インターナライゼーションと 2 つのディフェンシン、MtDef4、MtDef5、ウマゴヤシ分子; からの細胞内局在細胞イメージングを行った真菌の細胞。一方、MtDef5 は、Dylight550 が付いていた TMR MtDef4 化学的に合成した (Dylight550-MtDef5)。分生胞子膜の選択的色素 FM4 64 との組み合わせでいずれかのディフェンシンを添加されました。図 1は、TMR MtDef4 では、 n. の crassaのF. 麦類と比較しての様々 な輸送経路を示しています。N. の crassaの FM4 64 共同、ディフェンシンとローカライズされていないが、むしろ液胞内に隔離されます、ディフェンシンの膜の汚れ。F. 麦類で、他の一方で、TMR MtDef4 任意のバインドされている特定の膜細胞小器官内でローカライズされていないが (図 1) 細胞質に拡散されます。
蛍光標識ディフェンシンここで使用 (手順 1.3) と FM4 64 ショー、ディフェンシンは真菌細胞治療 (図 2) の 30 に 40 分以内を入力することができることの両方が付いたn. の crassa細胞タイムラプス イメージング。セルに入る際、蛍光標識ディフェンシンここで使用 (手順 1.3) 任意の特定の細胞小器官内でローカライズされていないが、容易に細胞質に拡散します。これはn. の crassa細胞に入ると治療 (図 1) の 3 時間後も小胞体の中で閉じ込められたまま TMR MtDef4 とは対照的です。
図 1: MtDef4 n. の crassaの様々 な輸送経路には、 ・ f ・麦類。TMR-MtDef4 (A) のn. の crassaの小胞体にローカライズしますが、 f. 麦類(B) の細胞質に拡散されます。N. の crassaのF. 麦類分生子が共同 12 μ M と 1 μ M のラベルが付いた TMR MtDef4 (赤)、それぞれと FM4-64 (緑)。治療の 3 時間後に撮影されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: MtDef5 n. の crassaの内面化および細胞内を拡散させます。DyLight550 MtDef5 n. の crassa細胞を内面化し、細胞質に拡散させます。N. の crassa細胞は、DyLight550 MtDef5 (赤) と FM4-64 (グリーン) 共同 3 μ M で付けられました。2 時間 30 分に撮影しました。MtDef5 の追加、画像集録の開始の間の遅延は 5 分スケール バー = 4 μ m。 してくださいこのビデオを見るにはこちらから。(右クリックしてダウンロード)
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Discussion
この研究では、信頼性の高い蛍光に分類された真菌ディフェンシンを使って生細胞イメージング方法論は、真菌細胞にこれらのペプチドの内面化の動力学を調査し、その細胞内ターゲットを決定する記述されていた。このメソッドは、時間的、空間的にディフェンシンと真菌細胞の相互作用のダイナミクスを可視化する強力なツールです。
様々 な方法は、内面化と植物のディフェンシン真菌細胞の細胞内局在性に関する研究に使用されています。これらのメソッドでは、ディフェンシン処理細胞が通常固定し、タバコプロトプ、電子顕微鏡や x 線トモグラフィー15,24,25処理します。さらに、これらの技術のほとんどは細胞ディフェンシンの挑戦への応答で行われる動的な変更を監視する同じ生体細胞タイムラプス イメージングを使用してリアルタイムではなく、特定の時点でのイメージングに制限されています。視覚化、分析および動的イベント ディフェンシンの抗真菌作用中にリアルタイムで真菌の細胞で場所を取って比較する能力は、効果的かつエキサイティングなこの手法をなります。さらに、ペプチドの動的な細胞内局在が時間と個々 の真菌細胞の形態形成に及ぼす影響のより良い理解を提供します。
このメソッドの重要な側面の 1 つは、重要な蛍光染料 (例えば FM4-64; と共に蛍光に分類されたペプチドを用いた細胞内ターゲットを決定することです。SG)。内局は、ペプチドが動作し、その相互作用パートナー、関数、および細胞機械装置26,27の潜在的な役割の解明に向けた重要なステップを表す環境を決定します。
この技法のマイナーな制限は蛍光ペプチドが多くの場合ラベルのないペプチドに比べ減少の抗真菌活性を展示です。ペプチド市販ペプチド ラベリング キットを使用してラベル付けは抗真菌活性の完全な損失を示して 場合は、ラベルの付いた小さな蛍光体 N 末端または C 領域ので化学的に合成されたペプチドをお勧めします。
要約すると、生きている細胞の蛍光タグ ディフェンシンに挑戦真菌細胞のイメージングは抗真菌ディフェンシンの MOA の直接の高時空間的解像度を提供することができます効果的なツールです。正確なモア研究のためこの手法と併用できる蛍光寿命イメージング他のペプチドまたはその他標識分子や細胞のペプチドの相互作用動態を測定できるようになります (FLIM)28リアルタイムで成分。これは抗菌ペプチド動作により農業と医学で使用するため抗真菌薬としての開発のスピードアップ方法の我々 の理解を豊かに。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
我々 は博士 r. ハワード ベルク、ドナルド ・ ダンフォース植物科学研究センター、彼の指導のための統合された顕微鏡施設の監督に感謝し、共焦点顕微鏡に役立ちます。著者は宣言する利害の対立があります。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FM4-64 Dye | Life Technologies | T13320 | |
| DyLight 550 Antibody Labeling Kit | Thermo Scientific | 84530 | |
| Glass Bottom Microwell Dishes | Mat TeK | P35G-1.5-10-C | |
| Mira cloth | EMD Millipore Corp | 475855-1R | |
| SP8-X confocal microscope | Leica | ||
| ImageJ software | FiJi | For Image analysis | |
| Imaris software | Bitplane | For Image analysis |
References
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