Summary
Pflanzlichen Defensine spielen eine wichtige Rolle in der Verteidigung der Pflanze gegen Krankheitserreger. Für effektive Nutzung dieser antimykotische Peptide als Antimykotika, verstehen ihre Wirkungsweisen (MOA) entscheidend ist. Hier ist eine live-Cell-imaging-Methode beschrieben, um kritische Aspekte der MOA dieser Peptide zu studieren.
Abstract
Kleinen Cystein-reiche Defensine sind eine der größten Gruppen von Host Verteidigung Peptiden in allen Pflanzen vorhanden. Viele pflanzlichen Defensine potente in Vitro antimykotische Aktivität gegen ein Breitspektrum Pilzerreger auszustellen und haben daher das Potenzial, als Antimykotika in transgenen Pflanzen verwendet werden. Um das volle Potenzial der Pflanze Defensine für Krankheiten Kontrolle zu erschließen, ist es wichtig, ihre Wirkmechanismen (MOA) aufzuklären. Mit dem Aufkommen der modernen Mikroskopiertechniken ist live Cell Imaging ein leistungsfähiges Werkzeug für das Verständnis der Dynamik von Antimykotika MOA von pflanzlichen Defensine geworden. Hier wird ein konfokalen Mikroskopie basierend live-Cell imaging Verfahren beschrieben mit zwei Eindringmittel bezeichnete Pflanze Defensine (MtDef4 und MtDef5) in Kombination mit lebenswichtigen Fluoreszenzfarbstoffen. Diese Technik ermöglicht Echtzeit-Visualisierung und Analyse der dynamischen Ereignisse der MtDef4 und MtDef5 Internalisierung in Pilzzellen. Wichtig ist, erzeugt dieser Assay eine Fülle von Informationen, einschließlich der Internalisierung Kinetik, Modus für die Einreise und subzelluläre Lokalisation dieser Peptide. Zusammen mit anderen biologischen Zelle-Tools haben diese Methoden kritische Einblicke in die Dynamik und Komplexität der MOA dieser Peptide zur Verfügung gestellt. Diese Tools können auch verwendet werden, die MOA dieser Peptide gegen verschiedene Pilze zu vergleichen.
Introduction
Pflanzen haben eine anspruchsvolle angeborene Immunsystem zur Abwehr der mikrobiellen Werk Krankheitserreger1entwickelt. Sie äußern zahlreiche Gen kodiert Host Verteidigung Peptide mit vermeintlichen antimikrobielle Aktivität2. In der Tat, viele dieser Peptide antimikrobielle Aktivität in Vitro3anzeigen Defensine bilden eine der größten Gruppen von Host Verteidigung Peptiden in der Pflanze Königreich4. Diese reich an Cystein, kationischen Peptide zeigen starkes Wachstum hemmende Aktivität gegen Pilz- und Eipilz Krankheitserreger in mikromolaren Konzentrationen und repräsentieren eine der ersten Linien der Verteidigung gegen diese Erreger5,6. Wegen ihrer starken antimykotische Aktivität kann Defensine ausgenutzt werden, in Agribiotechnological Anwendungen um Krankheiten resistente Pflanzen zu erzeugen. Konstitutive Überexpression von mehreren pflanzlichen Defensine hat sich gezeigt, Resistenz gegen Krankheiten in Gewächshaus und Freiland-Tests von transgenen Pflanzen6zu verbessern. Es ist wichtig, die Mechanismen der Wirkung (MOA) dieser antimykotische Peptide zu entwirren, um ihr Potenzial voll und ganz als wirksame Instrumente für den Pflanzenschutz zu erschließen. Die MOA diese Pflanze Defensine sind jedoch kaum erforscht. Aktuelle Hinweise darauf, dass sie verschiedene MOA5,6,7,8aufweisen. Einige Defensine wirken extrazellulär auf Pilze und gezielt bestimmte Zellwand/Plasma Membran resident Sphingolipide, Membran Integrität stören und aktivieren zelluläre Toxizität Wege9,10,11. Jedoch vor kurzem, wurden antimykotische Defensine, die in Pilzzellen translozieren entdeckten12,13,14. Einige von diesen Defensine binden an Membran-Resident bioaktive Phospholipide, bilden Oligomere komplexe und Plasmamembranen15,16,17permeabilize. So haben einige Aspekte des MOA von pflanzlichen Defensine aufgeklärt. Allerdings beinhalten die MOA von pflanzlichen Defensine wahrscheinlich eine komplexe Reihe von Ereignissen, die noch nicht identifiziert und in ein umfassendes Modell integriert wurden. Insbesondere bleibt eine große Lücke in unserem Verständnis der zellulären Ziele dieser Peptide.
Mit jüngsten Fortschritte in der Mikroskopie-Technologien und die Entwicklung von neuen fluoreszierende Sonden sind Leben-Zelle bildgebende Verfahren jetzt häufig verwendet, um die MOA antimikrobielle Peptide (AMPs) zu studieren. Diese Techniken ergänzen verbreitete Methoden wie Immunolocalization, Elektronenmikroskopie, Rasterkraftmikroskopie oder Röntgen-Tomographie18, die angewandt wurden, vor allem auf die Auswirkungen von Antimykotika Peptiden auf die Morphologie zu analysieren und Wachstum von Pilzzellen einschließlich der Untersuchung der Zellwand Integrität, Veränderungen in der Zelle Wachstum/Verzweigung Muster sowie Permeabilisierung der Plasmamembran und töten. Allerdings wurden diese Studien beschränkt Imaging Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt nach der Behandlung mit der Peptide anstatt Zeitraffer-Aufnahme die gleichen Zellen, ihre dynamischen Veränderungen in Reaktion auf defensin Herausforderung zu überwachen. In den letzten Jahren hat die Verwendung von Eindringmittel beschriftete Peptide in Verbindung mit live Cell imaging mit der konfokalen Mikroskopie Echtzeit-Visualisierung der Dynamik des AMP-Mikroben-Interaktionen ermöglicht. Beide natürlich gereinigt und chemisch synthetisierten antimykotische Peptide können mit Fluoreszenzmarkierungen markiert werden (z.B., DyLight, Rhodamin, BODIPY oder Alexa Fluor basierend Farbstoffe) und direkt während ihrer Interaktion mit Zellen von Time-Lapse beobachtet Live Cell Imaging. Die Verwendung dieser Peptide beschriftet unser Verständnis für die verschiedenen Aspekte der ihre MOA einschließlich Modus Eintritt, subzelluläre Lokalisation, intrazellulären Menschenhandel und Websites antimykotische Maßnahmen im lebenden Pilzzellen deutlich gestiegen 18.
Vor kurzem, haben mehrere Studien gezeigt, dass verschiedene Antimykotika Peptide einschließlich Anlage Defensine Leben Pilzzellen12,14,19,20internalisiert werden. Die MOA diese Defensine wahrscheinlich beinhalten Interaktion mit intrazellulären Ziele. Wir haben vor kurzem die antimykotische Wirkung von einer Pflanze defensin MtDef4 in zwei Schlauchpilz Pilzen, Neurospora Crassa und Fusarium Graminearumberichtet. MtDef4 wurde gezeigt, um verschiedene Wege für die Pilzzelle ein- und subzelluläre Lokalisation in diesen Pilzen14zu verwenden. Diese Studie verwendet chemisch synthetisiert Tetramethyl Rhodamin (TAMRA)-mit der Bezeichnung MtDef4 in Kombination mit lebenswichtigen Fluoreszenzfarbstoffen (Membran-permeationsfähigen Farbstoff, SYTOX Green, der Membran selektiv Farbstoff, FM4-64; der Zelle Tod Reporter Farbstoff, Propidium Jodid) und metabolische Inhibitoren. Diese Analysen zeigten die Kinetik der Internalisierung von MtDef4, die Mechanismen der intrazellulären Transport und seine subzelluläre Ziele14.
Hier ist ein Protokoll für live Cell Imaging mit der konfokalen Mikroskopie vorgestellt. Das Protokoll nutzt Eindringmittel beschriftete Peptide in Kombination mit lebenswichtigen Fluoreszenzfarbstoffen Pflanze defensin-Pilz-Interaktionen, insbesondere zu studieren, die Pfade der Translokation und die intrazellulären Ziele der Defensine in Pilzzellen.
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Protocol
1. Kennzeichnung der Defensine mit Fluorophore
- Wählen Sie eine Fluorophore, die minimale Auswirkungen auf die antimikrobiellen Eigenschaften sowie die Aufnahme und Lokalisierung von defensin innerhalb der lebenden Zelle hat.
Hinweis: Optimale Fluorophor Auswahl richtet sich nach experimentellen Einzelziele. Spektrale und chemischen Eigenschaften, Photostabilität, Größe und Ladung der Fluorophor sollten berücksichtigt werden. - Label defensin mit den ausgewählten Fluorophor mit einer entsprechenden Peptid labeling Kit von kommerziellen Anbietern erhältlich. Alternativ synthetisieren Sie chemisch Defensine Fluorophore beschriftet. In dieser Studie beschriften MtDef5 defensin mit DyLight550 mit einer kommerziellen Kennzeichnung gemäß des Herstellers Protokoll und Tetramethyl Rhodamin (TAMRA) kit-beschrifteten MtDef4 defensin kommerziell chemisch synthetisiert wurde.
Hinweis: Es wird empfohlen, dass chemisch synthetisierten Fluorophor getaggt Peptide (vor allem für kurze Peptide von bis zu 50 Aminosäuren) verwendet werden, da die N - oder C-terminalen Rückstände des Peptids zu gewährleisten minimale Auswirkungen auf das Fluorophor befestigt werden kann seine antimikrobielle Aktivität. Synthese von langen Peptiden mit mehr als drei Disulfid-Bindungen ist eine Herausforderung. In diesem Fall empfiehlt es sich das Peptid mit einer optimalen Fluorophor mit ein geeigneten handelsüblichen Peptid labeling Kit gekennzeichnet werden. - In-vitro- antimikrobielle Aktivität des beschrifteten defensin testen und bestimmen der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) gegen die Pilze untersucht werden.
Hinweis: In dieser Studie wurde die MIC der DyLight550-MtDef5 und TMR-MtDef4 gegen Neurospora Crassa und Fusarium Graminearumermittelt.
(2) Pilzkulturen und Wachstumsmedium
- Übertragen Sie Konidien aus einer N. Crassa Lager Kultur schräg Röhrchen mit Vogels Agar mittlere21 und 5 Tage bei Raumtemperatur unter Licht inkubieren.
- Kultur F. Graminearum PH-1-Stamm auf Tellern mit komplette mittlere (CM)22 auf 28 ° c für 5 Tage. Impfen Sie für die Produktion der Konidien 4 (10 mm Durchmesser) Stecker 5 Tage alten Kultur der F. Graminearum PH-1 in 50 mL Carboxymethylcellulose Zellulose (CMC) Medium (15 g Carboxymethylcellulose Zellulose, 1 g Hefeextrakt, 0,5 g MgSO4.7 H2O, 1 g NH 4 KEINE3und 1 g KH2PO4) und Kultur für 4-7 Tage bei 28 ° c in einem Dreh Shaker bei 180 Umdrehungen pro Minute.
3. Vorbereitung der Conidial Suspension
- F. Graminearum conidial Aufhängung
- Wirbel der Flüssigkultur F. Graminearum und sammle Konidien durch das Filtern von 1,5 mL pilzartige Kultur durch zwei Schichten von Filtermaterial (z. B. Miracloth) zu einem 2 mL Microcentrifuge Schlauch. Zentrifugieren Sie die conidial Aufhängung an 13.226 x g Geschwindigkeit in einem Microcentrifuge für 2 min.
- Verwerfen Sie den Überstand, und fügen Sie 1 mL sterilem Wasser um die Pellets zu waschen.
- Zentrifugieren Sie conidial Aufhängung an 13.226 x g Geschwindigkeit in einem Microcentrifuge für 2 min. verwerfen überstand und Aufschwemmen Sie das Pellet in 1 mL 2 X SFM (synthetische Pilz Medien)23.
- Zählen Sie die Konidien, die mit einem Hemocytometer unter einem Lichtmikroskop.
- Passen Sie die conidial Aufhängung 105 Konidien/mL mit 2 X SFM.
- N. Crassa conidial Aufhängung
- Eine kleine Menge (5 Tage alt) wachsende Kultur von N. Crassa mit einer Impfung-Schleife zu einem Microcentrifuge Schlauch mit 2 mL des flüssigen Mediums Vogels zu übertragen.
- Wirbel conidial Federung und Filter durch Filtermaterial zu einem neuen Microcentrifuge Schlauch.
- Zentrifugieren der conidial Suspension mit maximaler Geschwindigkeit in einem Microcentrifuge für 2 min. verwerfen des Überstands und conidial Pellet in 1 mL des flüssigen Mediums Vogels aufzuwirbeln.
- Zählen Sie die Konidien, die mit einem Hemocytometer unter einem Lichtmikroskop.
- Passen Sie die conidial Aufhängung 105 Konidien/mL mit Vogels flüssigen Mediums.
4. Probieren Sie Vorbereitung und konfokale Mikroskopie
- Subzelluläre Lokalisation der MtDef4 defensin in Pilzzellen
- Pipette 50 µL der einzelnen conidial Suspension (105 Konidien/mL) in 10 mm Microwell von 35 mm unten Microwell Glasschalen. Für die Beobachtung der Konidien direkt fahren Sie fort mit dem nächsten Schritt fort, oder für Germlings Vorbereitung, Pipette 50 µL N. Crassa und F. Graminearum Konidien in die 35 mm-Kultur-Gerichte und für 3-6 h bei Zimmertemperatur Keimen zu lassen.
- Fügen Sie 50 µL Eindringmittel beschrifteten defensin am MIC zu jedem Microwell-Gericht und 2,5 h inkubieren. Das Mikrofon des Fluorophore beschriftet Defensine hier verwendet (Schritt 1.3) ist 3 µM für N. Crassa und F. Graminearum und das Mikrofon des TMR-MtDef4 für N. Crassa und F. Graminearum betrug 1 µM und 12 µM bzw..
- Fügen Sie 2 µL der Membran-selektiven färben FM4-64 (Endkonzentration: 5 µM) in Kultur Gericht und 30 min inkubieren und sofort auf die confocal Mikroskop für die Bildgebung zu montieren.
- Wählen Sie den weiße Licht-Laser (WLL). Verwenden Sie die zwei Laser Quellen 488 nm und 550 nm, TMR-MtDef4 und FM4-64 Farbstoff bzw. begeistern. Fluoreszenz des TMR-MtDef4 bei 580-700 nm zu erkennen und FM4-64 Farbstoff bei 690-800 nm zu erkennen.
Hinweis: Führen Sie konfokalen Mikroskopie in den dunklen Raum.
- Time Lapse Bildgebung der Internalisierung von MtDef5 defensin
- Pipette 50 µL N. Crassa und F. Graminearum conidial Suspension (105 Konidien/mL) in 10 mm Microwell von 35 mm unten Microwell Glasschalen. Die 10 mm Microwell ist unbeschichtet und hat eine Nr. 1.5 Deckglas an der Unterseite. Fortfahren Sie für die Beobachtung der Konidien direkt mit dem nächsten Schritt. Inkubieren Sie für die Beobachtung von Germlings Konidien für 3-6 h bei Raumtemperatur bevor Sie mit der Mikroskopie.
- Schalten Sie WLL. Wählen Sie die Laserlinie bei 550 nm begeistern die Fluorophore beschriftet Defensine hier verwendet (Schritt 1.3) und FM4-64 mit 1,00 % Intensität und aktivieren Sie die entsprechende Detektoren. Fluorophore beschriftet Defensine hier verwendet (Schritt 1.3) wurde gefunden bei 560-600 nm und die FM4-64dye bei 690-800 nm erkannt wurde.
Hinweis: Verwenden Sie niedrige Laserintensität für live Cell imaging, da hohe Laserintensität live Pilzzellen beschädigen kann. - Montieren Sie die Microwell-Schüssel am Mikroskop. Die Zellen mit 10 X Ziele zunächst zu finden, wechseln Sie dann zu 100 X / 1,44 Öl Ziel für höhere Vergrößerung.
Hinweis: Standardmäßig den Scan-Modus mit Xyzt (Kombination von Z-Stapel und Zeitraffer-Modus), Z-Position, Zoom, Häufigkeit der Bilderfassung, etc..
Hinweis: Hinzufügen von defensin und Fluorophor nach Montage Microwell Gericht im Mikroskop des Interessenbereichs defocus kann. Daher muss nach der Microwell defensin und Fluorophor hinzufügen, Interessenbereich neu ausgerichtet werden die Verzögerung bei der Bildaufnahme hervorrufen können.
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Representative Results
Live Cell Imaging wurde durchgeführt, um zu verfolgen und vergleichen Sie die Internalisierung und subzelluläre Lokalisation der zwei Defensine, MtDef4 und MtDef5 von Medicago Truncatula; in Pilzzellen. TMR-MtDef4 wurde chemisch synthetisiert, während MtDef5 mit Dylight550 beschriftet war (Dylight550-MtDef5). Konidien inkubiert mit entweder defensin in Kombination mit der Membran selektiv Farbstoff FM4-64. Abbildung 1 zeigt, dass TMR-MtDef4 verschiedene Handel Wege in N. Crassa F. Graminearumgegenüber. In N. CrassaFM4-64 wird nicht zusammen mit der defensin lokalisieren sondern eher Flecken die Membranen der Vakuolen, innerhalb, die derer die defensin abgesondert wird. In F. Graminearumauf der anderen Seite TMR-MtDef4 ist nicht in einer speziellen Membran gebunden Organellen lokalisiert aber verbreitet im Zytoplasma (Abbildung 1).
Zeit Ablauf Bildgebung von N. Crassa Zellen beschriftet mit dem Fluorophor-Label Defensine hier verwendet (Schritt 1.3) und die FM4-64 zeigt, dass die defensin Pilzzellen innerhalb von 30 bis 40 Minuten Behandlung (Abbildung 2) eingeben. Bei der Einreise in die Zellen Fluorophore beschriftet Defensine hier verwendet (Schritt 1.3) nicht innerhalb einer bestimmten Organell zu lokalisieren aber leicht diffundiert in das Zytoplasma. Dies steht im Gegensatz zu TMR-MtDef4, welche in N. Crassa Zellen und bleibt auch nach 3 Stunden Behandlung (Abbildung 1) in die vesikuläre Körper gefangen.
Abbildung 1: MtDef4 hat verschiedene Wege des Drogenhandels in N. Crassa und F. Graminearum. TMR-MtDef4 in vesikuläre Körper in N. Crassa (A) lokalisiert, sondern ist in das Zytoplasma der F. Graminearum (B) diffundiert. Konidien von N. Crassa und F. Graminearum wurden Co beschriftet mit 1 µM und 12 µM TMR-MtDef4 (rot), bzw. mit FM4-64 (grün). Bilder wurden nach 3 h Behandlung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: MtDef5 von N. Crassa verinnerlicht und diffundiert in die Zellen. DyLight550-MtDef5 in N. Crassa Zellen verinnerlicht und diffundiert in das Zytoplasma. N. Crassa Zellen wurden mit 3 µM DyLight550-MtDef5 (rot) und FM4-64 (grün) Co beschriftet. Video wurde für 2 h und 30 min aufgezeichnet. Die Verzögerung zwischen den Zusatz von MtDef5 und Start der Bildaufnahme war 5 min. Skala bar = 4 µm. bitte hier klicken, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
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Discussion
In dieser Studie wurde eine zuverlässige live-Cell Image Methodik mit dem Einsatz von Eindringmittel beschrifteten antimykotische Defensine beschrieben, die Kinetik der Internalisierung dieser Peptide in Pilzzellen zu studieren und ihre subzelluläre Ziele zu bestimmen. Diese Methode ist ein mächtiges Werkzeug, um die Dynamik der Interaktion zwischen Defensine und Pilzzellen zeitlich und räumlich zu visualisieren.
Verschiedene Methoden wurden zur Untersuchung der Verinnerlichung und intrazelluläre Lokalisation der Pflanze Defensine in Pilzzellen. In diesen Methoden sind defensin-behandelten Zellen in der Regel fixiert und dann für Immunolocalization, Elektronenmikroskopie oder Röntgen-Tomographie15,24,25verarbeitet. Darüber hinaus wurden die meisten dieser Techniken eingeschränkt zu imaging Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt und nicht in Echtzeit mit Zeitraffer-Bildgebung der gleichen lebenden Zellen, um die dynamischen Veränderungen in Reaktion auf defensin Herausforderung zu überwachen. Die Fähigkeit zu visualisieren, analysieren und vergleichen Sie die dynamische stattfindenden in Pilzzellen in Echtzeit, während die antimykotische Wirkung der Defensine macht diese Technik effektiv und spannend. Darüber hinaus bietet es besseren zu verstehen wie die dynamische intrazelluläre Lokalisation des Peptids der Morphogenese von einzelnen Pilzzellen mit der Zeit beeinflusst.
Einer der wichtigsten Aspekte dieser Methode ist die Bestimmung der subzellulären Zielen Eindringmittel beschriftete Peptide zusammen mit lebenswichtigen fluoreszierende Farbstoffe (z. B. FM4-64; (SG). Subzelluläre Lokalisation bestimmt die Umwelt, in der eine Peptid betreibt, und ist ein wichtiger Schritt in Richtung Aufklärung seinen Interaktionspartnern, Funktion und mögliche Rollen in der zellulären Maschinerie26,27.
Eine kleine Einschränkung dieser Technik ist, dass das fluoreszierende Peptid oft reduzierten antimykotischen Aktivität im Vergleich zu den unbeschrifteten Peptid ausstellt. Wenn das Peptid ist beschriftet mit einem handelsüblichen Peptid labeling-Kit und vollständigen Verlust des antimykotische Aktivität zeigt, empfiehlt sich eine chemisch synthetisierte Peptid mit einem kleinen Fluorophor an seiner N - oder C-Terminus beschriftet.
In Zusammenfassung, live Zelle ist Bildgebung von Pilzzellen vor der Herausforderung, ein Fluorophor-Tags defensin ein wirksames Instrument, das direkte, räumlich-zeitliche hochauflösende von MOA von eine antimykotische defensin bieten kann. Für eine präzisere MOA Studie diese Technik Fluoreszenz Lifetime imaging-Mikroskopie (FLIM)28 kombinierbar mit Messung der Interaktion Kinetics eines Peptids mit anderen Peptiden oder andere markierte Moleküle oder Mobilfunknetz ermöglicht Bestandteile in Echtzeit. Dies wird unser Verständnis der Möglichkeiten bereichern, antimikrobielle Peptide Arbeiten beschleunigt so ihre Entwicklung als Antimykotika für den Einsatz in Landwirtschaft und Medizin.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir bedanken uns bei Dr. R. Howard Berg, Leiter der integrierten Mikroskopie-Einrichtung bei Donald Danforth Plant Science Center, für seine Beratung und Hilfe bei der konfokalen Mikroskopie. Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FM4-64 Dye | Life Technologies | T13320 | |
| DyLight 550 Antibody Labeling Kit | Thermo Scientific | 84530 | |
| Glass Bottom Microwell Dishes | Mat TeK | P35G-1.5-10-C | |
| Mira cloth | EMD Millipore Corp | 475855-1R | |
| SP8-X confocal microscope | Leica | ||
| ImageJ software | FiJi | For Image analysis | |
| Imaris software | Bitplane | For Image analysis |
References
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