Summary
이 프로토콜은 기본 양수 액체와 막 중간 엽 줄기 세포의 화학적으로 완벽 하 게 정의 된 조건에서 비 통합 episomal 접근을 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 설명 합니다. 추출, 문화, 프로그래밍, 그리고 엄격한 방법으로 결과 유도 만능 줄기 세포의 특성의 절차 자세히 나와 있습니다.
Abstract
자가 세포 기반 요법 유도 만능 줄기 세포의 소개와 함께 현실로 한 걸음 더 가까이 있어. 양수 등 막 중간 엽 줄기 세포, 태아 줄기 세포는 독특한 조직 공학에서 및 iPSC 미래 소아 개입 및 줄기 세포 은행으로 프로그래밍에 대 한 약속을 가진 미 분화 세포의 종류를 나타냅니다. 여기에 제시 된 프로토콜 추출에 대 한 최적화 된 절차를 설명 하 고 기본 양수 액체와 막 중간 엽 줄기 세포를 배양 하 고 episomal 생성 유도 만능 줄기 세포 화학적으로 완전히 정의 된 문화에서이 세포에서 인간 재조합 형 vitronectin 고 E8 매체를 이용 하는 조건. -Cytometry, confocal 영상, 기형종 형성과 transcriptional 프로 파일링-엄격한 방법을 적용 하 여 새로운 라인의 특성은 또한 기술 된다. 새로 생성 된 라인 SSEA-1 표식에 대 한 부정 되 고 있는 동안 배아 줄기 세포-Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4-마커를 표현 한다. 줄기 세포 라인 teratomas scid 베이지색 쥐에 6-8 주에 고 teratomas는 포함 모든 3 개의 세균 층의 대표적인 조직. 따라서이 방식은 동물 테스트 하는 매력적인 대안 그리고 모든 라인 만능 간주 bioinformatic pluripotency 평가 알고리즘 글로벌 식 microarray 데이터 전송 라인의 transcriptional 프로 파일링. 새로운 iPSC 라인 차별화 및 조직 공학의 최적화를 포함 하는 다운스트림 실험에서 쉽게 사용할 수 있습니다.
Introduction
유도 만능 줄기 세포 (iPSC)의 기술 발달 모델링, 잠재적인 세포 대체 요법, 질병 및 약물 및 독물학 심사1,2,3에 대 한 제공합니다. 대체 요법 개념적 세포 주입에 의해 달성 될 수 있다, 체 외에서 분화 (심장 패치) 등 조직 이식 또는 조직 공학에 의해 재생을 유도 합니다. 양수 (AFSC)와 막 줄기 세포 (AMSC)도 이러한 개입에 대 한 셀의 훌륭한 소스가 직접4,5,,67 또는 프로그래밍에 대 한 시작 셀 인구 로 pluripotency8,,910,,1112.
정의 되지 않은 문화 시스템을 사용 하는 초기 접근 또는9,10,,1112생성 방법의 수반 게놈 통합을 요구 하는 프로그래밍. 더 최근의 연구 iPSC 양수 유체 상피 세포에서 생성 하는 덜 정의 된 지하실 멤브레인 첨부 매트릭스 (BMM) 사용 되었다 하더라도 이종 무료 매체를 채택. 그러나, 기형종 형성 분석 결과 시험관 및 분자 데이터 함께 연구에 포함 되지. 양수 내 유체 상피 세포는 신생아 fibroblasts13에 비해 한 약 원죄 높은 재활 효율성이 있다을 발견 했다. 또 다른 연구에서는 양수에서 중간 엽 줄기 세포 또한 iPSC는 훨씬 더 높은 효율12로 재설정을 발견 했다.
만능 줄기 세포 조직 대표자 모든 3 세균 층으로 분화 될 수 있다 하 고 따라서 광범위 한 잠재력을가지고. 소아 환자 prenatally 수확, 프로그래밍, 그리고 그들의 헌 양수 액체 줄기 세포의 조직 공학에서 혜택을 수 있는 그리고 양수 막 줄기 세포 perinatally. 또한, 태아 줄기 세포 (성체 줄기 세포14,15보다 낮은)의 상대적으로 낮은 수준의 수 이론적으로 iPSC16소스 셀에서 관찰된 고정 후 바이어스의 해결에 도움이 됩니다.
여기에 우리가 현재 양수 프로그래밍에 대 한 프로토콜 및 막 줄기 세포의 pluripotency 화학적으로 재조합 vitronectin17 (VTN)18episomal 플라스 미드 사용 하 여 이종 무료 E8 매체를 정의. 프로그래밍에 대 한 셀의 원천으로 양수 액체와 막 셀의 주요 이점은 그들의 가용성을 사전에 속이 고 이렇게 주로 소아 조직 공학에 연구를 도움이 될 것 이라고 perinatally 및 따라서.
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Protocol
프로토콜 인간 연구에 대 한 윤리 위원회의 기관 지침을 따릅니다. 환자 서 면된 동의 연구는 양수를 사용 하 여 얻은 했다.
이 프로토콜의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의는 남쪽 알라바 마의 대학 정책을 따릅니다.
1. 격리와 기본 양수 중간 엽 줄기 세포의 문화
-
양수 내 유체 세포의 도금
- 의사에 의해 amniocentesis 과정에서 수확 하는 양수의 2.5 mL의 최소 얻을.
참고: 라이브 세포와 조직의 모든 처리 살 균 조직 문화 내각에서 수행 해야 하 고 적절 한 개인 보호 장비를 사용 해야 합니다. 기본적인 세포 배양 및 메 마른 기술 숙련도 필요 합니다. - 양수 및 막 셀 (AFMC) 문화 매체를 준비: EBM-2 기저 매체, 15% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), bFGF의 20 ng/mL, EGF, IGF의 10 ng/mL의 25 ng/mL. 기본 양수 양수 뿐만 아니라 유체 막 줄기 세포의 문화에 대 한 항생제 antimycotic 솔루션으로 매체를 보충 한다.
- 0 일에 혼합 양수의 2.5 mL AFMC 문화 매체와 접시의 3.5 mL T25 플라스 크로. 적어도 48 h 식민지의 존재에 대 한 확인 하기 전에 그대로 37 ° C, 5% CO2 에서 품 어.
- 5 일에 부착 세포의 식민지 존재 해야 합니다. 부드럽게 바위는 완전히 파편에 준수 한 진공-aspirate 보낸된 중간/양수 내 유체 혼합 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 셀을 꺼내 려 플라스 크. 신선한 AFMC 매체의 5 mL을 바꿉니다.
- 또 5 일에 대 한 문화입니다. 중간 단계 1.1.4에에서 설명 된 대로 매일 변경 합니다.
- 의사에 의해 amniocentesis 과정에서 수확 하는 양수의 2.5 mL의 최소 얻을.
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인간 amnion에서 기본 중간 엽 줄기 세포의 분리
- 반응과를 세포 무결성을 최대화 하기 위해 늦어도 24 시간 이내 출생, 최대한 빨리 다음을 얻습니다. amnion의 9 cm2 세그먼트를 잘라, 혈전을 제거 하 고 항생제 antimycotic 솔루션으로 보충 하는 PBS의 30 mL 50 mL 원심 분리기 튜브에 씻어.
- 멸 균 10cm 조직 문화 접시에 조각을 벌금 scalpels의 한 쌍을 사용 하 여 막 말하다. 세포 막의 소화와 세포의 추출 조직 분리 시스템을 사용 하 여 달성 될 것입니다. 제조 업체의 프로토콜을 따릅니다.
참고: 닦지 후 조직의 미세한 조각, 더 높은 셀 번호 소화 후 회복. - 한 조직 분리 관으로는 메스를 사용 하 여 다진된 막 조직 대량 전송 및 RPMI 1640 매체의 4.7 mL와 혼합. ( 재료의 표참조) 분리 효소에 혼합.
- 조직 dissociator에 튜브를 장착 하 고 프로그램 "h_tumor_01"를 실행 합니다. 30 분 동안 락 플랫폼에서 37 ° C에서 튜브를 품 어.
- 또한 RPMI 1640의 35 mL와 함께 정지를 희석 하 고 50 mL 수집 원심 분리기 튜브 위에 70 µ m 여과기에 적용 합니다.
- 원심 분리기 실내 온도에, 폐기 상쾌한 200 x g에서 5 분 RPMI 1640의 5 mL에 펠 릿을 resuspend, hemacytometer를 사용 하 여 셀의 개수와 갓 조직 문화 치료와 혈관으로 10000 셀/c m2 의 조밀도에 접시에 대 한 준비 AFMC 매체 항생제 antimycotic 솔루션으로 보완입니다.
참고: 불완전 한 소화의 경우 조직의 작은 조각 존재 되며 단일 셀 부족 될 것입니다. 다시 아래로 회전 하 고 한 T75 플라스 크에 전체 펠 릿 접시.
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1 차 AFSC 및 AMSC의 문화
- 진공 발음에 의해 AFSC/AMSC의 통로 식민지 보냈다 중간 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 플라스 크에 세포 분리 효소의 2 개 mL를 추가. 5-8 분 동안 37 ° C에서 품 어.
- 셀을 꺼내 려 하 고 정지 AFMC 매체의 동등한 양으로 혼합 데 플라스 크에 누릅니다 (항생제 antimycotic 보충 하셔야 합니다이 시점에서 필요한). 4-5 분 제거 중 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 상쾌한 또는 튜브를 거꾸로 하 고 폐기물 콘테이너로 그것을 비우는 의하여 단순히 200 g에서 원심.
- 액체의 나머지 드롭에서 단일 셀 서 스 펜 션으로 펠 릿 헤어 하 도금 AFMC 매체와 혼합 원심 분리기 튜브의 하단을 터치 합니다. 2, 500와 5000 셀/cm2사이 조밀도에 T-플라스 크에 격판덮개.
- 변경 매체 매일입니다. 통로 6 넘어 셀 라인 문화 하지 마십시오. 목적으로 프로그래밍에 대 한 낮은 사용 가능한 통로.
- 냉동 매체를 사용 하 여 백업으로 AFSC와 AMSC 냉동된 주식을 준비 합니다. 문화는 셀 분리 효소, 4 ° c 5 분 동안 200 g에서 원심 분리기를 사용 하 여 수확.
- 상쾌한 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 제거 하 고 펠 릿에 셀을 단 수로 바꾸기에 튜브의 하단 터치. Cryovials에 1 × 106/mL 및 약 수의 밀도에 완전 한 동결 매체에 resuspend. -80 ° c.에 하룻밤 냉동 컨테이너에 저장 장기 저장을 위한 액체 질소 다음 이동 합니다.
2. 프로그래밍 Pluripotency에
- 재활 플라스 미드를 얻기
- 비영리 플라스 미드 저장소를 통해 재활 플라스 미드를 구입. 자료 전송 계약 필요 합니다.
- 대장균 유능한 세포는 플라스 미드를 변환 하 고 상용 플라스 미드 추출 키트를 사용 하 여 플라스 미드를 분리. 제조업체의 지침을 따릅니다.
- 플라스 미드는 분 광 광도 계를 사용 하 여 DNA의 농도 측정 합니다. 높은 결과 농도, transfection 동안 샘플의 희석을 피하기 위해 이상적으로 1 µ g / µ L 플라스 미드에 대 한 목표.
- UV 분 광 광도 계 및 약 수를 사용 하 여 개별 플라스 미드의 농도 측정을 개별적으로.
- 믹스 함께 3 µ g, 3 µ g, EN2K, ET2K, M2L 플라스 미드의 2 µ g 각각. 이 재활 플라스 미드 솔루션입니다. 플라스 미드 솔루션의 금액 1 x 106 세포 transfect에 충분 하다. 이러한 여러 aliquots를 준비 합니다.
- -80 ° c.에 모든 aliquots를 저장
- 대상 문화 접시를 준비
- Vitronectin와 함께 한 6 잘 플레이트 코트-각 우물에 vitronectin 희석 버퍼의 1 mL을 추가 하 고 40 µ L VTN 재고 솔루션 (1 µ g/c m2)의 혼합. 실내 온도 (RT)에 또는 1 시간에 대 한 37 ° C에서 인큐베이터에 둡니다.
- 진공-aspirate 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 솔루션 고 각 잘에서 AFMC 매체의 2 개 mL를 바꿉니다. 도금을 셀 때까지 37 ° C에서 저장 합니다.
참고: 중요 한:이 단계에서 사용 되는 AFMC 매체 어떤 항생제 또는 antimycotic 솔루션 포함 하면 안.
- 기본 교양된 AFSC/AMSC 수확
참고: 문화 충분히 낮은 통로 번호에서 냉동된 주식 고 프로그래밍에 대 한 하나의 T-75 플라스 크 바치에 AFSC/AMSC를 확장 합니다. 몇 가지로부터 100000 세포는 충분 한 실험, 수확을 목표로 약 500000 세포 손실에 대 한 보상에 대 한 transfection 매개 변수 또는 다른 문화 조건 최적화는 테스트를 합니다.- 낮은 통로에 초기 편의에 AFSC/AMSC 1.3.1 1.3.2 단계에서 설명한 대로 셀 분리 효소 혼합을 사용 하 여 수확. 후 셀 centrifuged 되었습니다, 다음 단계를 진행 합니다.
- Resuspend 펠 릿 1 ml에서 PBS와 섞어 잘 씻어 혈 청 구성 요소. hemacytometer을 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 100000/mL의 PBS와 약 수를 셀 밀도 조정 합니다. 이 셀과 transfection 사용 되는 버퍼 사이 최소한의 접촉 시간을 보장 합니다.
- 5 mL 폴리스 티 렌 튜브 위에 microcentrifuge 관 배치 (어댑터로 하면 원심 일반 스윙으로 터) 및 실 온에서 4 분 x g 200에서 원심 분리기. 튜브를 반전 하 고 폐기물 컨테이너에는 상쾌한 삭제. 고정 각으로 터를 사용 하지 마십시오.
- 실 온에서 3 분 200 x g에 추가 원심 분리 단계를 수행 합니다. 이것은 나머지 수 하단에 수집 하는 튜브의 벽에서 액체. 신중 하 게 모든 200 µ L 피 펫을 사용 하 여 그것의 발음.
- Transfection 프로그래밍 플라스 미드와
- 실험, 프로그래밍에 대 한 transfection 시스템 ( 재료의 표참조) 사용 됩니다 셀에 재활 플라스 미드를 제공 하. 조직 문화의 장으로 transfection 팁, transfection 튜브, 물의 resuspension 버퍼 및 전해 버퍼를 놓습니다. 키트 시 약에 보관 됩니다 RT, 열 때까지 4 ° c.에 저장 된 다음
참고: 우리는 10 µ L 버전의 키트를 사용합니다. - Transfection 장치 가까이 관 역 그것의 캐비닛에 직접 배치 수 있도록 이동 합니다. 전해 버퍼의 3 mL와 함께 한 transfection 튜브를 슬롯 안에 모든 방법으로 그것을 추진 하 여 역으로 튜브를 탑재.
- 재활 플라스 미드-80 ° C 저장에서 2.1.5 단계에서 준비 하는 솔루션 aliquots 고 문화 캐비닛에 RT에 녹여 수 있도록.
- Transfection 장치에서 다음 transfection 매개 변수 선택: 950 V, 40 ms, 그리고 1 펄스.
- 100000 셀 10 µ L 물의 resuspension 버퍼에 포함 된 펠 릿 resuspend 신속 하 게이 시점에서에서 작동 때문에 물의 resuspension 버퍼 약간 독성 증가 노출 시간 눈에 띄게 낮은 세포 생존 능력에 있는 결과.
- 믹스 (aliquot 솔루션 1 x 106 세포의 총에 대 한 준비를 했다.) 재활 플라스 미드 솔루션의 1/10에.
- Transfection 피 펫에 transfection 팁을 탑재 합니다.
- 발음 세포 현 탁 액 transfection 팁으로 신중 하 게, 공기 방울의 형성을 방지. 거품은 관찰 하는 경우 정지를 추방 하 고 포부를 반복 합니다. 공기 방울 transfection를 방해 합니다.
- Transfection 피펫으로 transfection 튜브에 삽입 하 고 transfection 장치의 화면에서 "시작" 버튼을 누릅니다. Transfection는의 성공에 대해 알리는 화면 메시지를 기다립니다 고 튜브에서 피펫으로 즉시 제거 합니다.
- 대상 6 잘 플레이트 섹션 2.2에에서 준비의 1 정지를 추방. 매체는 이웃을 잘 혼합 하 고 두 웰 스 (결과 셀 밀도 50000/잘 될 것입니다)에 정지를 동등 하 게 배포.
- 모든 microcentrifuge 튜브 AFSC/AMSC를 개별적으로 포함 하 여 transfection를 반복 합니다. 37 ° C, 5% CO2인큐베이터에 접시를 놓습니다.
- 실험, 프로그래밍에 대 한 transfection 시스템 ( 재료의 표참조) 사용 됩니다 셀에 재활 플라스 미드를 제공 하. 조직 문화의 장으로 transfection 팁, transfection 튜브, 물의 resuspension 버퍼 및 전해 버퍼를 놓습니다. 키트 시 약에 보관 됩니다 RT, 열 때까지 4 ° c.에 저장 된 다음
- Transfected AFSC/AMSC의 문화
- 2-5 일 동안 transfected 세포 문화. 다음 E8 나트륨 낙 산 염의 100 µ M와 3 일에 보충 구성 된 재활 매체 전환 합니다.
참고: 보조 통로 소스 AFSC/AMSC의 전면에 자라 난을 피하기 위해 수행할 수 있습니다. 그러나,는 뿌리고 관심의이 매개 변수는 올바르게 재활 효율을 계산 하는 옵션을 비활성화 됩니다. - 10 일 동안 매일 매일 재활 매체를 변경 합니다. 10 일에서 매일에 매체를 변경 합니다.
- 2-5 일 동안 transfected 세포 문화. 다음 E8 나트륨 낙 산 염의 100 µ M와 3 일에 보충 구성 된 재활 매체 전환 합니다.
- 클론 확장을 위해 완전히 reprogramed 식민지의 수동 따기
- 완전히 재설정된 식민지 하루 14 나타납니다. 식민지를 크기에서 확장 하 여 압축 될 수 있습니다. 그들은 수 수동으로 선택 되며 빠르면 하루 15-16 신선한 격판덮개 전송.
- 따기 절차 전에 1 h 코트 잘 (1 µ g/c m2) 당 vitronectin 희석 버퍼의 300 µ L에 VTN의 8 µ L 24-잘 접시와 RT 또는 37 ° C에서 품 어 나트륨 낙 산 염 없이 E8 매체에 솔루션을 바꿉니다.
- 메 마른 문화 캐비닛에 충분 한 크기 (직경에서 이상적으로 400 µ m)의 식민지를 선택 합니다. 단계 대조 현미경 또는 stereomicroscope를 사용할 수 있습니다.
- 따기, 캐비닛에 배치 하는 LCD 영상 현미경의 모니터 oculars 필요가 이후 사용 됩니다. 현미경 단계 70% 에탄올으로 소독.
- 셀 문화 일반 단계 대조 현미경을 사용 하 여, 선택, 표시, 그리고 식민지 하의 수 있습니다. 이 실제 수확 하는 동안이 프로세스에 대 한 시간 낭비 되지 않습니다 있는지 확인 해야 합니다.
- 즉, 0.5 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 30 µ L로 하는 식민지의 수 이상의 PBS PCR 튜브의 수를 입력 합니다. 식민지는 도금 하기 전에 부분 분리가이 관에 배치 됩니다.
- 5 선택 하려는 2 µ L. 설정 10 µ L 피 펫을 사용 하 여 접시에서 한 번에 식민지 식민지 가장자리에 각도에서 피 펫 팁을 보유 하 고 신중 하 고 점차적으로 표면에서 전체 식민지를 다쳤어요. 즉시 피 펫 팁에 전체 식민지를 발음 하 고 EDTA 준비 PCR 튜브 중 하나에 그것을 전송.
- 나머지 4 식민지와 반복. 4-6 분 RT에서 품 어.
- 피펫으로 식민지를 작은 덩어리로 분해 하는 큰 피 펫 팁을 사용 하 여 부드럽게 위아래로 정지. 단일 세포 현 탁 액을 만들지 마십시오.
- 정지 단계 2.6.2에서에서 준비 하는 24-잘 접시의 대상에 직접 접시. 나머지 식민지와 반복.
- 5 개 이상의 식민지 하 하지만 한 번에 5 개 이상의 식민지를 선택 하지 않는 경우 2.6.6 2.6.10 통해 단계를 반복 합니다. 37 ° C, 5% CO2에서 품 어.
- 클론 확장 및 iPSC의 성숙
- 식민지 성장 하 고 압축 될 수 있습니다. 3-6 일은 충분. 매일 문화 매체를 변경 합니다. 400 µ L의 E8 셀 밀도에 따라 1 mL 사이 사용 합니다.
- 충분 한 식민지 밀도 24-잘 접시의 우물 6 잘 플레이트에 확장 될 것입니다. 1 시간 전에 뿌리고, 코트 (2.2.1 단계)로 VTN와 6 잘 플레이트. 다음에 잘 솔루션을 바꿉니다 잘 당 E8 매체의 2 mL.
- 1 mL 피 펫을 사용 하 여 소스 우물에서 보낸된 중간 발음 하 고 0.5 m EDTA 씻어 m의 300 µ L를 바꿉니다. 즉시 동일한 피 펫 팁을 사용 하 여 aspirate 다시, 0.5 m EDTA의 300 µ L를 바꿉니다 다음 5 분 발음 1 mL 피 펫을 사용 하 여 모든 액체에 대 한 RT에서 품 어.
- 용량 1 mL 피 펫을 설정 하 고, 그것에 1 mL 넓은 구멍 팁을 탑재 대상에서 E8 중간 끝에 발음. 매체의 스트림 소스 iPSC 문화를 씻어.
- 대상 잘 헤어 20-50 셀의 덩어리에 식민지를 여러 번 왔다 갔다 피펫으로에 정지를 전송 합니다. 그들은 부드러운 락 및 접시를 떨고에 의해 우물에서 균등 하 게 배포 얻을 하 고 37 ° C, 5% CO2에서 품 어 다는 것을 확인 하십시오.
- 매일 매체와 통로 3 ~ 4 일 마다 변경 합니다. 어떤 차별화 식민지 단계 대조 현미경 아래 표시 될 수 있습니다 및 캐비닛 문화에 피 펫 팁을 사용 하 여 제거. 높은-품질 순수 iPSC 문화의 선택적 전파 수 있습니다.
- 뿌리고, 전에 1 h 단계 2.2.1 에서처럼 VTN로 6 잘 플레이트의 웰 스 코트. 다음 솔루션을 바꿉니다 잘 당 E8 매체의 2 ml.
- 일상적인 뿌리고는 초기 뿌리고 다 0.5 m EDTA (단계 2.7.2 2.7.5)를 사용 하 여 비슷합니다. 6 잘 플레이트의 한 잘에서 보냈다 매체를를 씻어 버리고 EDTA의 1 mL에 바꿉니다.
- EDTA의 1 mL을 추가 하 고 5-7 분 부분 분리에 대 한 RT에서 품 어. 보육 시간 최적화 경우의 정지를 확인 하 고 필요한 주위 20 ~ 50 셀 덩어리 생산 됩니다. 단일 세포로 분리를 하지 마십시오.
- EDTA 솔루션을 삭제 하 고 대상에서 1 mL 피 펫을 사용 하 여 넓은 구멍 피 펫 팁에 E8 매체의 1 mL를 발음.
- 그것의 원하는 부분을 표면에서 릴리스된 때까지 E8 매체의 스트림 소스 iPSC 문화에서 반복 세척 하 고 잘 전송 대상으로. 이 부분 분할 비율을 나타냅니다 (예를 들어, 1/8는 문화의 옮겨질 수 있다 1:8 비율에 대 한.)
- 통로 마다 3-4 일입니다. 다운스트림 실험에 그들을 사용 하기 전에 적어도 15 구절에 대 한 그들을 배양 하 여 성숙 iPSC 라인 허용
3. 특성화 및 Pluripotency의 확인
참고: cytometry confocal 현미경 검사 법에 대 한 자세한 내용은 추가 파일을 참조 하십시오.
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기형종 형성 분석 결과
- 기형종 형성 분석 결과 의해 모든 3 개의 세균 층의 대표적인 조직으로 차별화 하는 iPSC의 용량을 확인 하려면 다음과 동물 관리 및 사용, 적절 한 프로토콜을 제출에 대 한 시간을 허용 하도록 미리 계획에 관한 제도적 정책 문서입니다. 쥐에서 기형종 형성 6-10 주가 소요 됩니다.
- 4 일 동안 4 우물 iPSC 라인 당 6 잘 플레이트의 문화. 마우스의 한 측면에 주입 하는 세포의 대략 수는 0.5 ~ 1 x 106 셀. 선택 사항: 추가 잘 수 전념 셀 분리 효소로 단일 셀 분리에 의해 잘에서 대표 휴대폰 번호를 확인 하 고 계산.
- IPSC 덩어리에서 일시 중지 됩니다 E8/BMM 혼합물의 볼륨 계산: 마우스의 두 측면은 주입, 각각 수 풀 서 스 펜 션의 150 µ L. 3 마우스는 기형종 1 iPSC 라인의 형성을 테스트 하기에 충분. 죽은 볼륨 손실에 대 한 보상 결과 볼륨에 바늘 당 추가 150 µ L를 포함 합니다. 마우스 당 1 바늘 사용 됩니다. 총 볼륨 이므로 3 * (150 µ L * 2 + 150 µ L) = 1350 µ L
- 2.7.8 2.7.10 단계에 설명 된 대로 passaged 될 그들이 마치 EDTA와 iPSC 식민지를 부분적으로 해리. 그것은 식민지 수 풀으로 해리 하 고 단일 세포로 분리 되지입니다.
- 워시 (3.3.3 단계에서 계산 된 양의 절반), E8 매체의 675 µ L와 iPSC 식민지에서 넓은 구멍 팁을 사용합니다. 5 mL 폴리스 티 렌 튜브에 덩어리 정지를 전송 합니다. 얼음에 놓습니다.
- BMM의 675 µ L를 결합 합니다. 주사까지 얼음에 결과 정지를 유지.
- Anesthetize 그들을 무력화 하 쥐 isoflurane를 사용 하 여. 이 수행 해야 또는 물고기의 숙련 된 인력에 의해 유도.
- 소용돌이 5 mL 폴리스 티 렌 튜브를 짧게 하 고 한 인슐린 주사기 22 G 바늘으로 장착으로 수 풀 서 스 펜 션 (마우스 당 450 µ L)를 발음. 세포 현 탁 액의 150 µ L를 피하 주사. 이 볼륨에는 약 1 × 106 셀을 (단계 3.1.2 참조) 포함 되어 있습니다.
- IPSC 라인 당 3 쥐를 주입. 모든 절차에 대 한 적절 한 동물 보호 연습을 따릅니다.
- 매일 쥐의 상태를 모니터링 합니다.
- Teratomas는 1.5 ~ 2 cm의 끝점 직경에 도달, 쥐를 안락사, explant, teratomas 고 24 h에 대 한 조직 고정을 위한 포 르 말린 용액에 그들을 저장 합니다.
- 얼룩 (H & E) 되며 오신 조직학 핵심 시설에 고정된 teratomas를 가져와. 병리학 자는 모든 3 개의 세균 층의 조직의 존재를 학년 것 이다.
Karyotyping에 대 한 참고: 문화를 제공 해야 하는 라이브 iPSC cytogenetic 실험실은 karyotype의 무결성의 테스트에 대 한 전문. 이 테스트 수행을 하는 것이 좋습니다 모든 5 구절.
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Transcriptional 프로 파일링
- 2 웰 스 한 RNA 샘플을 얻기 위해 3-4 일 동안 6 잘 플레이트의 문화. 만 높은-품질 문화를 사용 하 여, 세포 분화와 작은 오염 된다고 피펫으로 팁을 사용 하 여 해결할 수 있습니다.
- IPSC 문화 상용 키트 다음 제조 업체의 프로토콜을 사용 하 여에서 RNA를 분리. 전문된 게놈 핵심 시설에 샘플 제공.
- IPSC 라인 microarrays (지원된 선택에 대 한 테이블의 자료 를 참조) 또는 RNA 시퀀싱의 글로벌 transcriptional 프로필을 가져옵니다.
- Coriell 연구소에서 온라인 인터페이스를 통해 pluripotency의 bioinformatic 평가 대 한 "*.idat" 파일을 제출 합니다. 또는 제출 "*.cel" pluripotent 줄기 세포, 존스 홉킨스 대학에서 온라인 인터페이스를 통해 포함 하는 셀 형식의 bioinformatic 식별에 대 한 파일. 개별 bioinformatic 분석 허용 하는 데이터의 종류에 대 한 자세한 내용은 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
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Representative Results
정보 서 면된 동의 유전자 테스트 및 연구에 대 한 액체의 작은 약 수를 누리고 양수를 수확 하기 전에 환자 로부터 얻은 것입니다. 아무 동의 태 반 의료 폐기물을 나타냅니다 연구에 양수 막의 사용에 대 한 필요 합니다. 양수 및 막 줄기 세포는 전형적인 엽 속성을 표시, 형태학 상으로 그들의 세포는 스핀 들-모양 및 위상-밝은. 프로그래밍, 셀 엽-상피 (메트로) 전환 받을 고 조약돌 모양의 형태와 공간 조직 상피 속성을 나타내는 식민지의. 이 과정은 48-72 h episomal 플라스 미드를 프로그래밍의 도입에 따라 일찍 시작 됩니다. 하루 5 프로그래밍의 이러한 식민지의 부재 실험의 실패를 나타내는 것 이다. 메트로 식민지의 세포 증식 하 고 결과적으로 식민지 될 소형 주 5와 14 사이. 소형 메트로 식민지는 개별적으로 쉽게 인지할 수 (그림 1A) 있지 않은 셀의 구성 되어 있습니다. 하루 14, 완전히 재설정된 식민지 나타납니다, 운반 하는 단층으로 배열 하는 세포와 쉽게 인지할 수 핵과 nucleoli. 그들은 기계적으로 분리 하 고 식민지 적당 한 크기를 도달 하 고 소형 될 때 확장 준비가 (그림 1B).
부분적으로 재설정된 식민지 전체 pluripotency를 반드시 취득 하지 마십시오-하지만 완전히 그리고 부분적으로 재설정된 식민지 전체 재활 기간 내내 문화에 존재 하는. 그림 2 쇼 대표 흐름에 배아 줄기 세포 (ESC) 마커 식의 cytometric 분석 완전히 그리고 부분적으로 만능 식민지 그들의 해당 형태학. SSEA-1 식 음수19,,2021 (그림 2A)은 전체 pluripotency Nanog, Oct4, Sox2, TRA 항, SSEA-4, 식이와 연결 됩니다. 그러나 부분적으로 만능 세포,, 표현 하지 않습니다 Nanog와 TRA 항20 (그림 2B). 식 및 ESC 마커의 지역화 immunocytochemical 얼룩이 지 고 넓은 필드나 confocal 현미경 (그림 3)를 사용 하 여 몇 군데에 의해 확인 되어야 한다.
Pluripotency의 기능 확인 scid 베이지색 쥐로 셀의 피하 주사를 다음과 같은 형태로 teratomas iPSC 라인의 능력을 입증 함으로써 이루어집니다. 6-8 주 teratomas 끝점 크기에 도달 하기 위해 필요 합니다. H & E 조직 및 병리학 자에 의해 시험의 얼룩 다음 모든 3 개의 세균 층-endoderm, neuroectoderm 및 mesoderm (그림 4A)의 조직 담당자의 존재를 확인 하기 위해 수행 됩니다. 동물 실험에 대안 분석 transcriptional 서명 cDNA microarrays22,23같은 게놈 접근에 의해 pluripotency와 관련 된 것입니다. 잘 설립 iPSC 및 ESC 라인의 수영장 중 하나 겹치는 transcriptional 프로필의 비율이 두 분류자-pluripotency의 음모의 형태로 온라인 bioinformatic pluripotency 평가 소프트웨어에 의해 다음 정해질 수 및 참신 (그림 4B)입니다. 높을수록 pluripotency 점수는 더 많은 쿼리 iPSC 라인 설립된 라인 유사합니다. 그러나 참신 높은 점수는, 편차 또는 높은 pluripotency 점수 (teratocarcinoma 라인 등)22에 불구 하 고 심지어 염색체 착오를 나타낼 수 있습니다. 여기에 제시 된 프로토콜에 따라 생성 된 모든 iPSC 라인 있다 cytometry, 이미징, 기형종 형성과 transcriptional 분석 방법으로 만능을 간주 되었습니다.
그림 1: 프로그래밍 하는 동안 세포의 형태학 진행. (A) 고 양수 막 줄기 세포, 프로그래밍에 대 한 원본 셀을 나타내는 표시 전형적인 엽 형태학, 길쭉한 및 위상 밝은 (왼쪽) 그들은 엽-상피 전환 (메트로)를 받게 될 때까지 상피 속성의 인수 및 자갈 돌 같은 셀 (가운데)과 식민지의 형성으로 이어집니다. 이러한 식민지 격 증 하 고 메트로 세포의 불규칙 한 세포 질량을 (오른쪽) 만듭니다. (B) (하루 14에서 시작) 프로그래밍의 나중 단계에서 식민지 완전히 재설정된 셀의 등장-저명한 핵으로 개별적으로 인지할 수 셀 고 nucleoli 잘 정의 된 테두리 (센터)-monolayers에서 배열 있다 더 많은 (왼쪽)을 만난 식민지와 함께 현재. 완전히 재설정된 고립 된 성숙한 클론은 오른쪽에 그려져 있습니다. 눈금 막대 100 µ m = 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: ESC 마커의 식의 cytometric 분석 흐름에서 완전히 그리고 부분적으로 (메트로) 재설정 셀 식민지. (A) SSEA-1에 대 한 부정적인 동안 만능 식 프로필 Oct4, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, Nanog SSEA-4에 대 한 긍정적 이다. (B) 부분적으로-그 메트로 겪고 있지만 전체 pluripotency에 진행 하는 데 실패-만능 세포 식민지는 Oct4, Sox2에 대 한 긍정적인 하지만 Nanog, TRA와 SSEA 항 결 석. 관련된 형태학 측면-의해-측면 비교에 대 한 포함 되어 있습니다. 스케일 바 = 200 µ m 그리고 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 성숙한 양수 유체 iPSC ESC 마커의 표현의 분석 이미징 Confocal. 녹음 방송 요인 Oct3/4A, Nanog Sox2 TRA 동안 핵에 지역화 되어 있으며 SSEA 항 glycoproteins 막에 지역화. 눈금 막대 = 50 µ m. 큰 확대 (병합 2 X)의 이미지 Oct3/4, Nanog, Sox2 그들의 핵 지 방화의 더 나은 시각화를 위한 포함 했다. 눈금 막대 = 25 µ m. 감염-이미지 전송된의 빛에 인수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 기형종 형성과 성숙 양수 액체와 막 iPSC에 transcriptional 프로 파일링. (A) Teratomas 피하 scid 베이지색 쥐에서 성장 조직 모든 3 개의 세균 층 (100 배 확대)의 대표를 포함 합니다. (B) 글로벌 식 microarray 프로필 온라인 pluripotency 소프트웨어에 제출 두 분류자-pluripotency 및 참신의 반환. 높은 pluripotency 점수와 낮은 참신 점수-레드 클라우드-일반 ESC/iPSC 선의 식 프로필. 블루 클라우드는 희미 한 푸른 구름 부분적으로 만능 세포에 대 한 클러스터 영역을 나타내는 차별화 된 셀에 대 한 클러스터 영역을 나타냅니다. 양수 (3 라인)와 막 (4 선) iPSC 테스트에서 만능을 간주 했다. ESC 라인 WA25 컨트롤로 포함 되었고 여기 검은색 화살표로 식별 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
태아 줄기 세포에서 iPSC 생성의 초기 단계 태아 조직, 그들의 문화, 확장, 및 episomal 재활 플라스 미드의 소개에서 원본 셀의 추출 수반. 이 단계 뒤에 문화 기간 약 14 ~ 18 일 전에 첫 번째 완전히 재설정된 식민지 확장 될 수 있다. 마지막 단계는 iPSC 클론의 성숙. 양수 막 줄기 세포의 초기 추출은 amnion의 결합 된 기계 및 효소 소화에 의해 이루어집니다. 우리는 30 분의 부 화 시간이 결과 높은 생존 능력으로 추출 셀 수가 가장 발견. 소화 절차 조직 및 세포 덩어리의 작은 조각을 생성할 수 있습니다. 단일 셀을 기준으로 이들의 비율이 높은 경우, 이후 모든 부착 셀 outgrowths에 기여할 수 있는 한 그릇에 모든 덩어리와 단일 세포를 도금 하는 것이 좋습니다. 셀만 문화 매체와 혼합 하 고 알을 품을 부착 셀의 식민지는 충분 한 크기에 도달할 때까지 액체 양수 줄기 세포를 도금 하는 것은 간단 합니다. 일반 조직 문화 취급 plasticware 완벽 하 게 적합 한 고도 불구 하 고 이러한 낮은 viabilities 및 어려움에 뿌리고 관찰 이후 향상 된 주 세포 배양에 대 한 의도 된 특수 표면, 권장 하지 않습니다. 프로세스입니다.
양수 및 막 줄기 세포를 확장 합니다 및 주식 동결 하지만, 초기의 편의 셀으로 사용할 수 있습니다 소스 셀 프로그래밍에 대 한. 셀, 여기 950 V로 설정 transfection 매개 변수와 함께 사용 transfection 시스템으로 episomal 플라스 미드의 도입을 위해 40 ms 1 펄스 아주 잘 수행, 궁극적으로 성공적으로 재설정된 (시도 모든 라인 10 라인)입니다. 주요 경쟁 배달 시스템 비슷한 원리에 우리의 손에서 성공적인 재활 실험을 생성 하지 않았습니다.
Transfected 세포는 처음 3-5 일 동안 AFMC 매체에 vitronectin 코팅 접시에 시드 다음 매체는 E8 100 µ M 나트륨 낙 산 염 보충로 전환 합니다. 이 크게 전체 pluripotency 수집의 속도 증가합니다. 형태 변환의 첫 번째 징후는 48-72 h로 일찍 볼 수 있습니다. 원본 셀 받아야 메트로 및 상피 형태에 포함 된 셀의 식민지 나타납니다. 이들은 점차적으로 확산 하 고 소형 될. 식민지의 부분 집합 완전 만능 줄기 세포-저명한 핵 및 nucleoli, 개별적으로 인지할 수 세포의 형태학 상 특징을 취득할 것 이다 퍼지 테두리 반대로 잘 정의 된 경계와 평면 식민지 관찰에서 부분적으로 만능 메트로 식민지 전체 pluripotency의 인수의 순간에 소형 메트로 셀 식민지 획득 저명한 핵 개별 셀 독특한 형태학 패턴을 만드는 동안 인지할 수 되 고. 훈련 된 눈이 패턴은 성공적인 프로그래밍의 분명 한 신호입니다. 그러나, PSC 문화 훈련 부족 한 탐정에 게 성공적으로 진행 하 고 있으므로 전체 pluripotency에 식민지의 식별 필요 조심 평가 메트로 및 iPSC 클론 서로 대 한 오해 될 수 합니다. 그림 1 과 그림 2 는 둘 다의 예제를 제공합니다. 메트로 클론 대신 선택, 철저 한 흐름 cytometry 분석 실수를 공개 하 고 특히, TRA-1-60과 TRA-1-81 항 것입니다 가장 가능성이 없어야 하는 경우 그림 2와 같이. 실제로, TRA 항 이전 엄격한 pluripotency 마커를 것을 발견 했다. 그러나, 부분적으로 만능 메트로 세포 암 연구25의 수 있습니다.
이 문화 상태는 소스 AFSC/AMSC 차선 결국, 그들의 확산을 감속 할 것 이다 그리고 그들은 아첨, 구와 같은 형태를 습득 합니다. 원본 셀이 부정적인 재활 프로세스를 영향을 주지 않습니다 하지만 프로그래밍, 나중 단계 동안 표면에서 분리 수 있습니다 조직 형성. 그와 반대로, 프로세스는 가끔 원치 않는 취소 재설정된 세포질 물자를 제거 하는 동안 재설정된 식민지를 위한 공간 확보를 리드. 살 균 피 펫 팁, 부분적으로 떠나와 완전히 수동 선택 하류를 크게 단순화, 만능 식민지를 사용 하 여 분리 된 조직 삭제 쉽게 수 있습니다.
완전히 재설정된 식민지의 수동 따기, 이미징 시스템, 안전 캐비닛에 배치 될 수 있는, 공기 흐름을 방해 것이 밖으로 튀어나와 어떤 부품 부족 LCD 사용 합니다. 이 이미징 시스템 이외의 특별 한 장비 따기 자체는 일반 펫을 사용 하 여 수행할 수 있습니다으로 필요 하다. 고른된 식민지는 클론으로 밖으로 성장 하는 대상 웰 스도 도금 되 고 전에 EDTA/PBS 솔루션에 부분적으로 해리 했다. 라인과 몇 구절에 대 한 복제에 따라 자발적으로 세포 분화와 문화를 오염 수 있습니다. 수동 조작 및 직렬 뿌리고 일반적으로이 문제를 제거합니다. 그러나 광범위 한 차별화 벌집이 클론을 폐기 해야한다, 귀중 한 클론을 성공의 다양 한 각도 인양 하 수 반복된 수동 만능 식민지의 따기 보다는 세포 분화의 처분에 의하여 하는. Episomal 플라스 미드는 iPSC26에서 완전히 손실 15 구절을 표시 했다. 따라서, 그것은 성장에 대 한 적어도 구절의 그 수 다운스트림 응용 프로그램 및 분석, TRA 항 표현과 karyotype의 일상적인 모니터링을 제외 하 고 그들을 사용 하기 전에 복제를 허용 하는 것이 좋습니다. TRA 항 식 쉽게 모니터링할 수 있습니다. cytometry에 의해 여기에서 설명한 프로토콜, 이후 분석 결과 약 200, 000 셀을 요구 하 고 연구원은 의심 여부 교양된 클론 유지 하 고 있다에 때마다 수행할 수 있습니다. pluripotency 제대로. ESC 마커 식의 흐름 cytometry 분석 후보 라인19pluripotency를 확인 하는 충분 한 것 간주 되지 않습니다.
기형종 형성 분석 결과 표준 결정적인 pluripotency 테스트27이다. 화학적으로 정의 이종 무료 조건에서 성장 하는 PSC 분리 유도 될 죽음 되며 따라서, 대단히 짧은 시간으로 그들을 피하 주사 하는 것은 그들의 성공적인 이식8,28필요. 주입, 다음 보통 4-6 주 정도입니다 볼 수 이종 이식의 성장 및 8 주 전에 모두 수 수확, H & E 얼룩이 지 고 분석. 동물 복지, 비용, 및 긴 기간 필요한 테스트 방법 개발에 대 한 이유가 있습니다. 게놈 분석 고급 결합, 기계 학습 기반 bioinformatic 접근 글로벌 식 프로필의 정확한 평가 제공할 수 있습니다. 그러나 이러한 데이터를 얻기의 비용은 기형종 형성 분석 결과의 비용에 비해,, 게놈 방식은 상당히 빠르게 이며 동물이 사용할 수 없습니다. 이러한 한 분석 결과는 bioinformatic pluripotency 평가 소프트웨어22이다. 그것은 온라인 인터페이스 (자료 테이블)로 구현 됩니다. 성장 인기 및 RNA 시퀀싱의 급락 비용이이 접근의 연속성을 보장합니다. 이 pluripotency 소프트웨어 대신 존스 홉킨스 대학23 (cellnet.hms.harvard.edu)에서 사용할 수와 비슷한 방식에 기반 이며 transcriptome 인간 샘플의 분석 microarray 데이터를 받아들일 수 있습니다. 이 소프트웨어의 장점은 뿐만 아니라 만능 줄기 세포를 식별 하는 기능을가지고 있지만 또한 세포 분화을의 큐레이터 데이터 집합부터 기본 조직, 생체 외에 성장 셀 사이의 유사성의 수준에서에서 파생 했다 / 조직 및 생체 내에 조직을 확인할 수 있습니다, 분화 프로토콜 또는 조직 공학의 발전에 대 한 우수한 품질 관리를 제공 하. 테스트는 20 다른 세포 나 조직 형식으로 쿼리를 분류 하는 능력. 현재, 그것은 microarray 데이터를 필요로 하지만 저자는 플랫폼 옵션을 확장 하는 RNA을 향해 노력 하 고 있다 시퀀싱 뿐만.
제시 프로토콜에 따라, 연구팀은 화학적으로 완벽 하 게 정의 하 고 이종 무료 매체 및 비-통합 재활 방법을 사용 하 여 매우 높은 재현성 양수 액체와 막 줄기 세포에서 iPSC 라인을 생성할 수 있습니다. 이 라인은 분화 프로토콜을 최적화 하 고 궁극적으로 질병 모델링, 마약 검사, 또는 소아 조직 공학 연구를 기초 연구에 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
이 작품은 대학 취리히, 취리히 대학, 동호회 10.216 및 12.176에 스위스 사회의 심장, 스위스 국가 과학의 SCIEX NMS채널 의 Forschungskredit Fonds Medizinische Forschung에 의해 지원 되었다 재단 보조금 [320030-122273] 아래와 [310030-143992], 7 프레임 워크 프로그램, 생활 밸브, 그랜트 [242008], 올가 Mayenfisch 재단, EMDO 재단, 대학 병원 취리히 시작 그랜트 2012 유럽 위원회 및 미첼 암 연구소의 내부 자금입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | tissue dissociation system, reagent kit, includes tissue dissociation tubes and tissue dissociation enzymes |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | tissue dissociation system, dissociator |
| Thermo Scientific™ Shandon™ Disposable Scalpel No. 10, Sterile, Individually Wrapped, 5.75 (14.6cm) | Thermo-Fisher | 3120032 | |
| 70 µm cell strainers | Corning | 10054-456 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo-Fisher | 32404014 | |
| rocking platform | VWR | 40000-300 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Thermo-Fisher | 339652 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Thermo-Fisher | 339650 | |
| EBM-2 basal medium | Lonza | CC-3156 | basal medium for AFMC medium |
| FGF 2 Human (expressed in E. coli, non-glycosylated) | Prospec Bio | CYT-218 | bFGF, supplement for AFMC medium |
| EGF Human, Pichia | Prospec Bio | CYT-332 | EGF, supplement for AFMC medium |
| LR3 Insulin Like Growth Factor-1 Human Recombinant | Prospec Bio | CYT-022 | IGF, supplement for AFMC medium |
| Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified | Thermo-Fisher | 10439024 | FBS |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo-Fisher | 15240062 | for primary AFSC/AMSC, for routine AFSC/AMSC it should not be necessary, do not use in medium for transfected cells! |
| Accutase cell detachment solution | StemCell Technologies | 07920 | cell detachment enzyme |
| CryoStor™ CS10 | StemCell Technologies | 07930 | complete freezing medium |
| PBS, pH 7.4 | Thermo-Fisher Scientific | 10010023 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | 12362 | for plasmid isolation |
| pEP4 E02S EN2K | Addgene | 20925 | EN2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, Nanog+Klf4 |
| pEP4 E02S ET2K | Addgene | 20927 | ET2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4 |
| pCEP4-M2L | Addgene | 20926 | M2L, reprogramming factors c-Myc+LIN28 |
| NanoDrop 2000c UV-Vis Spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000C | spectrophotometer |
| Neon® Transfection System | Thermo-Fisher | MPK5000 | transfection system, components: Neon pipette - transfection pipette Neon device - transfection device |
| Neon® Transfection System 10 µL Kit | Thermo-Fisher | MPK1025 | consumables kit for the Neon Transfection System, it contains: Neon tip - transfection tip Neon tube - transfection tube buffer R - resuspension buffer buffer E - electrolytic buffer |
| Stemolecule™ Sodium Butyrate | StemGent | 04-0005 | small molecule enhancer of reprogramming |
| TeSR-E8 | StemCell Technologies | 05940 | E8 medium |
| Vitronectin XF™ | StemCell Technologies | 07180 | VTN, stock concentration 250 µg/ml, used for coating at 1 µg/cm2 in vitronectin dilution (CellAdhere) buffer |
| CellAdhere™ Dilution Buffer | StemCell Technologies | 07183 | vitronectin dilution buffer |
| UltraPure™ 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | dilute with PBS to 0.5 mM before use |
| EVOS® FL Imaging System | Thermo-Fisher Scientific | AMF4300 | LCD imaging microscope system |
| CKX53 Inverted Microscope | Olympus | phase contrast cell culture microscope | |
| Pierce™ 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo-Fisher | 28908 | dilute to 4% with PBS before use, diluted can be stored at 2-8 °C for 1 week |
| Perm Buffer III | BD Biosciences | 558050 | permeabilization buffer, chill to -20 °C before use |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 557782 | isotype control for Oct3/4A, Nanog |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 557783 | isotype control for Sox2 |
| Mouse anti-human Oct3/4 (Human Isoform A), Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 561628 | |
| Mouse anti-human Nanog, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 560791 | |
| Mouse anti-human Sox-2, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 562139 | |
| Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 401617 | isotype control for TRA-1-60 |
| Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 401618 | isotype control for TRA-1-81 |
| Mouse anti-human TRA-1-60, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 330613 | |
| Mouse anti-human TRA-1-81, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 330705 | |
| Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 400129 | isotype control for SSEA-1 |
| Mouse IgG3, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 401321 | isotype control for SSEA-4 |
| Mouse anti-human SSEA-1, Alexa Fluor® 488 | BD Biosciences | 323010 | |
| Mouse anti-human SSEA-4, Alexa Fluor® 647 | BD Biosciences | 330407 | |
| Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 488 | Jackson Immunoresearch | 115-606-068 | use at a dilution of 1:600 or further optimize |
| Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 647 | Jackson Immunoresearch | 115-546-068 | use at a dilution of 1:600 or further optimize |
| DAPI | Thermo-Fisher Scientific | D21490 | stock solution 10 mM, further dilute to 1:12.000 for a working solution |
| Corning® Matrigel® Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | basement membrane matrix (BMM) |
| scid-beige mice, female | Taconic | CBSCBG-F | |
| RNeasy Plus Mini Kit (50) | Qiagen | 74134 | RNA isolation kit |
| T-25 flasks, tissue culture-treated | Thermo-Fisher | 156367 | |
| T-75 flasks, tissue culture-treated | Thermo-Fisher | 156499 | |
| Nunc™ tissue-culture dish | Thermo-Fisher | 12-567-650 | 10 cm tissue culture dish |
| 6-well plates, tissue-culture treated | Thermo-Fisher | 140675 | |
| Neubauer counting chamber (hemacytometer) | VWR | 15170-173 | |
| Mr. Frosty™ Freezing Container | Thermo-Fisher | 5100-0001 | freezing container |
| FACS tubes, Round Bottom Polystyrene Test Tube, 5ml | Corning | 352058 | 5 ml polystyrene tubes |
| Eppendorf tubes, 1.5 ml | Thermo-Fisher | 05-402-96 | 1.5 ml microcentrifuge tubes |
| PCR tubes, 200 µl | Thermo-Fisher | 14-222-262 | |
| pipette tips, 100 to 1250 µl | Thermo-Fisher | 02-707-407 | narrow-bore 1 mL tips |
| pipette tips, 5 to 300 µl | Thermo-Fisher | 02-707-410 | |
| pipette tips, 0.1 to 10 µl | Thermo-Fisher | 02-707-437 | |
| wide-bore pipette tips, 1000 µl | VWR | 89049-166 | wide-bore 1 mL tips |
| glass Pasteur pipettes | Thermo-Fisher | 13-678-20A | |
| ethanol, 200 proof | Thermo-Fisher | 04-355-451 | |
| vortex mixer | VWR | 10153-842 | |
| chambered coverglass, 8-well, 1.5mm borosilicate glass | Thermo-Fisher | 155409 | glass-bottom confocal-grade cultureware |
| 22G needles | VWR | 82002-366 | |
| insulin syringes | Thermo-Fisher | 22-253-260 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fixation of explanted teratomas |
| Illumina HT-12 v4 Expression BeachChip | Illumina | BD-103-0204 | expression microarray, supported by PluriTest, discontinued by manufacturer |
| PrimeView Human Genome U219 Array Plate | Thermo-Fisher | 901605 | expression microarray (formerly Affymetrix brand), soon to be supported by PluriTest |
| GeneChip™ Human Genome U133 Plus 2.0 Array | Thermo-Fisher | 902482 | expression microarray (formerly Affymetrix brand), supported by CellNet, soon to be supported by PluriTest |
| PluriTest® | Coriell Institute | www.pluritest.org, free service for bioinformatic assessment of pluripotency, accepts microarray data - *.idat files from HT-12 v4 platform, soon to support U133, U219 microarray and RNA sequencing data | |
| CellNet | Johns Hopkins University | cellnet.hms.harvard.edu, free service for bioinformatic identification of cell type, including plutipotent stem cells, based on U133 microarray data - *.cel files, soon to support RNA sequencing data |
References
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