Summary
Vi beskriver en kirurgisk procedure i en bedøvet rottemodel til bestemmelse af tungenes muskelton og viskoelastiske egenskaber. Proceduren indebærer specifik stimulering af hypoglossale nerver og anvendelse af passive Lissajous kraft / deformationskurver til musklen.
Abstract
Tungen er en stærkt innerveret og vaskulariseret muskelhydrostat på gulvet i de fleste hvirveldyrs mund. Dets primære funktioner omfatter understøttelse af masticering og afbøjning samt smagsfølsomhed og fonetik. Følgelig kan styrken og volumenet af tungen påvirke hvirveldyrs evne til at udføre grundlæggende aktiviteter som fodring, kommunikation og vejrtrækning. Menneskepatienter med søvnapnø har forstørrede tunger, præget af nedsat muskelton og øget intramuskulært fedt, som kan visualiseres og kvantificeres ved magnetisk resonansbilleddannelse (MR). Evnerne til at måle kraftgenerering og viskoelastiske egenskaber af tungen er vigtige værktøjer til at opnå funktionel information for at korrelere med billeddannelsesdata. Her præsenterer vi teknikker til måling af tungekraftproduktion i bedøvede Zucker-rotter via elektrisk stimulering af hypoglossale nerver og til bestemmelse af de viskoelastiske egenskaber oF tungen ved at anvende passive Lissajous kraft / deformationskurver.
Introduction
Tungen giver væsentlig støtte til mastication, afgiftition, smagsfølsomhed og tale. Tilstedeværelsen af ekstrinsic og indre muskulatur, med særskilt indervation og anatomi / funktion, tegner sig for den unikke karakter af denne muskulære hydrostat. Nylige fremskridt inden for billedteknik har givet et mere detaljeret billede af dets komplekse anatomi 1 . Reduceret tungefunktionalitet, tungeatrofi, dysfagi og taleforstyrrelser er også almindelige manifestationer af myopatiske tilstande, såsom Parkinson 2 , Amyotrofisk Lateral Sclerose (ALS) 3 , Myotonisk Dystrofi (MD) 4 og andre myopatier.
Ændringer i muskelsammensætning associeret med almindelige sygdomstilstande påvirker tungens mekaniske og viskoelastiske egenskaber. For eksempel har funktionel analyse af tungekraft afdækket ændringer i kontraktile egenskaber forbundet med aldringSs = "xref"> 5 , 6 , hypoxi 7 , 8 og fedme 9 , 10 . I tilfælde af muskeldystrofi fører forøget fibrose til højere muskelstivhed, hvilket betyder, at deformation overholdes, når der anvendes en Lissajous deformationsprotokol 11 . Omvendt ændrer ændringer i muskelfedtindholdet, ligesom dem, der dokumenteres hos overvægtige patienter, både de metaboliske 12 og mekaniske egenskaber i skelettmuskel 13 , 14 og forventes at øge muskeloverensstemmelsen efter deformation. Øget tungefedt korrelerer også med udviklingen af obstruktiv søvnapnø (OSA) hos mennesker 17 ved at øge tungevolumen til punktet for delvis øvre luftvejseklusion (apnø) 15 , 16 . SimIlarly til mennesker, er tunge fedtsinfiltrering dokumenteret i overvægtige Zucker-rotter 10 , hvilket tyder på, at denne model er et værdifuldt værktøj til at studere virkningerne af fedtinfiltrering på tunfysiologi.
Målingstunge kraft kræver følsomme kirurgiske teknikker til at isolere og bilateralt stimulere hypoglossale nerver 17 , 18 . Sådanne teknikker er tidligere blevet beskrevet i rotter 5 , 17 , 19 , 20 , kaniner 21 og mennesker 22 , 23 , men dog med begrænsede visuelle hjælpemidler til undersøgeren. På grund af dets meget tekniske karakter vil tilgængeligheden af en detaljeret protokol betydeligt forbedre tilgængeligheden og reproducerbarheden af denne teknik. Målet med vores eksperimentelle paradigme er at sygeUstrate en gyldig og pålidelig teknik til måling af styrke og viskoelastiske egenskaber af tungen i en rotte model. For at opnå dette bedres rotten, hypoglossale nerver udsættes, og luftrøret er kanyleres for at sikre fri adgang til dyrets tunge. En sutursløjfe forbinder så spidsen af tungen med en krafttransducer, der er i stand til at styre både kraft og længde, mens to bipolære krogelektroder stimulerer hypoglossale nerver til at inducere sammentrækning af tungen. Efter at kraftmåling er afsluttet, anvendes kraftoverføringsorganets længdekontrolfunktioner til hurtigt at ændre længden af tungen ifølge en sinusbølgeprotokol med faste amplitude (Lissajous-kurver), varighed og frekvens, hvilket gør det muligt for en at udlede Dets viskoelastiske egenskaber 11 , 24 . Protokollen vil lede efterforskeren gennem dissektionstrinnene, positioneringen af dyret på den eksperimentelle platfoRm, placering af elektroder og endelig til opkøb og analyser af kraft- og viskoelasticitetsdata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, herunder dyrefag, er godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra University of Pennsylvania (protokol nr. 805822). Den beskrevne fremgangsmåde er terminal og kræver ikke anvendelse af aseptiske betingelser eller farmaceutiske kvalitetsprodukter.
1. Kirurgiske procedurer
Figur 1: Kirurgiske procedurer.
(A) Kirurgisk planlægning. Den røde stiplede linje angiver skæringsområdet. To sorte linjer angiver positionen af kæben, mens den nederste sorte linje markerer thoraxens position. Den blå linje angiver hyoidbenet. (B) Eksponering af den bageste mave af den digastriske muskel (pile) efter stump dissektion af fedtvæv, sublingual og submaxill Ary kirtler. (C) Resektion af den bageste mave af den digastriske muskel (stiplede grønne linje) for at afsløre hypoglossalnerven (hvid pil). (D) Den hypoglossale nerve (hvid pil) ryddes fra den omgivende fascia. (E) Trachea eksponeres ved forsigtigt at trække den glatte muskel rundt om den (de grønne pile indikerer retningen af den påførte kraft) og løftes (F) for at forberede sig til intubation. Stjernen indikerer tungens indsættelse ved hyoidbenet. Den grønne stiplede linje markerer snitpunktet for intubationen. Den hvide pil angiver den løse knude, der er forberedt på at sikre kanylen på plads, når den er blevet indsat. (G) Indsnævring af luftrøret til kanulering. (H) Trakealkanylen indsættes og fastgøres på plads med en firkantet knude. (I) Anvendelse af suturen til tungen.Target = "_ blank"> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
- Anæstesi og forberedelse til kirurgi
- Placer rotten i induktionskammeret med 4% isoflurananæstesi.
- Lad dyret ligge over en varmekilde og vedligeholde anæstesi med 1 - 3% isofluran fra en nosekon, der sikrer en respirationshastighed på mindst 70 vejrtrækninger pr. Minut.
- Barber halsområdet med en air-clipper og hårfjerningskrem. Når du bruger hårfjerningskrem, spred cremen med en bomuldsspids applikator, indtil pelsen er fjernet. Langvarig eksponering for hårfjerningskrem kan forårsage irritation af huden.
- Rens det kirurgiske område med 70% alkohol ( figur 1A ).
- Tjek dyrets vejrtrækningsmønster og reflekser (manglende tårefleksreflex), før du fortsætter med den indledende snit. Den løbende overvågning og vurdering af dybden af anæstesi er afgørende (reLedningsrespiration og manglende reflekser hver 10. minut); Dyret skal være under et dybt, kirurgisk anestesionsplan under hele proceduren.
- Identifikation af hypoglossale nerver
- Åbn det kirurgiske felt med et par operative saks ved at genoprette og fjerne huden som angivet med den røde punkterede linje i figur 1A .
- Blunt dissekeres gennem ethvert fedtvæv, de sublinguale og submaxillære kirtler og muskellaget omkring luftrøret.
BEMÆRK: Vær konservativ under dissektionen. Brug stump dissektion, når det er muligt, og pas på ikke at skade halsens blodkar. - Identificer den bageste mave af den digastriske muskel (PD) lateralt til luftrøret ( Figur 1B - hvide pile). Den hypoglossale nerve løber under denne muskel ( figur 1C - hvid pil). Med elektrocautery, resect PD proxImal til hyoidbenet ( figur 1C - punkteret linje).
BEMÆRK: Lad ikke nerven eller vævet omkring det blive tørt. Tilsæt en dråbe mineralolie på nerverne for at beskytte den. For at undgå muskelsammentrækning på grund af feltudbredelse af stimulus fra elektroderne skal du forsigtigt cauterize muskelvævet på de mulige kontaktsteder omkring nerverne. - Ved hjælp af et par fine pincetter dissekeres hypoglossalnerven fra den omgivende fascia. Ved hjælp af en krog skal du sørge for, at mindst 3 mm af nerve er til rådighed for tilslutning af den bipolare elektrode ( Figur 1D ).
- Ved hjælp af mikro hæmostatiske tænger, knus hypoglossal nerve så distalt fra hyoidbenet ( Figur 1D - hvid pil) som muligt for at undgå retrograd forplantning af stimulus. Crush nerveen ved at påtrykke det med de mikro hæmostatiske tang i 5 s. Når hæmostaten tager fat i nerven, en kort tHeksen på bunden af tungen skal være synlig.
- Gentag proceduren for den anden side.
- Tracheal intubation
- Udsæt luftrøret ved forsigtigt at adskille de omgivende glatte muskler ved stump dissektion ( Figur 1E - som angivet ved de grønne pile).
BEMÆRK: Vær konservativ og brug fortrinsvis stump dissektion. Sammenlign kanylens diameter med luftrørets diameter. Kanylen skal passe korrekt i luftrøret og bør forblive stabilt indsat efter suturering som beskrevet i trin 1.3.2 til 1.3.5. - Løft forsigtigt luftrøret ved hjælp af et par suturbindende tang og send en 4-0 sutur under den tæt ved thoraxen. Tie en indledende løs knude mellem den 6. og 7. ring fra strubehovedet ( Figur 1F - hvid pil). Denne knude lukkes, når kanylen er indsat for at holde den på plads.
- Skub stammen af aOverfør pipette (smør pipetten med mineralolie for at lette indsættelsen) under luftrøret for at løfte den og lette indsættelsen af kanylen (IV 14 gx 3,25 "kanyle).
- Skær et lille snit mellem fjerde og femte ringe fra strubehovedet ( Figur 1G - hvid pil). Efter det første snit vil åbningen være tilbøjelig til at sprede sig og derfor være konservativ, når du starter den første snit for at undgå fuldstændig resektion af luftrøret.
BEMÆRK: Sørg for, at kanylen er klar, og anæstesimodtageren er på, inden du går i indsnittet i luftrøret. - Start anæstesiadministrationen gennem kanylen og indsæt den forsigtigt ind i snittet, idet du forsigtigt går ind i luftrøret med en længde på ca. 5 ringe. Fastgør kanylen på plads med suturen for at skabe en lufttæt forsegling ( figur 1H ).
BEMÆRK: Sørg for, at der ikke kommer væske ind i brystrøret for at undgå at komme i stykkerocation. Når luftrøret er skæret, vil dyret puste rumluften. Det er derfor vigtigt at indsætte kanylen hurtigt, således at leveringen af anæstesien opretholdes. Når / hvis du flytter dyret, skal du kontrollere den korrekte position af kanylen i luftrøret. - Fjern forsigtigt dyret fra næsekonen.
BEMÆRK: Brug af injicerbare anæstetika i stedet for isofluran kan forenkle proceduren ved at eliminere behovet for tracheal intubation og rydde det eksperimentelle arbejdsområde fra overskydende slanger.
- Udsæt luftrøret ved forsigtigt at adskille de omgivende glatte muskler ved stump dissektion ( Figur 1E - som angivet ved de grønne pile).
- Tunge suturering
- Sug en 20 cm lang stykke 5/0 sutur (vi foreslår silke, sort flettet) i PBS.
- Mens du holder munden af rotten åben, hold forsigtigt spidsen af tungen med suturbindende tang.
- Pass suturen medialt gennem spidsen af tungen ( Figur 1I - hvid pil) opmærksom på at holde tungen fugtig med saltvand for at undgå potentielle vævskade.
- Bind en loop ca. 4 cm bred (diameteren kan ændre sig på basis af afstanden mellem dyret og krafttransduceren).
BEMÆRK: Sørg for, at suturen og tungen er våde for at lette indsættelsen og undgå unødvendige læsioner af vævet.
2. Eksperimentel opsætning
Figur 2: Placering og sikring af dyret.
(A) Musen er placeret på den eksperimentelle platform. Kæben er sikret og munden holdes åben ved anvendelse af vertikal spænding (grøn pil). Sutursløjfen er forbundet med kraftoverføreren (hvid pil). (B) Elektroderne er forbundet. (C) Hver elektrode, monteret på en micromanipulator, er stabilt forbundet til nerven. Indlægget viser afslutningen af tHan krogelektrode. (D) Tunens optimale længde måles med en Vernier-tykkelse, fra indsættelsen på hyoidens ben til spidsen af tungen. I dette billede blev elektroderne fjernet for tydelighed. Klik her for at se en større version af denne figur.
Bemærk: Placér dyret på ryggen på apparatets opvarmede bakke ved hjælp af følgende sikringsforanstaltninger for at undgå bevægelse under forsøget.
- Fastgør rotens næse til bakken med et plastbelagt metallisk snor, der er direkte forbundet med den opvarmede platform ( figur 2A , 2B ).
- Opretholde rotten munden åbnet ved at anvende lodret spænding (brug en 3-vejs drejebånd bundet til 9 kg test monofilament linje og hold fast med en kamera stick) ( Figur 2A - grøn pil).
BEMÆRK: En alternativ tilgang til stabilisering af rotten bruger en gnaver mund gag eller en brugerdefineret ændring af det. Det er vigtigt, at munden holdes åben og stabil for at undgå bevægelser i nakken, som kan påvirke målingenes kvalitet. - Tilslut sutursløjfen til kraftoverføreren ( Figur 2A - hvid pil).
- Ved hjælp af kirurgisk tape immobiliserer lemmerne og underlivet af rotten for at begrænse bevægelserne under stimuleringerne.
- Påfør de to stimulerende kroge bipolare elektroder til de dissekerede hypoglossale nerver, proximalt til crush site ( Figur 2C ).
- Brug stimulerende bipolære elektroder, der er specialfremstillet af et par kirurgiske stål 29 gauge nålelektroder, holdt sammen i en afstand af 2 mm fra hinanden ved hjælp af plastikunderstøtning (her brugte vi to 1 ml serologiske pipetter bundet sammen).
- Bøj nålelektroderne til en krogformLille nok til at danne en stabil kontakt med nerveen (~ 1 mm diameter) ( figur 2C - indlæg).
- Tilslut de to ledninger af hver elektrode til et stablet dobbeltbindingspost med banan jack x BNC jack, og tilslut derefter til stimulatormodulet af et in situ Muscle Test System (Tabel 3) ved hjælp af en BNC splitter.
BEMÆRK: Sørg for, at dyret er stabilt, og at halsen og tungen er justeret til kraftoverføringsarmen. Fortsæt med at overvåge respirationshastigheden og sørg for, at begrænsningerne ikke blander vejret.
3. Optimal længde (L 0 ) og maksimal isometrisk kraftbestemmelse
- Juster længden af tungen gradvist og anvender isometriske strejfstimuleringer, indtil der opnås en maksimal kraft.
- Definer L 0 som længden, hvor den isometriske kraftstyrke ( tabel 1 ) er maksimal, og registrere for den efterfølgende normalisering afKraftmålingerne, som det ændres for hvert dyr. Ved hjælp af en Vernier-tykkelse måles tunge længden fra indsatsen på niveauet af hyoidbenet ( figur 2D ) til spidsen af tungen.
BEMÆRK: Den korrekte positionering af elektroderne er afgørende for at sikre optimal kontakt med nerverne. Optimal positionering skal udøve lignende og additivkræfter, når de stimulerer henholdsvis en af de to nerver eller begge.
- Definer L 0 som længden, hvor den isometriske kraftstyrke ( tabel 1 ) er maksimal, og registrere for den efterfølgende normalisering afKraftmålingerne, som det ændres for hvert dyr. Ved hjælp af en Vernier-tykkelse måles tunge længden fra indsatsen på niveauet af hyoidbenet ( figur 2D ) til spidsen af tungen.
- Før eksperimentet påbegyndes, forbindes begge elektroderne til stimulatoren og administrerer en teststansstimulering ( tabel 1 ). I løbet af denne sammentrækning skal dyret overvåges for at sikre, at stillingen er stabil, og kontroller for uønskede synlige sammentrækninger i nakke musklerne.
- Mål isometrisk kraft ved at anvende en trik efterfulgt efter 20 s ved en tetanisk stimulering. Gentag stimuleringerne 3 gange, hvilket giver 4 min opsving mellem stimuleringscyklusser (en cyklus indbefatter en træk og påE tetanisk stimulering), og registrer de maksimale træk og tetaniske kræfter.
- Opretholde tungen våd hele tiden ved at anvende et par dråber PBS mellem sammentrækninger.
BEMÆRK: Hvis halsmusklerne er kontraherende, skal du omhyggeligt ændre elektrodens positionering, så de ikke rører ved noget omgivende muskelvæv og om nødvendigt cauterize vævet i kontakt med elektroderne.
4. Viskoelastiske egenskaber Bestemmelse (Lissajouskurver)
- Lad tungen hvile i 3 - 5 min efter isometrisk kraftbestemmelse. Udfør Lissajous-kurverne ved L 0 , derfor bør dyrets og krafttransducentens position aldrig ændres.
- Uden at stimulere hypoglossal nerverne, anvende cykler af passive strækninger ( tabel 2 ) med stigende forskydning (d) dvs. 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50% af L 0 (højere amplituder kan kræve en dobbelt Mode controller med higheR udflugt værdier end 305C-LR). For eksempel vil en amplitude på 40% L 0 forårsage deformation af tungen fra + 20% L 0 til -20% L 0 .
- Brug fast 2 Hz sinusfrekvens med 10 gentagelser i hver cyklus, i en samlet varighed på 5 s hver cyklus. Ændringer af sinusfrekvensen er tidligere blevet anvendt med væv såsom membran 24 og kunne vedtages for at modificere forsøgsprotokollen.
- Tillad 30 s mellem hver cyklus og sørg for, at tungen er våd under hele proceduren.
BEMÆRK: Hold tungen våd under proceduren, og tilføj et par dråber PBS. Sørg for, at fastholdelsen, der holder kæben, forbliver stabilt på plads under strækningerne, især når forskydningen når 40% eller derover.
- Umiddelbart efter færdiggørelsen af forsøget, mens dyret stadig er under et dybt kirurgisk plan for anæstesi, uddøder dyret i overensstemmelse med det godkendte IACUC animalske protestocol. Dissect tungen til yderligere behandling (frosne sektioner eller opbevaring til biokemiske analyser).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3: Repræsentative resultater.
(A) Eksempler på succesfulde træk og tetaniske kraftspor. Den tilsvarende stimulering er repræsenteret ved det røde spor. (B) Eksempel på mislykkede tunge tetaniske sammentrækninger på grund af submaximal sammentrækning (blå spor) og indirekte stimulering af nakke muskler. Begge betingelser kan forbedres ved at omplacere de stimulerende elektroder eller undgå kontakten mellem elektrodeafslutningerne og det omgivende muskelvæv. (C) Eksempel på sinusbølgeforskydning fra L0 (25% af L0) anvendt til at bestemme viskoelastiske viskoelastiske egenskaber. Den gennemsnitlige forlængelse (blå firkant) og forkortelse (grøn square) kan bruges til at beregne Peak-To-Peak force 24 . Den røde firkant iDicerer det interval, der tages i betragtning for analysen (eksklusive de første og de sidste sinusbølger). (D) Repræsentation af kraft / forskydningsforholdet som Lissajous-løkker opnået, hvilket øgede forskydningen fra 5% til 50% L0. Området inden for hver sløjfe svarer til energitabet, defineret som forskellen mellem det arbejde, der udføres på muskelen for at forlænge det og det arbejde, der udføres af muskelen, da det forkortes efter strækningen 24 . Klik her for at se en større version af denne figur.
Forventede værdier for træk og tetanic kræfter i en 3 måneder gammel Zucker rotte (gennemsnitlig kropsvægt 400 g til magert og 700 g for obese Zucker rotter) er vist i figur 3A . Den tetaniske kraft udviklet efter stimulering bør hurtigt spids (sort pilhoved)Og sænk derefter langsomt, indtil stimuleringen stopper. Figur 3B viser eksempler på mislykkede sammentrækninger, hvor kraftproduktionen ikke nåede et plateau niveau før stimuleringens slutning (blå linje - fx hvis tunge længde blev sat til en værdi lavere end L 0 eller hvis dyrets overkrop ikke er Helt stabiliseret), eller hvor stimulus udløste sammentrækningen af nakke muskler (grøn linje). I de fleste tilfælde kan omhyggelig omplacering af elektroderne forbedre sammentrækningen. Hvis nakke musklerne synligt kontraherer under nervestimuleringen, så prøv at isolere ethvert kontaktpunkt mellem elektroder og muskelvæv enten ved at cauterizing muskelen eller ved at flytte elektroderne væk fra den. Forcer kan normaliseres ved hjælp af volumenet af tungen målt af MR, hvis dette er tilgængeligt. Et alternativ til brugen af de volumetriske data er at normalisere mod tungens vægt efter dissektion.
figur 3C og 3D . Figur 3C viser længden og kraftsporerne separat, som kombineret som i figur 3D genererer de typiske Lissajous-loopspor. Det er vigtigt at sikre, at tungen forbliver våd mellem hver cyklus ved at tilføje et par dråber PBS. Stigende forskydning fra L 0 svarer til højere passiv (arbejde udført på musklen under forlængelse) og aktiv (arbejde udført af musklen under negative) kræfter. Analysen af disse spor kan være kompliceret. En kurvemontering af maksimal gennemsnitskraft og / eller massemasse for hver cyklus kan bruges til at beskrive tungens viskoelastiske egenskaber. En mere detaljeret analyse af Lissajous-arbejdsløkkenerne er blevet beskrevet af DA Syme 24 ved hjælp afRottemembranet.
| protokol | Pulsspænding (V) | Pulsfrekvens (Hz) | Pulsbredde (ms) | Pulser pr. Tog | Toglængde (ms) |
| Ryk | 10 | 2500 | 0,2 | 1 | 0,2 |
| tetanus | 10 | 120 | 0,2 | 96 | 800 |
Tabel 1: Foreslåede kontraktionsstimuleringsparametre.
Isometrisk trækkontraktion opnås ved bilateral nervestimulering med en enkelt elektrisk puls på 10V, der holder 0,2 ms. Efter 20 s opnås en tetanisk isometrisk sammentrækning ved at stimulere bilateraleLy med et pulserende træ (10 V, 120 Hz frekvens, 800 ms). Træk / tetanus stimulering gentages tre gange med 3 - 5 min interval mellem hver cyklus. De højeste træk og højeste tetaniske kræfter fra de tre gentagelser betragtes for analysen.
| Samlet afvigelse (d) fra L 0 (%) | Sin amplitude (% L 0 ) | Sinfrekvens (Hz) | Antal cykler | Tid mellem cyklusser |
| d | d / 2 | 2 | 10 | 30 |
Tabel 2: Lissajous-kurveparametre (sinusformet afvigelse fra L 0 ).
Anvendelsen af LissajOus force / displacement protokol begynder 3 - 5 min efter træk / tetanus stimulering. Hver cyklus varer 5 s (10 gentagelser ved 2 Hz frekvens) og udføres 30 s efter den foregående. % Forskydningen fra L 0 (d) stiger ved hver cyklus, fra et vilkårlig minimum på 5% op til 50% af L 0 . Højere udflugter kan opnås med andre kraftoverføringsmodeller ( tabel 3 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ændringer i tungemetabolismen og / eller sammensætningen, fx tunge fedtsinfiltrering som følge af fedme, forudses at medføre kvantificerbare ændringer af parametrene vurderet ved vores protokol. Kvantificeringen af tungekraft er af stor interesse, da en ubalance mellem fremspringende og retrusiv aktivitet eller overordnet tunge svækkelse kan resultere i okklusion af den øvre luftvej 15 . Træningsteknikker, der sigter mod at øge tunge styrke, er blevet anvendt med succes hos rotter 25 , 26 og også hos mennesker 27 , 28 , 29 , hvor de effektivt reducerede sværhedsgraden af søvnapnø. Derudover er hypoglossal nervestimulering nu en kirurgisk behandling for obstruktiv søvnapnø 22 , 23 , 30 .
31 , søvnmedicin 10 , 25 og patogenesen af obstruktiv søvnapnø 15 . Den beskrevne stimuleringsprotokol og parametre kan let modificeres for at opnå anden fysiologisk information såsom kraftfrekvensforholdet, træthed og træthedshastighedskapacitet samt kinetik af muskelkontraktion som reaktion på stimulering.
Når det anvendes uden stimuleringsfremkaldte kraftmålinger, er den passive kraft / deformationsprotokol, vi beskriver, egnet til gentagelseAnalyse over tid, da det ikke kræver nogen af de kirurgiske procedurer, der anvendes til nervestimulering og kraftmålinger, bortset fra den minimalt invasive suturering af tungen. I denne tilstand kan den fysiologiske længde af tungen, der beregnes af MR, anvendes som reference ( tabel 2 , parameter d) i stedet for den målte L0. Til dette formål vil anvendelsen af injicerbar anæstesi eliminere behovet for tracheal intubation.
En begrænsning af den nuværende fremgangsmåde ligger i manglende evne til at skelne mellem fremspringende og retrusive komponenter i tungenkontraktionen. De stimulerende krogelektroder, der beskrives i denne protokol, placeres proksimalt til bifurcationen af nerven, hvilket bevirker, at hele tungen stimuleres til at blive stimuleret. Andre grupper har beskrevet brugen af siliciumnerven manchet elektroder i rotter 19 , 32 eller kaniner 21 , som alLav selektiv adgang og stimulering af en eller begge grene af hypoglossale nerver. Derudover vil brugen af injicerbare anæstetika i stedet for isofluraninhalation give bedre adgang til den submandibulære region, hvor hypoglossale nerver gren.
Med praksis er denne protokol gældende for mindre dyr som mus, hvor langt de fleste sygdomsmodeller er tilgængelige. Især er en række musemodeller, hvor tunfysiologi ændres, kendt 33 , 34 , 35 , 36 . Skaling ned vil kræve anvendelse af mindre kirurgiske værktøjer, elektroder og trakealkanyler (hvis nødvendigt) og eventuelt med en kraftgiver, der er designet til lavere kraftområder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af to nationale institutter for sundhedsbidrag: HL089447 ("Fedme og OSA: Forstå betydningen af tunge fedt og metabolisk funktion") og HL094307 ("Forstå forholdet mellem fedme og tunge fedt")
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SurgiSuite (heated Surgical tray) | Kent Scientific | SurgiSuite-LG | Includes heated platform |
| LED Lighting and Magnification Kit | Kent Scientific | SURGI- 5003 | |
| RC2 Rodent Circuit Controller | VetEquip | 922100 | |
| Isoflurane | Butler Schein Animal Health Supply | 29405 | |
| Alcohol Prep | Webcol | 6818 | |
| Cotton-tipped applicators | MediChoice | WOD1002 | |
| Hair clipper | Conair | ||
| Hair remover lotion | Nair | ||
| Medical tape | Transpore | 3M | |
| D-PBS | Corning | 21-030-CM | |
| Operating Scissors | World Precision Instruments | 503717-12 | |
| Hemostatic Forceps | Merit | 97-458 | Any tissue forceps can be used instead |
| Microdissecting Forceps, Angled, Serrated, 10.2 cm, SS | World Precision Instruments | 504479 | |
| Suture Tying Forceps | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Blunt Micro Hook | Fine Science Tools | 10062-12 | |
| Microhemostat | Fine Science Tools | 12075-14 | |
| Thermal cautery | WPI | 501292 | Disposable cauteries are available at lower cost |
| IV 14g x 3.25" cannula | BD | B-D382268H | For tracheal cannulation |
| Braided silk non-absorbable suture size 4-0 | Harvard Apparatus | SP104 | For stabilization of the tracheal cannula |
| Braided non-absorbable silk 5/0 suture | Surgik LC, USA | ESILRC15387550 | For suturing the tongue |
| Plastic-coated metal twist-tie (or electrical wire) | For securing the rat's nose to the platform | ||
| Camera stick | |||
| 3 way-swivel and Trilene 9 Kg test monofilament line | Berkley | For securing the jaw and maintaining the mouth open | |
| Camera stick with adjustable angle | For supporting the 3 way-swivel and maintaining the mouth open. | ||
| in situ Muscle Test System | Aurora Scientific | 809C | This system is designed for mice and was modified by extending the platform. Alternatively the rat-specific 806D system can be used. |
| Dual-Mode Muscle lever (force transducer) | Aurora Scientific | 305C-LR | 309C offers higher excursion capabilities than 305C-LR. Link for more information and specifications: http://aurorascientific.com/products/muscle-physiology/dual-mode-muscle-levers/ |
| Needle Electrodes (surgical steel, 29 gauge) | AD Instruments | MLA1204 | 300C is recommended for use in mice. |
| Magnetic Stands | World Precision Instruments | M10 | Used for making the bipolar stimulating hook electrodes |
| Kite Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-R and KITE-L | Require a steel plate |
| Stackable Double Binding Post with Banana Jack x BNC Jack | McMaster Carr | 6704K13 | |
| Carbon fiber composites digital caliper | VWR | 36934-152 |
References
- Sanders, I., Mu, L. A three-dimensional atlas of human tongue muscles. Anat Rec (Hoboken). 296 (7), 1102-1114 (2013).
- Ciucci, M. R., et al. Tongue force and timing deficits in a rat model of Parkinson disease. Behav Brain Res. 222 (2), 315-320 (2011).
- Easterling, C., Antinoja, J., Cashin, S., Barkhaus, P. E. Changes in tongue pressure, pulmonary function, and salivary flow in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Dysphagia. 28 (2), 217-225 (2013).
- Wang, Z. J., Huang, X. S. Images in clinical medicine. Myotonia of the tongue. N Engl J Med. 365 (15), e32 (2011).
- Ota, F., Connor, N. P., Konopacki, R. Alterations in contractile properties of tongue muscles in old rats. Ann Otol Rhinol Laryngol. 114 (10), 799-803 (2005).
- Schwarz, E. C., Thompson, J. M., Connor, N. P., Behan, M. The Effects of Aging on Hypoglossal Motoneurons in Rats. Dysphagia. 24 (1), 40 (2008).
- Pae, E. -K., Wu, J., Nguyen, D., Monti, R., Harper, R. M. Geniohyoid muscle properties and myosin heavy chain composition are altered after short-term intermittent hypoxic exposure. J Appl Physiol. 98 (3), 889-894 (2005).
- Fuller, D. D., Fregosi, R. F. Fatiguing contractions of tongue protrudor and retractor muscles: influence of systemic hypoxia. J Appl Physiol. 88 (6), 2123-2130 (2000).
- Ray, A. D., Farkas, G. A., Pendergast, D. R. In-situ mechanical characteristics of the tongue are not altered in the obese Zucker rat. Sleep. 32 (7), 957 (2009).
- Brennick, M. J., et al. Tongue fat infiltration in obese versus lean Zucker rats. Sleep. 37 (6), 1095-1102 (2014).
- Stedman, H. H., Sweeney, H. L., Shrager, J. B., Maguire, H. C., Panettieri, R. A., Petrof, B., Narusawa, M., Leferovich, J. M., Sladky, J. T., Kelly, A. M. The mdx mouse diaphragm reproduces the degenerative changes of Duchenne muscular dystrophy. Nature. 352 (6335), 536-539 (1991).
- Goodpaster, B. H., Wolf, D. Skeletal muscle lipid accumulation in obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes. Pediatr Diabetes. 5 (4), 219-226 (2004).
- Loro, E., et al. IL-15Rα is a determinant of muscle fuel utilization, and its loss protects against obesity. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 309 (8), R835-R844 (2015).
- Rahemi, H., Nigam, N., Wakeling, J. M. The effect of intramuscular fat on skeletal muscle mechanics: implications for the elderly and obese. J R Soc Interface. 12 (109), 20150365 (2015).
- Kim, A. M., et al. Tongue fat and its relationship to obstructive sleep apnea. Sleep. 37 (10), 1639-1648 (2014).
- Kim, A. M., et al. Metabolic activity of the tongue in obstructive sleep apnea. A novel application of FDG positron emission tomography imaging. Am J Respir Crit Care Med. 189 (11), 1416-1425 (2014).
- Gilliam, E. E., Goldberg, S. J. Contractile properties of the tongue muscles: effects of hypoglossal nerve and extracellular motoneuron stimulation in rat. J Neurophysiol. 74 (2), 547-555 (1995).
- Sokoloff, A. J. Localization and contractile properties of intrinsic longitudinal motor units of the rat tongue. J Neurophysiol. 84 (2), 827-835 (2000).
- Becker, B. J., Russell, J. A., Connor, N. P. Effects of aging on evoked retrusive tongue actions. Arch Oral Biol. 60 (6), 966-971 (2015).
- Connor, N. P., et al. Tongue muscle plasticity following hypoglossal nerve stimulation in aged rats. Muscle Nerve. 47 (2), 230-240 (2013).
- Seo, J., et al. Nerve cuff electrode using embedded magnets and its application to hypoglossal nerve stimulation. J Neural Eng. 13 (6), 066014 (2016).
- Friedman, M., et al. Targeted hypoglossal nerve stimulation for the treatment of obstructive sleep apnea: Six-month results. Laryngoscope. 126 (11), 2618-2623 (2016).
- Heiser, C., Maurer, J. T., Steffen, A. Functional outcome of tongue motions with selective hypoglossal nerve stimulation in patients with obstructive sleep apnea. Sleep Breath. 20 (2), 553-560 (2016).
- Syme, D. A. Passive viscoelastic work of isolated rat, Rattus norvegicus, diaphragm muscle. J Physiol. 424, 301-315 (1990).
- Connor, N. P., et al. Effect of tongue exercise on protrusive force and muscle fiber area in aging rats. J Speech Lang Hear Res. 52 (3), 732-744 (2009).
- Schaser, A. J., Stang, K., Connor, N. P., Behan, M. The effect of age and tongue exercise on BDNF and TrkB in the hypoglossal nucleus of rats. Behav Brain Res. 226 (1), 235-241 (2012).
- Puhan, M. A., et al. Didgeridoo playing as alternative treatment for obstructive sleep apnea syndrome: randomised controlled trial. BMJ. 332 (7536), 266-270 (2006).
- Guimarães, K. C., Drager, L. F., Genta, P. R., Marcondes, B. F., Lorenzi-Filho, G. Effects of oropharyngeal exercises on patients with moderate obstructive sleep apnea syndrome. Am J Respir Crit Care Med. 179 (10), 962-966 (2009).
- Ueda, H., Almeida, F. R., Chen, H., Lowe, A. A. Effect of 2 jaw exercises on occlusal function in patients with obstructive sleep apnea during oral appliance therapy: a randomized controlled trial. Am J Orthod Dentofacial Orthop. 135 (4), 430 (2009).
- Strollo, P. J., et al. Upper-airway stimulation for obstructive sleep apnea. N Engl J Med. 370 (2), 139-149 (2014).
- Perrier, P., Payan, Y., Zandipour, M., Perkell, J. Influences of tongue biomechanics on speech movements during the production of velar stop consonants: A modeling study. J Acoust Soc Am. 114 (3), 1582-1599 (2003).
- Connor, N. P., et al. Tongue muscle plasticity following hypoglossal nerve stimulation in aged rats. Muscle & nerve. 47 (2), 230-240 (2013).
- Brady, J. P., et al. AlphaB-crystallin in lens development and muscle integrity: a gene knockout approach. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (12), 2924-2934 (2001).
- Spassov, A., et al. Differential expression of myosin heavy chain isoforms in the masticatory muscles of dystrophin-deficient mice. Eur J Orthod. , ciq113 (2010).
- Lever, T. E., et al. Videofluoroscopic Validation of a Translational Murine Model of Presbyphagia. Dysphagia. 30 (3), 328-342 (2015).
- Gantois, I., et al. Ablation of D1 dopamine receptor-expressing cells generates mice with seizures, dystonia, hyperactivity, and impaired oral behavior. Proc Natl Acad Sci. 104 (10), 4182-4187 (2007).
