Summary
Vi beskriver ett kirurgiskt ingrepp i en bedövad råttmodell för bestämning av tungans muskelton och viskoelastiska egenskaper. Förfarandet innefattar specifik stimulering av hypoglossala nerver och applicering av passiva Lissajous kraft / deformationskurvor till muskeln.
Abstract
Tungan är en mycket innerverad och vaskulär muskelhydrostat på munnen av de flesta ryggradsdjur. Dess primära funktioner inkluderar stödjande mastication och deglutition, samt smaksavkänning och fonetik. Följaktligen kan styrkan och volymen på tungan påverka ryggradenas förmåga att åstadkomma grundläggande aktiviteter såsom utfodring, kommunikation och andning. Mänskliga patienter med sömnapné har förstorade tungor, kännetecknad av minskad muskelton och ökat intramuskulärt fett som kan visualiseras och kvantifieras genom magnetisk resonansbildning (MRI). Förmågan att mäta kraftgenerering och viskoelastiska egenskaper hos tungan utgör viktiga verktyg för att erhålla funktionell information för att korrelera med bilddata. Här presenterar vi tekniker för mätning av tungstyrka i bedövade Zucker-råttor via elektrisk stimulering av hypoglossala nerver och för bestämning av viskoelastiska egenskaper oF tungan genom att applicera passiva Lissajous kraft / deformationskurvor.
Introduction
Tungan ger väsentligt stöd för mastication, deglutition, smakavkänning och talande. Förekomsten av extrinsisk och inneboende muskulatur, med distinkt innervation och anatomi / funktion, står för den unika egenskapen hos denna muskelhydrostat. Nya framsteg inom bildtekniker har gett en mer detaljerad bild av dess komplexa anatomi 1 . Minskad tungafunktionalitet, tunga atrofi, dysfagi och talproblem är också vanliga manifestationer av myopatiska tillstånd, såsom Parkinson 2 , Amyotrophic lateral Sclerosis (ALS) 3 , Myotonic Dystrophy (MD) 4 och andra myopatier.
Förändringar i muskelsammansättning i samband med vanliga sjukdomstillstånd påverkar tungans mekaniska och viskoelastiska egenskaper. Till exempel har funktionell analys av tungstyrkan visat förändringar i kontraktil egenskaper som hör samman med åldrandetSs = "xref"> 5 , 6 , hypoxi 7 , 8 och fetma 9 , 10 . Vid muskeldystrofi leder ökad fibros till högre muskelstyvhet, vilket innebär att deformationens överensstämmelse blir lägre när ett Lissajous deformationsprotokoll tillämpas 11 . Omvänt förändrar förändringar i muskelfettinnehållet, som de som dokumenteras hos överviktiga patienter, både de metaboliska 12 och mekaniska egenskaperna hos skelettmusklerna 13 , 14 och förväntas öka muskelöverensstämmelsen med deformation. Ökat tunga fett korrelerar också med utvecklingen av obstruktiv sömnapné (OSA) hos människor 17 genom att öka tungvolymen till punkten för partiell övre luftvägsblock (apné) 15 , 16 . SimIlarly till människor, har tunga infiltration dokumenterats i obese Zucker råttor 10 , vilket tyder på att denna modell är ett värdefullt verktyg för att studera effekterna av fettinfiltrering på tungfysiologi.
Mätande tungstyrka kräver delikata kirurgiska tekniker för att isolera och bilateralt stimulera hypoglossala nerver 17 , 18 . Sådana tekniker har tidigare beskrivits i råttor 5 , 17 , 19 , 20 , kaniner 21 och människor 22 , 23 , men med begränsade visuella hjälpmedel till utredaren. På grund av sin högteknologiska natur skulle tillgängligheten av ett detaljerat protokoll betydligt förbättra tillgängligheten och reproducerbarheten av denna teknik. Målet med vårt experimentella paradigm är att vara sjukUstrate en giltig och pålitlig teknik för att mäta styrka och viskoelastiska egenskaper hos tungan i en råttmodell. För att uppnå detta bedöms råttan, hypoglossala nerver exponeras och luftröret kanyleras för att säkerställa fri tillgång till djurets tunga. En suturslinga ansluter sedan spetsen av tungan till en kraftgivare som kan styra både kraft och längd medan två bipolära krokelektroder stimulerar hypoglossala nerver för att inducera sammandragning av tungan. Efter att kraftmätningen är avslutad används kraftöverförarens längdstyrande förmåga att snabbt ändra längden på tungan, enligt ett sinusvågsprotokoll med Lissajous-kurvor, längd och frekvens, så att en kan härledas Dess viskoelastiska egenskaper 11 , 24 . Protokollet kommer att leda utredaren genom dissektionsstegen, positioneringen av djuret på den experimentella plattformenRm, placering av elektroder och slutligen till förvärv och analys av kraft- och viskoelasticitetsdata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden inklusive djurämnen har godkänts av Institutionen för djurvård och användningskommitté (IACUC) vid University of Pennsylvania (protokoll nr 805822). Det beskrivna förfarandet är terminal och kräver inte användningen av aseptiska betingelser eller produkter av farmaceutisk kvalitet.
1. Kirurgiska förfaranden
Figur 1: Kirurgiska förfaranden.
(A) Kirurgisk planavgränsning. Den röda streckade linjen indikerar snittets område. Två svarta linjer indikerar käftens läge, medan den nedersta svarta linjen markerar thoraxens läge. Den blå linjen indikerar hyoidbenet. (B) Exponering av den bakre magen av digastriska muskeln (pilar) efter trubbig dissektion av fettvävnad, sublingualen och submaxillen Ary körtlar. (C) Resektion av den bakre magen av den digastriska muskeln (streckad grön linje) för att avslöja hypoglossal nerven (vit pil). (D) Den hypoglossala nerven (vit pilen) rensas från den omgivande fascien. (E) Trachea exponeras genom att försiktigt dra ihop den glatta muskeln runt den (de gröna pilarna indikerar kraften som appliceras) och lyfts (F) för att förbereda sig för intubation. Stjärnan indikerar tungens insättning vid hyoidbenet. Den gröna streckade linjen markerar snittet för intubationen. Den vita pilen indikerar den lösa knuten som är förberedd för att säkra kanylen på plats när den är införd. (G) Inskärning av luftröret för kanylering. (H) Trakealkanylen sätts in och fästs på plats med en kvadratknut. (I) Applicering av suturen på tungan.Target = "_ blank"> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
- Anestesi och förberedelse för operation
- Placera råttan i induktionskammaren med 4% isoflurananestesi.
- Låt djuret ligga över en värmekälla och bibehålla anestesi med 1 - 3% isofluran från en nosekon, vilket garanterar en andningshastighet på minst 70 andetag per minut.
- Rak upp nackområdet med en luftklippare och hårborttagningskräm. När du använder hårborttagningskräm, sprida grädden med en bomullsspetsapplikator tills pälsen är borttagen. Långvarig exponering för hårborttagningskräm kan orsaka hudirritation.
- Rengör det kirurgiska fältet med 70% alkohol ( Figur 1A ).
- Kontrollera djurets andningsmönster och reflexer (brist på tånklämningsreflex) innan du fortsätter med den första snittet. Den kontinuerliga övervakningen och bedömningen av bedövningsdjupet är väsentligt (reRespiratorisk respirationsfrekvens och brist på reflexer var 10: e minut); Djuret måste vara under ett djupt kirurgiskt narkosplan under hela förfarandet.
- Identifiering av hypoglossala nerver
- Öppna det kirurgiska fältet med ett par operativa saxar genom att resekta och ta bort huden enligt den röda streckade linjen i Figur 1A .
- Blunt dissekera genom vilken fettvävnad, sublingual som submaxillär körtlar och muskelskiktet som omger luftstrupen.
OBS: Var försiktig under dissektionen. Använd trubbig dissektion när det är möjligt och var försiktig så att du inte skadar halsens blodkärl. - Identifiera den bakre magen av digastriska muskeln (PD) lateral i luftröret ( Figur 1B - vita pilar). Den hypoglossala nerven löper under denna muskel ( Figur 1C - vit pil). Med elektrocautery, resect PD proxImal mot hyoidbenet ( Figur 1C - streckad linje).
OBS! Låt inte nerven eller vävnaden runt den bli torr. Lägg en droppe mineralolja på nerven för att skydda den. För att undvika muskelkontraktion på grund av fältförökning av stimulansen från elektroderna, försiktigt cauterize muskelvävnaden på de möjliga kontaktställena runt nerven. - Använda ett par fina pincett, dissekera hypoglossalnerven från den omgivande fascien. Kontrollera med hjälp av en krok att minst 3 mm av nerven är tillgänglig för anslutning av den bipolära elektroden ( Figur 1D ).
- Använda mikrohemostatiska tångar, krossa hypoglossal nerv så distalt från hyoidbenet ( Figur 1D - vit pil) som möjligt för att undvika retrograd spridning av stimulansen. Krossa nerven genom att trycka på den med de mikrohemostatiska tångarna i 5 s. När hemostat griper nerven, en kort tHäxa vid tungan bör vara synlig.
- Upprepa proceduren för den andra sidan.
- Tracheal intubation
- Exponera luftröret genom att försiktigt separera de omgivande släta musklerna genom trubbig dissektion ( Figur 1E - som indikeras av de gröna pilarna).
OBSERVERA: Var försiktig och använd helst slumpmässig dissektion. Jämför kanylens diameter med den hos luftröret. Kanylen ska passa rätt i luftröret och bör förbli stabilt införd efter sutureringen enligt beskrivningen i steg 1.3.2 till 1.3.5. - Lyft försiktigt luftröret med ett par suturbindande tångar och passera en 4-0 sutur under den, nära bröstkorgen. Tie en första lös knut mellan den 6: e och 7: e ringen från struphuvudet ( Figur 1F - vit pil). Denna knut kommer att stängas när kanylen är införd för att hålla den på plats.
- Skjut stammen av aÖverför pipetten (smör pipetten med mineralolja för att underlätta införandet) under luftröret för att lyfta det och underlätta införandet av kanylen (IV 14 gx 3,25 "kanyl).
- Klipp ett litet snitt mellan fjärde och femte ringen från struphuvudet ( Figur 1G - vit pil). Efter det första snittet kommer öppningen att tendera att sprida sig, var därför konservativ när du gör det första snittet för att undvika fullständig resektion av luftröret.
OBS! Innan du utför snittet i luftröret, kontrollera att kanylen är klar och att anestesimediet är på. - Starta anestesiadministrationen genom kanylen och sätt försiktigt in i snittet, och försiktigt in i luftröret, längden på cirka 5 ringar. Säkra kanylen på plats med suturen, för att skapa en lufttät försegling ( Figur 1H ).
OBSERVERA: Se till att ingen vätska kommer in i bröstkärlen för att undvika suffocation. När luftstrupen är snittad, kommer djuret att andas in i rumsluften. Det är därför viktigt att snabbt sätta in kanylen så att leverans av anestesen bibehålls. När / om du flyttar djuret, övervaka den korrekta positionen av kanylen i luftröret. - Ta försiktigt bort djuret från nosekonen.
OBS! Användning av injicerbara bedövningsmedel i stället för isofluran kan förenkla proceduren genom att eliminera behovet av tracheal intubation och rensa experimentell arbetsyta från överskott av rör.
- Exponera luftröret genom att försiktigt separera de omgivande släta musklerna genom trubbig dissektion ( Figur 1E - som indikeras av de gröna pilarna).
- Tunga sutur
- Blötlägg en 20 cm lång bit 5/0 sutur (vi föreslår Silk, svart flätat) i PBS.
- Medan råttans mun håller öppet håller du försiktigt spetsen av tungan med suturbindningstopparna.
- Passera suturen medialt genom spetsen av tungan ( Figur 1I - vit pil) med uppmärksamhet att hålla tungan fuktig med saltlösning för att undvika potentiell vävnadskada.
- Slå en slinga ca 4 cm bred (diametern kan ändras baserat på avståndet mellan djuret och kraftomvandlaren).
OBS! Se till att suturen och tungan är våta för att underlätta införandet och undvika onödiga lesioner i vävnaden.
2. Experimentell inställning
Figur 2: Positionering och säkring av djuret.
(A) Musen är placerad på experimentplattformen. Käken är fastsatt och munnen hålls öppen genom applicering av vertikal spänning (grön pil). Suturslingan är ansluten till kraftomvandlaren (vit pil). (B) Elektroderna är anslutna. (C) Varje elektrod, monterad på en mikromekanipulator, är stabilt ansluten till nerven. Inlägget visar avslutningen av tHan hakar elektroden. (D) Den optimala längden på tungan mäts med en Vernier-tjocklek, från insättningen på hyoidbenets nivå till spetsen av tungan. I denna bild avlägsnades elektroderna för tydlighet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Anmärkning: Placera djurets baksida på apparatens uppvärmda bricka med följande säkringsåtgärder för att undvika rörelse under experimentet.
- Säkra råttans näsa till brickan med en plastbelagd metallisk vridning direkt ansluten till den uppvärmda plattformen ( Figur 2A , 2B ).
- Håll råttans mun öppen genom att applicera vertikal spänning (använd en 3-vridbar vridning som är bunden till 9 kg testmonofilamentlinje och håll den på plats med en kamerasticka) ( Figur 2A - Grön pil).
OBS! Ett alternativt tillvägagångssätt för att stabilisera råttan är att använda en gnagare mungag eller en anpassad modifiering av den. Det är viktigt att munnen hålls öppen och stabil för att undvika rörelser i nacken som kan påverka mätarnas kvalitet. - Anslut suturslingan till kraftomvandlaren ( Figur 2A - vit pil).
- Med hjälp av kirurgisk tejp, immobilisera lemmar och bukets buk för att begränsa rörelserna under stimuleringarna.
- Applicera de två stimulerande krokbipolära elektroderna till de dissekerade hypoglossala nerverna, proximalt till krossplatsen ( Figur 2C ).
- Använd stimulerande bipolära elektroder specialtillverkade av ett par kirurgiska stål 29 gauge nålelektroder, hållna ihop på ett avstånd av 2 mm från varandra med hjälp av plaststöd (här använde vi två 1-ml serologiska pipetter bandade ihop).
- Böj spetsarna på nålelektroderna i en krokformTillräckligt liten för att bilda en stabil kontakt med nerven (~ 1 mm diameter) ( Figur 2C - inlägg).
- Anslut de båda ledningarna i varje elektrod till en stapelbar dubbelbindningsstation med banan jack x BNC jack och anslut sedan till stimulatormodulen i ett in situ Muscle Test System (Tabell 3) med en BNC-splitter.
ANMÄRKNING: Se till att djuret är stabilt och att nacken och tungan är inriktade mot kraftövervakarens hävarm. Fortsätt att övervaka andningsfrekvensen och se till att begränsningarna inte stör andningen.
3. Optimal längd (L 0 ) och Maximal isometrisk kraftbestämning
- Justera längden på tungan gradvis och applicera isometriska stimuleringsstimuleringar tills en maximal kraft erhålls.
- Definiera L 0 som längden vid vilken den isometriska kraften ( tabell 1 ) är maximal och registrera för den efterföljande normaliseringen avKraftmätningarna, som det ändras för varje djur. Med hjälp av en Vernier-mätare mäter du tunglängden från insättningen på nivån av hyoidbenet ( Figur 2D ) till tungens spets.
OBS: Korrekt positionering av elektroderna är avgörande för att säkerställa optimal kontakt med nerverna. Optimal positionering bör utöva liknande och additivstyrkor när man stimulerar en av de båda nerverna eller båda.
- Definiera L 0 som längden vid vilken den isometriska kraften ( tabell 1 ) är maximal och registrera för den efterföljande normaliseringen avKraftmätningarna, som det ändras för varje djur. Med hjälp av en Vernier-mätare mäter du tunglängden från insättningen på nivån av hyoidbenet ( Figur 2D ) till tungens spets.
- Innan experimentet påbörjas, anslut båda elektroderna till stimulatorn och administrera en teststansstimulering ( Tabell 1 ). Under denna sammandragning, övervaka djuret för att säkerställa att positionen är stabil och kontrollera om oönskade synliga sammandragningar i nackmusklerna.
- Mät isometrisk kraft genom att applicera en rubbning följd efter 20 s genom en tetanisk stimulering. Upprepa stimuleringarna tre gånger så att 4 min återhämtning mellan stimuleringscyklerna (en cykel innehåller en ryckning och påE tetanisk stimulering), och registrera maximal ryck och tetanic styrkor.
- Håll tungan våt hela tiden genom att applicera några droppar PBS mellan sammandragningar.
ANMÄRKNING: Om nackmusklerna samlas, byt elektrodpositionen noggrant så att de inte rör någon omgivande muskelvävnad och om nödvändigt cauterize vävnaden i kontakt med elektroderna.
4. Viscoelastic Properties Determination (Lissajous Curves)
- Låt tungan vila i 3 - 5 min efter isometrisk kraftbestämning. Utför Lissajous-kurvorna från L 0 , därför bör aldrig djurets och kraftomvandlarens läge ändras.
- Utan att stimulera hypoglossal nerverna, applicera cykler av passiva sträckor ( tabell 2 ) med ökande förskjutning (d) dvs 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50% av L 0 (högre amplitud kan kräva en dubbel Lägesregulator med higheR exkursionsvärden än 305C-LR). Till exempel kommer en amplitud på 40% L 0 att orsaka deformationen av tungan från + 20% L 0 till -20% L 0 .
- Använd fast 2 Hz sinusfrekvens med 10 repetitioner i varje cykel, för en total varaktighet på 5 s varje cykel. Ändringar av sinusfrekvensen har tidigare använts med vävnader såsom membran 24 och kan antas för att modifiera försöksprotokollet.
- Låt 30 s mellan varje cykel och se till att tungan är våt under hela proceduren.
OBS: Håll tungan våt under proceduren och tillsätt några droppar PBS. Se till att fasthållningen som håller käften förblir stabilt på plats under sträckorna, särskilt när förskjutningen når 40% eller högre.
- Omedelbart efter avslutad försök, dödar djuret fortfarande under ett djupt kirurgiskt narkosplan, djuret enligt det godkända IACUC-djurprotesenocol. Dissekt tungan för vidare bearbetning ( dvs frusen sektion eller lagring för biokemiska analyser).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3: Representativa resultat.
(A) Exempel på framgångsrika spår och tetaniska kraftspår. Den motsvarande stimulansen representeras av det röda spåret. (B) Exempel på misslyckade tunga tetaniska sammandragningar på grund av submaximal sammandragning (blå spår) och indirekt stimulering av nackmusklerna. Båda förhållandena kan förbättras genom att ompositionera de stimulerande elektroderna eller undvika kontakten mellan elektrodanslutningarna och den omgivande muskelvävnaden. (C) Exempel på sinusvågförskjutning från L0 (25% LO) som används för att bestämma viskoelastiska egenskaper hos tungan. Den genomsnittliga förlängningen (blå kvadrat) och förkortningen (gröna kvadrat) kan användas för att beräkna Peak-To-Peak force 24 . Den röda torget iDicaterar det intervall som beaktas för analysen (med undantag för första och sista sinusvågorna). (D) Representation av kraft / förskjutningsförhållandet som Lissajous loopar, vilket ökar förskjutningen från 5% till 50% L0. Området inom varje slinga motsvarar energiförlusten, definierad som skillnaden mellan det arbete som utförs på muskeln för att förlänga det och det arbete som görs av muskeln eftersom det förkortas efter sträckan 24 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Förväntade värden för tråks- och tetaniska krafter i en 3 månaders gammal Zucker-råtta (genomsnittlig kroppsvikt 400 g för magert och 700 g för obese Zucker-råttor) visas i figur 3A . Den tetaniska kraften som utvecklats efter stimulering bör snabbt toppa (svart pilhuvud)Och sedan sakta sakta tills stimuleringen stannar. Figur 3B visar exempel på misslyckade sammandragningar, i vilka kraftproduktionen inte nått en platånivå före stimulans slut (blå linje - t ex om tunglängden sattes till ett värde lägre än L 0 eller om djurets överkropp inte är Helt stabiliserad), eller i vilken stimulansen utlöste sammandragningen av nackmusklerna (grön linje). I de flesta fall kan noggrann ompositionering av elektroderna förbättra sammandragningen. Om nackmusklerna synligt kontraheras under nervstimuleringen, försök att isolera vilken kontaktpunkt som helst mellan elektroder och muskelvävnad, antingen genom att cauterizing muskeln eller genom att flytta elektroderna bort från den. Krafter kan normaliseras av volymen av tungan mätt av MRI om detta är tillgängligt. Ett alternativ till användningen av den volymetriska data är att normalisera mot tungans vikt efter dissektion.
figurerna 3C och 3D . Figur 3C visar längden och kraftspåren separat, vilka, när de kombineras som i Figur 3D, genererar de typiska Lissajous-loopspåren. Det är viktigt att se till att tungan förblir våt mellan varje cykel genom att lägga till några droppar PBS. Ökad förskjutning från L 0 motsvarar högre passiv (arbete som utförts på muskeln under förlängning) och aktiv (arbete som utförts av muskeln under negativa) krafter. Analysen av dessa spår kan vara komplicerad. En kurvmontering av maximal medelkraft och / eller masscentrum för varje cykel kan användas för att beskriva tungans viskoelastiska egenskaper. En mer detaljerad analys av Lissajous arbetslyckor har beskrivits av DA Syme 24 med användning avRåttmembranet.
| Protokoll | Pulsspänning (V) | Pulsfrekvens (Hz) | Pulsbredd (ms) | Pulser per tåg | Tåglängd (ms) |
| Rycka till | 10 | 2500 | 0,2 | 1 | 0,2 |
| Stelkramp | 10 | 120 | 0,2 | 96 | 800 |
Tabell 1: Föreslagna kontraktionsstimuleringsparametrar.
Isometrisk twitch-kontraktion erhålls genom bilateral nervstimulering med en enda elektrisk puls av 10V, varaktig 0,2 ms. Efter 20 s erhålles en tetanisk isometrisk sammandragning genom att stimulera bilateralaLy med ett pulsspår (10 V, 120 Hz frekvens, 800 ms). Töjningen / tetanusstimuleringen upprepas tre gånger med 3 - 5 minuters intervall mellan varje cykel. De högsta ryckningarna och de högsta tetaniska krafterna från de tre repetitionerna beaktas för analysen.
| Totalavvikelse (d) från L 0 (%) | Sinamplitud (% L 0 ) | Sinfrekvens (Hz) | Antal cykler | Tid mellan cykler |
| d | d / 2 | 2 | 10 | 30 |
Tabell 2: Lissajous-kurvparametrar (Sinusformad avvikelse från L 0 ).
Tillämpningen av LissajOus force / displacement protokollet börjar 3 - 5 min efter trängsel / tetanus stimulering. Varje cykel varar 5 s (10 repetitioner vid 2 Hz frekvens) och utförs 30 s efter föregående. % Förskjutningen från L 0 (d) ökar vid varje cykel, från ett godtyckligt minimum på 5% upp till 50% av L 0 . Högre utflykter kan uppnås med andra kraftöverföringsmodeller ( tabell 3 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förändringar i tungmetabolismen och / eller sammansättningen, t ex infektionen av tunga fett som en följd av fetma, förutses förorsaka kvantifierbara förändringar av parametrarna enligt vårt protokoll. Kvantifieringen av tungstyrkan är av stor intresse, eftersom en obalans mellan utskjutande och retrusiv aktivitet eller allmänt tunga försvagning kan resultera i ocklusion av den övre luftvägen 15 . Övningstekniker som syftar till ökad tungstyrka har framgångsrikt använts hos råttor 25 , 26 och även hos människor 27 , 28 , 29 , där de effektivt minskade svårighetsgraden av sömnapné. Dessutom är hypoglossal nervstimulering nu en kirurgisk behandling för obstruktiv sömnapné 22 , 23 , 30 .
31 , sömnmedicin 10 , 25 och patogenesen av obstruktiv sömnapné 15 . Det beskrivna stimuleringsprotokollet och parametrarna kan lätt modifieras för att erhålla annan fysiologisk information, såsom kraftfrekvensförhållandet, utmattningsförmåga och utmattningsåtervinningskapacitet, såväl som kinetik av muskelkontraktion som svar på stimulering.
När det används utan stimuleringskrävda kraftmätningar är det passiva kraft / deformationsprotokollet vi beskriver lämpligt för upprepadeAnalys över tiden, eftersom det inte kräver några av de kirurgiska förfarandena som används för nervstimulering och kraftmätningar, förutom den tungt invasiva suturen av tungan. I detta tillstånd kan den fysiologiska längden av tungan beräknad med MR-en användas som referens ( Tabell 2 , parameter d) istället för den uppmätta L 0 . För detta ändamål kommer användningen av injicerbar anestesi att eliminera behovet av tracheal intubation.
En begränsning av det nuvarande tillvägagångssättet ligger i oförmågan att särskilja mellan utskjutande och retriktiva komponenter i tungkontraktionen. De stimulerande krokelektroderna som beskrivs i detta protokoll placeras proximala till bifurcationen av nerven, vilket gör att hela tungan stimuleras för att stimuleras. Andra grupper har beskrivit användningen av kiselnerven-manschettelektroder i råttor 19 , 32 eller kaniner 21 , vilka alLåg selektiv tillgång och stimulering av en eller båda grenarna av hypoglossala nerver. Dessutom skulle användningen av injicerbara anestetika istället för isofluraninhalation ge bättre tillgång till den submandibulära regionen där hypoglossala nerver grenar sig.
Med praktiken är detta protokoll tillämpligt på mindre djur som möss, där de allra flesta sjukdomsmodeller för närvarande finns tillgängliga. I synnerhet är en serie musmodeller i vilka tungfysiologi förändras kända 33 , 34 , 35 , 36 . Avskalning kommer att kräva användningen av mindre kirurgiska verktyg, elektroder och trakealkanyler (om det behövs) och eventuellt med en kraftgivare konstruerad för lägre kraftområden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Denna undersökning stöddes av två nationella institut för hälsotillskott: HL089447 ("Fetma och OSA: Förstå betydelsen av tunga fett och metabolisk funktion") och HL094307 ("Förstå förhållandet mellan fetma och tunga fett")
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SurgiSuite (heated Surgical tray) | Kent Scientific | SurgiSuite-LG | Includes heated platform |
| LED Lighting and Magnification Kit | Kent Scientific | SURGI- 5003 | |
| RC2 Rodent Circuit Controller | VetEquip | 922100 | |
| Isoflurane | Butler Schein Animal Health Supply | 29405 | |
| Alcohol Prep | Webcol | 6818 | |
| Cotton-tipped applicators | MediChoice | WOD1002 | |
| Hair clipper | Conair | ||
| Hair remover lotion | Nair | ||
| Medical tape | Transpore | 3M | |
| D-PBS | Corning | 21-030-CM | |
| Operating Scissors | World Precision Instruments | 503717-12 | |
| Hemostatic Forceps | Merit | 97-458 | Any tissue forceps can be used instead |
| Microdissecting Forceps, Angled, Serrated, 10.2 cm, SS | World Precision Instruments | 504479 | |
| Suture Tying Forceps | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Blunt Micro Hook | Fine Science Tools | 10062-12 | |
| Microhemostat | Fine Science Tools | 12075-14 | |
| Thermal cautery | WPI | 501292 | Disposable cauteries are available at lower cost |
| IV 14g x 3.25" cannula | BD | B-D382268H | For tracheal cannulation |
| Braided silk non-absorbable suture size 4-0 | Harvard Apparatus | SP104 | For stabilization of the tracheal cannula |
| Braided non-absorbable silk 5/0 suture | Surgik LC, USA | ESILRC15387550 | For suturing the tongue |
| Plastic-coated metal twist-tie (or electrical wire) | For securing the rat's nose to the platform | ||
| Camera stick | |||
| 3 way-swivel and Trilene 9 Kg test monofilament line | Berkley | For securing the jaw and maintaining the mouth open | |
| Camera stick with adjustable angle | For supporting the 3 way-swivel and maintaining the mouth open. | ||
| in situ Muscle Test System | Aurora Scientific | 809C | This system is designed for mice and was modified by extending the platform. Alternatively the rat-specific 806D system can be used. |
| Dual-Mode Muscle lever (force transducer) | Aurora Scientific | 305C-LR | 309C offers higher excursion capabilities than 305C-LR. Link for more information and specifications: http://aurorascientific.com/products/muscle-physiology/dual-mode-muscle-levers/ |
| Needle Electrodes (surgical steel, 29 gauge) | AD Instruments | MLA1204 | 300C is recommended for use in mice. |
| Magnetic Stands | World Precision Instruments | M10 | Used for making the bipolar stimulating hook electrodes |
| Kite Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-R and KITE-L | Require a steel plate |
| Stackable Double Binding Post with Banana Jack x BNC Jack | McMaster Carr | 6704K13 | |
| Carbon fiber composites digital caliper | VWR | 36934-152 |
References
- Sanders, I., Mu, L. A three-dimensional atlas of human tongue muscles. Anat Rec (Hoboken). 296 (7), 1102-1114 (2013).
- Ciucci, M. R., et al. Tongue force and timing deficits in a rat model of Parkinson disease. Behav Brain Res. 222 (2), 315-320 (2011).
- Easterling, C., Antinoja, J., Cashin, S., Barkhaus, P. E. Changes in tongue pressure, pulmonary function, and salivary flow in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Dysphagia. 28 (2), 217-225 (2013).
- Wang, Z. J., Huang, X. S. Images in clinical medicine. Myotonia of the tongue. N Engl J Med. 365 (15), e32 (2011).
- Ota, F., Connor, N. P., Konopacki, R. Alterations in contractile properties of tongue muscles in old rats. Ann Otol Rhinol Laryngol. 114 (10), 799-803 (2005).
- Schwarz, E. C., Thompson, J. M., Connor, N. P., Behan, M. The Effects of Aging on Hypoglossal Motoneurons in Rats. Dysphagia. 24 (1), 40 (2008).
- Pae, E. -K., Wu, J., Nguyen, D., Monti, R., Harper, R. M. Geniohyoid muscle properties and myosin heavy chain composition are altered after short-term intermittent hypoxic exposure. J Appl Physiol. 98 (3), 889-894 (2005).
- Fuller, D. D., Fregosi, R. F. Fatiguing contractions of tongue protrudor and retractor muscles: influence of systemic hypoxia. J Appl Physiol. 88 (6), 2123-2130 (2000).
- Ray, A. D., Farkas, G. A., Pendergast, D. R. In-situ mechanical characteristics of the tongue are not altered in the obese Zucker rat. Sleep. 32 (7), 957 (2009).
- Brennick, M. J., et al. Tongue fat infiltration in obese versus lean Zucker rats. Sleep. 37 (6), 1095-1102 (2014).
- Stedman, H. H., Sweeney, H. L., Shrager, J. B., Maguire, H. C., Panettieri, R. A., Petrof, B., Narusawa, M., Leferovich, J. M., Sladky, J. T., Kelly, A. M. The mdx mouse diaphragm reproduces the degenerative changes of Duchenne muscular dystrophy. Nature. 352 (6335), 536-539 (1991).
- Goodpaster, B. H., Wolf, D. Skeletal muscle lipid accumulation in obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes. Pediatr Diabetes. 5 (4), 219-226 (2004).
- Loro, E., et al. IL-15Rα is a determinant of muscle fuel utilization, and its loss protects against obesity. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 309 (8), R835-R844 (2015).
- Rahemi, H., Nigam, N., Wakeling, J. M. The effect of intramuscular fat on skeletal muscle mechanics: implications for the elderly and obese. J R Soc Interface. 12 (109), 20150365 (2015).
- Kim, A. M., et al. Tongue fat and its relationship to obstructive sleep apnea. Sleep. 37 (10), 1639-1648 (2014).
- Kim, A. M., et al. Metabolic activity of the tongue in obstructive sleep apnea. A novel application of FDG positron emission tomography imaging. Am J Respir Crit Care Med. 189 (11), 1416-1425 (2014).
- Gilliam, E. E., Goldberg, S. J. Contractile properties of the tongue muscles: effects of hypoglossal nerve and extracellular motoneuron stimulation in rat. J Neurophysiol. 74 (2), 547-555 (1995).
- Sokoloff, A. J. Localization and contractile properties of intrinsic longitudinal motor units of the rat tongue. J Neurophysiol. 84 (2), 827-835 (2000).
- Becker, B. J., Russell, J. A., Connor, N. P. Effects of aging on evoked retrusive tongue actions. Arch Oral Biol. 60 (6), 966-971 (2015).
- Connor, N. P., et al. Tongue muscle plasticity following hypoglossal nerve stimulation in aged rats. Muscle Nerve. 47 (2), 230-240 (2013).
- Seo, J., et al. Nerve cuff electrode using embedded magnets and its application to hypoglossal nerve stimulation. J Neural Eng. 13 (6), 066014 (2016).
- Friedman, M., et al. Targeted hypoglossal nerve stimulation for the treatment of obstructive sleep apnea: Six-month results. Laryngoscope. 126 (11), 2618-2623 (2016).
- Heiser, C., Maurer, J. T., Steffen, A. Functional outcome of tongue motions with selective hypoglossal nerve stimulation in patients with obstructive sleep apnea. Sleep Breath. 20 (2), 553-560 (2016).
- Syme, D. A. Passive viscoelastic work of isolated rat, Rattus norvegicus, diaphragm muscle. J Physiol. 424, 301-315 (1990).
- Connor, N. P., et al. Effect of tongue exercise on protrusive force and muscle fiber area in aging rats. J Speech Lang Hear Res. 52 (3), 732-744 (2009).
- Schaser, A. J., Stang, K., Connor, N. P., Behan, M. The effect of age and tongue exercise on BDNF and TrkB in the hypoglossal nucleus of rats. Behav Brain Res. 226 (1), 235-241 (2012).
- Puhan, M. A., et al. Didgeridoo playing as alternative treatment for obstructive sleep apnea syndrome: randomised controlled trial. BMJ. 332 (7536), 266-270 (2006).
- Guimarães, K. C., Drager, L. F., Genta, P. R., Marcondes, B. F., Lorenzi-Filho, G. Effects of oropharyngeal exercises on patients with moderate obstructive sleep apnea syndrome. Am J Respir Crit Care Med. 179 (10), 962-966 (2009).
- Ueda, H., Almeida, F. R., Chen, H., Lowe, A. A. Effect of 2 jaw exercises on occlusal function in patients with obstructive sleep apnea during oral appliance therapy: a randomized controlled trial. Am J Orthod Dentofacial Orthop. 135 (4), 430 (2009).
- Strollo, P. J., et al. Upper-airway stimulation for obstructive sleep apnea. N Engl J Med. 370 (2), 139-149 (2014).
- Perrier, P., Payan, Y., Zandipour, M., Perkell, J. Influences of tongue biomechanics on speech movements during the production of velar stop consonants: A modeling study. J Acoust Soc Am. 114 (3), 1582-1599 (2003).
- Connor, N. P., et al. Tongue muscle plasticity following hypoglossal nerve stimulation in aged rats. Muscle & nerve. 47 (2), 230-240 (2013).
- Brady, J. P., et al. AlphaB-crystallin in lens development and muscle integrity: a gene knockout approach. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (12), 2924-2934 (2001).
- Spassov, A., et al. Differential expression of myosin heavy chain isoforms in the masticatory muscles of dystrophin-deficient mice. Eur J Orthod. , ciq113 (2010).
- Lever, T. E., et al. Videofluoroscopic Validation of a Translational Murine Model of Presbyphagia. Dysphagia. 30 (3), 328-342 (2015).
- Gantois, I., et al. Ablation of D1 dopamine receptor-expressing cells generates mice with seizures, dystonia, hyperactivity, and impaired oral behavior. Proc Natl Acad Sci. 104 (10), 4182-4187 (2007).
