Questo protocollo descrive la riprogrammazione di primaria amniotico liquido e membrana di cellule staminali mesenchimali in cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un approccio episomal non-integrazione in condizioni completamente chimicamente definite. Procedure di estrazione, cultura, riprogrammazione e caratterizzazione delle cellule staminali pluripotenti indotte risultanti dai rigorosi metodi sono dettagliate.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Riprogrammazione primario del liquido amniotico e le celle a membrana di pluripotenza in condizioni prive di Xeno
In questo articolo
Sommario
Abstract
Terapie basate su cellule autologhe ha un passo più vicino alla realtà con l'introduzione di cellule staminali pluripotenti indotte. Cellule staminali embrionali, come il liquido amniotico e cellule staminali mesenchimali di membrana, rappresentano un tipo unico di cellule non differenziate con promessa in ingegneria tissutale e per riprogrammare in iPSC per futuri interventi pediatrici e bancaggio delle cellule staminali. Il protocollo presentato qui descrive una procedura ottimizzata per l'estrazione e la coltura primaria amniotico liquido e la membrana delle cellule staminali mesenchimali e generando episomal indotta da cellule staminali pluripotenti da queste cellule in cultura completamente chimicamente definita condizioni che utilizzano umano ricombinante vitronectina e il mezzo di E8. Caratterizzazione delle nuove linee applicando metodi rigorosi – flusso cytometry, imaging confocale, la formazione di teratoma e profiling trascrizionale – inoltre è descritto. Le linee appena generate esprimono marcatori di cellule staminali embrionali – Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 – pur essendo negativo per il marcatore di SSEA-1. Le linee di cellule staminali formano i teratomas in topi scid-beige in 6-8 settimane e i teratomas contengono tessuti rappresentativi di tutti i tre strati di germe. Profiling trascrizionale delle linee di invio dei dati di microarray di espressione globale a un algoritmo di valutazione pluripotenza bioinformatic ritenute tutte le linee pluripotenti e di conseguenza, questo approccio è un'attraente alternativa alla sperimentazione animale. Le nuove linee di iPSC prontamente possono essere utilizzate in esperimenti a valle che coinvolgono l'ottimizzazione di differenziazione e dell'ingegneria tissutale.
Introduzione
La tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) comporta potenziali terapie di sostituzione cellulare, malattia e modellazione inerente allo sviluppo e droga e selezione tossicologica1,2,3. Terapie sostitutive concettualmente può essere ottenute tramite l'iniezione delle cellule, in vitro differenziato l'impianto del tessuto (ad esempio di patch cardiaci), o rigenerazione guidata mediante ingegneria tissutale. Liquido amniotico (AFSC) e cellule staminali di membrana (AMSC) sono un'ottima fonte di cellule per questi interventi sia direttamente
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Il protocollo segue le linee guida istituzionali del comitato etico per la ricerca umana. Consenso scritto del paziente è stata ottenuta per l'utilizzo del liquido amniotico per la ricerca.
Questo protocollo segue i criteri del Comitato uso della University of South Alabama e istituzionali Animal Care.
1. isolamento e coltura di cellule staminali amniotiche primario Mesenchymal
-
Placcatura di cellule del liquido amniotico
- Ottenere un minimo di 2,5 mL di liquido amniotico raccolto nel processo di amniocentesi da un medico.
Nota: Tutte le manipolazioni di tessuto e cellule vi....
- Ottenere un minimo di 2,5 mL di liquido amniotico raccolto nel processo di amniocentesi da un medico.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Consenso informato scritto è stato ottenuto dai pazienti prima della raccolta del liquido amniotico per scopi di test genetici e dedicando una piccola aliquota del fluido per la ricerca. Nessun consenso è richiesto per l'uso della membrana amniotica nella ricerca, come la placenta rappresenta rifiuti sanitari. Le cellule staminali della membrana e del liquido amniotico tipico mesenchymal proprietà di visualizzazione, morfologicamente le loro cellule sono fusiformi e fase-brillante. Al mom.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
La fase iniziale della generazione di iPSC da cellule staminali embrionali comporta l'estrazione di celle di origine da tessuti fetali, loro cultura, espansione e introduzione dei plasmidi riprogrammazione episomal. Questa fase è seguita da un periodo di cultura di circa 14-18 giorni prima che le prime colonie completamente riprogrammate possono essere espansa. La fase finale è la maturazione dei cloni iPSC. L'iniziale estrazione delle cellule staminali della membrana amniotica è realizzata per mezzo di una combinato dig.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal Fonds Medizinische Forschung presso l'Università di Zurigo, Forschungskredit dell'Università di Zurigo, The SCIEX NMSCh sotto 10.216 Fellowships e 12.176, The Swiss Society of Cardiology, The Swiss National Science Fondazione sotto Grant [320030-122273] e [310030-143992], il 7 ° programma quadro, la valvola di vita, la Commissione europea sotto Grant [242008], l'Olga Mayenfisch Foundation, la Fondazione EMDO, la concessione di Start-up 2012 dell'ospedale universitario di Zurigo, e finanziamento interno del Mitchell Cancer Institute.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit di dissociazione tumorale, sistema di | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | , kit di reagenti, include provette di dissociazione tissutale ed enzimi di dissociazione tissutale |
| delicato Dissociatore MACS | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | sistema di dissociazione tissutale, dissociatore |
| Thermo Scientific™ Shandon e commercio; Bisturi monouso n. 10, sterile, confezionato singolarmente, 5,75 (14,6 cm) | Thermo-Fisher | 3120032 | |
| 70 &; filtri cellulari m | Corning | 10054-456 | |
| RPMI 1640 medio | Thermo-Fisher | 32404014 | |
| piattaforma oscillante | VWR | 40000-300 | |
| provette da centrifuga da 50 ml | Thermo-Fisher | 339652 | |
| provette da centrifuga da 15 ml | Thermo-Fisher | 339650 | |
| EBM-2 terreno basale | Lonza | CC-3156 | terreno basale per AFMC terreno |
| FGF 2 umano (espresso in E. coli, non glicosilato) | Prospec Bio | CYT-218 | bFGF, integratore per AFMC medium |
| EGF Human, Pichia | Prospec Bio | CYT-332 | EGF, supplemento per il terreno AFMC |
| LR3 Insulin Like Growth Factor-1 Human Recombinant | Prospec Bio | CYT-022 | IGF, integratore per AFMC siero |
| Thermo-Fisher | qualificato per cellule staminali embrionali | 10439024 | FBS |
| antibiotico-antimicotico (100X) | Thermo-Fisher | 15240062 | per AFSC/AMSC primarie, per AFSC/AMSC di routine non dovrebbe essere necessario, non utilizzare in terreno per cellule trasfettate! |
| Soluzione per il distacco di cellule accutasi, | StemCell Technologies | 07920 | enzima per il distacco di cellule |
| , CryoStor™ CS10 | StemCell Technologies | 07930 | mezzo di congelamento completo |
| PBS, pH 7,4 | Thermo-Fisher Scientific | 10010023 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | 12362 | per l'isolamento del plasmide |
| pEP4 E02S EN2K | Addgene | 20925 | EN2K, fattori di riprogrammazione Oct4+Sox2, Nanog+Klf4 |
| pEP4 E02S ET2K | Addgene | 20927 | ET2K, fattori di riprogrammazione Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4 |
| pCEP4-M2L | Addgene | 20926 | M2L, fattori di riprogrammazione c-Myc+LIN28 |
| Spettrofotometro UV-Vis NanoDrop 2000c | Spettrofotometro | Thermo-Fisher | ND-2000C |
| Neon® Sistema di trasfezione | Thermo-Fisher | MPK5000 | sistema di trasfezione, componenti: Pipetta al neon - pipetta di trasfezione Dispositivo al neon - dispositivo di trasfezione |
| Neon® Sistema di trasfezione 10 µ L Kit | Thermo-Fisher | MPK1025 | kit di materiali di consumo per il sistema di trasfezione al neon, contiene: punta per neon - punta per trasfezione tubo per neon - tubo per trasfezione tampone R - tampone per risospensione tampone E - tampone elettrolitico |
| Stemolecule™ Sodium Butirrate | StemGent | 04-0005 | potenziatore di piccole molecole di riprogrammazione |
| TeSR-E8 | StemCell Technologies | 05940 | E8 medio |
| Vitronectina XF™ | StemCell Technologies | 07180 | VTN, concentrazione stock 250 &; g/ml, utilizzato per il rivestimento a 1 µ g/cm2 in diluizione di vitronectina (CellAdhere) tampone |
| CellAdhere™ Tampone di diluizione | StemCell Technologies | 07183 | tampone di diluizione di vitronectina |
| UltraPure™ 0,5M EDTA, pH 8,0 | Thermo-Fisher | 15575020 | diluire con PBS a 0,5 mM prima dell'uso |
| EVOS® Sistema di imaging FL | Thermo-Fisher Scientific | AMF4300 | Sistema di microscopio per immagini LCD |
| CKX53 Microscopio invertito | Microscopio per colture cellulari a contrasto di fase | Olympus | |
| Pierce™ 16% di formaldeide (p/v), senza metanolo | Thermo-Fisher | 28908 | diluito al 4% con PBS prima dell'uso, diluito può essere conservato a 2-8 gradi &; C per 1 settimana |
| Perm Buffer III | BD Biosciences | 558050 | tampone di permeabilizzazione, raffreddare a -20 ° C prima dell'uso |
| IgG1 di topo, κ Controllo isotipico, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 557782 | il controllo degli isotipi per Oct3/4A, Nanog |
| Mouse IgG1, κ Controllo isotipico, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | controllo dell'isotipo per Sox2 | |
| Topo anti-umano Oct3/4 (Human Isoform A), Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 561628 | |
| Topo anti-umano Nanog, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 560791 | |
| Topo anti-umano Sox-2, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 562139 | |
| IgGM di topo, κ Controllo isotipico, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | il controllo dell'isotipo per TRA-1-60 | |
| IgGM di topo, κ Controllo isotipico, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 401618 | controllo isotipico per TRA-1-81 |
| Topo anti-umano TRA-1-60, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 330613 | |
| Topo anti-umano TRA-1-81, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 330705 | |
| Topo IgG1, κ Controllo isotipico, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 400129 | il controllo isotipico per SSEA-1 |
| IgG3 di topo, κ Controllo isotipico, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | controllo dell'isotipo per SSEA-4 | |
| Topo anti-umano SSEA-1, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 323010 | |
| Topo anti-umano SSEA-4, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 330407 | |
| Affinipure F(ab')2 Frammento di capra anti-topo IgG+IgM, Alexa Fluor® 488 | Jackson Immunoresearch | 115-606-068 | utilizzare a una diluizione di 1:600 o ottimizzare ulteriormente |
| Affinipure F(ab')2 Frammento di capra Anti-topo IgG+IgM, Alexa Fluor® 647 | Jackson Immunoresearch | 115-546-068 | utilizzare a una diluizione di 1:600 o ottimizzare ulteriormente |
| DAPI | Thermo-Fisher Scientific | D21490 | soluzione madre 10 mM, ulteriormente diluire a 1:12.000 per una soluzione funzionante |
| Corning® Matrigel® Fattore di crescita ridotto, privo di rosso fenolo | Corning | 356231 | matrice della membrana basale (BMM) |
| scid-beige topi, femmina | Taconic | CBSCBG-F | |
| RNeasy Plus Mini Kit (50) | Qiagen | 74134 | Kit di isolamento dell'RNA |
| T-25 matracci, | Thermo-Fisher | trattato con | |
| matracci T-75, Thermo-Fisher trattato con coltura tissutale | |||
| piatto per coltura tissutale Nunc™ | Thermo-Fisher | 12-567-650 | Piatto per coltura tissutale da 10 cm |
| piastre a 6 pozzetti, trattate con coltura tissutale | Camera di conteggio Thermo-Fisher | 140675 | |
| Neubauer (ematocitometro) | VWR | 15170-173 | |
| Mr. Frosty™ contenitore per congelamento | Thermo-Fisher | 5100-0001 | contenitore di congelamento |
| Provette FACS, provetta in polistirene a fondo tondo, provette | Corning | 352058 | 5 ml in polistirene Provette |
| Eppendorf da 1,5 ml | Thermo-Fisher | 05-402-96 | Provette per microcentrifuga da 1,5 ml |
| Provette per PCR, 200 e micro; l | Puntali per pipette Thermo-Fisher | 14-222-262 | |
| , da 100 a 1250 &; l | Thermo-Fisher | 02-707-407 | puntali a foro stretto da 1 mL |
| puntali per pipette, da 5 a 300 &; l | Thermo-Fisher | 02-707-410 | |
| puntali per pipette, da 0,1 a 10 &; l | Thermo-Fisher | 02-707-437 | |
| puntali per pipette a foro largo, 1000 &; l | VWR | 89049-166 | puntali da 1 mL |
| Pipette Pasteur | Thermo-Fisher | 13-678-20A | |
| etanolo, 200 proof | Thermo-Fisher | 04-355-451 | |
| miscelatore a vortice | VWR | 10153-842 | |
| vetro di copertura a camera, 8 pozzetti, vetro borosilicato da 1,5 mm | Thermo-Fisher | 155409 | colture confocali con fondo in vetro |
| Aghi 22G | VWR | 82002-366 | |
| siringhe da insulina | Thermo-Fisher | 22-253-260 | |
| Soluzione di formalina, tampone neutro, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fissazione di teratomi espiantati |
| Illumina HT-12 v4 Expression BeachChip | Illumina BD-103-0204 | expression microarray, supportato da PluriTest, fuori produzione dal produttore | |
| PrimeView Human Genome U219 Array Plate | Thermo-Fisher | 901605 | microarray di espressione (ex marchio Affymetrix), presto supportato da PluriTest |
| GeneChip™ Human Genome U133 Plus 2.0 Array | Thermo-Fisher | 902482 | di espressione microarray (ex marchio Affymetrix), supportato da CellNet, presto supportato da PluriTest |
| PluriTest® | Coriell Institute | www.pluritest.org, servizio gratuito per la valutazione bioinformatica della pluripotenza, accetta dati di microarray - file *.idat dalla piattaforma HT-12 v4, che presto supporterà i dati di sequenziamento di microarray e RNA U133, U219 | |
| CellNet | Johns Hopkins University | cellnet.hms.harvard.edu, servizio gratuito per l'identificazione bioinformatica del tipo di cellula, comprese le cellule staminali plutipotenti, basato sui dati di microarray U133 - file *.cel, presto supporterà l'RNA Sequenziamento dei dati |
Riferimenti
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Yu, J., et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cell....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
