Summary
ويصف هذا البروتوكول إعادة برمجة الابتدائي السلي السائل وغشاء الخلايا الجذعية الوسيطة في الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent استخدام نهج ابيسومال غير دمج في ظروف محددة بالكامل كيميائيا. وترد تفاصيل إجراءات استخراج والثقافة، وإعادة برمجة، وتوصيف الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent الناتجة بطرق صارمة.
Abstract
حصلت العلاج ذاتي يستند إلى الخلية على خطوة أقرب إلى الواقع مع الأخذ بالخلايا الجذعية المستحثة pluripotent. الخلايا الجذعية الجنينية، مثل السائل السلوى وغشاء الخلايا الجذعية الوسيطة، تمثل نوعا فريداً من خلايا غير متمايزة بالوعد في هندسة الأنسجة وإعادة برمجة في اللجنة التوجيهية للتدخلات المستقبلية في طب الأطفال والخلايا الجذعية المصرفية. يصف البروتوكول المعروضة هنا إجراء أمثل لاستخراج واستزراع الابتدائي السلي السائل وغشاء الخلايا الجذعية الوسيطة وتوليد ابيسومال الناجمين عن الخلايا الجذعية pluripotent من هذه الخلايا في ثقافة محددة بالكامل كيميائيا شروط استخدام فيترونيكتين الماشوب البشري والمتوسطة E8. ويرد أيضا وصف خطوط جديدة بتطبيق أساليب صارمة – التدفق الخلوي والتصوير [كنفوكل]، وتشكيل تيراتوما والتنميط النسخي –. الأسطر التي تم إنشاؤها حديثا تعبر عن علامات للخلايا الجذعية الجنينية – Oct3/4A، نانج، Sox2، وهيئة تنظيم الاتصالات-1-60، وهيئة تنظيم الاتصالات-1-81، سا-4 – بينما يجري سلبية بالنسبة لعلامة سا-1. خطوط الخلايا الجذعية تشكل تيراتوماس في الفئران بيج مشمولان في 6-8 أسابيع وتيراتوماس تحتوي على أنسجة تمثيلية من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث. التنميط النسخي للخطوط بتقديم البيانات ميكرواري التعبير العالمي إلى خوارزمية تقييم بلوريبوتينسي بيوينفورماتيك تعتبر جميع خطوط pluripotent وذلك، أن هذا النهج بديل جذاب للتجارب الحيوانية. يمكن بسهولة استخدام الخطوط التوجيهية الجديدة في المصب التجارب التي تنطوي على الاستفادة المثلى من التمايز وهندسة الأنسجة.
Introduction
تكنولوجيا الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent (اللجنة التوجيهية) يرتفع عن المخدرات والمرض والنمذجة التنموية، وعلاجات استبدال خلية المحتملة فحص السمية1،،من23. العلاج البديلة نظرياً يمكن أن يتحقق عن طريق حقن الخلايا، في المختبر متباينة زرع الأنسجة (مثل بقع القلب)، أو تسترشد التجديد عن طريق هندسة الأنسجة. السائل السلوى (أفسك) وغشاء الخلايا الجذعية (أمسك) مصدر ممتاز لخلايا لهذه التدخلات أما مباشرة4،5،،من67 أو كمحتوى خلية بداية لإعادة برمجة في بلوريبوتينسي8،،من910،،من1112.
استخدام نهج أوائل نظم الاستزراع غير معرف أو إعادة برمجة الأساليب التي تتطلب إدماج يستتبع الجينوم بنيات9،10،،من1112. دراسة حديثة تستخدم وسيلة خالية من كرة، حتى ولو تم استخدام مصفوفة مرفق غشاء أقل محددة (بم)، لإنشاء اللجنة التوجيهية من الخلايا الظهارية السائل السلوى. ومع ذلك، لم تدرج المقايسة تشكيل تيراتوما في الدراسة جنبا إلى جنب مع ثروة من البيانات الجزيئية وفي المختبر. تم العثور على الخلايا الظهارية السائل السلوى يكون من كفاءة إعادة برمجة أعلى 8-fold تقريبا بالمقارنة مع الخلايا الليفية الولدان13. في دراسة أخرى، وجد أيضا الخلايا الجذعية الوسيطة من السائل السلوى أن تعاد برمجتها في اللجنة التوجيهية بكثير أعلى كفاءة12.
يمكن أن تكون متباينة في أنسجة ممثل كل الطبقات الجرثومية 3 الخلايا الجذعية Pluripotent وهكذا تنطوي على إمكانات أوسع. طب الأطفال المرضى يمكن أن تستفيد من حصاد وإعادة برمجة، وهندسة الأنسجة بالخلايا الجذعية السائل السلوى ذاتي بريناتالي والخلايا الجذعية غشاء السلي الولادة. وعلاوة على ذلك، يمكن نظرياً المعونة المستوى المنخفض نسبيا للتفريق بين الخلايا الجذعية الجنينية (أقل من الخلايا الجذعية البالغة14،15) في التصدي لاستبقاء لوحظ تحيز جينية من الخلايا المصدر في اللجنة التوجيهية16.
نقدم هنا بروتوكولا لإعادة برمجة السائل السلوى وغشاء الخلايا الجذعية إلى بلوريبوتينسي في تعريف كيميائيا خالية من كرة متوسطة E8 في المؤتلف فيترونيكتين17 (VTN) باستخدام البلازميدات ابيسومال18. والميزة الرئيسية لخلايا السائل والغشاء السلي كمصدر للخلايا لإعادة برمجة يكمن في توافرها قبل والولادة وبالتالي هذا النهج سيفيد أساسا للبحث في هندسة الأنسجة طب الأطفال.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية المؤسسية للجنة الأخلاقيات البحثية البشرية. تم الحصول على موافقة خطية من المريض لاستخدام السائل السلوى للبحوث.
هذا البروتوكول يتبع سياسات رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة لجامعة جنوب ألاباما.
1-العزلة والثقافة من الخلايا الجذعية الوسيطة السلي الابتدائية
-
طلاء خلايا السائل السلوى
- الحصول على الحد أدنى من 2.5 مل سائل السلوى حصاد عملية بزل طبيب.
ملاحظة: يجب أن يتم التعامل مع كافة الخلايا الحية والأنسجة بمجلس وزراء زراعة أنسجة معقمة ويجب استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة. مطلوب الإلمام بالثقافة الخلية الأساسية وتقنية العقيمة. - تعد المتوسطة ثقافة الخلية (أفمك) السائل والغشاء السلي: متوسطة القاعدية EBM-2، 15% مصل بقرى الجنين (FBS)، 20 نانوغرام/مل من بفجف، 25 نانوغرام/مليلتر من مماثلة، 10 نانوغرام/مل لمنتدى إدارة الإنترنت. لثقافة خلايا الجذعية الأولية غشاء السلي السائل فضلا عن السلوى، ينبغي أن تستكمل في المتوسط مع الحل مضاد حيوي فطري.
- في اليوم 0، مزيج 2.5 مل سائل السلوى مع 3.5 مل AFMC الثقافة المتوسطة ولوحة في قارورة T25. احتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمالا يقل عن 48 ساعة دون عائق قبل التحقق من وجود المستعمرات.
- في يوم 5، ينبغي أن تكون مستعمرات الخلايا ملتصقة الحالية. روك بلطف قارورة لإزاحة الخلايا التي لم لا تماما التمسك بالقاع والحطام والفراغ-أسبيراتي الخليط السائل المتوسطة/السلي المستهلك استخدام ماصة باستور. استبدال مع 5 مل من جديد أفمك المتوسطة.
- الثقافة لمدة 5 أيام أخرى. تغيير المتوسطة كل يوم كما هو موضح في الخطوة 1.1.4.
- الحصول على الحد أدنى من 2.5 مل سائل السلوى حصاد عملية بزل طبيب.
-
عزل الخلايا الجذعية الوسيطة الأولى من amnion البشرية
- الحصول على مشيمة وقت ممكن بعد الولادة، وخلال 24 ساعة على أكثر تقدير، تحقيق أقصى قدر من النزاهة الخلوية. قص شريحة2 سم 9 من amnion وإزالة تجلط الدم وتغسل في أنبوب الطرد مركزي 50 مل مع 30 مل من برنامج تلفزيوني وتستكمل مع الحل مضاد حيوي فطري.
- فرم الأغشية باستخدام زوج من المشارط للقطع في طبق استنبات الأنسجة معقمة 10 سم بشكل جيد. سوف يتحقق هضم الأغشية واستخراج الخلايا باستخدام نظام تفكك نسيج. اتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
ملاحظة: أدق قطعة من الأنسجة بعد تنميق، شُفي ارتفاع أرقام الخلية بعد الهضم. - نقل كتلة الأنسجة غشاء المفروم باستخدام شفرات مشرط في أنبوب تفكك النسيج واحد وتخلط مع مل 4.7 في المتوسط RPMI 1640. خلط في تفكك الإنزيمات (انظر الجدول للمواد).
- جبل الأنابيب على ديسوسياتور الأنسجة وتشغيل برنامج "h_tumor_01". احتضان هذه الأنابيب عند 37 درجة مئوية على منصة هزاز لمدة 30 دقيقة.
- كذلك تمييع المعلقات مع 35 مل من RPMI 1640 وتنطبق على مصفاة ميكرومتر 70 وضع عبر أنبوب الطرد مركزي جمع 50 مل.
- أجهزة الطرد المركزي 5 دقائق في ز 200 x في درجة حرارة الغرفة، تجاهل المادة طافية، ريسوسبيند بيليه في 5 مل من RPMI 1640، عد الخلايا باستخدام هيماسيتوميتير، ولوحة في كثافة 10,000 الخلايا/سم2 إلى سفن زراعة الأنسجة تعامل مع طازجة أعد أفمك المتوسطة وتستكمل مع الحل مضاد حيوي فطري.
ملاحظة: في حالة غير مكتملة الهضم، قطع صغيرة من الأنسجة ستكون حاضرة وسوف تكون الخلايا المفردة النادرة. زيادة ونقصان لأسفل مرة أخرى ولوحة بيليه كلها في قارورة T75 واحد.
-
الثقافة الأولية أفسك وأمسك
- قضى المستعمرات المرور من أفسك/أمسك بفراغ يسفط استخدام ماصة باستور المتوسط وإضافة 2 مل إنزيم الخلية المفرزة إلى قارورة. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5-8 دقائق.
- اضغط على قارورة للمساعدة في إزاحة الخلايا ومزيج التعليق مع حجم متساوية من متوسطة أفمك (الملحق مضاد حيوي فطري لا ضرورة من هذه النقطة). الطرد المركزي في 200 غ 4-5 الحد الأدنى إزالة المادة طافية باستخدام أما زجاج ماصة باستير أو ببساطة عن طريق عكس الأنبوب ويصب عليه في حاوية نفايات.
- نفض الغبار الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي لتفريق بيليه في تعليق خلية مفردة في إسقاط المتبقي من السائل وتخلط مع أفمك المتوسطة للطلاء. لوحة في قوارير تي في بكثافة بين 2500 و 5,000 الخلايا/سم2.
- تغير متوسط كل يوم. الثقافة لا خطوط الخلايا بعد مرور 6. لإعادة برمجة الأغراض، تستخدم كانخفاض مرور قدر الإمكان.
- إعداد الأرصدة المجمدة أفسك وأمسك كتجميد المتوسطة باستخدام النسخ الاحتياطية. حصاد الثقافات تستخدم خلية مفرزة إنزيم، أجهزة الطرد المركزي في 200 غ عن 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- إزالة المادة طافية باستخدام ماصة باستور ونفض الغبار الجزء السفلي من أنبوب لجعلها مفردة الخلايا في بيليه. ريسوسبيند في المتوسط التجميد الكامل في كثافة 1 × 106/mL وقاسمه في كريوفيالس. تخزين في حاوية تجميد بين عشية وضحاها في-80 درجة مئوية. ثم نقل إلى النتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.
2-إعادة برمجة في بلوريبوتينسي
- الحصول على البلازميدات إعادة برمجة
- شراء والبلازميدات إعادة برمجة من خلال مستودع بلازميد غير هادفة للربح. ويلزم "اتفاق نقل المواد".
- تحويل الخلايا المختصة كولاي البلازميدات وعزل البلازميدات استخدام مجموعة أدوات استخراج بلازميد تجارية. اتبع إرشادات الشركة المصنعة.
- قياس تركيز بلازميد الحمض النووي باستخدام جهاز المطياف الضوئي. وتهدف لتركيز بلازميد الناتجة عال، من الناحية المثالية حوالي 1 ميكروغرام/ميليلتر لتجنب إضعاف العينة أثناء تعداء.
- قياس تركيزات والبلازميدات الفردية باستخدام الأشعة فوق البنفسجية--جهاز المطياف الضوئي وقاسمه منهم على حدة.
- مزيج معا ميكروغرام 3 و 3 ميكروغرام و 2 ميكروغرام من EN2K و ET2K و M2L البلازميدات، على التوالي. هذا هو الحل بلازميد إعادة برمجة. مقدار بلازميد الحل ما يكفي ترانسفيكت 1 × 106 خلايا. إعداد عدة مثل مختبرين.
- تخزين جميع مختبرين في-80 درجة مئوية.
- إعداد لوحات الثقافة المستهدفة
- معطف واحد لوحة 6-جيدا مع فيترونيكتين – إضافة 1 مل من المخزن المؤقت لتمييع فيترونيكتين في كل بئر وخلط في 40 ميكروليتر VTN الأسهم الحل (1 ميكروغرام/سم2). تترك في درجة حرارة الغرفة (RT) أو في الحضانة عند 37 درجة مئوية ح 1.
- فراغ-أسبيراتي الحل باستخدام ماصة باستور واستبدال مع 2 مل متوسطة أفمك في كل بئر. تخزين في 37 درجة مئوية حتى يتم الخلايا تكون مطلي.
ملاحظة: هامة: AFMC الوسيلة المستخدمة في هذه الخطوة يجب أن لا تحتوي على أية حلول المضادات الحيوية أو فطري.
- الحصاد مثقف الابتدائي أفسك/أمسك
ملاحظة: قم بتوسيع أفسك/أمسك في الثقافة ما يكفي لجعل الأرصدة المجمدة في عدد مرور منخفضة وتكريس قارورة T-75 واحدة لإعادة برمجة. منذ قليلة كما تكفي 100,000 الخلايا لتجربة، وتهدف إلى جمع حوالي 500,000 الخلايا للتعويض عن الخسائر، وإذا كانت الأمثل لمعلمات تعداء أو ظروف ثقافة مختلفة لفحصها.- في أقرب وقت ممكن في ممر منخفض، حصاد أفسك/أمسك استخدام الخلية المفرزة إنزيم ميكس كما هو موضح في الخطوة 1.3.1 إلى 1.3.2. بعد أن تم فصل الخلايا، تابع إلى الخطوة التالية.
- ريسوسبيند بيليه في 1 مل من برنامج تلفزيوني ومزيج جيد لغسل مكونات المصل. عد الخلايا باستخدام هيماسيتوميتير. ضبط كثافة الخلية إلى 100,000 مليلتر من برنامج تلفزيوني وقاسمه إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنابيب. وهذا ما يضمن إلا أدنى وقت اتصال بين الخلايا والمخزن المؤقت المستخدم تعداء.
- ضع أنبوب ميكروسينتريفوجي على رأس مل 5 أنابيب البوليستيرين (كمحولات، سوف تسمح للطرد المركزي في دوار سوينغ عادية) وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ز لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة. عكس هذه الأنابيب وتجاهل المادة طافية في حاوية نفايات. لا تستخدم دوار زاوية ثابتة.
- إجراء خطوة إضافية استخدام الطرد المركزي في 200 x ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. سيسمح هذا بقية السائل من جدران أنبوب لتجميع في الجزء السفلي. نضح بعناية كل ذلك باستخدام ماصة 200 ميليلتر.
- تعداء مع إعادة برمجة والبلازميدات
- لإعادة برمجة التجارب، نظام تعداء (انظر الجدول للمواد) ستستخدم لتقديم والبلازميدات إعادة برمجة في الخلايا. وضع أنابيب تعداء واستثارة المخزن المؤقت، نصائح تعداء والعازلة كهربائياً في مجلس الوزراء زراعة الأنسجة. الكواشف طقم يتم الاحتفاظ في الرايت حتى يتم فتحها، ثم يتم تخزينها في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: نحن نستخدم إصدار الطقم 10 ميليلتر. - تحريك إغلاق الجهاز تعداء بحيث يمكن أن توضع محطة أنبوب به مباشرة إلى مجلس الوزراء. ملء أنبوب تعداء واحد مع 3 مل من المخزن المؤقت الالكتروليتى وجبل الأنبوب في المحطة التي دفعها طوال الطريق داخل الفتحة.
- تأخذ بلازميد إعادة برمجة مختبرين الحل أعد الخطوة 2.1.5 خارج مخزن-80 درجة مئوية والسماح لها بالذوبان في RT في ثقافة مجلس الوزراء.
- على الجهاز تعداء، حدد المعلمات تعداء التالية: 950 الخامس، 40 مرض التصلب العصبي المتعدد، ونبض 1.
- ريسوسبيند بيليه الذي يحتوي على خلايا 100,000 في 10 ميليلتر استثارة العازلة. العمل بسرعة من هذه النقطة في المخزن المؤقت لاستثارة السامة قليلاً ووقت تعرض لزيادة النتائج في بقاء خلية أقل بشكل ملحوظ.
- خلط في 1/10 من إعادة برمجة بلازميد الحل (حل الكوة مستعد لما مجموعة 1 × 106 خلايا).
- جبل تلميح تعداء على ماصة تعداء.
- نضح تعليق خلية في تلميح تعداء بعناية، تجنب تكوين فقاعات الهواء. إذا هي لاحظت فقاعات، طرد التعليق وكرر التطلع. وسوف تعوق فقاعات الهواء تعداء.
- إدراج أنبوب تعداء ماصة تعداء واضغط الزر "ابدأ" على شاشة الجهاز تعداء. انتظر شاشة رسالة إعلام بنجاح تعداء وإزالة الماصة من الأنبوب فورا.
- طرد التعليق في 1 جيدا من لوحة 6-جيدا الهدف أعد في القسم 2-2. خلط في الأجل المتوسط من المجاورة شكل جيد وتوزيع التعليق على قدم المساواة في آبار على حد سواء (كثافة الخلية الناتجة ستكون 50,000/جيد).
- كرر تعداء لجميع ميكروسينتريفوجي الأنابيب التي تحتوي على أفسك/أمسك على حدة. ضع اللوحة في الحضانة عند 37 درجة مئوية و 5% أول أكسيد الكربون2.
- لإعادة برمجة التجارب، نظام تعداء (انظر الجدول للمواد) ستستخدم لتقديم والبلازميدات إعادة برمجة في الخلايا. وضع أنابيب تعداء واستثارة المخزن المؤقت، نصائح تعداء والعازلة كهربائياً في مجلس الوزراء زراعة الأنسجة. الكواشف طقم يتم الاحتفاظ في الرايت حتى يتم فتحها، ثم يتم تخزينها في 4 درجات مئوية.
- ثقافة ترانسفيكتيد أفسك/أمسك
- الثقافة transfected الخلايا لمدة 2-5 أيام. قم بالتبديل إلى إعادة برمجة المتوسطة تتألف من E8 تستكمل مع 100 ميكرون من بوتيرات الصوديوم في اليوم 3.
ملاحظة: يمكن أن يؤديها مرور الثانوية لتجنب فرط مصدر أفسك/أمسك. بيد باساجينج سيتم تعطيل الخيار لحساب كفاءة إعادة برمجة بشكل صحيح إذا كانت هذه المعلمة للفائدة. - تغيير المتوسطة إعادة برمجة كل يوم لكل يوم لمدة 10 أيام. تغيير في المتوسط كل يوم من يوم 10 على.
- الثقافة transfected الخلايا لمدة 2-5 أيام. قم بالتبديل إلى إعادة برمجة المتوسطة تتألف من E8 تستكمل مع 100 ميكرون من بوتيرات الصوديوم في اليوم 3.
- الانتقاء اليدوي من المستعمرات ريبروجراميد الكامل للتوسع في الاستنساخ
- تظهر المستعمرات أعيدت برمجتها تماما حول يوم 14. السماح للمستعمرات توسيع حجمها وتصبح مدمجة. يمكن يدوياً اختار وتحويلها إلى لوحات جديدة لها في أقرب وقت يوم 15-16.
- ح 1 قبل إجراء الانتقاء، معطف لوحات 24-جيدا مع 8 ميليلتر من VTN في 300 ميليلتر من المخزن المؤقت لتمييع فيترونيكتين كل بئر (1 ميكروغرام/سم2) واحتضان RT أو 37 درجة مئوية. استبدال الحل مع المتوسطة E8 دون بوتيرات الصوديوم.
- حدد المستعمرات ذات حجم كاف (من الناحية المثالية ما يزيد على 400 ميكرومتر في القطر) في ثقافة عقيمة مجلس الوزراء. ويمكن استخدام مجهر تباين المرحلة أو ستيريوميكروسكوبي.
- الانتقاء، سيتم استخدام مجهر تصوير شاشات الكريستال السائل وضعها في مجلس الوزراء منذ رصد يلغي الحاجة إلى أوكولارس. تعقيم مرحلة مجهر مع الإيثانول 70%.
- استخدام مجهر ثقافة خلية مرحلة عادية-على النقيض، حدد وضع علامة وملاحظة عدد المستعمرات انتقاء. هذا أمر مهم للتأكد من عدم إضاعة الوقت خلال عملية الانتقاء الفعلي لهذه العملية.
- شغل عدد من أنابيب PCR التي مساوية أو أكبر من عدد المستعمرات انتقاء مع 30 ميليلتر من 0.5 ملم حمض الإيثيلين (يدتا) في برنامج تلفزيوني. سيتم وضع المستعمرات داخل هذه الأنابيب للتفكك الجزئي قبل الطلاء.
- خطة لاختيار 5 مستعمرات في وقت من لوحات باستخدام ماصة 10 ميليلتر تعيين إلى 2 ميليلتر. عقد طرف الماصة بزاوية عند حافة مستعمرة بعناية وعلى نحو تدريجي كشط مستعمرة كله قبالة السطح. نضح مستعمرة كاملة في تلميح ماصة على الفور ونقلها إلى أحد أنابيب PCR مستعدة مع يدتا.
- كرر مع المستعمرات 4 المتبقية. تبني على RT لمدة 4-6 دقائق.
- بيبيت تعليق صعودا وهبوطاً برفق باستخدام تلميح ماصة أكبر لتقسيم هذه المستعمرة إلى كتل أصغر حجماً. تجنب إنشاء تعليق خلية مفردة.
- لوحة التعليق مباشرة إلى هدفا جيدا لصفيحة 24-كذلك أعد الخطوة 2.6.2. كرر مع المستعمرات المتبقية.
- كرر الخطوات 2.6.6 خلال 2.6.10 إذا المستعمرات أكثر من 5 انتقاء ولكن عدم اختيار المستعمرات أكثر من 5 في وقت واحد. احتضان CO 37 درجة مئوية و 5%2.
- التوسع في الاستنساخ ونضج للجنة التوجيهية
- السماح للمستعمرات أن تنمو وتصبح مدمجة. 3-6 أيام تكفي. تغيير ثقافة المتوسط يوميا. استخدم بين 400 ميليلتر و 1 مل من المتوسطة E8 استناداً إلى كثافة الخلية.
- وسيوسع الآبار لصفيحة 24-جيدا مع كثافة مستعمرة كافية في لوحات 6-جيدا. ح 1 قبل باساجينج، معطف لوحات 6-جيدا مع VTN (كما هو الحال في خطوة 2.2.1). قم باستبدال الحل في البئر مع 2 مل متوسطة E8 كل بئر.
- نضح المتوسطة المستهلك من الآبار المصدر باستخدام ماصة 1 مل واستبدال مع 300 ميليلتر من 0.5 مم أدتا غسل. نضح فورا باستخدام تلميح ماصة نفس واستبدال مع 300 ميليلتر من 0.5 مم يدتا مرة أخرى، ثم احتضانها في RT لأدنى 5 نضح جميع السائل باستخدام ماصة 1 مل.
- تعيين ماصة 1 مل إلى القدرة وجبل تلميح 1 مل على صعيد تحمل عليه نضح المتوسطة E8 من الهدف في التلميح. يغسل ثقافة اللجنة التوجيهية المصدر مع تيار الوسط.
- نقل التعليق في الهدف جيدا وبيبيت صعودا وهبوطاً عدة مرات لتفريق مستعمرات في كتل من الخلايا 20-50. تأكد من أنها تحصل على توزع بالتساوي في البئر هزاز لطيف وتهز اللوحة واحتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
- تغيير في المتوسط يوميا ومرور كل 3 إلى 4 أيام. يمكن وضع علامة تحت مجهر تباين المرحلة أي مستعمرات التفريق وإزالتها باستخدام تلميح ماصة في ثقافة مجلس الوزراء. وهذا يسمح للنشر الانتقائي لثقافة عالية الجودة الصرفة اللجنة التوجيهية.
- ح 1 قبل باساجينج، معطف آبار صفيحة 6-جيدا مع VTN كما هو الحال في خطوة 2.2.1. قم باستبدال الحل مع 2 مل متوسطة E8 كل بئر.
- باساجينج الروتيني شبيه الأولى باساجينج القيام به باستخدام 0.5 مم يدتا (الخطوات 2.7.2 ل 2.7.5). استبدال المستهلك المتوسط في بئر واحدة للوحة 6-جيدا مع 1 مل أدتا غسل وتجاهل.
- أضف 1 مل يدتا واحتضان في RT لمدة 5-7 دقائق للتفكك الجزئي. تحسين وقت الحضانة إذا اللازمة، مع التأكد من تعليق حول 20-50-الخلية إلى كتل يتم إنتاج. تجنب التفكك في الخلايا المفردة.
- تجاهل الحل يدتا ونضح 1 مل المتوسط E8 استخدام ماصة 1 مل من الهدف في تلميح ماصة واسعة-تتحمل.
- يغسل ثقافة المصدر اللجنة التوجيهية مع تيار الوسط E8 مرارا وتكرارا حتى صدر جزء المرجوة من ذلك من على سطح الأرض ونقل إلى الهدف جيدا. هذا الجزء يمثل نسبة سبليت (مثلاً، 1/8 الثقافة يمكن نقلها لنسبة 1:8.)
- مرور كل 3-4 أيام. السماح للخطوط التوجيهية ناضجة باستزراع لهم للممرات 15 على الأقل قبل استخدامها في التجارب النهائية
3. وصف وتأكيد بلوريبوتينسي
ملاحظة: تشير إلى الملفات التكميلية للحصول على تفاصيل حول التدفق الخلوي والفحص المجهري [كنفوكل].
-
فحص تكوين تيراتوما
- لتحديد قدرة اللجنة التوجيهية أن يميز في أنسجة تمثيلية من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث بمقايسة تشكيل تيراتوما، اتبع سياسات مؤسسية بشأن الرعاية الحيوانية واستخدامها، التخطيط للمستقبل لإتاحة الوقت لإيداع البروتوكول المناسب الوثائق. تشكيل تيراتوما في الفئران سوف يستغرق ما بين 6-10 أسابيع.
- ثقافة 4 آبار للوحة 6-جيدا كل سطر اللجنة التوجيهية لمدة 4 أيام. العدد التقريبي للخلايا تحقن في الجناح واحدة على فأرة الحاسوب من 0.5 إلى 1 × 106 خلايا. اختياري: إضافية جيدا يمكن أن تكون مكرسة لتحديد عدد خلايا ممثل في بئر عن طريق تفكك خلية مفردة مع إنزيم خلية مفرزة والعد.
- حساب حجم الخليط E8/بم سيتم تعليق كتل اللجنة التوجيهية في: كلا الجناحين بالماوس يتم حقنها، كل منها 150 ميليلتر من تعليق أجمة. الفئران الثلاثة كافية لاختبار تيراتوما تشكيل اللجنة التوجيهية سطر واحد. وتشمل ميليلتر إضافية 150 كل إبرة في حجم الناتج تعويض الخسارة في التخزين الميت. يتم استخدام إبرة 1 كل الماوس. فمن مجموع حجم 3 * (150 ميليلتر * 2 + 150 ميليلتر) = ميليلتر 1350
- ننأى المستعمرات اللجنة التوجيهية مع يدتا جزئيا كما لو كانوا يريدون أن باساجيد، كما هو موضح في الخطوات 2.7.8 ل 2.7.10. من المهم أن تنفصل إلى كتل المستعمرات ولا يفصل في الخلايا المفردة.
- يغسل قبالة المستعمرات اللجنة التوجيهية مع ميليلتر 675 المتوسطة E8 (نصف حجم المحسوبة من الخطوة 3.3.3)، استخدام تلميح تحمل واسعة. نقل تعليق أجمة في أنبوب البوليستيرين 5 مل. ضع على الجليد.
- وتجمع بين ميليلتر 675 من بم. ستبقى على تعليق الناتجة على الجليد حتى الحقن.
- تخدير الفئران شل لهم باستخدام إيسوفلوراني. هذا ينبغي أن يؤديها أو تسترشد بالموظفين المهرة فيفاريوم.
- دوامة البوليستيرين 5 مل الأنبوبة بإيجاز ونضح تعليق أجمة (450 ميليلتر للماوس) في محقن الأنسولين واحدة مزودة بإبرة ز 22. ضخ 150 ميليلتر من تعليق خلية تحت الجلد. هذا المجلد يحتوي على حوالي 1 × 106 خلايا (راجع الخطوة 3.1.2).
- حقن الفئران 3 كل سطر اللجنة التوجيهية. اتباع ممارسات رعاية الحيوان السليم لجميع الإجراءات.
- متابعة الحالة الصحية للفئران يوميا.
- عندما تيراتوماس الوصول إلى قطر نقطة نهاية من 1.5 إلى 2 سم، euthanize الفئران و explant teratomas وتخزينها في محلول الفورمالين لتثبيت الأنسجة ح 24.
- إحضار teratomas الثابتة إلى منشأة أساسية علم الأنسجة الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ (H & E). وسوف الصف أخصائي وجود أنسجة من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث.
ملاحظة كاريوتيبينج: اللجنة التوجيهية يعيش الثقافات يجب أن تشحن إلى المتخصصة المختبرات الخلوية الوراثية لاختبار السلامة تناذر. من المستحسن إجراء هذا الاختبار كل الممرات 5.
-
التنميط النسخي
- ثقافة ويلز 2 من لوحة 6-جيدا لمدة 3-4 أيام للحصول على عينة من الحمض النووي الريبي واحدة. استخدم فقط ثقافات عالية الجودة، يمكن معالجة التلوث طفيفة مع التفريق بين الخلايا بإلغاء تثبيتها باستخدام تلميح بيبيت.
- عزل الحمض النووي الريبي من الثقافات اللجنة التوجيهية باستخدام مجموعة أدوات متوفرة تجارياً يتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. شحن العينات إلى منشأة متخصصة أساسية الجينوم.
- الحصول على ملفات النسخي العالمية للخطوط التوجيهية باستخدام [ميكروارس] (انظر الجدول للمواد للخيارات المعتمدة) أو تسلسل الحمض النووي الريبي.
- إرسال ملفات "*.idat" من أجل تقييم بيوينفورماتيك من بلوريبوتينسي عن طريق وصلة إنترنت في معهد كوريل. وبدلاً من ذلك، يقدم "*.cel" الملفات لتحديد بيوينفورماتيك من نوع من الخلايا، بما في ذلك الخلايا الجذعية pluripotent، من خلال واجهة على شبكة إنترنت في جامعة جونز هوبكنز. انظر الجدول للمواد لمزيد من التفاصيل عن أنواع البيانات قبول فحوصات bioinformatic الفردية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من المرضى قبل الحصاد السائل السلوى لأغراض الاختبار وتكريس قاسمة صغيرة من السائل للبحوث الوراثية. مطلوب لا موافقة لاستخدام الغشاء السلوى في البحوث كما المشيمة تمثل النفايات الطبية. الخلايا الجذعية السائل والغشاء السلي عرض خصائص الوسيطة نموذجية، وشكليا خلاياها على شكل عمود الدوران ومرحلة مشرقة. عند إعادة برمجة، الخلايا يخضع الوسيطة إلى الظهارية (MET) الانتقال والحصول على مورفولوجيا تشبه حصاة كبيرة ومنظمة المكانية من المستعمرات، التي تشير إلى خصائص الظهارية. يتم بدء هذه العملية لها في أقرب وقت ح 48-72 بعد الأخذ بإعادة برمجة والبلازميدات ابيسومال. نظراً لغياب هذه المستعمرات يوم 5 من إعادة برمجة تشير إلى فشل التجربة. تتكاثر خلايا المستعمرات MET، ونتيجة لذلك أصبحت المستعمرات المدمجة، بين 5 و 14 يوم. الاتفاق يلتقي مستعمرات تتألف من خلايا ليست ملحوظة بسهولة على حدة (الشكل 1A). في حوالي اليوم 14، المستعمرات أعيدت برمجتها تماما تظهر مع خلايا مرتبة في أحادي الطبقة، تحمل بارزة، الأنوية يمكن بسهولة تمييز ونوكليولي. أنهم على استعداد لتكون معزولة ميكانيكيا وتوسيع عندما تصل إلى حجم مناسب المستعمرات وأصبح الاتفاق (الشكل 1B).
المستعمرات أعيدت برمجتها كاملا وجزئياً موجودة في ثقافات طوال فترة إعادة برمجة، ولو أعيدت برمجتها جزئيا المستعمرات لا يكتسبون بالضرورة بلوريبوتينسي كامل. يظهر الشكل 2 ممثل سيتوميتريك تحليل الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) علامة التعبير في تدفق كاملا وجزئياً pluripotent المستعمرات وما مورفولوجيس المقابلة. بلوريبوتينسي كامل يرتبط بالتعبير عن Oct4، نانج، Sox2، ترا المستضدات وسا-4، بينما التعبير سا-1 هو السلبية19،،من2021 (الشكل 2A). جزئيا pluripotent الخلايا، ومع ذلك، لا تعبر عن نانج وهيئة تنظيم الاتصالات المستضدات20 (الشكل 2). ينبغي تأكيد التعبير وإضفاء الطابع المحلي على علامات ESC قبل immunocytochemical تلطيخ وتصويرها باستخدام مجهر واسع المجال أو [كنفوكل] (الشكل 3).
تأكيد وظيفية من بلوريبوتينسي يتحقق بإظهار قدرة الخطوط التوجيهية على teratomas النموذج بعد الحقن تحت الجلد من الخلايا في الفئران مشمولان-بيج. 6-8 أسابيع هي الحاجة إلى تيراتوماس للوصول إلى حجم نقطة النهاية. ثم يتم تنفيذ ح & ه تلطيخ الأنسجة والدراسة من جانب أخصائي للتأكد من وجود ممثل الأنسجة من كل الطبقات الجرثومية الثلاث – الأنسجة، ونيوروكتوديرم، وميسوديرم (الشكل 4 أ). بديل للحيوان اختبار لتحليل التوقيع النسخي المرتبطة بلوريبوتينسي عن طريق نهج الجينومي مثل كدنا [ميكروارس]22،23. يمكن ثم كمياً نسبة الشخصية النسخي يتداخل مع واحد من مجموعة من اللجنة التوجيهية الراسخة وخطوط ESC قبل برنامج التقييم بلوريبوتينسي بيوينفورماتيك على شبكة الإنترنت في شكل قطعة مصنفين – بلوريبوتينسي و الجدة (الشكل 4 باء). كلما زادت درجة بلوريبوتينسي، أكثر الاستعلام [ايبسك] خط يشبه الخطوط الثابتة. درجة عالية والجدة، ومع ذلك، يمكن أن تشير إلى الانحرافات أو حتى الكروموزومي، رغم بلوريبوتينسي ارتفاع درجة (مثل كما هو الحال في خطوط تيراتوكارسينوما)22. تعتبر كافة بنود اللجنة التوجيهية التي تم إنشاؤها عن طريق اتباع البروتوكول المعروضة هنا pluripotent بالتدفق الخلوي وتصوير وتشكيل تيراتوما وأساليب التحليل النسخي.
رقم 1: تطور الخصائص المورفولوجية للخلايا أثناء إعادة برمجة- (أ) السائل السلوى وغشاء الخلايا الجذعية، والتي تمثل مصدر الخلايا لإعادة برمجة، عرض مورفولوجيا الوسيطة نموذجي، ممدود ومرحلة مشرقة (يسار) حتى أنها تمر بمرحلة انتقالية الوسيطة إلى الظهارية (MET) التي ويؤدي إلى اكتساب خصائص الظهارية وتشكيل المستعمرات مع الحصى الحجر-مثل الخلايا (في الوسط). تتكاثر هذه المستعمرات وإنشاء غير النظامية الجماهير الخلوية للخلايا MET (يمين). (ب) في المراحل اللاحقة من إعادة برمجة (بدءاً من يوم 14)، تظهر مستعمرات الخلايا أعيدت برمجتها تماما – خلايا منفردة ملحوظ مع نويات بارز ونوكليولي مرتبة في مونولاييرس، مع حدود واضحة المعالم (في الوسط) – وهي هذا إلى جانب MET المستعمرات التي هي أكثر عددا (على اليسار). ويرد على الحق استنساخ ناضجة معزولة تماما أعيدت برمجتها. شريط المقياس = 100 ميكرومتر الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تحليل سيتوميتريك للتعبير عن علامات ESC تدفق بالكامل وجزئياً (MET) برمجة مستعمرات الخلايا. (أ) الشخصية التعبير pluripotent أمر إيجابي ل Oct4، نانج، Sox2، وهيئة تنظيم الاتصالات-1-60، وهيئة تنظيم الاتصالات-1-81 وسا-4، بينما السلبية سا-1. (ب) جزئيا مستعمرات الخلايا pluripotent – تلك التي مرت في مومباي ولكن فشل للتقدم إلى بلوريبوتينسي كامل – إيجابية Oct4 و Sox2 ولكن المستضدات نانج وهيئة تنظيم الاتصالات سا غائبة. وترد مورفولوجيس المرتبطة بها للمقارنة جنبا بجنب. تغيير حجم أشرطة = 200 ميكرومتر و 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: [كنفوكل] التصوير تحليل التعبير عن علامات ESC في اللجنة التوجيهية السائل السلوى ناضجة. عوامل النسخ Oct3/4A ونانج Sox2 تكون مترجمة في الأنوية مع هيئة تنظيم الاتصالات ومولدات سا glycoproteins المترجمة على الغشاء. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. صور لزيادة التكبير (دمج 2 X) أدرجت Oct3/4 ونانج Sox2 لتصور أفضل عن التعريب النووية. شريط المقياس = 25 ميكرومتر. تنتقل – الصور المكتسبة في ضوء المنقولة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: تشكيل تيراتوما والتنميط النسخي في اللجنة التوجيهية السائل والغشاء السلي ناضجة. (أ) Teratomas نمت في الفئران بيج إخضاعها تحت الجلد تحتوي على أنسجة تمثيلية من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث (100 X التكبير). (ب) لمحات ميكرواري التعبير العالمية المقدمة للبرمجيات على الإنترنت بلوريبوتينسي عاد قطعة مصنفين – بلوريبوتينسي والجدة. عشرات بلوريبوتينسي عالية ومنخفضة والجدة عشرات-حمراء سحابة-تشير إلى ملف تعريف تعبير من خط ESC/اللجنة التوجيهية النموذجية. سحابة زرقاء تمثل منطقة كتلة للخلايا المتمايزة، بينما تمثل سحابة زرقاء باهتة منطقة كتلة جزئيا pluripotent الخلايا. واعتبرت السائل السلوى (3 خطوط) وغشاء (4 خطوط) اللجنة التوجيهية pluripotent قبل الاختبار. وأدرج كعنصر تحكم خط ESC WA25 ويتم تحديدها هنا مع سهم أسود. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المرحلة الأولى من إنشاء اللجنة التوجيهية من الخلايا الجذعية الجنينية ينطوي على استخراج الخلايا المصدر من الأنسجة الجنينية، والثقافة، والتوسع، وإدخال والبلازميدات إعادة برمجة ابيسومال. هذه المرحلة هو متبوعاً بنقطة ثقافة حوالي 14-18 يوما قبل أن يمكن توسيع المستعمرات الأولى أعيدت برمجتها تماما. المرحلة النهائية نضوج المستنسخين اللجنة التوجيهية. استخراج الأولية للخلايا الجذعية غشاء السلي يتحقق عن طريق هضم الميكانيكية والانزيميه مجتمعة amnion. ووجدنا أن فترة حضانة من 30 دقيقة أسفرت عن أكبر عدد من الخلايا المستخرجة مع بقاء أعلى. يمكن أن تنتج إجراء الهضم على قطع صغيرة من كتل الأنسجة والخلايا. في حالة ارتفاع نسبة هذه بالنسبة إلى الخلايا المفردة، نوصي بطلاء جميع كتل والخلايا المفردة في سفينة واحدة حيث يمكن أن تسهم جميعها في أووتجرووثس الخلايا ملتصقة. طلاء الخلايا الجذعية السائل السلوى بسيط كما الخلايا المختلطة مع المتوسط الثقافة والمحتضنة حتى تصل إلى مستعمرات الخلايا ملتصقة بحجم يكفي فقط. بلاستيكواري المعالجة بزراعة الأنسجة العادية مناسبة تماما ولا ننصح السطوح المتخصصة، على الرغم من أنها مخصصة لتحسين الابتدائية خلية ثقافة، إذ لاحظنا مع هذه الدنيا فيابيليتيس والصعوبات باساجينج عملية.
الأرصدة المجمدة وتنبع السائل والغشاء السلي وينبغي توسيع نطاق الخلايا، ولكن في أقرب وقت ممكن، يمكن استخدام الخلايا كخلايا المصدر لإعادة برمجة. أداؤها جيدا جداً، مع جميع خطوط حاول في نهاية المطاف أعيدت برمجتها بنجاح (غرض إدخال والبلازميدات ابيسومال في الخلايا، ونظام تعداء المستخدمة هنا مع المعلمات تعداء تعيين إلى 950 الخامس، 40 مللي ثانية، ونبض 1 أكثر من 10 خطوط). نظام التسليم المتنافسة الرئيسية العاملة على مبدأ مماثل لم تسفر تجربة ناجحة لإعادة برمجة في أيدينا.
Transfected الخلايا هي المصنفة على الأطباق المغلفة فيترونيكتين في المتوسط أفمك لأول 3-5 الأيام، ثم يتم تبديل المتوسطة إلى E8 تستكمل مع 100 ميكرومتر الصوديوم بوتيرات. وهذا يزيد كثيرا من معدل اقتناء بلوريبوتينسي كامل. ويمكن رؤية العلامات الأولى للتحول المورفولوجية أقرب وقت ح 48-72. تخضع الخلايا المصدر في مومباي وتظهر مستعمرات الخلايا مع مورفولوجيا الظهارية. هذه تنتشر تدريجيا وأصبح الاتفاق. مجموعة فرعية من المستعمرات سيكتسب ملامح المورفولوجية للخلايا الجذعية pluripotent تماما – خلايا منفردة ملحوظ مع نويات بارز ونوكليولي، لاحظ المستعمرات مسطحة مع حدود واضحة المعالم، بدلاً من الحدود غامض في جزئيا pluripotent MET المستعمرات. عند لحظة الحصول على كامل بلوريبوتينسي، اكتساب المستعمرات الخلية المدمجة MET أنوية بارزة وتصبح الخلايا الفردية ملحوظ أثناء إنشاء نمط مورفولوجية فريدة من نوعها. لعين مدربة، وهذا النمط علامة واضحة على إعادة برمجة ناجحة. بيد لمحقق الذي يفتقر إلى التدريب الثقافة PSC، تحديد المستعمرات التي انتقلت بنجاح إلى بلوريبوتينسي الكامل يتطلب إجراء تقييم دقيق كما يمكن أن يكون مخطئا استنساخ MET واللجنة التوجيهية لبعضها البعض. الشكل 1 و الشكل 2 تقديم أمثلة على حد سواء. إذا كان يتم انتقاؤها استنساخ MET بدلاً من ذلك، تحليل شامل التدفق الخلوي سوف تكشف عن الخطأ، وعلى وجه الخصوص، ستكون غائبة على الأرجح المستضدات هيئة تنظيم الاتصالات-1-60 وهيئة تنظيم الاتصالات-1-81 كما هو مبين في الشكل 2. والواقع أن المستضدات ترا سابقا تبين أن علامات بلوريبوتينسي الصارمة. ومع ذلك، جزئيا MET pluripotent الخلايا قد يكون الاهتمام ب أبحاث السرطان25.
هذا الشرط الثقافة دون المستوى الأمثل لمصدر أفسك/أمسك وفي نهاية المطاف، سوف تبطئ انتشار هذه الأسلحة وسوف يحصلون مورفولوجيا تملق، مثل تنتجها الخلايا الليفية. وتشكل الخلايا المصدر الأنسجة التي يمكن فصلها من السطح خلال المراحل اللاحقة من إعادة برمجة، على الرغم من أن هذا لا يؤثر سلبا على عملية إعادة برمجة. على العكس من ذلك، في بعض الأحيان تؤدي العملية لتحرير مساحة للمستعمرات أعيدت برمجتها، مع التخلص من المواد غير المرغوب فيها الخلوية الأمم المتحدة أعيدت برمجتها. يمكن بسهولة تجاهل الأنسجة منفصلة باستخدام تلميح ماصة معقمة، تاركاً جزئيا والمستعمرات pluripotent خلف، تبسيط كبير التحديد اليدوي المصب تماما.
دليل الانتقاء من المستعمرات أعيدت برمجتها تماما، نستخدم شاشات الكريستال السائل التصوير النظام، التي يمكن أن توضع في مجلس الوزراء السلامة، وتفتقر إلى أية أجزاء بارزة من شأنها أن تخل تدفق الهواء. خلاف هذا نظام التصوير، هناك حاجة إلى أي معدات خاصة كما يمكن إجراء الانتقاء نفسها باستخدام الماصات العادية. يتم فصل المستعمرات المنتقاة جزئيا في حل يدتا/برنامج تلفزيوني قبل يجري مطلي في الآبار المستهدفة تنمو بها كالحيوانات المستنسخة. اعتماداً على الخط والاستنساخ، لعدة مقاطع، قد تكون ملوثة الثقافات بصورة عفوية التفريق بين الخلايا. باساجينج المسلسل والتلاعب اليدوي عادة القضاء على هذه المشكلة. يجب أن يتم تجاهل الحيوانات المستنسخة بوابل من تمييز واسع النطاق، ومع ذلك، يمكن إنقاذه استنساخ الثمينة بدرجات مختلفة من النجاح عن طريق دليل المتكررة الانتقاء من المستعمرات pluripotent بدلاً من التخلص من التفريق بين الخلايا. وعرضت والبلازميدات ابيسومال أن حوالي 15 ممرات تفقد تماما من اللجنة التوجيهية26. ولذلك، فمن المستحسن للسماح استنساخ تنمو لمالا يقل عن ذلك العدد من الممرات قبل استخدامها لتطبيقات المتلقين للمعلومات والتحليلات، باستثناء مراقبة روتينية التعبير مستضد ترا وتناذر. يمكن بسهولة رصد التعبير مستضد ترا بالتدفق الخلوي كما هو موضح هنا في البروتوكول، منذ الفحص فقط تتطلب الخلايا حوالي 200,000، ويمكن أن يؤديها كلما الباحثون في الشك في ما إذا كان يتم الحفاظ على المستنسخين مثقف بلوريبوتينسي بشكل صحيح. التدفق الخلوي تحليل التعبير علامة ESC لا يعتبر كافياً لتأكيد بلوريبوتينسي في خطوط المرشح19.
والرزن تشكيل تيراتوما هو اختبار بلوريبوتينسي قاطعة القياسية27. PSC نمت في ظروف محددة كيميائيا، خالية من كرة الموت المعرضة بشكل خاص لفعل الانفصال ومن ثم الحقن منهم تحت الجلد ككتل الضروري على زرع ناجحة8،28. وبعد الحقن، عادة ما تكون 4-6 أسابيع كافية لنمو كرة من الطعوم بحيث تكون مرئية وقبل الأسبوع 8، كل ما يمكن أن يكون حصادها، ح & الملون ه وتحليلها. الرفق بالحيوان، والتكلفة، واختبار طويلة الفترات اللازمة أسباب استحداث طرق بديلة. تحليلات الجينومية جنبا إلى جنب مع متقدمة، والنهج بدعم التعلم bioinformatic آلة يمكن أن توفر تقييما دقيقا لملامح التعبير العالمية. تكلفة الحصول على هذه البيانات قابل للمقارنة إلى تكلفة الفحص تشكيل تيراتوما، بيد أن نهج الجينومي أسرع بكثير والحيوانات لا يجب أن تستخدم. واحد مثل هذا التحليل هو بيوينفورماتيك بلوريبوتينسي تقييم برمجيات22. ويتم تنفيذه كواجهة على شبكة إنترنت (جدول المواد). تزايد شعبية وتراجع تكلفة الإرادة تسلسل الحمض النووي الريبي ضمان استمرارية هذا النهج. بديل لهذا البرنامج بلوريبوتينسي من جامعة جون هوبكنز23 (cellnet.hms.harvard.edu) ويستند إلى نهج مماثل وقادرة على قبول البيانات ميكرواري لتحليل الترنسكربيتوم للعينات البشرية. الاستفادة من هذا البرنامج هو أنه لديه القدرة على التعرف على الخلايا الجذعية pluripotent ليس فقط ولكن أيضا التمييز بين الخلايا و، منذ datasets المنسق لها مستمدة من الأنسجة الأولية، ومستوى التشابه بين الخلايا في المختبر نمت/ ويمكن تحديد الأنسجة والأنسجة في الجسم الحي ، توفير عنصر تحكم جودة ممتازة لتطوير بروتوكولات التفريق أو هندسة الأنسجة. الاختبار لديه القدرة على تصنيف الاستعلامات إلى 20 خلية مختلفة أو أنواع الأنسجة. وفي الوقت الحاضر، فإنه يتطلب البيانات ميكرواري لكن المؤلفين وتعمل على توسيع الخيارات منصة للحمض النووي الريبي تسلسلها كذلك.
الباحثون باتباع البروتوكول المقدم، يمكن توليد الخطوط التوجيهية من الخلايا الجذعية السائل والغشاء السلي مع إمكانية تكرار نتائج عالية جداً في المتوسط محددة بالكامل كيميائيا وخالية من كرة واستخدام أسلوب إعادة برمجة غير دمج. يمكن استخدام هذه الخطوط في البحوث الأساسية لتحسين البروتوكولات التمايز وفي نهاية المطاف في النمذجة المرض، والمخدرات الأنسجة الفرز، أو طب الأطفال الدراسات الهندسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
هذا العمل كان يدعمها في فوندز Medizinische Forschung في جامعة زيوريخ، فورشونجسكريديت من جامعة زيوريخ، وديكينستون NMSCh تحت 10.216 الزمالات و 12.176، المجتمع السويسري للقلب، "العلم الوطني السويسري" مؤسسة في إطار المنحة [320030-122273] و [310030-143992]، البرنامج الإطاري السابع، صمام الحياة، اللجنة الأوروبية في إطار منحة [242008]، ومؤسسة مايينفيش أولغا، مؤسسة امدو، بدء المنحة 2012 من مستشفى جامعة زيورخ، و التمويل الداخلي لمعهد السرطان ميتشل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | tissue dissociation system, reagent kit, includes tissue dissociation tubes and tissue dissociation enzymes |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | tissue dissociation system, dissociator |
| Thermo Scientific™ Shandon™ Disposable Scalpel No. 10, Sterile, Individually Wrapped, 5.75 (14.6cm) | Thermo-Fisher | 3120032 | |
| 70 µm cell strainers | Corning | 10054-456 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo-Fisher | 32404014 | |
| rocking platform | VWR | 40000-300 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Thermo-Fisher | 339652 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Thermo-Fisher | 339650 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC-3156 | basal medium for AFMC medium |
| FGF 2 Human (expressed in E. coli, non-glycosylated) | Prospec Bio | CYT-218 | bFGF, supplement for AFMC medium |
| EGF Human, Pichia | Prospec Bio | CYT-332 | EGF, supplement for AFMC medium |
| LR3 Insulin Like Growth Factor-1 Human Recombinant | Prospec Bio | CYT-022 | IGF, supplement for AFMC medium |
| Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified | Thermo-Fisher | 10439024 | FBS |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo-Fisher | 15240062 | for primary AFSC/AMSC, for routine AFSC/AMSC it should not be necessary, do not use in medium for transfected cells! |
| Accutase cell detachment solution | StemCell Technologies | 07920 | cell detachment enzyme |
| CryoStor™ CS10 | StemCell Technologies | 07930 | complete freezing medium |
| PBS, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 10010023 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | 12362 | for plasmid isolation |
| pEP4 E02S EN2K | Addgene | 20925 | EN2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, Nanog+Klf4 |
| pEP4 E02S ET2K | Addgene | 20927 | ET2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4 |
| pCEP4-M2L | Addgene | 20926 | M2L, reprogramming factors c-Myc+LIN28 |
| NanoDrop 2000c UV-Vis Spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000C | spectrophotometer |
| Neon® Transfection System | Thermo-Fisher | MPK5000 | transfection system, components: Neon pipette - transfection pipette Neon device - transfection device |
| Neon® Transfection System 10 µL Kit | Thermo-Fisher | MPK1025 | consumables kit for the Neon Transfection System, it contains: Neon tip - transfection tip Neon tube - transfection tube buffer R - resuspension buffer buffer E - electrolytic buffer |
| Stemolecule™ Sodium Butyrate | StemGent | 04-0005 | small molecule enhancer of reprogramming |
| TeSR-E8 | StemCell Technologies | 05940 | E8 medium |
| Vitronectin XF™ | StemCell Technologies | 07180 | VTN, stock concentration 250 µg/ml, used for coating at 1 µg/cm2 in vitronectin dilution (CellAdhere) buffer |
| CellAdhere™ Dilution Buffer | StemCell Technologies | 07183 | vitronectin dilution buffer |
| UltraPure™ 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | dilute with PBS to 0.5 mM before use |
| EVOS® FL Imaging System | Thermo-Fisher Scientific | AMF4300 | LCD imaging microscope system |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | phase contrast cell culture microscope | |
| Pierce™ 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo-Fisher | 28908 | dilute to 4% with PBS before use, diluted can be stored at 2-8 °C for 1 week |
| Perm Buffer III | BD Biosciences | 558050 | permeabilization buffer, chill to -20 °C before use |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 557782 | isotype control for Oct3/4A, Nanog |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 557783 | isotype control for Sox2 |
| Mouse anti-human Oct3/4 (Human Isoform A), Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 561628 | |
| Mouse anti-human Nanog, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 560791 | |
| Mouse anti-human Sox-2, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 562139 | |
| Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 401617 | isotype control for TRA-1-60 |
| Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 401618 | isotype control for TRA-1-81 |
| Mouse anti-human TRA-1-60, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 330613 | |
| Mouse anti-human TRA-1-81, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 330705 | |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 400129 | isotype control for SSEA-1 |
| Mouse IgG3, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 401321 | isotype control for SSEA-4 |
| Mouse anti-human SSEA-1, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 323010 | |
| Mouse anti-human SSEA-4, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 330407 | |
| Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 488 | Jackson Immunoresearch | 115-606-068 | use at a dilution of 1:600 or further optimize |
| Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 647 | Jackson Immunoresearch | 115-546-068 | use at a dilution of 1:600 or further optimize |
| DAPI | Thermo-Fisher Scientific | D21490 | stock solution 10 mM, further dilute to 1:12.000 for a working solution |
| Corning® Matrigel® Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | basement membrane matrix (BMM) |
| scid-beige mice, female | Taconic | CBSCBG-F | |
| RNeasy Plus Mini Kit (50) | Qiagen | 74134 | RNA isolation kit |
| T-25 flasks, tissue culture-treated | Thermo-Fisher | 156367 | |
| T-75 flasks, tissue culture-treated | Thermo-Fisher | 156499 | |
| Nunc™ tissue-culture dish | Thermo-Fisher | 12-567-650 | 10 cm tissue culture dish |
| 6-well plates, tissue-culture treated | Thermo-Fisher | 140675 | |
| Neubauer counting chamber (hemacytometer) | VWR | 15170-173 | |
| Mr. Frosty™ Freezing Container | Thermo-Fisher | 5100-0001 | freezing container |
| FACS tubes, Round Bottom Polystyrene Test Tube, 5ml | Corning | 352058 | 5 ml polystyrene tubes |
| Eppendorf tubes, 1.5 ml | Thermo-Fisher | 05-402-96 | 1.5 ml microcentrifuge tubes |
| PCR tubes, 200 µl | Thermo-Fisher | 14-222-262 | |
| pipette tips, 100 to 1250 µl | Thermo-Fisher | 02-707-407 | narrow-bore 1 mL tips |
| pipette tips, 5 to 300 µl | Thermo-Fisher | 02-707-410 | |
| pipette tips, 0.1 to 10 µl | Thermo-Fisher | 02-707-437 | |
| wide-bore pipette tips, 1000 µl | VWR | 89049-166 | wide-bore 1 mL tips |
| glass Pasteur pipettes | Thermo-Fisher | 13-678-20A | |
| ethanol, 200 proof | Thermo-Fisher | 04-355-451 | |
| vortex mixer | VWR | 10153-842 | |
| chambered coverglass, 8-well, 1.5mm borosilicate glass | Thermo-Fisher | 155409 | glass-bottom confocal-grade cultureware |
| 22G needles | VWR | 82002-366 | |
| insulin syringes | Thermo-Fisher | 22-253-260 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fixation of explanted teratomas |
| Illumina HT-12 v4 Expression BeachChip | Illumina | BD-103-0204 | expression microarray, supported by PluriTest, discontinued by manufacturer |
| PrimeView Human Genome U219 Array Plate | Thermo-Fisher | 901605 | expression microarray (formerly Affymetrix brand), soon to be supported by PluriTest |
| GeneChip™ Human Genome U133 Plus 2.0 Array | Thermo-Fisher | 902482 | expression microarray (formerly Affymetrix brand), supported by CellNet, soon to be supported by PluriTest |
| PluriTest® | Coriell Institute | www.pluritest.org, free service for bioinformatic assessment of pluripotency, accepts microarray data - *.idat files from HT-12 v4 platform, soon to support U133, U219 microarray and RNA sequencing data | |
| CellNet | Johns Hopkins University | cellnet.hms.harvard.edu, free service for bioinformatic identification of cell type, including plutipotent stem cells, based on U133 microarray data - *.cel files, soon to support RNA sequencing data |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Yu, J., et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17 (3), 194-200 (2016).
- Schmidt, D., et al. Prenatally fabricated autologous human living heart valves based on amniotic fluid derived progenitor cells as single cell source. Circulation. 116 (11 Suppl), I64-I70 (2007).
- Weber, B., Zeisberger, S. M., Hoerstrup, S. P. Prenatally harvested cells for cardiovascular tissue engineering: Fabrication of autologous implants prior to birth. Placenta. 32, S316-S319 (2011).
- Weber, B., et al. Prenatally engineered autologous amniotic fluid stem cell-based heart valves in the fetal circulation. Biomaterials. 33 (16), 4031-4043 (2012).
- Kehl, D., Weber, B., Hoerstrup, S. P. Bioengineered living cardiac and venous valve replacements: current status and future prospects. Cardiovasc. Pathol. 25 (4), 300-305 (2016).
- Slamecka, J., et al. Non-integrating episomal plasmid-based reprogramming of human amniotic fluid stem cells into induced pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Cell Cycle. 15 (2), 234-249 (2016).
- Jiang, G., et al. Human Transgene-Free Amniotic-Fluid-Derived Induced Pluripotent Stem Cells for Autologous Cell Therapy. Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).
- Pipino, C., et al. Trisomy 21 mid-trimester amniotic fluid induced pluripotent stem cells maintain genetic signatures during reprogramming: implications for disease modeling and cryobanking. Cell. Reprogram. 16 (5), 331-344 (2014).
- Cai, J., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from umbilical cord matrix and amniotic membrane mesenchymal cells. J Biol. Chem. 285 (15), 11227-11234 (2010).
- Ge, X., et al. Human Amniotic Mesenchymal Stem Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells May Generate a Universal Source of Cardiac Cells. Stem Cells Dev. 21 (15), 2798-2808 (2012).
- Drozd, A. M., Walczak, M. P., Piaskowski, S., Stoczynska-Fidelus, E., Rieske, P., Grzela, D. P. Generation of human iPSCs from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res. Ther. 6 (1), (2015).
- Kang, N. -H., et al. Potential antitumor therapeutic strategies of human amniotic membrane and amniotic fluid-derived stem cells. Cancer Gene Ther. 19 (8), 517-522 (2012).
- Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol. Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Yu, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
- Martí, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 8 (2), 223-253 (2013).
- Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat. Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
- Adewumi, O., et al. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat. Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
- Müller, F. -J., et al. A bioinformatic assay for pluripotency in human cells. Nature Methods. 8 (4), 315-317 (2011).
- Cahan, P., Li, H., Morris, S. A., Lummertz da Rocha, E., Daley, G. Q., Collins, J. J. CellNet: Network Biology Applied to Stem Cell Engineering. Cell. 158 (4), 903-915 (2014).
- Schopperle, W. M., DeWolf, W. C. The TRA-1-60 and TRA-1-81 Human Pluripotent Stem Cell Markers Are Expressed on Podocalyxin in Embryonal Carcinoma. STEM CELLS. 25 (3), 723-730 (2007).
- Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2014).
- Müller, F. -J., Goldmann, J., Löser, P., Loring, J. F. A call to standardize teratoma assays used to define human pluripotent cell lines. Cell Stem Cell. 6 (5), 412-414 (2010).
- Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat. Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
