Summary
אנו מציגים פרוטוקול מבוסס סינון לבודד גרעינים באיכות גבוהה מן הצלב המקושרים שריר השלד העכבר שבו הסרנו את הצורך ultracentrifugation, מה שהופך אותו ישים בקלות. אנו מראים כי הכרומטין מוכן מן הגרעינים מתאים immunoprecipitation הכרומטין וסביר הכרומטין immunoprecipitation רצף מחקרים.
Abstract
Chromatin immunoprecipitation (שבב) היא שיטה רבת עוצמה כדי לקבוע מחייב חלבון ל- DNA הכרומטין. שריר השלד עשיר, עם זאת, כבר אתגר עבור שבב עקב קושי טכני בבידוד של גרעינים באיכות גבוהה עם זיהום מינימלי של myofibrils. פרוטוקולים קודמים ניסו לטהר גרעינים לפני הצלב המקשר, אשר נוטל את הסיכון של אינטראקציה DNA- חלבון השתנה במהלך תהליך הכנת גרעינים ממושכים. בפרוטוקול הנוכחי, אנחנו הראשונים לחצות את רקמת שריר השלד שנאספו עכברים, ואת הרקמות היו minced ו sonicated. מאז מצאנו כי ultracentrifugation לא היה מסוגל להפריד בין גרעינים מ myofibrils באמצעות צולבות צלב רקמות, אנו המציא הליך סינון רציף כדי להשיג גרעינים באיכות גבוהה ללא נטילת myofibril משמעותי. לאחר מכן הכינו הכרומטין באמצעות ultrasonicator, מבחני שבב עם נוגדן אנטי BMAL1 חשף מחייב היממה חזקדפוס של BMAL1 למקדמי הגן. פרוטוקול סינון זה מהווה שיטה הניתנת להחלה בקלות על מנת לבודד גרעינים באיכות גבוהה מרקמת שריר השלד הצולבת, ומאפשר עיבוד דגימה עקבי ללימודים היומיים והרגישים לזמן. בשילוב עם הדור הבא רצף (NGS), השיטה שלנו ניתן לפרוס למחקרים מכניסטיים גנומי שונים התמקדות תפקוד שרירי השלד.
Introduction
שריר השלד משחק תפקידים חשובים בפיזיולוגיה והתנהגות. סיבי השריר רב נוקלאציה מורכבת myofibrils שבו אקטין ו מיוסין טופס יחידות פונקציונליות קרא sarcomeres לייצר כוח התכווצות. שריר השלד הוא גם האיבר המטבולי הגדול ביותר בגוף, חשבונאות עבור 80% לאחר גלוקוז הכנסה הכנסה ותגובה התגובה אינסולין הומאוסטזיס מטבולית 1 , 2 . פיזיולוגיה של שרירים ומטבוליזם מוסדרים היטב על ידי השעון היממה, שעון ביולוגי פנימי 3 , 4 , 5 , 6 . לדוגמה, המחיקה הספציפית של שריר השלד של Bmal1 , אחד מרכיבי שעון היממה המרכזיים, הביאה להתנגדות לאינסולין ולצמצום ספיגת גלוקוז בשרירי השלד, והחיות נמצאו לפתח סוכרת מסוג 2. אניבנוסף, שריר השלד הוא גם יותר ויותר להיות מוערך כמו איבר אנדוקריני 8 , מפריש myocines כדי להסדיר מטבוליזם מערכתית ופיזיולוגיה. מחקרים מכניקים נדרשים כדי להבין את הפונקציות הרגולטוריות הללו בשרירי השלד.
שבב הוא גישה רבת עוצמה כדי לגבש גיוס האמרגן של חלבונים דנה מחייב. שבב פותחה לראשונה כדי לזהות ארגון nucleosome על הכרומטין DNA 9 , 10 . מגוון של שיטות מאז דווחו לחצות חלבונים ו DNA הכרומטין באמצעות פורמלדהיד, דימתיל סולפט או אולטרה סגול הקרנה (UV) 11 , 12 . פורמלדהיד cross-linking הוא הנפוץ ביותר, שמירה על מבנה הכרומטין ו- DNA חלבונים אינטראקציות 9 , 13 , 14 . כרומט צולבב הוא מגורר על ידי sonication ו immunoprecipitated עם נוגדן נגד חלבון מסוים DNA מחייב עניין 15 , 16 . בשנים האחרונות פותחה שיטת השבב (CHIP-seq), שיטה המשלבת שבב עם NGS, לחקירת גורם שעתוק בגנום רחב 17 , ובמקרים מסוימים גם לעקוב אחר שינויים דינמיים במהלך קורס 18 , 19 , 20 . לדוגמה, מחקרים שבב-שבב seq חשפו רצף מתוזמר מאוד של מחייב גנומי של רכיבי שעון היממה ואת סמנים היסטון, אשר מניע ביטוי גנטי מדויק timporally לאורך ~ 24 שעות מחזור היממה 18 .
פרוטוקולי השבבים הזמינים ביותר מיועדים לרקמות רכות ( למשל , כבד, מוח וכו ' ), ומעט מאוד פורסמו עבור רקמות קשות כולל סקלהשריר. זה מאתגר מבחינה טכנית כדי homogenize סיבים שריר השלד עשיר לבודד גרעינים באיכות גבוהה 21 , במיוחד עבור ניסויים שבב הדורשים cross- המקשר. במחקר שבץ שריר שנערך לאחרונה, 22 הופרדו תאי לוויין מהמיוביבים, וגרעינים הוכנו משני סוגי התאים באמצעות הליך ממושך של עיכול רקמות. התהליך כולו לקח כשלוש שעות כדי להשלים לפני פורמלדהיד cross-linking בוצע על גרעינים מבודדים. בעוד פרוצדורה זו נמנעת בין סיבי השריר המקושרים, מה שהופך את רקמת השריר אפילו יותר עקשן להומוגניזציה יעילה, והיה מסוגל לייצר גרעינים באיכות גבוהה, פיגור הזמן המשמעותי מאוסף רקמות לגרעינים מקושרים את הסיכון ל- DNA שונה אינטראקציה בין פרוטאינים. לעומת זאת, רוב המחקרים ביצעו קישור צולב מיד לאחר טיפול ניסיוני או אוסף רקמות על מנת לשמר את ה- DNA בזמן אמת חלבוניםכריכה 12 . חיסרון שני של בידוד גרעיני לפני cross-linking היא כי זה מונע זמן רגיש יישומים כגון אוסף מדגם היממה אשר בדרך כלל מתרחשת במרווחים 3 - 4 שעות. בלי לחצות את הגרעינים, הבידוד צריך להתקדם מיד לאחר לנתיחה, ואילו דגימות צולבות ניתן לעבד יחד לאחר כל הקורס הזמן הושלמה, ובכך להבטיח עקביות ניסויית יותר.
פרוטוקולים אחרים לבידוד גרעינים מ שריר השלד unrosslinked דווחו גם. שני מחקרים תיארו את השימוש ultracentrifugation הדרגתי לגרעינים נפרדים מן הנותרים myofibrils ופסולת 23 , 24 . בעוד סוכרת או collucal colloundal gradientugugation הדרגתי יעיל עם רקמות שריר uncrosslinked, הניסויים שלנו גילה כי לאחר crosslinking, ultracentrifugation הדרגתי נכשל להפריד בין גרעיני תא DEbris על שיפוע.
לכן פיתחנו נוהל לבידוד גרעינים באיכות גבוהה תוך שימוש ברקמות שריר השלד. במקום ultcentrifugugation הדרגתי, אנו המציא שיטת סינון סדרתי ביעילות נפרד גרעינים מן פסולת. בעקבות ultrasonication, דגימות הכרומטין יושמו בהצלחה למחקרים שבב אשר הראו דפוס היממה של חלבון BMAL1 מחייב למקד מקדמי. השיטה שלנו יכולה להיות חלים באופן נרחב על מחקרים מכניסטיים שונים של רקמות השריר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
טיפול בבעלי חיים בוצע תחת טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש ועדת הוועדה (IACUC) הנחיות, והנהלים נערכו על פי פרוטוקול בעלי חיים שאושרו על ידי אוניברסיטת טקסס הבריאות המרכז ביוסטון.
1. בידוד גרעיני מן שרירי השלד הצלב
- לשקול ולכפות את שרירי הגפיים מאחורי שריר השלד, מבודדים מן כ 20 שבועות בשבוע C57BL / 6 עכברים זכר, ב פוספט קר כקרח שנאגרו מלוחים (PBS) כמתואר בפירוט בעבר 22 .
הערה: בדרך כלל אנו מקבלים 1.0 - 1.5 גרם של שריר השלד מעכבר אחד.- מניחים רקמת שריר השלד ממוקש בצינור 50 מ"ל חרוטי המכיל 10 מ"ל PBS על הקרח.
- צנטריפוגה ב XG 300 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- הסר בזהירות PBS supernatant על ידי שאיפה.
- הערכת נפח גלולה בכל צינור 50 מ"ל באמצעות צינורות התייחסות עם 1, 2, 3 ו 4 מ"ל מים.
- הוסף 7 כרכים שלקרח קר 1% פורמלדהיד ב PBS ו homogenize דגימות על הקרח באמצעות homogenizer רקמות בדיקה (ראה טבלה של חומרים ).
הערה: אופציונלי: הליך homogenization יכול להתבצע בחדר קר. - לחצות את המדגם על ידי דוגרים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
- להרוות את הצלב מקשר התגובה על ידי תוספת של גליצין 1 M לריכוז סופי של 0.125 M ו דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- צנטריפוגה דגימות ב XG 3000 במשך 5 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant באמצעות שאיפה.
- לשטוף עם 10 מ"ל של חיץ בסיס קר (10 מ"מ HEPES-KOH ב pH 7.3, 10 מ"מ EDTA, 10 מ"מ KCl, 5 מ"מ MgCl 2 , 0.5 מ"מ DTT) המכילים מעכבי פרוטאז שנוספו טרי (0.2 mM phenylmethylsulfonyl פלואוריד (PMSF) , ו 10 מיקרוגרם / מ"ל leupeptin). צנטריפוגה ב 3000 גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C בזהירות להסיר את supernatant על ידי שאיפה.
- Resuspend גלולה ב 6 מ"ל של חיץ תמוגה (10 מ"מ HEPES-KOH ב pH 7.3, 10 מ"מ EDTA, 10 מ"מ KCl, 5 מ"מ MgCl 2 , 0.5 מ"מ DTT, 1% Triton X-100) המכילים מעכבי פרוטאז הוסיף (טון 0.2 PMSF, ו 10 מיקרוגרם / מ"ל leupeptin).
- מעבירים את המדגם למוצר preuncill 15 מ"ל Dounce ו דגירה במשך 10 דקות על hom.Dounce homogenize כל מדגם על הקרח עם 15 משיכות איטיות באמצעות העלי רופף ואחריו 15 משיכות עם עלי חזק לשחרר את הגרעינים.
- מסנן homogenate (6 מ"ל) באמצעות מסננת התא (גודל הנקבוביות: 100 מיקרומטר) ולשטוף עם 4 מ"ל של חיץ תמוגה. צנטריפוגה דגימות ב 1000 xg במשך 10 דקות ב 4 ° C. Resuspend לתוך 5 מ"ל של חיץ בסיס קר כקרח ו dounce 10 פעמים עם עלי חזק לשחרר גרעינים.
- הסר aliquot של 20 μL למדידת ריכוז ה- DNA עם ספקטרופוטומטר (OD260 / OD280) ו תצפית מיקרוסקופית עם כחול trypan אם יש צורך (ראה להלן) ( איור 1 א ).
- סנן את ההשעיה באמצעותמסננת התא (גודל הנקבוביות: 70 מיקרומטר), לשטוף את הצינור ואת המסנן שוב עם חיץ בסיס 2 מ"ל כאמור.
- חזור על סינון כמו בשלב 1.13 עם מסננים התא של גודל הנקבוביות מופחת בהדרגה (40 מיקרומטר, 30 מיקרומטר, 20 מיקרומטר ו 10 מיקרומטר).
הערה: בסך הכל, מסננים של 6 גודל הנקבוביות שימשו צעדים 1.12-1.14. - צנטריפוגה ב 1000 גרם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הסר supernatant ו resuspend גלולה במאגר מאגר 500 μL.
- למדוד ריכוז DNA כאמור.
הערה: כ 200 מיקרוגרם של DNA גרעיני התקבל משילוב שתי הגפיים האחוריות מחיה אחת. לחלופין, שמור 20 μL עבור תצפית מיקרוסקופית עם מכתים כחול trypan (ריכוז מלאי 0.4%, דילול 1: 5); גרעיני יהיה כתם כחול ( איור 1 ב ' ). - צנטריפוגה ב 1000 גרם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולזנוח supernatant. חנות גלולה ב -80 מעלות צלזיוס.
2. Sonication
<Ol>הערה: דוגמה להערכת יעילות sonication מוצג באיור 2 .
3. הערכה של Sonication ו quantitation
- הוסף 1.0ΜL של RNase A (500 U / מ"ל RNase A: 20,000 U / מ"ל RNase T1) ל 50 נשמר דוגמאות μL sonicated ו דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- הוסף 8 μL של פרוטאז K (10 מ"ג / מ"ל) ו דגירה 30 דקות ב 55 מעלות צלזיוס.
- קציר את ה- DNA באמצעות ערכת מיצוי DNA.
- הוסף 5 כרכים של חיץ מחייב, להחיל אותו על ספין טור, צנטריפוגה ב XG 4,000, 10 דקות.
- החל את המעבר על גבי אותו עמודה צנטריפוגות שוב.
- לשטוף עם חיץ כביסה פעמיים ב 13,000 XG, 1 דקות.
- צנטריפוגה שוב ב 13,000 XG, 1 דקות לייבש את הטור.
- הוסף 50 μL של H 2 O ו צנטריפוגה ב XG 13,000, 1 דקות כדי DNA elute.
- החל את המעבר על גבי אותו עמודה צנטריפוגות שוב.
- לכמת את כמות ה- DNA עם ספקטרופוטומטר (OD260 / OD280). הפעל דגימות על ג 'ל 0.8% כדי להעריך את גודל וכמות (1 מיקרוגרם) של מוצרים sonicated ( איור 2 ).
הערה: התשואה הכרומטין הממוצע הוא כ ~ 20%.
4. שבב
- להפשיר את הכרומטין שנשמרו בעבר ב -80 מעלות צלזיוס aliquot הכרומטין ~ 100-120 מיקרוגרם לכל צינור. מדולל 01:10 עם חיישן (RIPA) רדיואקטיבי (20 מ"מ טריס- HCl (pH 7.4), 150mM NaCl, 1mm EDTA, 1MM NaF, 1mM Na3VO4, 1mm PMSF, קוקטייל 1x Protease inhibitor (PIC), 0.1% Na-deoxycholate W / v), 1% Triton X-100).
- אם יש מספר דגימות בכל קבוצה, לשלב כמויות שוות של DNA הכרומטין לסכום הסופי של ~ 100-120 מיקרוגרם / מדגם. שמור 10% כקלט.
- הוסף 40 μL (50% V / V slurry במאגר RIPA) של BSA מראש חסומה (~ 2 שעות, 4 ° C) חלבון A / G agose (נוגדנים שאינם עוף) או חרוזים IgY (נוגדנים עוף) ו דגירה ב סיבוב עבור 3 שעות ב 4 ° C.
- צנטריפוגה ב 1000 xg, 10 דקות בזהירות להעביר את supernatant צינורות חדשים.
- הוסף נוגדנים 1 נוגדן μg לכל ~25 - 100 מיקרומטר DNA הכרומטין.
- סובב בעדינות על 4 מעלות צלזיוס למשך לילה בסביבות 15 סל"ד.
- הוסף 10 μL של BSA מראש חסומה (~ 2 שעות, 4 ° C) חלבון A / G agarose (נוגדנים שאינם עוף) או חרוזים IgY (נוגדנים עוף) לערבב לסובב בחדר קר במשך 2 שעות.
- שטפו חרוזים כדלקמן. לשטוף עם 1 מ"ל של חיץ RIPA במשך 3 דקות פעמיים, לשטוף עם 1 מ"ל של חיץ מלח גבוהה (20 מ"מ Tris-HCl (pH 7.4), 500mM NaCl, 2mm EDTA, 1mm PMSF, 1% Triton X-100) במשך 3 דקות פעמיים , לשטוף עם 1 מ"ל של חיץ LiCl (20mM Tris-HCl (pH 7.4), 250mm LiCl, 2mm EDTA, PMSF 1mm, 1% Na-deoxycholate, 0.5% NP40) במשך 3 דקות פעמיים.
- לשטוף עם 1 מ"ל של טריס-EDTA (TE) חיץ (10mm Tris-HCl (pH 7.4), 1mm EDTA) במשך 3 דקות פעם אחת. ואז elute DNA עם חיץ elution (20 מ"מ Tris-HCl, 5 מ"מ EDTA ו 0.5% SDS).
- צנטריפוגה ב 1000 גרם, 1 דקות בזהירות להסיר את supernatant.
- Resuspend את החרוז עם 50 μL של חיץ elution.
- דגירה של 10דקות ב 65 ° C.
- צנטריפוגה ב 12,000 גרם במשך 5 דקות.
- מעבירים את supernatant לצינור חדש, להוסיף עוד 50 μL ו צנטריפוגה שוב ב 12,000 גרם במשך 5 דקות. נפח elution הסופי יהיה 100 μL.
- הפוך crosslinking ו elution DNA.
- לדגור את הכרומטין eluted לילה ב 65 מעלות צלזיוס.
- הוסף 1.0 μL של RNase ו דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- הוסף 8 μL של פרוטאז K (10 מ"ג / מ"ל) ו דגירה 30 דקות ב 55 מעלות צלזיוס.
- קציר ה- DNA באמצעות ערכת ניקוי PCR עם נפח elution ב 50 μL לפי פרוטוקול של היצרן.
- ניתוח הפרופילים על ידי qPCR בזמן אמת כפי שתואר לעיל 25 , 26 .
הערה: רצפים תחלתי מופיעים באיור 3 מקרא . הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM ( איור 3 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן ביצענו פורמלדהיד cross-linking מיד לאחר איסוף רקמה כדי לשמר בזמן אמת אינטראקציה DNA חלבון. עם זאת, מצאנו כי שיפוע סוכרוז או colloidal, נפוץ לבידוד גרעיני 23 , 24 , לא היה יעיל בהפרדת גרעינים מ myofibrils (נתונים לא מוצג). הסיבה עשויה להיות כי cross-linking העניק הכבידה דומה עבור גרעינים ו myofibrils. לכן, פיתחנו תהליך סינון סדרתי כדי להסיר ביעילות myofibrils גדול ופסולת אחרת חלק הגרעינים. לאחר 100 סינון מיקרומטר, היו עדיין פסולת רקמות גדולות myofibrils ( איור 1 א ). לשם השוואה, בסוף סינון רציף, הרוב הגדול של פסולת רקמות גדולות, תאים שלמים myofibrils גדול הוסרו בהצלחה ( איור 1 ב ' ).
התחת = "jove_content" עבור: לשמור יחד. עם = page = "1"> גרעינים אלה שימשו בצורת ultrasonication בצורת צלחת. גרעינים מאוחסנים ב -80 מעלות צלזיוס הושעו במאגר תמוגה SDS ו נתון מיד sonication. למרות הדגירה של גרעינים במאגר תמוגה SDS על הקרח או בטמפרטורת החדר עשוי לשפר את sonication עבור רקמות מסוימות כגון כבד 27 או fibroblast עובריים עכבר (MEF) 28 , מניסיוננו זה הפריע sonication של גרעיני השלד וגרם מריחה רחבה, המציין סוניקציה לא יעילה. באמצעות פרוטוקול הנוכחי עם sonication מיידית לאחר ההשעיה במאגר תמוגה SDS ראינו sonication יעיל עם הכרומטין לגרוס בהדרגה בצורה תלויי מחזור ובסופו של דבר לייצר ~ 500 דגימות DNA BP ( איור 2 ). טרום הדגירה במאגר תמוגה לגילוי ניכר את יעילות sonication.
להונותהמשרד את איכות הכנת הכרומטין עבור שבב, בדקנו מחייב דנ"א של גורם שעתוק היממה BMAL1, אשר הראה שיא מחייב שוקת בזמן Zeitgeber (ZT) 6 ו ZT18, בהתאמה 18 , 29 . דגימות שריר השלד של עכברים C57B / 6J נאספו ב ZT6 ו ZT18, ודגימות הכרומטין הוכנו כאמור. בקצרה, לאחר sonication, דגימות הכרומטין shredded היו מראש מסומנת עם חרוזים IgY שהיו מראש חסום עם BSA ואחריו הדגירה עם נוגדנים נגד BMAL1 ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר elution וטיהור של הכרומטין, ביצענו RT-qPCR כדי לאתר מחייב BMAL1 על אלמנטים תיבת דואר של שני גנים היעד, Nr1d1 ו Dbp 30 . מצאנו קשר חזק בין BMAL1 לבין אלמנטים E-Box ב ZT6 ו מחייב מינימלי ב ZT18 ( Nr1d1 : 0.452 ± 0.022 לעומת 0.039 ± 0.002, Dbp -0.4: 0.627 ± 0.013 לעומת 0.062 ± 0.009, Dbp+0.8: 0.176 ± 0.013 לעומת 0.008 ± 0.001, Dbp +2.4: 0.466 ± 0.010 לעומת 0.122 ± 0.014; כל הערכים הם ממוצע ± SEM) ( איור 3 ), אימות הפרוטוקול עבור זמן רגיש גורם שעתוק מחייב ניתוח שריר השלד.
איור 1 : סינון רצף ביעילות הוסר פסולת רקמות. (א) נציג תמונות מראה דגימות לאחר 100 סינון מיקרומטר. רקמות גדולות ופסולת סיבים נצפים. (ב) נציג תמונות מראה דוגמאות לאחר סינון סדרתי. פסולת סיבים גדולה פונו. רק גרעינים מבודדים ושברי myofibril קטנים נצפים. התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ אור בהגדלה 10X, 20X ו 40X. סרגלי סולם מוצגים בצד ימין בצד לוחות.אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2 איור 2. פרוגרסיבי הכרומטין רטוש באמצעות 10 מחזורים של Sonication. עשרה מחזורים של sonication עם DNA מעוכל הכרומטין ~ 500 BP, כפי שנחשף ג'ל agarose 0.8%, לרוץ 150 V במשך 60 דקות. הפאנל הימני מציין יעילות sonication נמוך לאחר הדגירה מראש במאגר קר כקרח SDS תמוגה במשך 1 שעות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
FiGure 3 : נציג תוצאות qPCR עבור שבב BMAL1 עם עכבר דגימות שריר השלד שנאספו ב ZT6 ו ZT18. הנתונים מוצגים כ ממוצע ± SEM. Dbp -0.4, +0.8 ו -2.4 מצביעים על מיקומים של רכיבי ה- E-Box בגן Dbp . NC: שליטה שלילית עם IgY. הדפוס הזמני של הכריכה של BMAL1 עולה בקנה אחד עם התוצאות הקודמות מראה שיא BMAL1 מחייב בסביבות ZT6 18 . את primers קדימה לאחור הם כדלקמן. Rev-erba: 5'-GTAGACTACAAATCCCAACAATCCTG, ו- 5'-TGGAGCAGGTACCATGTGATGTTC; Dbp -0.4: 5'-ACACCCGCATCCGATAGC, ו- 5'-CCACTTCGGGCCAATGAG; Dbp +0.8: 5'- ATGCTCACACGGTGCAGACAA, ו- 5'- CTGCTCAGGCACATTCCTCAT; Dbp +2.4: 5'- TGGGACGCCTGGGTACACAC, ו- 5'- GGGAATGTGCAGCACTGGTT. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מתארים שיטה חזקה שבה צולבות רקמות שריר השלד שימשו לבודד גרעינים באיכות גבוהה. סינון רציף בוצע על מנת להפריד באופן יעיל גרעינים מן פסולת, ואנרגיה אקוסטית קולי מן מתכון בצורת צלחת גזז את הכרומטין לניתוח CHIP. התוצאות הראו מחייב זמן ספציפי היממה של BMAL1 למקדמים היזמים.
שבב ניתן להשתמש כדי ללכוד תפוסה חלבון בזמן אמת על DNA גנומי כאשר cross-linking מתרחש. כדי לנצל את הפוטנציאל הזה, אנו נועדו לפתח שיטה כדי לאפשר חוצה של שריר השלד בזמן של דיסקציה רקמות כדי לייעל את בידוד גרעינים ללא ultracentrifugation הדרגתי. בשל הקושי של homogenizing סיבים עשירים בשרירי השלד לעומת רקמות רכות כגון הכבד, אנחנו רקמה שריר קר כקרח PBS ולאחר מכן homogenized המדגם במאגר פורמלדהיד. לאחר מרווה, השעיה רקמות waS centrifuged ושטף עם חיץ בסיס קר כקרח לשטוף כל פורמלין הנותרים. גרעינים שוחררו על ידי הומוגניזציה Dounce, ואת homogenates היו מסוננים ברצף כדי להסיר בהדרגה פסולת התא ו myofibrils. פיתחנו את סדרת הסינון כדי למזער סתימת מסננים שעלולה להשפיע לרעה על התשואה. רק מיופרילים קצרים מאוד נותרו כאשר הסינון הסידורי הושלם.
Sonication ונהלי שבב הותאמו דו"ח 12 הקודם עם שינויים כולל תזמון sonication ואת כמות חיץ SDS. צורת בצורת sonicator מאפשר חשיפה גל קולי מרכזי עבור דגימות צלוחיות זכוכית באמבט מים קרים. בהשוואה sonicators בדיקה, זה sonicator שולט בטמפרטורת המדגם, כדי למנוע התחממות יתר, וגם מונע מדגם לחצות זיהום. אם sonicators בדיקה משמשים, התנאים sonication אופטימלי צריך להיקבע באופן אמפירי. אנחנו גם צמצמו את אמוןלא של חיץ SDS מאז התשואה של הכרומטין שריר נמוך מזה של הכבד 12 . מספר פרוטוקולים 28 , 31 , 32 כולל הדגירה על קרח או בטמפרטורת החדר לפני sonication. עם זאת, מניסיוננו, מראש הדגירה על הקרח לא לשפר את היעילות sonication. למעשה, במקרים מסוימים סוניקציה היה בסכנה. ייתכן כי myofibrils שיורית הסתבכו ה- DNA הכרומטין במהלך הדגירה ויעילות sonication מוחלש. עם sonication מיידית לאחר ההשעיה גרעינים במאגר תמוגה SDS, הצלחנו להשיג פיצול פרוגרסיבי הכרומטין עם מחזורי sonication הגדלת ( איור 2 ).
אנחנו תוקף את איכות הכרומטין עם QPCR שבב. כפי שמוצג באיור 3 , התפוסה מקדם BMAL1 היה חזק ב ZT6 ו מינימלי ב ZT18, עולה בקנה אחד עם הראה בעבר BMAL1 circaמקדם דיאן מחייב 18 . זה assay פונקציונלי אישר את איכות הגרעינים הכרומטין. בשנים האחרונות, פיתוח מהיר NGS פתח אופק חדש ליישום ChIP שבו שבב- seq יכול לחקור כמותית הכריכה הגנומית עם רגישות גבוהה 17 . במיוחד עבור שבב- seq, גרעינים באיכות גבוהה הכרומטין נדרשים באופן עקבי ללכוד אינטראקציה DNA- חלבון. הנוהל המתואר כאן עשוי להוות משאב בעל ערך עבור שבב- Seq מחקרים באמצעות שריר השלד. שים לב, הכנת שבב- seq הספרייה דורש צעדים נוספים כדי לשפר את רזולוציית האות, כגון בחירת גודל מבוסס PAGE 18 .
לסיכום, פיתחנו פרוטוקול המבוסס על סינון להכנת גרעינים באיכות גבוהה משרירי שלד צולבים. אנחנו מסירים את הצורך ultracentrifugation, מה שהופך אותו ישים בקלות. בנוסף שבב עבור גנים של עניין, את הגרעין ואת הכרומטין PREpared כמתואר ניתן להחיל באופן נרחב על שבב- seq מחקרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לגלות.
Acknowledgments
אנו מודים Karyn אסר, נובויה Koike ו Noheon פארק עצה מועילה. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי NIH / NIGMS (R01GM114424) ל- S.-HY, ו- Robert A. Welch Foundation (AU-1731) ו- NIH / NIA (R01AG045828) ל- ZC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Fisher Scientific | 15250061 | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| Protease K | Sigma Aldrich | 3115887001 | |
| Chicken Anti-BMAL1 antibody | Generated in chicken (Cocalico Biologicals) against antigen aa 318 - 579, and IgY was affinity purified using the same antigen. | ||
| Chicken IgY Precipitating Resin | GenScript | L00405 | |
| Equipment | |||
| KINEMATICA Polytron PT2100 Benchtop Homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-178 | |
| 15 mL Dounce tissue grinder | Whearton | 357544 | |
| Falcon Cell Strainers 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| Falcon Cell Strainers 70 µm | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Falcon Cell Strainers 40 µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| pluriStrainer 30 µm | PluriSelect | 43-50030-03 | |
| pluriStrainer 20 µm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| pluriStrainer 10 µm | PluriSelect | 43-50010-03 | |
| Covaris S2 Focused-ultrasonicator | Covaris | Model S2 | |
| Labquake | Thermo Scientific | C415110 | |
| CCD Microscope Camera | Leica Microsystems | DFC3000 G | |
| Reagent Kit | |||
| DNA extraction kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| Buffers | |||
| All buffer components are discribed in the protocol. Each component was purchased from Sigma Aldrich |
References
- Bouzakri, K., et al. siRNA-based gene silencing reveals specialized roles of IRS-1/Akt2 and IRS-2/Akt1 in glucose and lipid metabolism in human skeletal muscle. Cell Metab. 4 (1), 89-96 (2006).
- Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (1), (2014).
- Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J.
- Liu, A. C., Lewis, W. G., Kay, S. A. Mammalian circadian signaling networks and therapeutic targets. Nat Chem Biol. 3 (10), 630-639 (2007).
- Harfmann, B. D., Schroder, E. A., Esser, K. A. Circadian rhythms, the molecular clock, and skeletal muscle. J Biol Rhythms. 30 (2), 84-94 (2015).
- Nohara, K., Yoo, S. H., Chen, Z. J. Manipulating the circadian and sleep cycles to protect against metabolic disease. Front Endocrinol (Lausanne). 6, 35 (2015).
- Harfmann, B. D., et al. Muscle-specific loss of Bmal1 leads to disrupted tissue glucose metabolism and systemic glucose homeostasis. Skelet Muscle. 6, 12 (2016).
- Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Jackson, V. Studies on histone organization in the nucleosome using formaldehyde as a reversible cross-linking agent. Cell. 15 (3), 945-954 (1978).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Takahashi, J. S., et al. ChIP-seq and RNA-seq methods to study circadian control of transcription in mammals. Methods Enzymol. 551, 285-321 (2015).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
- Chen, Z., Manley, J. L. Core promoter elements and TAFs contribute to the diversity of transcriptional activation in vertebrates. Mol Cell Biol. 23 (20), 7350-7362 (2003).
- Menet, J. S., Abruzzi, K. C., Desrochers, J., Rodriguez, J., Rosbash, M. Dynamic PER repression mechanisms in the Drosophila circadian clock: from on-DNA to off-DNA. Genes Dev. 24 (4), 358-367 (2010).
- Miki, T., Matsumoto, T., Zhao, Z., Lee, C. C. p53 regulates Period2 expression and the circadian clock. Nat Commun. 4, 2444 (2013).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Koike, N., et al. Transcriptional architecture and chromatin landscape of the core circadian clock in mammals. Science. 338 (6105), 349-354 (2012).
- Zhou, J., Yu, W., Hardin, P. E. ChIPping away at the Drosophila clock. Methods Enzymol. 551, 323-347 (2015).
- Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nat Rev Genet. , (2016).
- Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L.
- Ohkawa, Y., Mallappa, C., Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. Isolation of nuclei from skeletal muscle satellite cells and myofibers for use in chromatin immunoprecipitation assays. Methods Mol Biol. 798, 517-530 (2012).
- Wilkie, G. S., Schirmer, E. C. Purification of nuclei and preparation of nuclear envelopes from skeletal muscle. Methods Mol Biol. 463, 23-41 (2008).
- Hahn, C. G., Covault, J. Isolation of transcriptionally active nuclei from striated muscle using Percoll density gradients. Anal Biochem. 190 (2), 193-197 (1990).
- Jeong, K., et al. Dual attenuation of proteasomal and autophagic BMAL1 degradation in Clock Delta19/+ mice contributes to improved glucose homeostasis. Scientific reports. 5, 12801 (2015).
- Nohara, K., et al. Ammonia-lowering activities and carbamoyl phosphate synthetase 1 (Cps1) induction mechanism of a natural flavonoid. Nutrition & metabolism. 12, 23 (2015).
- Zhang, L., Rubins, N. E., Ahima, R. S., Greenbaum, L. E., Kaestner, K. H. Foxa2 integrates the transcriptional response of the hepatocyte to fasting. Cell Metab. 2 (2), 141-148 (2005).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
- Kondratov, R. V., et al. BMAL1-dependent circadian oscillation of nuclear CLOCK: posttranslational events induced by dimerization of transcriptional activators of the mammalian clock system. Genes Dev. 17 (15), 1921-1932 (2003).
- Ripperger, J. A., Schibler, U. Rhythmic CLOCK-BMAL1 binding to multiple E-box motifs drives circadian Dbp transcription and chromatin transitions. Nat Genet. 38 (3), 369-374 (2006).
- Laplante, M., et al. DEPTOR cell-autonomously promotes adipogenesis, and its expression is associated with obesity. Cell Metab. 16 (2), 202-212 (2012).
- Blechman, J., Amir-Zilberstein, L., Gutnick, A., Ben-Dor, S., Levkowitz, G. The metabolic regulator PGC-1alpha directly controls the expression of the hypothalamic neuropeptide oxytocin. J Neurosci. 31 (42), 14835-14840 (2011).
