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Medicine

In vivo Auswertung der mechanischen und viskoelastischen Eigenschaften der Rattenzunge

Published: July 6, 2017 doi: 10.3791/56006
Automatic Translation
*1, *2, 2, 1
1Department of Physiology and Pennsylvania Muscle Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Center for Sleep & Circadian Neurobiology, University of Pennsylvania
* These authors contributed equally

Summary

Wir beschreiben ein chirurgisches Verfahren in einem anästhesierten Rattenmodell zur Bestimmung des Muskeltonus und der viskoelastischen Eigenschaften der Zunge. Das Verfahren beinhaltet eine spezifische Stimulation der hypoglossalen Nerven und die Anwendung von passiven Lissajous-Kraft- / Deformationskurven auf den Muskel.

Abstract

Die Zunge ist ein sehr innervierter und vaskularisierter Muskel Hydrostat auf dem Boden des Mundes der meisten Wirbeltiere. Seine primären Funktionen sind die Unterstützung Mastikation und Schlupf, sowie Geschmack-Sensing und Phonetik. Dementsprechend kann die Stärke und das Volumen der Zunge die Fähigkeit von Wirbeltieren beeinflussen, grundlegende Aktivitäten wie Füttern, Kommunizieren und Atmen zu erreichen. Menschliche Patienten mit Schlafapnoe haben vergrößerte Zungen, gekennzeichnet durch reduzierten Muskeltonus und erhöhte intramuskuläre Fett, die durch Magnetresonanztomographie (MRT) visualisiert und quantifiziert werden können. Die Fähigkeiten zur Messung der Krafterzeugung und der viskoelastischen Eigenschaften der Zunge stellen wichtige Werkzeuge dar, um funktionelle Informationen zu erhalten, um mit bildgebenden Daten zu korrelieren. Hier präsentieren wir Techniken zur Messung der Zungenkraftproduktion in anästhesierten Zucker-Ratten durch elektrische Stimulation der hypoglossalen Nerven und zur Bestimmung der viskoelastischen Eigenschaften oF die Zunge durch Anwendung passiver Lissajous Kraft / Deformation Kurven.

Introduction

Die Zunge bietet wesentliche Unterstützung für Mastikation, Schluck, Geschmackssinn und Sprechen. Das Vorhandensein der extrinsischen und intrinsischen Muskulatur, mit deutlicher Innervation und Anatomie / Funktion, erklärt die Einzigartigkeit dieses muskulösen Hydrostat. Jüngste Fortschritte in der bildgebenden Technik haben eine detailliertere Sicht auf ihre komplexe Anatomie gegeben 1 . Eine verminderte Zungenfunktionalität, Zungenatrophie, Dysphagie und Sprachhemmnisse sind auch häufige Manifestationen myopathischer Zustände wie Parkinson 2 , Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) 3 , Myotonische Dystrophie (MD) 4 und andere Myopathien.

Veränderungen der Muskelzusammensetzung, die mit gemeinsamen Krankheitszuständen verbunden sind, beeinflussen die mechanischen und viskoelastischen Eigenschaften der Zunge. Zum Beispiel hat die Funktionsanalyse der Zungenkraft Änderungen der kontraktilen Eigenschaften, die mit dem Altern verbunden sind, aufgedecktSs = "xref"> 5 , 6 , Hypoxie 7 , 8 und Fettleibigkeit 9 , 10 . Im Falle der Muskeldystrophie führt eine erhöhte Fibrose zu einer höheren Muskelsteifigkeit, was zu einer niedrigeren Einhaltung der Verformung führt, wenn ein Lissajous-Deformationsprotokoll angewendet wird 11 . Umgekehrt verändern Veränderungen des Muskelfettgehalts, wie sie bei adipösen Patienten dokumentiert sind, sowohl den metabolischen als auch die mechanischen Eigenschaften des Skelettmuskels 13 , 14 und werden vorausgesagt, um die Muskelkonformität der Verformung zu erhöhen. Erhöhte Zungenfett korreliert auch mit der Entwicklung der obstruktiven Schlafapnoe (OSA) beim Menschen 17 durch Erhöhung des Zungenvolumens bis zum Punkt der partiellen oberen Atemwegsverschluss (Apnoe) 15 , 16 . SimÄhnlich zum Menschen ist die Zungenfett-Infiltration in fettleibigen Zucker-Ratten 10 dokumentiert, was darauf hindeutet, dass dieses Modell ein wertvolles Werkzeug für das Studium der Auswirkungen der Fettinfiltration auf die Zungenphysiologie ist.

Die Messung der Zungenkraft erfordert empfindliche chirurgische Techniken, um die hypoglossalen Nerven zu isolieren und bilateral zu stimulieren 17 , 18 . Solche Techniken wurden bisher in den Ratten 5 , 17 , 19 , 20 , Kaninchen 21 und den Menschen 22 , 23 beschrieben , jedoch mit begrenzten Sehhilfen für den Forscher. Aufgrund seiner hochtechnischen Natur würde die Verfügbarkeit eines detaillierten Protokolls die Zugänglichkeit und Reproduzierbarkeit dieser Technik erheblich verbessern. Das Ziel unseres experimentellen Paradigmas ist krankUstrate eine gültige und zuverlässige Technik zur Messung der Festigkeit und viskoelastischen Eigenschaften der Zunge in einem Rattenmodell. Um dies zu erreichen, wird die Ratte anästhesiert, die hypoglossalen Nerven sind ausgesetzt und die Trachea ist kanüliert, um freien Zugang zur Tierzunge zu gewährleisten. Eine Nahtschleife verbindet dann die Spitze der Zunge mit einem Kraftwandler, der sowohl Kraft als auch Länge steuern kann, während zwei bipolare Hakenelektroden die hypoglossalen Nerven stimulieren, um eine Kontraktion der Zunge zu induzieren. Nachdem die Kraftmessung abgeschlossen ist, werden die Längensteuerungsfähigkeiten des Kraftaufnehmers verwendet, um die Länge der Zunge nach einem Sinuswellenprotokoll mit fester Amplitude (Lissajous-Kurven), Dauer und Frequenz schnell zu ändern, so dass man sich ableiten kann Seine viskoelastischen Eigenschaften 11 , 24 . Das Protokoll führt den Ermittler durch die Sektionsschritte, die Positionierung des Tieres auf dem experimentellen PlatfoRm, Platzierung von Elektroden und schließlich zur Erfassung und Auswertung der Kraft- und Viskoelastizitätsdaten.

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Protocol

Alle Verfahren einschließlich Tierfächer wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Pennsylvania (Protokoll Nr. 805822) genehmigt. Das beschriebene Verfahren ist endständig und erfordert nicht die Verwendung von aseptischen Bedingungen oder pharmazeutischen Produkten.

1. Chirurgische Verfahren

Abbildung 1
Abbildung 1: Chirurgische Verfahren.
(A) Chirurgische Planabgrenzung Die rote gestrichelte Linie zeigt den Bereich des Einschnitts an. Zwei schwarze Linien zeigen die Position des Kiefers an, während die untere schwarze Linie die Position des Thorax markiert. Die blaue Linie zeigt den Zungenbein an. (B) Exposition des hinteren Bauches des digastrischen Muskels (Pfeile) nach stumpfer Dissektion von Fettgewebe, Sublingual und Submaxill Arme Drüsen (C) Resektion des hinteren Bauches des digastrischen Muskels (gestrichelte grüne Linie), um den hypoglossalen Nerv (weißer Pfeil) auszusetzen. (D) Der hypoglossale Nerv (weißer Pfeil) wird aus der umgebenden Faszie entfernt. (E) Die Trachea wird durch sanftes Auseinanderziehen der glatten Muskeln um sie herum ausgesetzt (die grünen Pfeile geben die Richtung der angewandten Kraft an) und hob (F) , um sich auf die Intubation vorzubereiten. Der Stern zeigt die Einfügung der Zunge am Zungenbein an. Die grüne gestrichelte Linie markiert den Einschnitt für die Intubation. Der weiße Pfeil zeigt den losen Knoten an, der vorbereitet ist, um die Kanüle zu befestigen. (G) Inzision der Trachea zur Kanülierung (H) Die Trachealkanüle wird mit einem quadratischen Knoten eingelegt und gesichert. (I) Anwendung der Naht auf die Zunge.Target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Anästhesie und Präparation für Chirurgie
    1. Legen Sie die Ratte in die Induktionskammer mit 4% Isofluran Anästhesie.
    2. Legen Sie das Tier Rückenlage über eine Wärmequelle und pflegen Anästhesie mit 1 - 3% Isofluran aus einem Nosecon, so dass eine Atemfrequenz von mindestens 70 Atemzüge pro Minute.
    3. Rasieren Sie den Halsbereich mit einem Luftschneider und Haarentfernung Creme. Bei der Verwendung der Haarentfernung Creme, die Creme mit einem Baumwoll-Top-Applikator, bis das Fell entfernt wird. Eine längere Exposition gegenüber Haarentfernung Creme kann Reizungen der Haut verursachen.
    4. Reinigen Sie das chirurgische Feld mit 70% Alkohol ( Abbildung 1A ).
    5. Überprüfen Sie das Atemmuster und die Reflexe des Tieres (Mangel an Zehensperre), bevor Sie mit dem anfänglichen Schnitt beginnen. Die kontinuierliche Überwachung und Bewertung der Tiefe der Anästhesie ist essentiell (ReCord Atemfrequenz und Mangel an Reflexen alle 10 min); Das Tier muss während des gesamten Vorgangs unter einer tiefen, chirurgischen Ebene der Anästhesie stehen.
  2. Hypoglossal Nerven Identifizierung
    1. Öffnen Sie das chirurgische Feld mit einer Paar operierenden Scheren, indem Sie die Haut respektieren und entfernen, wie durch die rot-gestrichelte Linie in Abbildung 1A angezeigt.
    2. Stumpfes Sezieren durch jedes Fettgewebe, die sublingualen und submaxillären Drüsen und die Muskelschicht, die die Trachea umgibt.
      HINWEIS: Seid konservativ während der Sektion. Verwenden Sie eine stumpfe Sektion, wann immer möglich und achten Sie darauf, die Blutgefäße des Halses nicht zu beschädigen.
    3. Identifizieren Sie den hinteren Bauch des digastrischen Muskels (PD) seitlich zur Trachea ( Abbildung 1B - weiße Pfeile). Der hypoglossale Nerv läuft unter diesem Muskel ( Abbildung 1C - weißer Pfeil). Mit dem Elektrokauter, resezieren die PD proxImal zum Zungenbein ( Abbildung 1C - gestrichelte Linie).
      HINWEIS: Lassen Sie den Nerv nicht oder das Gewebe um ihn herum werden trocken. Füge einen Tropfen Mineralöl auf den Nerv, um ihn zu schützen. Zur Vermeidung von Muskelkontraktionen durch Feldausbreitung des Stimulus aus den Elektroden sorgfältig das Muskelgewebe in den möglichen Kontaktstellen um den Nerv kauterisieren.
    4. Mit einem Paar feiner Pinzette sehe den hypoglossalen Nerv aus der umgebenden Faszie. Mit Hilfe eines Hakens ist darauf zu achten, dass mindestens 3 mm des Nervs für den Anschluss der bipolaren Elektrode zur Verfügung stehen ( Abbildung 1D ).
    5. Mit mikro-hämostatischen Zangen, zerdrücken Sie den hypoglossalen Nerv so distal vom Zungenbein ( Abbildung 1D - weißer Pfeil) wie möglich, um eine retrograde Ausbreitung des Reizes zu vermeiden. Zerkleinern Sie den Nerv, indem Sie mit der Mikro-Hämostase für 5 s Druck auf ihn drücken. Wenn der Hämostat den Nerv erfaßt,Hexe an der Zungenbasis sollte sichtbar sein.
    6. Wiederholen Sie den Vorgang für die andere Seite.
  3. Tracheale Intubation
    1. Entlüft die Trachea, indem du die umlaufenden glatten Muskeln vorsichtig durch stumpfe Dissektion trennst ( Abb. 1E - wie durch die grünen Pfeile angedeutet).
      HINWEIS: Seien Sie konservativ und verwenden Sie vorzugsweise stumpfe Dissektion. Vergleichen Sie den Durchmesser der Kanüle mit dem der Trachea. Die Kanüle sollte in der Trachea korrekt passen und nach dem Nähen, wie in den Schritten 1.3.2 bis 1.3.5 beschrieben, stabil eingelegt werden.
    2. Heben Sie die Trachea vorsichtig mit einem Paar Nahtzangen an und passieren Sie eine 4-0 Naht darunter, in der Nähe des Thorax. Binden Sie einen anfänglichen losen Knoten zwischen dem 6. und dem 7. Ring aus dem Kehlkopf ( Abbildung 1F - weißer Pfeil). Dieser Knoten wird geschlossen, sobald die Kanüle eingelegt ist, um sie festzuhalten.
    3. Schieben Sie den Stiel einesTransferpipette (Schmierung der Pipette mit Mineralöl zur Erleichterung der Insertion) unter der Trachea, um sie zu heben und das Einsetzen der Kanüle (IV 14 gx 3.25 "Kanüle) zu erleichtern.
    4. Schneiden Sie einen kleinen Schnitt zwischen dem 4. und 5. Ringe aus dem Kehlkopf ( Abbildung 1G - weißer Pfeil). Nach dem ersten Einschnitt wird sich die Öffnung dazu veranlassen, sich zu verbreiten, also bei der Initialisierung konservativ zu sein, um die vollständige Resektion der Trachea zu vermeiden.
      HINWEIS: Bevor Sie den Einschnitt der Trachea durchführen, stellen Sie sicher, dass die Kanüle fertig ist und die Anästhesielieferung eingeschaltet ist.
    5. Starten Sie die Anästhesie-Verabreichung durch die Kanüle und legen Sie sie vorsichtig in den Einschnitt ein und schieben sanft in die Trachea die Länge von etwa 5 Ringen. Sichern Sie die Kanüle mit der Naht, um eine luftdichte Abdichtung zu erzeugen ( Abbildung 1H ).
      HINWEIS: Sicherstellen, dass keine Flüssigkeit in die gelierte Trachea gelangt, um zu vermeidenOcation Sobald die Trachea eingeschnitten ist, wird das Tier atmen Raumluft. Es ist daher wichtig, die Kanüle schnell einzuführen, damit die Anästhesie beibehalten wird. Wenn / wenn das Tier bewegt wird, überwacht die korrekte Position der Kanüle in der Trachea.
    6. Entfernen Sie das Tier vorsichtig aus dem Nasenhaut.
      HINWEIS: Die Verwendung von injizierbaren Anästhetika anstelle von Isofluran kann das Verfahren durch die Beseitigung der Notwendigkeit der Tracheal-Intubation und Clearing der experimentellen Arbeitsraum von überschüssigen Schlauch zu vereinfachen.
  4. Zungennähte
    1. Ein 20 cm langes Stück 5/0 Naht einweichen (wir empfehlen Silk, schwarz geflochten) in PBS.
    2. Halten Sie den Mund der Ratte offen, halten Sie die Zungenspitze vorsichtig mit der Nahtzange.
    3. Pass die Naht medial durch die Spitze der Zunge ( Abbildung 1I - weißen Pfeil) Aufmerksamkeit zu halten die Zunge feucht mit Kochsalzlösung, um potenzielle Gewebe zu vermeidenBeschädigung.
    4. Binden Sie eine Schleife ca. 4 cm breit (der Durchmesser kann sich ändern, basierend auf dem Abstand zwischen dem Tier und dem Kraftaufnehmer).
      HINWEIS: Sicherstellen, dass die Naht und die Zunge nass sind, um die Insertion zu erleichtern und unnötige Läsionen des Gewebes zu vermeiden.

2. Experimentelles Setup

Figur 2
Abbildung 2: Positionierung und Sicherung des Tieres
(A) Die Maus befindet sich auf der experimentellen Plattform. Der Kiefer ist gesichert und der Mund durch die Anwendung der vertikalen Spannung (grüner Pfeil) offen gehalten. Die Nahtschlaufe ist mit dem Kraftaufnehmer (weißer Pfeil) verbunden. (B) Die Elektroden sind angeschlossen. (C) Jede Elektrode, die auf einem Mikromanipulator montiert ist, ist stabil mit dem Nerv verbunden. Die Einlage zeigt die Beendigung von tEr hakte Elektrode. (D) Die optimale Länge der Zunge wird mit einem Vernier-Bremssattel gemessen, von der Einfügung auf der Höhe des Zungenbeins bis zur Zungenspitze. In diesem Bild wurden die Elektroden aus Gründen der Klarheit entfernt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Hinweis: Stellen Sie das Tier auf dem beheizten Tablett des Gerätes mit den folgenden Befestigungsmaßnahmen auf, um Bewegungen während des Experiments zu vermeiden.

  1. Sichern Sie die Nase der Ratte mit einer kunststoffbeschichteten metallischen Twist-Bindung, die direkt mit der beheizten Plattform verbunden ist ( Abbildung 2A , 2B ).
  2. Halten Sie den Mund der Ratte, indem Sie die vertikale Spannung aufnehmen (verwenden Sie einen 3-Wege-Drehgelenk, der an 9 kg-Test-Monofilamentlinie gebunden ist und mit einem Kameratift festhalten) ( Abbildung 2A - grüner Pfeil).
    ANMERKUNG: Ein alternativer Ansatz zur Stabilisierung der Ratte ist die Verwendung eines Nagetier Mund Knebel oder eine benutzerdefinierte Änderung davon. Es ist wichtig, dass der Mund offen und stabil gehalten wird, um Bewegungen des Halses zu vermeiden, die die Qualität der Messungen beeinträchtigen könnten.
  3. Verbinden Sie die Nahtschlaufe mit dem Kraftaufnehmer ( Abbildung 2A - weißer Pfeil).
  4. Mit chirurgischen Band, immobilisieren die Gliedmaßen und den Bauch der Ratte, um Bewegungen während der Stimulationen zu begrenzen.
  5. Tragen Sie die beiden stimulierenden Haken-Bipolarelektroden auf die zerlegten hypoglossalen Nerven, proximal zur Crush-Stelle ( Abbildung 2C ).
    1. Verwenden Sie stimulierende bipolare Elektroden, die aus einem Paar von Chirurgie-Edelstahl-Nadel-Elektroden hergestellt wurden, die in einem Abstand von 2 mm voneinander unter Verwendung eines Plastik-Trägers zusammengehalten wurden (hier verwendeten wir zwei 1-mL-serologische Pipetten, die zusammengeklebt wurden).
    2. Biegen Sie die Spitzen der Nadelelektroden zu einer HakenformKlein genug, um einen stabilen Kontakt mit dem Nerv zu bilden (~ 1 mm Durchmesser) ( Abbildung 2C - Einlage).
    3. Verbinden Sie die beiden Drähte jeder Elektrode mit einem stapelbaren doppelten Bindeposten mit Bananenbuchse x BNC-Buchse und verbinden Sie sich mit dem Stimulatormodul eines in situ Muscle Test Systems (Tabelle 3) mit einem BNC-Splitter.
      HINWEIS: Sicherstellen, dass das Tier stabil ist und dass der Hals und die Zunge auf den Kraftaufnehmerhebel ausgerichtet sind. Die Überwachung der Atemfrequenz fortsetzen und sicherstellen, dass die Beschränkungen die Atmung nicht beeinträchtigen.

3. Optimale Länge (L 0 ) und Maximal Isometrische Kraft Bestimmung

  1. Passen Sie die Länge der Zunge allmählich an und wenden Sie isometrische Zuckungsstimulationen an, bis eine maximale Kraft erhalten wird.
    1. Definiere L & sub0; als die Länge, bei der die isometrische Zuckungskraft ( Tabelle 1 ) maximal ist, und für die nachfolgende Normalisierung aufzeichnenDie Kraftmessungen, wie es sich für jedes Tier ändert. Mit einem Vernier-Bremssattel die Zungenlänge von der Einfügung auf Höhe des Zungenbeins ( Abb. 2D ) bis zur Zungenspitze messen.
      HINWEIS: Die korrekte Positionierung der Elektroden ist wichtig, um einen optimalen Kontakt mit den Nerven zu gewährleisten. Eine optimale Positionierung sollte ähnliche und additive Kräfte ausüben, wenn sie eine der beiden Nerven oder beides stimulieren.
  2. Vor Beginn des Experiments die beiden Elektroden an den Stimulator anschließen und eine Test-Tetan-Stimulation verabreichen ( Tabelle 1 ). Während dieser Kontraktion, überwachen Sie das Tier, um sicherzustellen, dass die Position stabil ist, und prüfen Sie auf unerwünschte sichtbare Kontraktionen der Nackenmuskulatur.
  3. Messen Sie isometrische Kraft durch Anwendung eines Zuckens, gefolgt von 20 s durch eine tetanische Stimulation. Wiederholen Sie die Stimulationen 3 mal, so dass 4 min Erholung zwischen Stimulationszyklen (ein Zyklus umfasst ein Zucken und aufE tetanische Stimulation) und notieren die maximalen zuckenden und tetanischen Kräfte.
  4. Halten Sie die Zunge immer nass, indem Sie einige Tropfen PBS zwischen Kontraktionen anwenden.
    HINWEIS: Wenn sich die Nackenmuskeln zusammenziehen, ändern Sie sorgfältig die Positionierung der Elektroden, so dass sie kein umgebendes Muskelgewebe berühren und bei Bedarf das Gewebe in Kontakt mit den Elektroden kauterisieren.

4. Viskoelastische Eigenschaftenbestimmung (Lissajous Curves)

  1. Lassen Sie die Zunge für 3 - 5 min nach der isometrischen Kraftbestimmung ruhen. Führen Sie die Lissajous-Kurven ab L 0 aus , daher sollte die Position des Tieres und des Kraftaufnehmers niemals geändert werden.
  2. Ohne die hypoglossalen Nerven zu stimulieren, werden die Zyklen der passiven Strecken angewendet ( Tabelle 2 ) mit zunehmender Verschiebung (d) dh 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50% L 0 (höhere Amplituden können ein Dual Modus-Controller mit higheR Ausflugswerte als die 305C-LR). Beispielsweise bewirkt eine Amplitude von 40% L & sub0; die Verformung der Zunge von + 20% L & sub0; bis -20% L & sub0 ;.
    1. Verwenden Sie feste 2 Hz Sinusfrequenz mit 10 Wiederholungen in jedem Zyklus, für eine Gesamtdauer von 5 s jeden Zyklus. Änderungen der Sinusfrequenz wurden in der Vergangenheit mit Geweben wie dem Zwerchfell 24 verwendet und könnten angenommen werden, um das experimentelle Protokoll zu modifizieren.
    2. Erlaube 30 s zwischen jedem Zyklus und sorge, dass die Zunge während des ganzen Vorgangs nass ist.
      HINWEIS: Halten Sie die Zunge nass während der Prozedur und fügen Sie einige Tropfen PBS hinzu. Achten Sie darauf, dass die Rückhaltevorrichtung, die die Backe hält, während der Strecken stabil bleibt, besonders wenn die Verschiebung 40% oder mehr erreicht.
  3. Unmittelbar nach der Fertigstellung des Experiments, während das Tier noch unter einer tiefen chirurgischen Ebene der Anästhesie ist, töten das Tier nach dem genehmigten IACUC Tier protOcol Zerkleinerung der Zunge zur Weiterverarbeitung ( dh gefrorene Schnitte oder Lagerung für biochemische Analysen).

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Representative Results

Abbildung 3
Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse.
(A) Beispiele für erfolgreiche Zuckungen und tetanische Kraftspuren. Die entsprechende Stimulation wird durch die rote Spur dargestellt. (B) Beispiel für erfolglose Zungen-tetanische Kontraktionen durch submaximale Kontraktion (blaue Spur) und indirekte Stimulation der Nackenmuskulatur. Beide Bedingungen können verbessert werden, indem die Stimulationselektroden neu positioniert werden oder der Kontakt zwischen den Elektrodenabschlüssen und dem umgebenden Muskelgewebe vermieden wird. (C) Beispiel für eine Sinuswellenverschiebung von L 0 (25% von L 0 ), die verwendet wird, um die viskoelastischen Eigenschaften der Zunge zu bestimmen. Die durchschnittliche Verlängerung (blaue quadratische) und kürzere (grüne quadratische) Kräfte können verwendet werden, um die Peak-To-Peak-Kraft zu berechnen 24 . Das rote Quadrat inSpezifiziert den Bereich, der für die Analyse berücksichtigt wird (ausgenommen die erste und die letzte Sinuswelle). (D) Darstellung der Kraft- / Verschiebungsbeziehung als Lissajous-Schleifen, wodurch die Verlagerung von 5% auf 50% L 0 erhöht wurde. Die Fläche innerhalb jeder Schleife entspricht dem Energieverlust, definiert als der Unterschied zwischen der Arbeit am Muskel, um sie zu verlängern und die Arbeit, die durch den Muskel gemacht wird, während sie sich nach der Strecke verkürzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Die erwarteten Werte für Zucken und tetanische Kräfte in einer 3 Monate alten Zucker-Ratte (durchschnittliches Körpergewicht 400 g für mageres und 700 g für fettleder Zucker-Ratten) sind in Abbildung 3A dargestellt . Die nach der Stimulation entwickelte tetanische Kraft sollte schnell spitzen (schwarze Pfeilspitze)Und dann langsam abnehmen, bis die Stimulation aufhört. Abbildung 3B zeigt Beispiele für erfolglose Kontraktionen, bei denen die Krafterzeugung vor dem Ende der Stimulation kein Plateau-Niveau erreichte (blaue Linie - zB wenn die Zungenlänge auf einen Wert kleiner als L 0 gesetzt wurde oder wenn der Oberkörper des Tieres nicht ist Ganz stabilisiert), oder bei dem der Stimulus die Kontraktion der Nackenmuskulatur (grüne Linie) auslöste. In den meisten Fällen kann eine sorgfältige Neupositionierung der Elektroden die Kontraktion verbessern. Wenn sich die Nackenmuskeln während der Nervenstimulation sichtbar zusammenziehen, versuchen Sie, jede Kontaktstelle zwischen Elektroden und Muskelgewebe entweder durch Kauterisieren des Muskels zu isolieren oder indem Sie die Elektroden davon weg bewegen. Die Kräfte können durch das durch die MRT gemessene Zungenvolumen normalisiert werden, falls dies verfügbar ist. Eine Alternative zur Verwendung der volumetrischen Daten besteht darin, sich nach der Sektion gegen das Gewicht der Zunge zu normalisieren.

0 erhalten, ist in den 3C und 3D gezeigt . Abbildung 3C zeigt die Längen- und Kraftspuren getrennt, die, wenn sie wie in Abbildung 3D kombiniert werden, die typischen Lissajous-Loop-Spuren erzeugen. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die Zunge zwischen jedem Zyklus nass bleibt, indem man einige Tropfen PBS hinzufügt. Die zunehmende Verschiebung von L 0 entspricht dem höheren Passiv (die Arbeit am Muskel während der Verlängerung) und aktiv (die Arbeit des Muskels bei negativen) Kräften. Die Analyse dieser Spuren kann kompliziert sein. Für die Beschreibung der viskoelastischen Eigenschaften der Zunge kann eine Kurvenanpassung der maximalen Durchschnittskraft und / oder des Massenmittelpunktes für jeden Zyklus verwendet werden. Eine detailliertere Analyse der Lissajous-Arbeitsschleifen wurde von DA Syme 24 beschriebenDie Rattenmembran.

Protokoll Pulsspannung (V) Pulsfrequenz (Hz) Pulsbreite (ms) Impulse pro Zug Zugdauer (ms)
Zucken 10 2500 0,2 1 0,2
Tetanus 10 120 0,2 96 800

Tabelle 1: Vorgeschlagene Kontraktionsstimulationsparameter.
Isometrische Zuckerkontraktion wird durch bilaterale Nervenstimulation mit einem einzigen elektrischen Puls von 10V erhalten, der 0,2 ms dauert. Nach 20 s wird eine tetanische isometrische kontraktion durch stimulierende bilaterale erhaltenMit einem Zug von Impulsen (10 V, 120 Hz Frequenz, für 800 ms). Die Twitch / Tetanus Stimulation wird dreimal mit einem Abstand von 3 - 5 Minuten zwischen jedem Zyklus wiederholt. Die höchsten Zuckungen und höchsten tetanischen Kräfte aus den drei Wiederholungen werden für die Analyse betrachtet.

Gesamtabweichung (d) von L 0 (%) Sinusamplitude (% L 0 ) Sinusfrequenz (Hz) Anzahl der Zyklen Zeit zwischen Zyklen (s)
D D / 2 2 10 30

Tabelle 2: Lissajous Curve Parameter (Sinusförmige Abweichung von L 0 ).
Die Anwendung der LissajOus Kraft / Verschiebung Protokoll beginnt 3 - 5 min nach der twitch / tetanus Stimulation. Jeder Zyklus dauert 5 s (10 Wiederholungen bei 2 Hz Frequenz) und wird 30 s nach dem vorherigen durchgeführt. Die% Verschiebung von L 0 (d) nimmt bei jedem Zyklus von einem beliebigen Minimum von 5% bis zu 50% von L 0 zu . Höhere Ausflüge können mit anderen Kraftaufnehmermodellen erreicht werden ( Tabelle 3 ).

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Discussion

Änderungen des Zungenmetabolismus und / oder der Zusammensetzung, z. B. Zungenfettinfiltration als Folge von Fettleibigkeit, werden voraussichtlich quantifizierbare Veränderungen der durch unser Protokoll beurteilten Parameter bewirken. Die Quantifizierung der Zungenkraft ist von großem Interesse, da ein Ungleichgewicht zwischen protrusiver und retrusiver Aktivität oder Gesamtzungenschwäche zur Okklusion des oberen Atemwegs 15 führen kann . Übungsmethoden, die darauf abzielen, die Zungenstärke zu erhöhen, wurden bei den Ratten 25 , 26 und auch bei den Menschen 27 , 28 , 29 erfolgreich angewendet, wo sie die Schwere der Schlafapnoe effektiv verringert haben. Darüber hinaus ist die hypoglossale Nervenstimulation nun eine chirurgische Behandlung für die obstruktive Schlafapnoe 22 , 23 , 30 .

31 , die Schlafmedizin 10 , 25 und die Pathogenese der obstruktiven Schlafapnoe 15 . Das beschriebene Stimulationsprotokoll und die Parameter können leicht modifiziert werden, um andere physiologische Informationen wie die Kraft-Frequenz-Beziehung, die Ermüdbarkeit und die Ermüdungsrückgewinnungskapazität sowie die Kinetik der Muskelkontraktion als Reaktion auf die Stimulation zu erhalten.

Bei Verwendung ohne Stimulations-evozierte Kraftmessungen ist das passive Kraft- / Deformations-Protokoll, das wir beschreiben, für wiederholt geeignetAnalyse über die Zeit, da es keine der chirurgischen Verfahren für Nervenstimulation und Kraft Messungen, mit Ausnahme der minimal-invasiven Naht der Zunge verwendet. In diesem Zustand kann die physikalische Länge der Zunge, die durch MRI berechnet wird, als Referenz ( Tabelle 2 , Parameter d) anstelle des gemessenen L 0 verwendet werden . Zu diesem Zweck wird die Verwendung einer injizierbaren Anästhesie die Notwendigkeit einer trachealen Intubation eliminieren.

Eine Begrenzung des gegenwärtigen Ansatzes besteht in der Unfähigkeit, zwischen protrusive und retrusiven Komponenten der Zungenkontraktion zu unterscheiden. Die in diesem Protokoll beschriebenen stimulierenden Hakenelektroden sind proximal zur Bifurkation des Nervs angeordnet, wodurch die ganze Zunge stimuliert wird. Andere Gruppen haben die Verwendung von Silikonnervenmanschettenelektroden bei Ratten 19 , 32 oder Kaninchen 21 beschrieben , die alNiedriger selektiver Zugang und Stimulation eines oder beider Zweige der hypoglossalen Nerven. Darüber hinaus würde die Verwendung von injizierbaren Anästhetika anstelle von Isofluran-Inhalation einen besseren Zugang zu der submandibulären Region, wo die hypoglossalen Nerven verzweigen.

Mit der Praxis gilt dieses Protokoll für kleinere Tiere wie Mäuse, wo die überwiegende Mehrheit der Krankheitsmodelle derzeit verfügbar ist. Insbesondere sind eine Reihe von Mausmodellen, in denen die Zungenphysiologie verändert ist, 33 , 34 , 35 , 36 bekannt . Die Skalierung erfordert die Verwendung von kleineren chirurgischen Werkzeugen, Elektroden und Trachealkanülen (falls erforderlich) und optional mit einem Kraftgeber, der für niedrigere Kraftbereiche ausgelegt ist.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Diese Untersuchung wurde von zwei National Institutes of Health Grants unterstützt: HL089447 ("Adipositas und OSA: Verständnis der Bedeutung der Zunge Fat & Metabolic Function") und HL094307 ("Verständnis der Beziehung zwischen Fettleibigkeit und Zungenfett")

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SurgiSuite (heated Surgical tray) Kent Scientific SurgiSuite-LG Includes heated platform
LED Lighting and Magnification Kit Kent Scientific SURGI- 5003
RC2 Rodent Circuit Controller VetEquip 922100
Isoflurane Butler Schein Animal Health Supply 29405
Alcohol Prep Webcol 6818
Cotton-tipped applicators MediChoice WOD1002
Hair clipper Conair
Hair remover lotion Nair
Medical tape Transpore 3M
D-PBS Corning 21-030-CM
Operating Scissors World Precision Instruments 503717-12
Hemostatic Forceps Merit 97-458 Any tissue forceps can be used instead
Microdissecting Forceps, Angled, Serrated, 10.2 cm, SS World Precision Instruments 504479
Suture Tying Forceps Fine Science Tools 18025-10
Blunt Micro Hook Fine Science Tools 10062-12
Microhemostat Fine Science Tools 12075-14
Thermal cautery WPI 501292 Disposable cauteries are available at lower cost
IV 14g x 3.25" cannula BD B-D382268H For tracheal cannulation
Braided silk non-absorbable suture size 4-0 Harvard Apparatus SP104 For stabilization of the tracheal cannula
Braided non-absorbable silk 5/0 suture Surgik LC, USA ESILRC15387550 For suturing the tongue
Plastic-coated metal twist-tie (or electrical wire) For securing the rat's nose to the platform
Camera stick
3 way-swivel and Trilene 9 Kg test monofilament line Berkley For securing the jaw and maintaining the mouth open
Camera stick with adjustable angle For supporting the 3 way-swivel and maintaining the mouth open.
in situ Muscle Test System Aurora Scientific 809C This system is designed for mice and was modified by extending the platform. Alternatively the rat-specific 806D system can be used.
Dual-Mode Muscle lever (force transducer) Aurora Scientific 305C-LR 309C offers higher excursion capabilities than 305C-LR. Link for more information and specifications: http://aurorascientific.com/products/muscle-physiology/dual-mode-muscle-levers/
Needle Electrodes (surgical steel, 29 gauge) AD Instruments MLA1204 300C is recommended for use in mice.
Magnetic Stands World Precision Instruments M10 Used for making the bipolar stimulating hook electrodes
Kite Manual Micromanipulator World Precision Instruments KITE-R and KITE-L Require a steel plate
Stackable Double Binding Post with Banana Jack x BNC Jack McMaster Carr 6704K13
Carbon fiber composites digital caliper VWR 36934-152

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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<em>In vivo</em> Auswertung der mechanischen und viskoelastischen Eigenschaften der Rattenzunge
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Loro, E., Wang, S. H., Schwab, R.… More

Loro, E., Wang, S. H., Schwab, R. J., Khurana, T. S. In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue. J. Vis. Exp. (125), e56006, doi:10.3791/56006 (2017).

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