Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Modellering Amyloid-β42 giftighet og Neurodegeneration i voksen sebrafisk hjernen

Published: October 25, 2017 doi: 10.3791/56014
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 3, 2, 1,3
1German Centre for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Dresden within Helmholtz Association, 2B CUBE, Center for Molecular Bioengineering, Technische Universität Dresden, 3Center for Regenerative Therapies Dresden (CRTD), TU Dresden

Summary

Denne protokollen beskriver syntese, karakterisering og injeksjon av monomerisk amyloid-β42 peptider for generering av amyloid toksisitet i voksen sebrafisk å etablere en Alzheimers sykdom modell, etterfulgt av histologiske analyser og påvisning av samlinger.

Abstract

Alzheimers sykdom (AD) er en ødeleggende nevrodegenerative sykdommer som opphopning av giftige amyloid-β42 (Aβ42) peptider fører til synaptic degenerasjon, betennelse, neuronal død, og lære underskudd. Mennesker kan ikke generere tapt neurons i AD delvis på grunn av nedsatt proliferativ kapasitet av nevrale stammen/stamfar celler (NSPCs) og redusert neurogenesis. Derfor effektiv regenerativ Therapy også burde styrke spredning og neurogenic NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) er en regenerativ organisme, og vi kan lære grunnleggende molekylær programmene som vi kunne utforme terapeutiske metoder å takle AD. Derfor var generering av en annonse som modell i sebrafisk nødvendig. Med vår metodikk, kan vi introdusere syntetiske derivater av Aβ42 peptid med vev gjennomtrengende evnen til voksen sebrafisk hjernen og analysere sykdom patologi og regenererende svaret. Fordelen over eksisterende metoder eller dyremodeller er at sebrafisk kan lære oss hvordan virveldyr hjernen kan naturlig regenerere, og dermed hjelpe oss å behandle menneskelige nevrodegenerative sykdommer bedre av målretting endogene NSPCs. Derfor åpne amyloid-toksisitet modellen i voksen sebrafisk hjernen nye muligheter for forskning i nevrovitenskap og klinisk medisin. I tillegg gir enkel utførelsen av denne metoden for billig og effektiv eksperimentelle vurdering. Dette manuskriptet beskriver syntese og injeksjon av Aβ42 peptider i sebrafisk hjernen.

Introduction

Annonsen er en kronisk progressiv sykdom preget av tapet av nevroner og synapser i hjernebarken1,2,3,4,5. Klassisk neuropathological kjennetegnene av Annonsen er avsettelse av amyloid peptider og dannelsen av den neurofibrillary floker (NFTs)6. Senil plaketter, også kjent som amyloid plaques, består av amyloid-β (Aβ) peptider som danner β-pleated strukturer i hjernen parenchyma5. Oppsamling av Aβ42 i Annonsen pasienter har en tidlig og kritisk rolle i sykdomsprogresjon. AD utløser en kaskade av hendelser som førte til synaptic dysfunksjon, svekket plastisitet og neuronal tap7,8,9,10.

Voksen hjerne teleost sebrafisk fungerer som en utmerket modell å studere regulering av stilk cellen plastisitet11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20 og ulike sykdommer i sentralnervesystemet (CNS), inkludert AD21,22,23 ,24. På grunn av en lang rekke eksperimentelle metoder for tilgjengelig19,20,25,26,27,28,29, 30 , 31, disse studiene er informativ og gjennomførbart. Sebrafisk kan fylle CNS13,15,32,33,34,35,36,37, 38, delvis ved hjelp av molekylære programmer aktivert etter neuronal tap19,39,40,41,42,43, 44. Derfor kan etablere en neurodegenerative sykdom modell i sebrafisk hjelpe adresse roman spørsmål angående regenerativ evne og stamcelleforskningen biologi i virveldyr hjernen.

Nylig har utviklet vi en amyloid toksisitet modell i voksen sebrafisk hjernen ved å injisere syntetisk Aβ42 peptider (tabell 1)39. Denne injeksjon forårsaket neurodegeneration fenotyper minner om menneskelige hjerne patologi (f.eks, celledød, microglial aktivisering, synaptic degenerasjon og minne underskudd), som indikerer at sebrafisk kan brukes for fremlokkende neurodegeneration i sebrafisk hjernen, Aβ42 peptider kan oppdages med immunohistochemical stainings og molekylære mekanismer av gjenfødelse voksen sebrafisk CNS kan bli identifisert39. Denne protokollen viser vi injeksjon av syntetiske amyloid peptider i sebrafisk hjernen med en cerebroventricular injeksjon (CVMI) metoden27,39,45,46 å etterligne amyloid avsetning (figur 1). CVMI gir en ny måte å levere peptidene som samlet ved injeksjon som β arks strukturer og utøve toksisitet. Peptidene er jevnt fordelt i hele hjernen, målretting ventrikkel området langs hele rostro-caudal aksen45. I tillegg gir denne metoden for å analysere NSPCs i voksen sebrafisk hjernen etter amyloid Inneslutninger morfologiske og molekylære svar. Slike studier vil gi oss innsikt for vellykket hjernen reparasjon i pattedyr. Vår metode kan brukes å forstå nødvendig molekylær mekanismen for vellykket gjenfødelse svar etter AD-lignende symptomer å indusere påfyll av tapt neurons og funksjonelle utvinning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

denne protokollen er en standard prosedyre foreslått av EU retningslinjene (2010/63) og European Society for fisk modeller i biologi og medisin (EuFishBioMed) i Karlsruhe Insitute av teknologi (KIT). Alle metodene beskrevet etter her er godkjent av etikk commission (Landesdirektion Dresden, bilagsnummer TVV-52/2015).

1. forberedelse av Aβ42 peptid

  1. syntetisere peptider (se tabell 1) standard 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) kjemi med 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3- tetramethyluronoiumhexafluorphosphate (HBTU) som kobling reagensen på en automatisert solid-fase peptid synthesizer 52. Omfanget av syntesen var 100 µmol.
  2. Laster en automatisert peptid synthesizer med 500 mg av Fmoc-beskyttet harpiks som solid fasen (lasting kapasitet på 0,2 mmol/g). Laste oppløst Fmoc-beskyttet aminosyrer i en konsentrasjon 0,5 M i volumet kreves og som beregnet for respektive synthesizeren.
    Merk: Beregningene gjøres aktivere koblingen av aminosyre hver Fmoc-beskyttet to ganger med 5 ganger overskudd av hver byggestein for harpiks 47.
  3. Løses nødvendig reagensene peptid syntese i dimethlyformamide (DMF). For eksempel Forbered aktivatoren, HBTU, i en konsentrasjon av 0,48 M, 45% v/v N-Methylmorpholine (NMM) (base) og 5% v/v eddiksyre (lokkpåsettingsmaskiner blandingen) cap ikke reagerte amino gruppene.
  4. Cleave alle peptider fra harpiks ved å blande kontinuerlig solid støtte bruker en agitator i en nylaget cleavage blanding bestående av Trifluoroacetic syre (TFA): Triisopropylsilane(TIS): vann: Dithiothreitol (DTT) på 90 (v/v): 5 (v/v): 2,5 (v/v): 2.5 (m/v), for 4 h. bruker 10 mL for syntese omfanget av 100 µmol.
  5. Utløse cleaved produktet ved å legge cleavage blandingen til 100 mL iskalde diethyl ether. Passere gjennom en filtrering enhet som inneholder filtere Polytetrafluoroethylene (PTFE) med en porestørrelse på 0,45 µm og vask med 20 mL iskalde diethyl ether.
  6. Samle den filtrerte peptid filter papir og oppløse 100 mg av utfelt peptid i 5 mL destillert deionisert vann: acetonitrile på 1:1.
  7. Rense via omvendt-fase høytrykks flytende kromatografi (HPLC) på en semi preparative HPLC utstyrt med en porøs polystyren divinylbenzene kolonnen bead størrelse 10 µm.
    1. Forvarm kolonnen og vedlikehold ved 50 ° C bruker en kolonne oppvarming enhet. Samle alle store fraksjoner bruker en automatisert brøkdel kollektoren ved å bruke en gradering fra 5% til 100% løsemiddel B over 25 min på 4 mL/min.
      Merk: Løsemiddel A er 0,1% TFA i vann og løsemiddel B er 0,1% TFA i acetonitrile 52.
    2. Overvåke chromatogram på 220 nm, samle inn de aktuelle toppene og analysere ved hjelp av LC-MS.
  8. Bekreft renheten av analytiske omvendt fase ultrahøy press flytende kromatografi (UPLC) på 220 nm ved å overvåke med en UV-detektor mens bestått prøven gjennom en analytisk C18 kolonne (bead størrelse 1.7 µm). Bekreft peptid produktet massespektrometri.
    Merk: UPLC er koblet til en electrospray ionization massespektrometri (ESI-MS) og Tandem Quadrupole detektoren.
  9. Lyophilize riktig fraksjoner av den ønskede peptid i en rund bunn kolbe, ved å bruke et vakuum av 0.052 mbar, en lun pulver. Par vakuumpumpe til en frysing enhet opprettholdt på-78 ° C. butikken på-80 ° C, uendelige.
  10. Bruk av lyofilisert peptid til å forberede en lagerløsning 1 mm i en blanding av acetonitrile: DMF: analytisk klasse vann på 1:1:1 for eksperimenter. Denne løsningen kan lagres i minst 6 måneder, som peptidene ikke samler i denne løsningen.

2. Utarbeidelse av injeksjon blandingen

  1. forberede fosfat-bufret saltvann (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7.4) fortynne lyofilisert peptidene.
  2. Løses peptid til en siste konsentrasjon på 20 µM i PBS. Klargjør denne løsning frisk. Bland godt og lagre på is til injeksjon. Ikke overstige 30 min for å hindre samling i løsning.

3. Anestesi

  1. forberede lager løsning av anestesi, 0,1% etyl-m-aminobenzoate methanesulphonate (MESAB), i vanlige fisk vann fra circulating systemet. Forberede anaesthetization løsningen på en siste konsentrasjon av 0.0025% (v/v).
  2. Fjerne ønsket antall fisk fra sine tanker i en transport beholder med 5 L system vann.
  3. Halvdupleks fylle en plast Petriskål (90 mm) med 40 mL bedøvelse. Bruk denne parabolen for injeksjoner.
  4. Ruge fisken bedøvelse før den opercular bevegelsen har opphørt.

4. Cerebroventricular Microinjection

  1. utarbeidelse av injeksjon apparater
    1. forberede glasset injeksjon kapillærene med en nål avtrekker med følgende parametere: oppvarming syklus, 537 trekke syklus, 250; hastighet, 1.5 s; gang, 80 ms.
    2. bringe trykkinnstilling på trykket kilde til 25 psi.
    3. Angi microinjector parametere til følgende: hold trykk 20 psi, kaste ut press 10 psi, Periodeverdien 2.5; gating verdien 100 ms.
    4. Last glasset kapillær med injeksjon løsning. Inn microinjection innehaver av glass kapillær. Justere injeksjon vinkelen til 45°.
      Merk: Nærmere protokoller kan bli funnet som beskrevet i referanser 27 , 46.
  2. Sted en fisk i en ny Petriskål fylt med anaesthetization løsning (som trinn 3.3).
  3. Holde fisken med tang og orientert for injeksjon.
  4. Genererer et slit med spissen av en 30 G nål i skallen over fiberoptisk tectum der de to laterale platene møtes. Setter ikke inn spissen i hjernevevet, dette ville føre til blødning og skade. Se referanser 27 , 45 , 46 for ytterligere informasjon.
  5. Av glass kapillær inn slit.
    1. Bruker bare spissen av nålen og trenge gjennom ikke tykkere enn 1 mm gjennom skallen. Hold inne fisken og stikk glasset kapillær via webområdet snitt.
    2. Plasser tuppen av glasset kapillær mot telencephalon i 45° vinkel. Injisere 1 µL av løsningen. Væsken sprer umiddelbart etter injeksjon.

5. Recovery

  1. sted fisken tilbake til en transport beholder før den kommer. Koble beholderen til regelmessig sirkulerende fisken vann for å sikre optimal vannkvalitet.
    Merk: Utvinning bør normalt ta 1 min. Hvis den tar lengere, fisken må holdes i bedøvelse i kortere tid (dette må optimaliseres ved eksperimentator).

6. Vev forberedelse og Sectioning

  1. venter en ønsket tidsperiode før ofre fisken.
    Merk: Dette avhenger eksperimentelle spørsmålet. Amyloid deponering kan sees så tidlig som en dag etter injeksjon.
  2. Ofre fisken bruke fremgangsmåten avhengig av etiske regelverket (f.eks behandle fisken med 0.1 M MESAB).
  3. Klippes skallen over fiberoptisk tectum med spiss tang på dorsal side og dissekere hodet bare bak pectoral fin ved hjelp av en skalpell.
  4. Fikse hodet med 2% paraformaldehyde (PFA) overnatter i 4 ° C. Bruk 3 mL av PFA per hode i et plastrør med skruen lokk.
    FORSIKTIG: Bruke riktig personlig verneutstyr når du håndterer PFA.
  5. For cryoprotection og Avkalking, vaske hoder tre ganger i 0.1M fosfatbuffer (pH 7.4), deretter overføre dem til 20% sucrose/20% ethylenediaminetetraacetic (EDTA) løsning og ruge over natten på 4 ° C.
  6. Legge inn vevet i snitting harpiks, fryse hoder i 7,5% gelatin/20% sucrose løsning i plast histology mugg på tørris (ca 3-5 min fryse en blokk). Lagre prøver-80 ° c eller fortsette til neste trinn (og kryosnitt).
  7. Delen hodene til 12 µm tykk cryosections bruker en kryostaten som beskrevet 28 , 42. Overføre cryosections direkte på glass lysbilder og lagre på 20 ° C for langsiktig bruk.

7. Immunohistochemical flekker og mikroskopi

Merk: utføre alle inkubasjon trinnene i en fuktet kammer. Og alle vask skritt er for 10 min.

  1. Tørr delene i 30 min ved romtemperatur. Tine, vaskes delene to ganger på PBS og en gang i PBSTx (PBS 0,03% Triton-X-100).
  2. Incubate med det primære antistoffet (anti-Aβ42 antistoff, 1:500 fortynning i PBSTx) 4 ° C over natten etter dag, vask en gang i PBS og dobbelt PBSTx.
  3. Ruge avsnittene med sekundær antistoffer (fluorescens-kombinert gjenkjenning, 1:500 fortynning) med DAPI (1 μg/mL) i PBSTx for 2 timer ved romtemperatur.
  4. Vask tre ganger i PBSTx. Etter siste vask, montere lysbildene med en dekkglassvæske med 100 μL 70% glyserol.
  5. Hent fluorescerende bilder ved hjelp av en AC confocal mikroskop (for eksempel med 20 X PL APO N.A. 0,7 målet med 488 eksitasjon utvalg og en standard grønne filter; figur 2) 39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HPLC ble brukt til å rense den syntetiserte peptid og massespektrometri har blitt brukt til å beskrive renset amyloid β peptidene. Kolonnen HPLC ble oppvarmet til 50 ° C å forbedre separasjon av Aβ-peptider og alle fraksjoner ble samlet. For å identifisere det korrekt syntetisert peptid, ble masse spectroscopy analyse utført for alle fraksjoner. UPLC-chromatogram viser renheten av sammensatte. HPLC brøken som ga en topp på UPLC (dvs., riktig massen lade forholdet mellom den nødvendige amyloid β peptid) ble ytterligere behandlet for eksperimenter (figur 2).

Funksjonaliteten av peptider i forming aggregater kan vurderes ved hjelp av ulike spektroskopiske metoder39,48,49, og også av rugende peptider i PBS ved romtemperatur for mer enn 1 h, som vil gi aggregat. I dette tilfellet bør precipitates og store mengder sees i løsningen.

Etter cerebroventricular microinjection samle peptidene i hjernen og skjemaet amyloid avsetninger (Figur 3). Disse aggregater er hovedsakelig sett som intracellulær depositions, men også rundt blodkar. Slike samlinger finnes en vellykket akkumulering av amyloid peptider i vevet.

Figure 1
Figur 1: skjematisk fremstilling av det peptid syntese, rensing, injeksjon og analyser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: karakterisering av innfødte amyloid-β42 peptid. Massespektrometri karakterisering av innfødte amyloid-β42 peptid (A) og CPP-merket amyloid-β42 peptid (TR-Aβ42; B). (C) chromatograph av det renset, native og TR-Aβ42 peptid på Ultra-high press flytende kromatografi (UPLC). X-axes betegne masse-til-lade forholdet (m/z) (A, B) og elueringsrør tiden i minutter (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Immunohistochemical flekker amyloid program i en voksen sebrafisk hjernen del 1 dag etter injeksjon. Aβ42 er i grønt, og kjerner er i blått. Påvisning av grønne klynger angir effektiv Aβ42 aggregering. Skalere barer = 100 µm. Dette tallet er endret fra referanse39.

Peptid Peptid sekvens MW (g/mol)
AΒ42 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA 4514.1
ST-AΒ42 GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKILDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA 5919.8

Tabell 1: Aβ42 og TR-Aβ42 peptid sekvenser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Amyloid peptidene kan endres for å inkludere sekvens variasjoner eller ulike koder. For eksempel, en kryptert amyloid peptid kan genereres og peptidene kan være merket med fluorescerende koder på N-terminus peptid slutten eller merket med transportør peptider39. Tilsvarende i denne protokollen er bærer peptid i celle-gjennomtrengende peptid TR på grunn av effektiviteten til transport Last dypt i hjernen vev39. I tillegg gir vår metode for injeksjon og analyser av ulike peptider som kan forårsake giftig samlinger50,51. Derfor tilbyr systemet en allsidig metode for manuell injeksjon av giftige proteiner i sebrafisk hjernen og analysere mobilnettet effektene av slike toksisitet.

Amyloid peptider samlet raskt, og derfor aksjer må holdes i vann-DMF-acetonitrile løsningen, og skal blandes med PBS bare 0,5 h før injeksjon. Hvis det er store mengder i løsningen, bør injeksjon løsningen være forberedt bare 10 min før injeksjon. Injeksjonseffektiviteten er en viktig parameter for gir konsistente resultater. Se vår tidligere JoVE papir46 for å utføre en god og konsekvent injeksjon. Hvis ingen samling er sett etter injeksjon, må metoden innsetting optimaliseres.

Vår metode er begrenset i forhold til størrelsen på molekylene skal injiseres. Vi viste tidligere at plasmider eller korte oligomers kan tas effektivt av ventrikkel celler45,46, men for effektiv levering i dypt hjernen vev, store molekyler (f.eks, antistoffer, store proteiner) kan ikke brukes. I tillegg kan lipofile molekyler ikke lett trenge dypt vev fordi slike molekyler vil være sequestered av første par lag med ventrikkel celler.

Generering av musen modeller av neurodegeneration er tidkrevende og vedlikehold av disse modellene er ganske dyrt. Våre injeksjon metoden er en rask modell for giftige amyloid avsettelse og neurodegeneration. I tillegg til sebrafisk har en overlegen regenerativ evne sammenlignet pattedyr modeller og undersøkelser med fokus på hvordan virveldyr hjernen kunne montere gjenfødelse svar etter neurodegeneration vil sikkert ha nytte av raske analysen systemer i sebrafisk.

Kvaliteten på den syntetiserte peptid og sin renhet er viktig for suksessen av eksperimentet. For å sikre denne kvaliteten, må syntetisert peptider være grundig preget med flytende kromatografi og masse spectroscopy. I tillegg foreslås sirkulære dichroism og aggregering studier som beskrevet39 .

Injeksjon i fisk hjernen er et kritisk steg å sikre en konsekvent aggregering og patologisk resultat. En langtidsstudie som analyserer aggregering og klarering dynamikken av amyloid peptider kan utføres, om ønskelig. Vi bruker en amyloid peptid koplet til en transportør peptid for å sikre lik distribusjon og gjennomtrengning i hjernevevet. Montert amyloid peptider gir samme resultat, men tidslinjen i distribusjon og aggregering er forskjellige39. Eksperimentator kan velge den ønskede versjonen av amyloid peptider avhengig av målet.

Det er stort potensial for bruk av vår metode i kombinasjon med andre manipulasjon studier. CVMI av amyloid peptider kan kombineres med medikamentelle behandlinger eller injeksjon av andre forbindelser å teste synergieffekter av ulike molekyler i en sykdom tilstand. Til slutt, vår raske og romanen modell kan også brukes for småskala narkotika-screening tilnærminger i et enkelt laboratorium.

Vår manuell microinjection metode kan effektivt brukes til å injisere amyloid peptider i voksen sebrafisk hjernen å etterligne amyloid deponering. Amyloid depositions på hjernen framprovosere cytotoksiske virkning og resultater i AD patologi, derfor vise en akutt nevrodegenerative tilstand. Fremtidige utsikter for denne metoden ville være å bruke den i en akutt degenerative modell å studere neuropathology i sebrafisk hjernen og regenererende svaret dertil. Slik forståelse vil gi en viktig plattform for å designe nye strategier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av DZNE og Helmholtz Association (VH-NG-1021), CRTD, TU Dresden (FZ-111, 043_261518) og DFG (KI1524/6) (ck); og av Leibniz Association (så-2011-IPF-2) og BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). Vi vil også gjerne takke Ulrike Hofmann for peptid syntese og Nandini Asokan, Prayag Murawala og Elly Tanaka for hjelp under filmingen prosedyren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fmoc-protected amino acids IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS)
N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU) IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) RL-1030 Activator
Oxyma IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) RL-1180 Racemization supressor
N,N-Diisopropylethylamine IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) SOL-003 Base
Dimethylformamide IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany) SOL-004 Solvent
N-Methylmorpholine Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany A12158 Base
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA) 157260 ALDRICH Activator
Piperidine MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 822299 Fmoc deprotection reagent
Dichlormethane (DCM) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 106050 Solvent
Formic acid (FA) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 100264 Buffer component for HPLC
Trifluoroacetic acid (TFA) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 808260 Clevage Mixture reagent
Triisopropylsilane(TIS) MERCK KGaA (Darmstadt, Germany) 233781 ALDRICH Clevage Mixture reagent
Acetonitrile (for UPLC/LCMS) Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH 34967-1L Solvent
Acetonitrile (for HPLC) VWR International Ltd, England 83639.320 Solvent
Diethylether VWR International Ltd, England 23811.326 Solvent for peptide precipitation
Dithiotritol (DTT) VWR International Ltd, England 0281-25G Clevage Mixture reagent
TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany) S30023 Solid phase for SPPS
Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters Intavis AG (Cologne, Germany) 34.274 Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase
Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter Sartorius Stedtim (Aubagne, France) 11806-50-N Filteration of precipitated peptides
Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe KC78.1 Pre-filteration for HPLC
Peptide Synthesizer Intavis, Cologne, Germany ResPep SL Automated solid-phase peptide synthesizer
Water Alliance HPLC Waters, Milford Massachusetts, USA Waters 2998, Waters e2695 Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC)
PolymerX, bead size 10μm, 250x10 mm Phenomenex Ltd. Germany 00G-4328-N0 Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column
Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA LCPAK0001 Water purification system
Filtration Unit Sartorius Stedtim (Aubagne, France) 16307 Filtration unit for peptide precipitation
UPLC Aquity with UV Detector Waters, Milford Massachusetts, USA M09UPA 664M Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS
ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 μm, 50x2.1 mm Waters, Milford Massachusetts, USA 186002350 Analytical C18 column
ACQUITY TQ Detector Waters, Milford Massachusetts, USA QBB908 Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS)
CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6 Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany 16706, 101542 Lyophilizer with vaccum pump
Paradigm plate reader Beckman Coulter
MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate) Sigma-Aldrich A5040
Petri dishes Sarstedt 821.472
Phosphate-buffered saline Life Technologies, GIBCO 10010-056
Needle Becton-Dickinson 305178
Dissecting microscope Olympus, Leica, Zeiss Varies with the manufacturer
Dumont Tweezers World Precision Instruments 501985
Gillies Dissecting Forceps World Precision Instruments 501265
Glass injection capillaries World Precision Instruments TWF10
PicoNozzle World Precision Instruments 5430-12
Pneumatic PicoPump World Precision Instruments SYS-PV820
Ring illuminator; Ring Light Guide Parkland Scientific ILL-RLG
Cryostat Leica CM1950

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. LaFerla, F. M., Green, K. N. Animal models of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
  2. Selkoe, D. J. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev. 81 (2), 741-766 (2001).
  3. Serpell, L. C. Alzheimer's amyloid fibrils: structure and assembly. Biochim Biophys Acta. 1502 (1), 16-30 (2000).
  4. Beyreuther, K., Masters, C. L. Alzheimer's disease. The ins and outs of amyloid-beta. Nature. 389 (6652), 677-678 (1997).
  5. Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120 (3), 885-890 (1984).
  6. Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. Alzheimer's disease. Lancet. 368 (9533), 387-403 (2006).
  7. Hardy, J. The amyloid hypothesis for Alzheimer's disease: a critical reappraisal. J Neurochem. 110 (4), 1129-1134 (2009).
  8. McGowan, E., et al. Abeta42 is essential for parenchymal and vascular amyloid deposition in mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
  9. Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297 (5580), 353-356 (2002).
  10. Tincer, G., Mashkaryan, V., Bhattarai, P., Kizil, C. Neural stem/progenitor cells in Alzheimer's disease. Yale J Biol Med. 89 (1), 23-35 (2016).
  11. Diotel, N., et al. Effects of estradiol in adult neurogenesis and brain repair in zebrafish. Horm Behav. 63 (2), 193-207 (2013).
  12. Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223 (1-2), 131-147 (2013).
  13. Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).
  14. Diotel, N., et al. Cxcr4 and Cxcl12 expression in radial glial cells of the brain of adult zebrafish. J Comp Neurol. 518 (24), 4855-4876 (2010).
  15. Zupanc, G. K. Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the brain of teleost fish. J Physiol Paris. 102 (4-6), 357-373 (2008).
  16. Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).
  17. Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Dev Biol. 295 (1), 263-277 (2006).
  18. Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).
  19. Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
  20. Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
  21. Santana, S., Rico, E. P., Burgos, J. S. Can zebrafish be used as animal model to study Alzheimer's disease? Am J Neurodegener Dis. 1 (1), 32-48 (2012).
  22. Newman, M., Verdile, G., Martins, R. N., Lardelli, M. Zebrafish as a tool in Alzheimer's disease research. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 346-352 (2010).
  23. Paquet, D., et al. A zebrafish model of tauopathy allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation. J Clin Invest. 119 (5), 1382-1395 (2009).
  24. Xi, Y., Noble, S., Ekker, M. Modeling neurodegeneration in zebrafish. Curr Neurol Neurosci Rep. 11 (3), 274-282 (2011).
  25. Barbosa, J. S., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 348 (6236), 789-793 (2015).
  26. Dray, N., et al. Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche. Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).
  27. Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), e27395 (2011).
  28. Chapouton, P., Godinho, L. Neurogenesis. Methods Cell Biol. 100, 73-126 (2010).
  29. Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
  30. McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), (2016).
  31. Mokalled, M. H., et al. Injury-induced ctgfa directs glial bridging and spinal cord regeneration in zebrafish. Science. 354 (6312), 630-634 (2016).
  32. Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Dis Model Mech. 5 (2), 200-209 (2012).
  33. Fleisch, V. C., Fraser, B., Allison, W. T. Investigating regeneration and functional integration of CNS neurons: lessons from zebrafish genetics and other fish species. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 364-380 (2010).
  34. Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates. Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).
  35. Becker, T., et al. Readiness of zebrafish brain neurons to regenerate a spinal axon correlates with differential expression of specific cell recognition molecules. J Neurosci. 18 (15), 5789-5803 (1998).
  36. Rothenaigner, I., et al. Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate. Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).
  37. Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240 (9), 2221-2231 (2012).
  38. Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
  39. Bhattarai, P., et al. IL4/STAT6 signaling activates neural stem cell proliferation and neurogenesis upon Amyloid-β42 aggregation in adult zebrafish brain. Cell Reports. 17 (4), 941-948 (2016).
  40. Cosacak, M. I., Papadimitriou, C., Kizil, C. Regeneration, Plasticity, and Induced Molecular Programs in Adult Zebrafish Brain. Biomed Res Int. , (2015).
  41. Kizil, C., et al. The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain. Neural Dev. 7, 27 (2012).
  42. Kizil, C., et al. Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3. Dev Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).
  43. Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
  44. Katz, S., et al. A Nuclear Role for miR-9 and Argonaute Proteins in Balancing Quiescent and Activated Neural Stem Cell States. Cell Rep. 17 (5), 1383-1398 (2016).
  45. Kizil, C., et al. Efficient cargo delivery using a short cell-penetrating peptide in vertebrate brains. PLoS One. 10 (4), e0124073 (2015).
  46. Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415 (2013).
  47. Sewald, N., Jakubke, H. Peptides: Chemistry and Biology. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. (2009).
  48. Beyer, I., et al. Solid-Phase Synthesis and Characterization of N-Terminally Elongated Abeta-3-x -Peptides. Chemistry. 22 (25), 8685-8693 (2016).
  49. Zheng, Y., et al. Kinesin-1 inhibits the aggregation of amyloid-beta peptide as detected by fluorescence cross-correlation spectroscopy. FEBS Lett. 590 (7), 1028-1037 (2016).
  50. Balducci, C., Forloni, G. In Vivo Application of Beta Amyloid Oligomers: a Simple Tool to Evaluate Mechanisms of Action and New Therapeutic Approaches. Curr Pharm Des. 20 (15), 2491-2505 (2013).
  51. Schiffer, N. W., et al. Identification of anti-prion compounds as efficient inhibitors of polyglutamine protein aggregation in a zebrafish model. J Biol Chem. 282 (12), 9195-9203 (2007).
  52. Wieduwild, R., Tsurkan, M., Chwalek, K., Murawala, P., Nowak, M., Freudenberg, U., Neinhuis, C., Werner, C., Zhang, Y. Minimal peptide motif for non-covalent peptide-heparin hydrogels. Journal of the American Chemical Society. 135 (8), 2919-2922 (2013).

Tags

Nevrovitenskap problemet 128 Amyloid β42 sebrafisk neurodegeneration cerebroventricular microinjection Alzheimers sykdom solid fase peptid syntese
Modellering Amyloid-β42 giftighet og Neurodegeneration i voksen sebrafisk hjernen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bhattarai, P., Thomas, A. K.,… More

Bhattarai, P., Thomas, A. K., Cosacak, M. I., Papadimitriou, C., Mashkaryan, V., Zhang, Y., Kizil, C. Modeling Amyloid-β42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain. J. Vis. Exp. (128), e56014, doi:10.3791/56014 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter