Summary
Wir präsentieren ein Filtrations-basiertes Protokoll, um qualitativ hochwertige Kerne aus vernetzten Mäuseskelettmuskeln zu isolieren, wobei wir die Notwendigkeit einer Ultrazentrifugation entfernt haben, wodurch es leicht anwendbar ist. Wir zeigen, dass das aus den Kernen hergestellte Chromatin für die Chromatin-Immunpräzipitation und wahrscheinlich Chromatin-Immunpräzipitations-Sequenzierungsstudien geeignet ist.
Abstract
Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) ist eine leistungsfähige Methode zur Bestimmung der Proteinbindung an Chromatin-DNA. Faserreicher Skelettmuskel war jedoch eine Herausforderung für ChIP aufgrund technischer Schwierigkeiten bei der Isolierung von hochwertigen Kernen mit minimaler Kontamination von Myofibrillen. Bisherige Protokolle haben versucht, Kerne vor der Vernetzung zu reinigen, was das Risiko einer veränderten DNA-Protein-Wechselwirkung während des verlängerten Keimpräparationsverfahrens verursacht. In dem aktuellen Protokoll haben wir zuerst das Skelettmuskelgewebe, das von Mäusen gesammelt wurde, vernetzt und die Gewebe wurden gehackt und beschallt. Da wir festgestellt haben, dass die Ultrazentrifugation nicht in der Lage war, Kerne von Myofibrillen unter Verwendung von vernetzten Muskelgeweben zu trennen, entwickelten wir ein sequentielles Filtrationsverfahren, um qualitativ hochwertige Kerne ohne signifikante Myofibrillenverunreinigung zu erhalten. Anschließend wurden Chromatin unter Verwendung eines Ultraschallgerätes hergestellt und ChIP-Assays mit anti-BMAL1-Antikörper zeigten eine robuste zirkadiane BindungMuster von BMAL1 zu Zielgen-Promotoren. Dieses Filtrationsprotokoll stellt eine leicht anwendbare Methode dar, um qualitativ hochwertige Kerne aus vernetzten Skelettmuskelgeweben zu isolieren, was eine konsistente Probenverarbeitung für zirkadiane und andere zeitempfindliche Studien ermöglicht. In Kombination mit der Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) kann unsere Methode für verschiedene mechanistische und genomische Studien eingesetzt werden, die sich auf die Skelettmuskelfunktion konzentrieren.
Introduction
Skelettmuskel spielt eine wichtige Rolle in Physiologie und Verhalten. Die mehrkernige Muskelfaser besteht aus Myofibrillen, in denen Aktin und Myosin funktionale Einheiten bilden, die Sarkomere genannt werden, um kontraktile Kraft zu erzeugen. Skelettmuskel ist auch das größte Stoffwechselorgan im Körper, das für> 80% postprandiale Glukoseaufnahme und regulierende Insulinreaktion und metabolische Homöostase 1 , 2 verantwortlich ist . Die Muskelphysiologie und der Stoffwechsel werden durch die zirkadiane Uhr, einen intrinsischen biologischen Timer 3 , 4 , 5 , 6, genau reguliert. Zum Beispiel führte die Skelettmuskelspezifische Deletion von Bmal1 , einer der Kern-zirkadianen Taktkomponenten , zu einer Insulinresistenz und einer verminderten Glukoseaufnahme im Skelettmuskel, und die Tiere wurden gefunden, um Typ-2-Diabetes 7 zu entwickeln . ichNeben der Skelettmuskulatur wird auch zunehmend ein endokrines Organ 8 geschätzt, das Myokine sekretiert, um den systemischen Stoffwechsel und die Physiologie zu regulieren. Mechanistische Studien sind erforderlich, um diese regulatorischen Funktionen im Skelettmuskel vollständig zu verstehen.
ChIP ist ein leistungsfähiger Ansatz zur Abgrenzung der Promotorrekrutierung von DNA-bindenden Proteinen. ChIP wurde ursprünglich entwickelt, um die Nukleosomenorganisation auf Chromatin-DNA 9 , 10 zu identifizieren. Es wurde bisher eine Vielzahl von Verfahren zur Vernetzung von Proteinen und Chromatin-DNA unter Verwendung von Formaldehyd, Dimethylsulfat oder Ultraviolettbestrahlung (UV) 11 , 12 beschrieben . Die Formaldehyd-Vernetzung ist die am häufigsten verwendete, konservierende Chromatinstruktur und DNA-Protein-Wechselwirkungen 9 , 13 , 14 . Vernetztes ChromatIn wird durch Beschallung zerkleinert und mit Antikörper gegen das jeweilige DNA-bindende Protein von Interesse 15 , 16 immunpräzipitiert. In den letzten Jahren wurde die ChIP-Sequenzierung (ChIP-seq), eine Methode, die ChIP mit NGS kombiniert, entwickelt, um die genomweite Transkriptionsfaktorbindung 17 zu untersuchen und in einigen Fällen die dynamischen Veränderungen über einen Zeitverlauf 18 , 19 , 20 zu überwachen . Zum Beispiel haben zirkadiane ChIP-seq-Studien eine hochorchestrierte Sequenz der genomischen Bindung von zirkadianen Taktkomponenten und Histonmarkern, die eine zeitlich präzise Genexpression während des gesamten 24h-zirkadischen Zyklus 18 antreibt.
Die meisten verfügbaren ChIP-Protokolle sind für Weichgewebe ( zB Leber, Gehirn, etc. ) konzipiert, und nur sehr wenige wurden für harte Gewebe einschließlich Skele veröffentlichtTal muskel Es ist technisch anspruchsvoll, den faserreichen Skelettmuskel zu homogenisieren und die hochwertigen Kerne 21 zu isolieren, insbesondere für ChIP-Experimente, die eine Vernetzung erfordern. In einer neueren Muskel-ChIP-Studie 22 wurden Satelliten-Zellen von Myofasern getrennt, und die Kerne wurden aus beiden Zelltypen durch ein verlängertes Verfahren mit Gewebeverdauung hergestellt. Der gesamte Prozeß dauerte etwa drei Stunden, bis die Formaldehyd-Vernetzung an isolierten Kernen durchgeführt wurde. Während dieses Verfahren eine vernetzte Muskelfaser vermeidet, die das Muskelgewebe für eine effiziente Homogenisierung noch widerstandsfähiger macht und in der Lage war, qualitativ hochwertige Kerne herzustellen, entsteht die signifikante Zeitverzögerung von der Gewebsansammlung zur Keimvernetzung das Risiko einer veränderten DNA -protein-interaktion Im Gegensatz dazu führten die meisten Studien eine Vernetzung unmittelbar nach der experimentellen Behandlung oder Gewebesammlung durch, um das Echtzeit-DNA-Protei zu erhaltenN Bindung 12 Ein zweiter Nachteil der Kerneisolation vor der Vernetzung besteht darin, dass sie zeitempfindliche Anwendungen wie zirkadiane Probensammlungen ausschließt, die typischerweise in Intervallen von 3 - 4 h auftreten. Ohne Vernetzung der Kerne muss die Isolierung unmittelbar nach der Sezierung erfolgen, während vernetzte Proben nach Beendigung des gesamten Zeitverlaufs zusammen verarbeitet werden können, so dass eine größere experimentelle Konsistenz gewährleistet ist.
Andere Protokolle für die Kernenisolation aus dem unvernetzten Skelettmuskel wurden ebenfalls berichtet. Zwei Studien beschreiben die Verwendung von Gradienten-Ultrazentrifugation, um Kerne von verbleibenden Myofibrillen und Zelltrümmern 23 , 24 zu trennen. Während die Saccharose- oder Kolloidgradienten-Ultrazentrifugation mit unvernetzten Muskelgeweben wirksam ist, zeigten unsere Experimente, dass nach der Vernetzung die Gradienten-Ultrazentrifugation die Kerne nicht von der Zelle d trennteEbris auf dem gradienten
Wir haben daher ein Verfahren entwickelt, um qualitativ hochwertige Kerne unter Verwendung von vernetzten Maus-Skelettmuskelgeweben zu isolieren. Statt der Gradienten-Ultrazentrifugation haben wir eine serielle Filtrationsmethode entwickelt, um die Kerne effektiv von Trümmern zu trennen. Nach der Ultraschallbehandlung wurden die Chromatinproben erfolgreich für ChIP-Studien angewendet, die ein zirkadianes Muster der BMAL1-Proteinbindung an Ziel-Promotoren zeigten. Unsere Methode kann breit auf verschiedene mechanistische Studien von Muskelgeweben anwendbar sein.
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Protocol
Die Tierpflege wurde unter den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) durchgeführt und die Verfahren wurden nach einem Tierprotokoll durchgeführt, das von der University of Texas Health Science Center in Houston genehmigt wurde.
1. Kernisolierung aus vernetzten Skelettmuskeln
- Wiegen und Hackfleisch-Skelettmuskel, isoliert von etwa 20 Wochen alten C57BL / 6 männlichen Mäusen, in eiskalter Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS), wie im Detail zuvor beschrieben.
HINWEIS: Wir erhalten in der Regel 1,0 - 1,5 g Skelettmuskel von einer Maus.- Legen Sie gehacktes Skelettmuskelgewebe in ein 50-ml-konisches Röhrchen mit 10 ml PBS auf Eis ein.
- Zentrifugieren bei 300 xg bei 4 ° C für 5 min.
- Den PBS-Überstand vorsichtig durch Aspiration entfernen.
- Schätzung des Pelletvolumens in jedem 50-ml-Röhrchen unter Verwendung von Referenzrohren mit 1, 2, 3 und 4 ml Wasser.
- 7 Bände hinzufügenEiskaltes 1% Formaldehyd in PBS und homogenisieren die Proben auf Eis unter Verwendung eines Sondengewebehomogenisators (siehe Tabelle der Materialien ).
HINWEIS: Optional: Die Homogenisierung kann in einem kalten Raum durchgeführt werden. - Vernetzen Sie die Probe durch Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min.
- Die Vernetzungsreaktion durch Zugabe von 1 M Glycin auf eine Endkonzentration von 0,125 m müngen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Die Proben bei 3.000 xg für 5 min bei 4 ° C zentrifugieren. Den Überstand über Aspiration entfernen.
- Spülen mit 10 ml eiskaltem Basenpuffer (10 mM HEPES-KOH bei pH 7,3, 10 mM EDTA, 10 mM KCl, 5 mM MgCl 2 , 0,5 mM DTT) mit frisch zugesetzten Protease-Inhibitoren (0,2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) , Und 10 & mgr; g / ml Leupeptin). Bei 3000 g 5 min bei 4 ° C zentrifugieren und den Überstand vorsichtig durch Absaugen entfernen.
- Das Pellet wird in 6 ml Lysepuffer (10 mM HEPES-KOH bei pH 7,3, 10 mM EDTA, 10 mM KCl, 5 mM MgCl 2 , 0,5 mM DTT, 1% Triton X-100) mit frisch zugesetzten Protease-Inhibitoren (0,2 mM PMSF und 10 μg / mL Leupeptin).
- Übertragen Sie die Probe auf einen vorgekühlten 15 ml Dounce-Homogenisator und inkubieren Sie für 10 min auf Eis. Bevorzugt homogenisieren Sie jede Probe auf Eis mit 15 langsamen Schlägen mit einer losen Stößel gefolgt von 15 Schlägen mit engen Stößel, um die Kerne freizugeben.
- Filtriere das Homogenat (6 ml) durch Zellsieb (Porengröße: 100 μm) und spüle mit 4 ml Lysepuffer. Die Proben bei 1000 xg für 10 min bei 4 ° C zentrifugieren. In 5 ml eiskaltes Basispuffer resuspendieren und 10 mal mit einer engen Pistille abgeben, um Kerne freizusetzen.
- Entfernen Sie ein Aliquot von 20 μl für die DNA-Konzentrationsmessung mit einem Spektrophotometer (OD260 / OD280) und mikroskopische Beobachtung mit Trypanblau, wenn nötig (siehe unten) ( Abbildung 1 A ).
- Filtriere die Suspension durchEin Zellsieb (Porengröße: 70 μm), spülen Sie das Röhrchen und filtrieren Sie erneut mit 2 mL Basispuffer wie oben.
- Wiederholen Sie die Filtration wie in Schritt 1.13 mit Zellsegmenten mit allmählich reduzierter Porengröße (40 μm, 30 μm, 20 μm und 10 μm).
HINWEIS: Insgesamt wurden in den Schritten 1.12-1.14 Siebe mit 6 Porengrößen verwendet. - Bei 1000 ° C bei 4 ° C für 10 min zentrifugieren Den Überstand entfernen und das Pellet in 500 μl Basispuffer resuspendieren.
- Messen Sie die DNA-Konzentration wie oben.
ANMERKUNG: Etwa 200 μg nukleäre DNA wurden aus der Kombination von beiden Hinterbeinen von einem Tier erhalten. Gegebenenfalls 20 μl für die mikroskopische Beobachtung mit Trypan-Blau-Färbung (Stammkonzentration 0,4%, 1: 5 Verdünnung); Die Kerne werden blau gefärbt ( Abbildung 1 B ). - Bei 1000 ° C bei 4 ° C für 10 min zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Pellets bei -80 ° C aufbewahren.
2. Sonikation
<Ol>HINWEIS: Ein Beispiel für die Bewertung der Ultraschall-Wirksamkeit ist in Abbildung 2 dargestellt .
3. Bewertung der Sonde und Quantifizierung
- Add 1.0Μl RNase A (500 U / mL RNase A: 20.000 U / ml RNase T1) zu den eingesparten 50 μl beschallten Proben und inkubieren für 30 min bei 37 ° C.
- Man gibt 8 μl Protease K (10 mg / ml) zu und inkubiert 30 min bei 55 ° C.
- Ernte die DNA unter Verwendung eines DNA Extraktionskits.
- Füge 5 Volumen Bindepuffer hinzu, wende sie auf Spinsäule auf und zentrifugiere bei 4.000 xg, 10 min.
- Tragen Sie den Durchgang auf die gleiche Säule und zentrifugieren Sie wieder.
- Waschen mit Waschpuffer zweimal bei 13.000 xg, 1 min.
- Zentrifugieren Sie erneut bei 13.000 xg, 1 min, um die Säule zu trocknen.
- 50 μl H 2 O zugeben und bei 13.000 xg, 1 min zentrifugieren, um DNA zu eluieren.
- Tragen Sie den Durchgang auf die gleiche Säule und zentrifugieren Sie wieder.
- Quantifizierung der DNA-Menge mit einem Spektrophotometer (OD260 / OD280). Führen Sie Proben auf 0,8% Gele aus, um die Größe und Menge (1 μg) der beschallten Produkte zu bewerten ( Abbildung 2 ).
HINWEIS: Die durchschnittliche Chromatinausbeute beträgt ca. ~ 20%.
4. ChIP
- Das zuvor gereinigte Chromatin bei -80 ° C auftauen und das Chromatin auf ~ 100 - 120 μg pro Röhrchen austauschen. Verdünnen Sie 1:10 mit Radioimmunopräzipitationstest (RIPA) -Puffer (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM NaF, 1 mM Na 3 VO 4, 1 mM PMSF, 1x Protease-Inhibitor-Cocktail (PIC), 0,1% Na-Desoxycholat W / v), 1% Triton X-100).
- Wenn es mehrere Proben in jeder Gruppe gibt, kombinieren Sie gleiche Mengen an Chromatin-DNA mit der Endmenge von ~ 100 - 120 μg / Probe. Sparen Sie 10% als Eingabe.
- Fügen Sie 40 μl (50% v / v Aufschlämmung in RIPA-Puffer) von BSA-vorblockierten (~ 2 h, 4 ° C) Protein A / G Agarose (Nicht-Huhn Antikörper) oder IgY Perlen (Chicken Antikörper) und inkubieren auf Ein Rotator für 3 h bei 4 ° C.
- Zentrifugieren Sie bei 1000 xg, 10 min und übergeben Sie den Überstand sorgfältig auf neue Röhrchen.
- Füge Antikörper bei 1 μg Antikörper pro ~ hinzu25 - 100 & mgr; g Chromatin-DNA.
- Bei 4 ° C über Nacht bei ca. 15 U / min leicht einwirken lassen.
- Füge 10 μl BSA-vorblockierte (~ 2 h, 4 ° C) Protein A / G Agarose (Nicht-Huhn Antikörper) oder IgY Perlen (Hühner Antikörper) Mischung und drehen im kalten Raum für 2 h.
- Waschen Perlen wie folgt. Mit 1 ml RIPA-Puffer für 3 min zweimal waschen, mit 1 ml hohem Salzpuffer (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% Triton X-100) für 3 min zweimal waschen , Mit 1 ml LiCl-Puffer (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 250 mM LiCl, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% Na-Desoxycholat, 0,5% NP40) für 3 min zweimal gewaschen.
- Mit 1 ml Tris-EDTA (TE) -Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA) für 3 min einmal abwaschen. Dann eluierte DNA mit Elutionspuffer (20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA und 0,5% SDS).
- Zentrifugieren bei 1.000 g, 1 min und vorsichtig den Überstand entfernen.
- Resaustieren Sie den Wulst mit 50 & mgr; l Elutionspuffer.
- Inkubieren für 10Min bei 65 ° C.
- Zentrifugieren bei 12.000 g für 5 min.
- Übertragen Sie den Überstand in ein neues Röhrchen, fügen Sie weitere 50 μl hinzu und zentrifugieren Sie noch einmal bei 12.000 g für 5 min. Das endgültige Elutionsvolumen beträgt 100 μl.
- Reverse Vernetzung und DNA-Elution.
- Inkubieren des eluierten Chromatins über Nacht bei 65 ° C.
- Man gibt 1,0 ul RNase A zu und inkubiert für 30 min bei 37 ° C.
- Man gibt 8 μl Protease K (10 mg / ml) zu und inkubiert 30 min bei 55 ° C.
- Ernte die DNA unter Verwendung eines PCR-Cleanup-Kits mit Elutionsvolumen bei 50 μL nach dem Protokoll des Herstellers.
- Analysieren Sie die Profile von Real-time qPCR wie zuvor beschrieben 25 , 26 .
HINWEIS: Die Primer-Sequenzen sind in Abbildung 3 Legende aufgelistet. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt ( Abbildung 3 ).
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Representative Results
Hier haben wir die Formaldehyd-Vernetzung unmittelbar nach der Gewebesammlung durchgeführt, um die DNA-Protein-Wechselwirkung in Echtzeit zu bewahren. Jedoch fanden wir, dass Saccharose oder kolloidaler Gradient, der üblicherweise für die Kerneisolation 23 , 24 verwendet wurde , bei der Trennung von Kernen von Myofibrillen (Daten nicht gezeigt) wirksam war. Der Grund mag sein, dass die Vernetzung eine ähnliche Schwerkraft für Kerne und Myofibrillen verlieh. Daher entwickelten wir ein serielles Filtrationsverfahren, um effektiv große Myofibrillen und andere Ablagerungen aus der Kernefraktion zu entfernen. Nach 100 μm Filtration gab es noch große Gewebeablagerungen und Myofibrillen ( Abbildung 1 A ). Im Vergleich dazu wurden am Ende der sequentiellen Filtration die meisten großen Gewebeablagerungen, intakten Zellen und großen Myofibrillen erfolgreich entfernt ( Abbildung 1 B ).
27 oder Maus-Embryonal-Fibroblasten (MEF) 28 verbessern kann, störte er in unserer Erfahrung die Beschallung von Skelettmuskelkernen und führte zu einem breiten Verschmieren Ineffektive sonication Unter Verwendung des aktuellen Protokolls mit sofortiger Beschallung nach Suspension in SDS-Lysepuffer beobachteten wir eine effiziente Ultraschallbehandlung mit Chromatin, die allmählich zyklusabhängig zerkleinert wurde und schließlich ~ 500 bp DNA-Fragmente produzierte ( Abbildung 2 ). Die Vorinkubation im Lysepuffer beeinträchtigte die Beschallungseffizienz nachweisbar.
BetrügenFeste die Qualität der Chromatinpräparation für ChIP, untersuchten wir die DNA-Bindung des zirkadianen Transkriptionsfaktors BMAL1, der bei Zeitgeberzeit (ZT) 6 bzw. ZT18 bzw. 18 , 29 Bindungspeak und Trog zeigte. Skelettmuskelproben von C57B / 6J-Mäusen wurden bei ZT6 und ZT18 gesammelt und Chromatinproben wurden wie oben hergestellt. Kurz nach der Beschallung wurden zerkleinerte Chromatinproben mit IgY-Kügelchen vorbereitet, die mit BSA vorblockiert worden waren, gefolgt von einer Inkubation mit anti-BMAL1-Antikörper bei 4ºC über Nacht. Nach der Elution und Reinigung von Chromatin haben wir RT-qPCR durchgeführt, um die BMAL1-Bindung an E-Box-Elementen von zwei Zielgenen Nr1d1 und Dbp 30 zu detektieren . Wir erkannten eine robuste Bindung von BMAL1 an die E-Box-Elemente bei ZT6 und eine minimale Bindung an ZT18 ( Nr1d1 : 0,452 ± 0,022 vs. 0,039 ± 0,002, Dbp -0,4: 0,627 ± 0,013 gegenüber 0,062 ± 0,009, Dbp+0,8: 0,176 ± 0,013 gegenüber 0,008 ± 0,001, Dbp +2,4: 0,466 ± 0,010 gegenüber 0,122 ± 0,014; Alle Werte sind Mittelwert ± SEM) ( Abbildung 3 ), Validierung des Protokolls für die zeitempfindliche Transkriptionsfaktor-Bindungsanalyse im Skelettmuskel.
Abbildung 1 : Sequentielle Filtration wirksam entnommene Tissue Debris. (A) Repräsentative Bilder, die Proben nach 100 μm Filtration zeigen. Große Gewebe- und Faserablagerungen werden beobachtet. (B) Repräsentative Bilder, die Proben nach serieller Filtration zeigen. Große Faserablagerungen wurden geräumt. Es werden nur isolierte Kerne und kleine Myofibrillenfragmente beobachtet. Bilder wurden mit einem Lichtmikroskop bei 10X, 20X und 40X Vergrößerungen aufgenommen. Maßstäbe werden auf der rechten Seite angezeigt.Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2 : Progressive Chromatin-Zerkleinerung durch 10 Zyklen der Sonikation. Zehn Zyklen der Beschallung mit verdauter Chromatin-DNA bis ~ 500 bp, wie in einem 0,8% Agarosegel offenbart, laufen bei 150 V für 60 min. Das rechte Panel zeigt eine niedrigere Ultraschallwirkung nach der Vorinkubation in eiskaltem SDS-Lysepuffer für 1 h an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
FiAbbildung 3 : Repräsentative qPCR Ergebnisse für BMAL1 ChIP mit Maus Skelettmuskelproben bei ZT6 und ZT18 gesammelt. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Dbp -0.4, +0.8 und +2.4 geben Orte der E-Box-Elemente auf dem Dbp- Gen an. NC: Negativkontrolle mit IgY. Das zeitliche Muster der BMAL1-Bindung stimmt mit den bisherigen Ergebnissen überein, die den BMAL1-Bindungspeak um etwa ZT6 18 zeigen . Die Vorwärts- und Rückwärtsprimer sind wie folgt. Rev-erba: 5'-GTAGACTACAAATCCCAACAATCCTG und 5'-TGGAGCAGGTACCATGTGATTC; Dbp -0,4: 5'-ACACCCGCATCCGATAGC und 5'-CCACTTCGGGCCAATGAG; Dbp +0,8: 5'- ATGCTCACACGGTGCAGACA und 5'- CTGCTCAGGCACATTCCTCAT; Dbp +2.4: 5'- TGGGACGCCTGGGTACAC und 5'-GGGAATGTGCAGCACTGGTT. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Hier beschreiben wir eine robuste Methode, bei der vernetzte Skelettmuskelgewebe verwendet wurden, um qualitativ hochwertige Kerne zu isolieren. Eine sequenzielle Filtration wurde durchgeführt, um die Kerne effektiv von Trümmern zu trennen, und die akustische Ultraschall-Energie aus dem schalenförmigen Wandler scherte das Chromatin für die ChIP-Analyse. Die Ergebnisse zeigten eine zirkadiane zeitspezifische Bindung von BMAL1 an Zielpromotoren.
ChIP kann verwendet werden, um Echtzeit-Protein-Belegung auf genomische DNA zu erfassen, wenn Quervernetzung stattfindet. Um dieses Potenzial auszunutzen, zielten wir darauf ab, eine Methode zu entwickeln, um die Vernetzung des Skelettmuskels zum Zeitpunkt der Gewebedissektion zu ermöglichen und die Keimisolation ohne Gradienten-Ultrazentrifugation zu rationalisieren. Aufgrund der Schwierigkeit, den faserreichen Skelettmuskel im Vergleich zu weichen Geweben wie Leber zu homogenisieren, haben wir das Muskelgewebe in eiskaltem PBS gehackt und dann die Probe in einem Formaldehydpuffer homogenisiert. Nach dem Abschrecken, Gewebe Suspension waS zentrifugiert und mit eiskaltem Basispuffer gespült, um den restlichen Formaldehyd auszuspülen. Nuklei wurden durch Dounce-Homogenisierung freigesetzt, und die Homogenate wurden nacheinander filtriert, um allmählich Zelltrümmer und Myofibrillen zu entfernen. Wir haben die Filtrationsreihe entwickelt, um die Filterverstopfung zu minimieren, die die Ausbeute nachteilig beeinflussen könnte. Nur sehr kurze Myofibrillen blieben, als die sequentielle Filtration abgeschlossen war.
Die Beschallungs- und ChIP-Prozeduren wurden von einem vorherigen Bericht 12 mit Modifikationen einschließlich Ultraschallzeitpunkt und SDS-Puffermenge angepasst. Der schalenförmige Sonicator ermöglicht die Exposition gegenüber zentraler Ultraschallwelle für Proben in Glasfläschchen in einem kalten Wasserbad. Im Vergleich zu Sonden-Sonicatoren steuert dieser Ultraschallgerät die Probentemperatur, um eine Überhitzung zu vermeiden, und verhindert auch eine Proben-Kreuzkontamination. Wenn Sondenschallgeber verwendet werden, müssen optimale Beschallungsbedingungen empirisch bestimmt werden. Wir haben auch die amoun reduziertT SDS-Puffer, da die Ausbeute an Muskelchromatin niedriger ist als in der Leber 12 . Mehrere Protokolle 28 , 31 , 32 umfassen die Inkubation auf Eis oder bei Raumtemperatur vor der Beschallung. Doch in unserer Erfahrung hat die Vorinkubation auf Eis nicht die Ultraschall-Effizienz verbessert. In der Tat wurde in einigen Fällen die Beschallung kompromittiert. Es ist möglich, dass restliche Myofibrillen die Chromatin-DNA während der Inkubation und der abgeschwächten Ultraschall-Wirksamkeit verstrickt haben. Mit sofortiger Beschallung nach Keimsuspension im SDS-Lysepuffer gelang es uns, eine progressive Chromatin-Fragmentierung mit zunehmenden Ultraschallzyklen zu erhalten ( Abbildung 2 ).
Wir bestätigten die Qualität von Chromatin mit ChIP qPCR. Wie in Fig. 3 gezeigt , war die BMAL1-Promotorbelegung bei ZT6 robust und bei ZT18 minimal, im Einklang mit dem zuvor gezeigten BMAL1 circaDian Promotorbindung 18 Dieser funktionelle Assay bestätigte die Qualität von Kernen und Chromatin. In den letzten Jahren eröffnete die rasante Entwicklung in NGS einen neuen Horizont für die ChIP-Applikation, wo ChIP-seq die genomische Bindung mit hoher Empfindlichkeit quantitativ abfragen kann. Besonders für ChIP-seq sind qualitativ hochwertige Kerne und Chromatine erforderlich, um die Protein-DNA-Wechselwirkung konsequent zu erfassen. Das hier beschriebene Verfahren kann eine wertvolle Ressource für ChIP-seq-Studien unter Verwendung des Skelettmuskels darstellen. Die ChIP-seq-Bibliotheksvorbereitung erfordert zusätzliche Maßnahmen zur Verbesserung der Signalauflösung, wie z. B. PAGE-basierte Größenauswahl 18 .
Abschließend haben wir ein filtrationsbasiertes Protokoll entwickelt, um qualitativ hochwertige Kerne aus vernetzten Skelettmuskeln herzustellen. Wir entfernen die Notwendigkeit für die Ultrazentrifugation, so dass es leicht anwendbar ist. Zusätzlich zu ChIP für Gene von Interesse, die Kerne und Chromatin prWie beschrieben, kann breit auf ChIP-seq-Studien anwendbar sein.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken Karyn Esser, Nobuya Koike und Noheon Park für hilfsbereite Beratung. Diese Arbeit wurde zum Teil von NIH / NIGMS (R01GM114424) an S.-HY und der Robert A. Welch Foundation (AU-1731) und NIH / NIA (R01AG045828) an ZC unterstützt
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Fisher Scientific | 15250061 | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| Protease K | Sigma Aldrich | 3115887001 | |
| Chicken Anti-BMAL1 antibody | Generated in chicken (Cocalico Biologicals) against antigen aa 318 - 579, and IgY was affinity purified using the same antigen. | ||
| Chicken IgY Precipitating Resin | GenScript | L00405 | |
| Equipment | |||
| KINEMATICA Polytron PT2100 Benchtop Homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-178 | |
| 15 mL Dounce tissue grinder | Whearton | 357544 | |
| Falcon Cell Strainers 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| Falcon Cell Strainers 70 µm | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Falcon Cell Strainers 40 µm | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| pluriStrainer 30 µm | PluriSelect | 43-50030-03 | |
| pluriStrainer 20 µm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| pluriStrainer 10 µm | PluriSelect | 43-50010-03 | |
| Covaris S2 Focused-ultrasonicator | Covaris | Model S2 | |
| Labquake | Thermo Scientific | C415110 | |
| CCD Microscope Camera | Leica Microsystems | DFC3000 G | |
| Reagent Kit | |||
| DNA extraction kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| Buffers | |||
| All buffer components are discribed in the protocol. Each component was purchased from Sigma Aldrich |
References
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