Summary
ここでは、共焦点顕微鏡法を用いたマウス二次口蓋融合のライブイメージングのためのプロトコールを提示する。このプロトコールは、様々な蛍光レポーターマウス系統と、および機械的洞察のための経路阻害剤と組み合わせて使用することができる。このプロトコールは、他の発生系におけるライブイメージングに適合させることができる。
Abstract
2次口蓋棚を融合させて2次口蓋を形成することは、哺乳類の発達における重要なプロセスであり、その破壊は、ヒトにおける共通の先天性異常である口蓋裂につながる可能性がある。二次口蓋融合は、このプロセスを仲介するいくつかの提案された細胞機構に至るまで広範に研究されている。しかし、これらの研究は、発達中の漸進的時点または静的時点で分析された固定外植体培養において、固定胚組織で主に行われてきた。静的解析は、口蓋の融合などの動的な形態形成過程の分析に限られており、どのタイプの動的細胞行動が口蓋の融合を媒介するかについては不完全に理解されている。ここでは、マウス胚におけるex vivo二次口蓋融合のライブイメージングのプロトコールについて説明します。口蓋の融合の細胞挙動を調べるために、上皮特異的なケラチン 14-クレアを用いて、 ROSの口蓋上皮細胞を標識したA26-mTmG floxレポーター胚。糸状アクチンを視覚化するために、 Lifeact-mRFPrubyレポーターマウスを使用した。二次口蓋融合のライブイメージングは、胚の日（E）14.5ステージ胚の最近接着した二次口蓋棚を解剖し、ガラス皿にアガロース含有培地で培養して倒立共焦点顕微鏡で画像化することにより行った。この方法を用いて、二次口蓋融合時に様々な新規細胞行動を検出した。空間的および時間的に明確な細胞の挙動がどのように調整されるかを理解することは、この動的形態形成過程の理解に大きく寄与する。このプロトコールは、突然変異マウス系統、または薬理学的阻害剤で処理した培養物に適用して、二次性口蓋融合がどのように制御されるかの理解をさらに進めることができる。
Introduction
組織融合は、複数の臓器の発達において重要なステップです。口唇および口蓋の裂け目、脊髄二分脊椎および心臓の奇形などの主要なヒトの先天性欠損は、組織融合の欠陥1に起因し得る。マウス二次口蓋融合は、広範囲の開発2、3、4、組織融合を制御する細胞および分子機構を同定するために検討されています。マウスでは、二次性口蓋の発達は、E11.5付近で始まり、両側の上顎プロセスのそれぞれから二次口蓋棚の成育を開始する。口蓋棚の初期成長は、舌に沿って垂直方向に約E14.0まで起こり、その時点で口蓋は舌の上で水平に上昇する。内向きの成長は、2つの口蓋棚の上皮間の物理的接触をもたらし、正中線上皮を形成するE14.5でのal seam（MES）。間葉の合流を可能にするために、介入MESを二次口蓋棚の間から除去し、完全な融合した2次口蓋の発達をE15.5 3で行わなければならない。
共培養上皮MES細胞層が2つの別々の口蓋棚の間でどのように形成され、次に間葉の密集を達成するために除去されたかは、口蓋裂進展における中心的な問題であった。マウスの組織学的および電子顕微鏡（EM）研究、外植体培養研究、および機能的なマウス遺伝学的実験に基づいて、いくつかの基本的な細胞挙動がこの過程に関与している。各口蓋棚の内側縁上皮MEEから糸状仮足状突起は、共有単MES 6,7にこれらの上皮細胞のインターカレーションに続く最初の接点5,6を容易にします。結果として得られる共用MESの除去3つの非排他的メカニズムによって進展することが提案されている。組織学的観察およびバイタル染料でトレースエクスビボ系統を用いた初期の研究は、MESは、MES細胞の間葉移行（EMT）に上皮によって除去される可能性があります8、9、しかしより最近、上皮細胞の遺伝系統のトレースがに関して不確実性を上げたことを示し口蓋棚間葉10、11、12への上皮細胞の長期的な貢献。重要なアポトーシス細胞の数、および適切な口蓋融合を受けることができないいくつかの変異体ではその数の減少は、アポトーシスがMESの溶解2、3の主要なドライバーになるかもしれないという考えにつながっています。最後に、進行性の時点での上皮標識および静的観察を含む研究に最初から基づいて、MES細胞13、口鼻及び前後寸法11に移行することを提案するが、このような動的な細胞の振る舞いが原因ライブ口蓋組織でそれらを観察することができないため、最初は未確認でした。最近、我々は、蛍光標識のマウス遺伝的方法と外植片の棚の共焦点ライブイメージングを組み合わせた新しいライブイメージング方法論を開発することによって、これらの挙動を直接観察することができた。
まず、口蓋融合中口蓋上皮細胞における動的細胞挙動を視覚化するために、我々はKeratin14-CREマウス14、15とROSA26-mTmG FLOXマウスを交配することによって、上皮特異的レポーターマウスを生成しました。得られた胚の口蓋外植片培養の共焦点ライブイメージングは、以前に提案されたいくつかの細胞挙動を確認し、融合プロセス6における新規事象を同定した6、16を駆動する主要なメカニズムでした。このイメージング方法は、他のレポーターラインでも使用できます。我々は、融合プロセス中のアクチン細胞骨格の動態を調べるためにLifeact-mRFPrubyトランスジェニックマウス17、18を利用しました。他のレポーターもまた口蓋融合の他の特定の局面を観察するために使用することができ、この方法はイメージングの必要性および顕微鏡の利用可能性に応じてレーザー走査共焦点顕微鏡またはスピニングディスク共焦点顕微鏡に適合させることができる。ライブイメージングは、発達生物学において重要なアプローチとなりつつあります。 Parti白内障、頭蓋顔面の形態形成は複雑であり、顔に影響を与えるヒトの先天性欠損が一般的である。この共焦点ライブイメージング法は、ヒトの頭蓋顔面異常の起源だけでなく、基本的な発達メカニズムの基礎知識の改善を可能にする。
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Protocol
すべての動物実験は、カリフォルニア大学サンフランシスコ機関動物管理および使用委員会のプロトコルに従って実施した。
1.ライブイメージングメディアの作成
- 液体培地の調製
- 20％ウシ胎仔血清（FBS）、2mM L-グルタミン、100U / mLペニシリン、100μg/ mLストレプトマイシン、200μg/ mL L-アスコルビン酸、15mM HEPESをダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）/ F12メディア。
注：ライブイメージングメディアは、イメージングの直前に新しく作成されました。この培地にはフェノールレッドが含まれており、長時間のライブイメージングで光毒性を引き起こす可能性があります。フェノールレッドを使用しないメディアに置き換えると、長期間のイメージングが改善される場合があります。
- 20％ウシ胎仔血清（FBS）、2mM L-グルタミン、100U / mLペニシリン、100μg/ mLストレプトマイシン、200μg/ mL L-アスコルビン酸、15mM HEPESをダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）/ F12メディア。
- 低融点アガロース溶液の調製
- 350mgの低融点アガロースを10mLのオートクレーブ蒸留水に溶解して、3.5％ストック溶液を作製する。
- アガロース溶液をよく混合し、水浴中で70℃でインキュベートして、アガロースを完全に溶解させる。
- アガロース溶液を37℃の水浴で冷却してから、ライブイメージングメディアに加えます。
- アガロース原液1 mLを液体ライブイメージングメディア5 mLに加えて最終濃度（0.6％）とする。
- アガロースで培地を37℃の水槽に保存して、早すぎる凝固を防ぐ。
ライブイメージングのための口蓋外植片培養の準備
- 最近付随したE14.5二次口蓋棚の解剖
注：私たちの経験では、イメージングの融合は口蓋棚のわずかに接着されたペアから開始する必要があります。この接着は、画像化中に融合が起こらないようにする外植片の動きを防止する。- 1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）にE14.5段階の胚を解剖し、緑色蛍光タンパク質（GFP）発現（K14-cre; ROSA26-mTmG flox ）または（赤色蛍光タンパク質）RFP発現（ Lifeact-mRFPruby由来 ）陽性胚を蛍光灯を備えた解剖顕微鏡を用いて検出した。組織をアガロースを含まない予熱したライブイメージング培地に移す。
- 2つの細かい5番鉗子（ 図 1A-C ）を使用して、胚頭を切断し、上部脳領域を除去する。他の5番の鉗子は口蓋棚の外側の余分な組織を切断するように胚を保持するために1つのNo.5鉗子を使用してください。
注：5番の鉗子の代わりに1番の胚の頭を切断するために、はさみを使用することができます。しかし、2番の5番の細かい鉗子は、正確な切断を行うためのより良い制御を与えるでしょう。 - 図 1Dおよび1Eに示すように、口蓋を損傷することなく下顎を注意深く取り外す。口蓋を損傷する可能性を減らすために、下顎の切開を通して舌を維持し、f舌を慎重に取り除いた後、
- 下顎骨と舌を除去した後、二次口蓋の口腔側を蛍光顕微鏡で実体顕微鏡で検査し、MES中の強いレポーターシグナルを確認する（ 図 1M ）。
- 下顎と舌を除去した後、後脳および脳幹を含む後部を解剖する（ 図 1F ）。
- 接着した口蓋棚付きの両上顎を外す（ 図 1G ）。
- 前顎の組織を切って、一次口蓋と二次口蓋の両方を無傷に保ちます （ 図 1HおよびI ）。
- MESを露出させる外植片の鼻側の鼻中隔を除去する。
注：これらの解剖の後のステップは、2つの二次口蓋棚の間の接触を乱さないように注意する必要があります。鼻中隔の除去は、他の領域からのバックグラウンドシグナルを低減し、垂直組織の動きを低減し、安定したイメージングを可能にします （ 図1 J-L ）。 - 口蓋棚を切開した後、正中線レポーターシグナルを再度検査して、組織間の上皮層に損傷がないことを確認する。
- ライブイメージング培地を用いた培養皿の口蓋外植片の設定
- ライブイメージングメディアを35mmのガラスボトムディッシュに入れます。
- 倒立共焦点顕微鏡（ 図1の N ）で画像化するために、解剖した口蓋蓋の口側をガラス底面にできるだけ近づけて置く。
- ドライアイスペレットを培養皿の近くの導電性表面に置き、速やかに温度を下げてアガロース固化を促進するか、培養皿を4℃に置く。パラフィン包埋に使用されるもののような冷プレートもまたこれに使用することができるtage。
注：ドライアイスを使用する場合、凍結媒体を防ぐためにアガロース培地交換を注意深く監視する必要があります。
3.口蓋外植片の共焦点経時的イメージング
- イメージングとデータ収集
- アガロースを半凝固させた後、培養皿を37℃インキュベーションチャンバーを備えた倒立共焦点顕微鏡に取り付ける。白色光共焦点顕微鏡と細胞観察者スピニングディスク共焦点顕微鏡を使用する。
注：我々は、CO 2ガスを含まない15mM HEPESを含む改変培地を使用した。 - 培地の蒸発を防ぐために、シリンジを使用して培養皿とカバーの間に石油ゼリーを入れます（ 図1 N ）。
注：一晩（O / N）培養後に培養皿の上に結露が生じるが、培地の量は変化せず、石油ゼリーが培地の蒸発を防ぐことを示唆している。 - 低倍率の対物レンズ（10倍）で関心領域を探し、3倍デジタルズームで20倍対物レンズ、またはImmersion Wで倍率40倍対物レンズを使用して、タイムラプスライブイメージングを行います。
注：解剖された二次口蓋棚は平らではありません。二次口蓋は湾曲した構造であり、これにより、同一平面内のMES全体を画像化することが困難になる。低倍率（10倍）のイメージングは口蓋全体のイメージングを可能にしますが、40倍の対物レンズは、より深いZ位置で詳細な細胞の動きを調べるために、より良いイメージ解像度を提供します。中口蓋領域では曲率が高い。前部および後部の口蓋は、中口蓋に比べて比較的平坦である。我々はしばしば、二次口蓋の中間前部に向かって画像を描き、最大曲率の領域を避ける。 - 適切なレーザー励起（GFPの場合は488 nm、RFPの場合は532/561 nm）を使用して16-24 hの各ステップで5μmの複数のZスタックをスキャンします（ 図2 ）。
注：潜在的な光毒性を減らすために、最小レーザー出力と暴露時間を使用してください。これは、特に多色撮像の場合に重要である。 membraneTomato（mT）には552 nmレーザーパワーの22％、membraneGFP（mG）には495 nmレーザーパワーの30％、membraneRFPには561 nmレーザーパワーの25％を使用します。平均曝露時間は550msであった。 - 画像解析ソフトウェアを使用して、細胞の追跡および定量分析を行います。
- アガロースを半凝固させた後、培養皿を37℃インキュベーションチャンバーを備えた倒立共焦点顕微鏡に取り付ける。白色光共焦点顕微鏡と細胞観察者スピニングディスク共焦点顕微鏡を使用する。
4.データ画像解析
注：ここでは、Imarisが使用されました。同様のデータ分析は、ImageJまたはVolocityソフトウェアパッケージでも実行できます。
- 画像シーケンスから3次元（3D）サーフェスをレンダリングする。
注：このセクションでは、膜のGFPシグナルで生成されたムービーからサーフェスを生成することができます。- [ 編集]をクリックします。表示調整を表示し 、ヒストグラムスライダを使用して、膜の信号が透明になるように信号強度を調整しますムービーの長さうち（ 図3A）。
- イメージを使用して漂白されたシグナルを修正する 処理|減衰補正 。ムービーの長さ全体にわたって膜信号が透明になるように、[強度フロント]と[強度バック]の値を調整します。これらの値の設定には試行錯誤が必要な場合があります。
注：レーザーの透過が限られているため、強度バック（深いZ位置）値は強度フロント（表面Z位置）値より小さくなります。したがって、これらの値を変更してZシリーズの信号強度を正規化することもできます。両方の値を調整して漂白補正を達成することができる。減衰補正も排出減衰補正19と呼ばれています。 - メンブレン信号からサーフェスを生成するには、 Surpass |サーフェスで、ソースチャンネルとしきい値タイプ（絶対強度）を選択し、アルゴリズム設定〜する 関心領域のみをセグメント化する 最後に画像全体の処理を行い 、続いて順方向矢印をクリックします。生成されたサーフェスが蛍光シグナルを反映しているかどうかを確認しながら、前方矢印を押し続けます（デフォルト設定を使用するか、表面領域の詳細レベルと閾値方法を試行錯誤で指定します）。関心領域を指定するには、X、Y、Z位置を切り取ってレンダリングする領域と時間を選択します。
注：選択してください 最終的に画像全体を処理することで、ムービー全体に調整としきい値が適用されます。 - もう一度矢印をクリックしてサーフェスを生成します。次に、 フィルターのヒストグラムを膜信号に対応させて変更して、しきい値を調整します。
- サーフェスが生成された後、サーフェス/設定でサーフェスを選択してサーフェス信号を視覚化し、サーフェス生成プロセスを終了するには、double forw（ 図 3B ）。
- 表面に行く| マスクプロパティを編集し、 マスクのプロパティでマスクすべてをクリックすると、マスクされたチャンネルイメージが生成されます。
- OKをクリックすると、Mask Channelウィンドウが自動的に開きます。 GFPチャネルを選択し、サーフェス外のボクセルを最大信号強度値（ Edit | Display調整 ）に設定し、サーフェス内のボクセルを最小GFP強度値に設定します 編集|ディスプレイの調整 ）をMask Settingsで選択して、膜信号のマスクを生成します。
- メンブレン信号のマスクがボリュームビューで表示されるので、 画像処理|コントラストの変更|反転 （ 図 3C ）。
- 反転した表面画像からスポットを検出する。
注：このセクションでは、各セルの中心をユニークなスポットでマークされ、時空間を追跡します。- スルーシーンを選択|スポット|作成します 。アルゴリズム設定では、関心領域のみのセグメントを選択し、 最終的には画像全体の処理を行い、時間の経過とともにトラックスポットを選択します。
- 前方矢印をクリックして、関心領域を指定します。スポットを追跡する領域と時間を選択します。順方向矢印を押し続け、マスクされたチャネルをソースチャネルとして選択し、推定されたスポットのXY直径を決定する。
- 前方矢印ボタンをクリックすると、自動的にフィルタウィンドウが開きます。ヒストグラムの値を変更して各細胞の中央に単一スポットを生成することによってスポット検出閾値を調整する（ 図 3D ）。
- 前方矢印ボタンを再度クリックすると、 アルゴリズムウィンドウが開き、 Autoregressiveモーショントラッキングモデル 20を選択し、最大トラッキングdiを指定します短い間隔で不連続となるトラックを接続するためのスタンスと最大ギャップサイズを提供します。
- 前方矢印ボタンを再度クリックすると、Filtersウィンドウが開き、すべてのセルがトラッキングされるようにヒストグラムを調整してトラックの継続時間のしきい値を設定します。二重矢印ボタンをクリックすると、スポット検出が完了します。
- 組織のドリフトを修正するには、[ スポット|トラックエディタを開き 、[ ドリフトの補正]を選択します。 アルゴリズムウィンドウが自動的に開きます。 「 翻訳ドリフト」、「結果全体を含める」 、および「 オブジェクトの位置を修正する」を選択します。
- 定量分析のためのプロットを生成する。
注：このプログラムの散布図は、複数のオブジェクトを持つ多次元（X、Y、Z、カラー、スケール）グラフを生成するツールです。これらのプロットは、時間の経過とともに多くの細胞運動の傾向を見るのに役立ちます。- セルトラッキングデータの2Dまたは3Dプロットを、Vantage-New Vantageプロットメニューを追加します（ 図3 Eおよび3F ）。
- ボリュームまたはスポットを選択し、 作成/カテゴリとプロットタイプを選択
- プロット値を調整して、異なるVantageグラフを生成します。
- スナップショット機能を使用してグラフをエクスポートします。
注：統計データをスプレッドシートとしてエクスポートして、さらに数値分析を行うこともできます。保存します 。
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Representative Results
口蓋外植片培養のライブイメージングは、口蓋核融合を媒介する複数の細胞プロセスを明らかにした6 。 2つの上皮細胞間の初期接触は、膜突起によって行われる（ 図 2B-2E ）。 2つの上皮層が会合すると、それらは上皮収束を介して統合された単一細胞層MESを作製するためにインターカレーションされた後、多細胞層状MESを形成する（ 図 2A-2Eおよび図 2K-2O ）。より深いZレベルの上皮細胞もまた、上皮収束過程に寄与するMESの経口側に徐々に移動する（ 図 2K ）。後頭部細胞移動が中口蓋MESで観察された（ 図 2F-2J ）。さらに、我々は上皮細胞のextMESの上皮細胞がこの能動的プロセスによって除去され得ることを示唆している（ 図 2Q、2T ）。統合された上皮の縫い目は、最終的には間葉の密集を達成するために破壊される（ 図 2S、2T ）。
Lifeact-mRFPrubyの口蓋は、口蓋の融合中に動的アクチン細胞骨格再編成を示した6 。糸状アクチンは、前 - 後軸に沿ってケーブル様構造を形成する上皮および間葉領域の境界で富化された（ 図 2K-2T） 。アクロミオシンの収縮性は、ミオシン活性またはアクチン重合の化学的阻害がこれらの動的プロセスを阻害するため、上皮収束およびMES破壊を引き起こす6 。
hin-page = "1">ソフトウェアは、口蓋の融合中に細胞の挙動を追跡するために使用されました。細胞追跡のための最良の方法は、レポーターシグナルに依存する。核レポーターマウスを使用すると、プログラムは細胞中心21として蛍光シグナルの中心を追跡することができます。従って、 ROSA26 GFP-NLS-lacZ （ GNZ） 22のような核GFPレポーターマウスは、組織特異的Cre系を用いて上皮細胞を標識するために使用することができる;私たちの手では、この特定の核レポーターは、ライブイメージングで使用される長い時間コースよりも速く漂白を示しました。したがって、 本発明者らは、本発明者らの研究において、膜-GFPレポーター（ ROSA26-mTmG flox ）を用いて上皮細胞の動きを追跡した。これは、膜シグナルによって個々の細胞を同定および追跡するための方法を必要とした。この問題を解決するために、我々は修正された細胞追跡法を利用した（ 図3 およびプロトコルセクション4 ）。
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図1 ：マウスの二次口蓋の切開の概略図。 （ A ）E14.5マウス胚の側面図。口蓋棚を解剖するために、頭は最初の白い点線＃1に沿って切断された。 （ B、C ）上の脳（第2白線の上、＃2）を除去した。 （ D、E ）解剖された頭部の口頭。下部下顎骨（＃3）を切開し、舌（＃4）を除去した。 （ F ）ライン＃5に沿った頭部の後部を切り取った。 （ GI ）上顎（＃6、＃7）および上顎の前部（＃8）の両方を除去した。 （ JL ）鼻中隔（＃9）を除去した（ M ） K14-creからの解剖された口蓋のMESにおけるGFPシグナル; ROSA26 mTmGマウス胚。 （ N ）ライブイメージングセットアップ。仲間の口頭外植片を下にして倒立共焦点顕微鏡で画像化した。 MESは白い矢印（ FI ）で示されています。画像化された領域は、LおよびMの白い点線のボックスによって示されている。スケールバー= Aで2cm、BIで1cm、JMで500μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2 ：口蓋外植片培養のライブイメージング。 （ AE ） K14-creからの前二次口蓋のライブイメージング; ROSA26 mTmG外植片（深さ5μm）。白い矢印は、上皮細胞（ FJ ）からの膜突起を示し、 K14-creからの中口蓋のライブイメージングを示す。 ROSA26 mTmG外植片（ 5μmdepth）。白い矢印は、前部から後部の口蓋への細胞移動の方向を示す。 （ KO ） Lifeact-mRFPruby外植片（5μmの深さ）からの前蓋のライブイメージング。口腔表面への上皮細胞の移動（黄色の矢印）および正中線におけるケーブル様アクチン構造を有する統合されたMESを形成するための収束。 （ PT ） Lifeact-mRFPruby外植片（25μmの深さ）からの前蓋のライブイメージング。赤い矢印は、細胞押し出しイベント（ Q、T ）を示します。シームの将来の破損点は、SとTの2つの垂直の白い矢印によって示されている。スケールバー=20μm。この図のすべてのライブイメージングデータは、以前に6で発表された実験から得られたものです。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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図3 ：データ分析。 （ AD ） K14-creからの膜GFPシグナルで上皮細胞を追跡する; ROSA26 mTmG口蓋外植片（ A ）、膜GFPシグナル（ B ）のボリュームレンダリングによって表面を生成した。作成された表面（ C ）をマスキングした後、反転した画像が生成された。 Imaris（ D ）のスポット検出機能を用いて、倒立像から細胞中心を同定した。 （ E ）3D再構成により、細胞の動きを複数の方向に追跡することができる。 A：前方、P：後方、N：鼻、O：経口（ F ）2D分析は、中口蓋MESにおいて前方から後方へ移動する細胞を示す視野プロットを生成する。スケールバー= ADで20μm、EFで10μm。s / ftp_upload / 56041 / 56041fig3large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
ビデオ図1： K14-creのライブイメージング。 ROSA26-mTmG floxの前蓋 （5μmの深さ）。 10分（10分/フレーム）ごとに16時間20分間、スケールバー=25μmで画像を捕捉した。このビデオは、参考文献6で以前に公開された映画の異なるZポジションです。 このビデオを見るにはここをクリックしてください。 （右クリックしてダウンロードしてください）
ビデオ図2： K14-creのライブイメージング。 ROSA26-mTmG flox中口蓋（深さ5μm）。画像は15分毎（15分/フレーム）に13時間30分、スケールバー=25μmで捕捉した。この動画は、参考文献6に掲載されています。 このビデオを見るにはここをクリックしてください。 （右クリックしてダウンロードしてください）
ビデオ図3： Lifeact-mRFPrubyの前部口蓋（5μmの深さ）のライブイメージング。
画像を10分ごとに（10分/フレーム）、7時間50分にわたり採取した。スケールバー=20μm。この動画は、参考文献6に掲載されています。 このビデオを見るにはここをクリックしてください。 （右クリックしてダウンロードしてください）
ビデオ図4： Lifeact-mRFPrubyの前部口蓋（25μmの深さ）のライブイメージング。
画像を10分ごとに（10分/フレーム）、7時間50分にわたり採取した。スケールバー=20μm。このビデオは、参考文献6で以前に公開された映画の異なるZポジションです。 このビデオを見るにはここをクリックしてください。 （右クリックしてダウンロードしてください）
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Discussion
3D臓器外植片培養による組織形態形成のライブイメージングは、固定組織切片の従来の染色分析では示されない細胞プロセスに関する詳細な情報を提供することができる。マウス胚性二次口蓋のin vitro外植体培養を用いて、上皮収束および細胞押し出しを含む新規な口蓋融合機構を提案するいくつかの興味深い細胞挙動を観察した。
このタイプの研究における共通の課題の1つは、長時間にわたる連続レーザー励起による光退色である。我々の研究では、白色光共焦点および回転円盤共焦点顕微鏡を使用した。経時的なシグナル強度の低下は、イメージングソフトウェア（LAS-AF）（プロトコル4.1）における漂白補正によって補正することができる。漂白の矯正は限られているので、各イメージングシステムでレーザーパワーと露光時間を慎重に最適化することが重要です。我々はまたチェックしたその口蓋融合は、3日間培養した後6ライブイメージング媒体に通常発生します。
ライブイメージングにおける第2の共通の問題は組織ドリフトである。フォーカルプレーンの変化は、時間の経過に伴う形態形成変化の理解を混乱させる可能性があるので、ライブイメージング中に一貫性のある画像を得るためにドリフトを最小にすることが重要である。熱ドリフトを制御することは、多くの共焦点顕微鏡（顕微鏡における明確な焦点）で達成することができるが、ガラス底に対する組織のドリフトは、これらの方法では矯正できない。アガロースを利用し、ガラス底に移植片を配置することは、これを最小にするのに役立つが、相対的に一定した位置を維持するそれらの映画を分析するためにのみ注意を払う必要がある。これは、イメージングフィールド内の複数の制御点を経時的に追跡し、それらが一定のままであるか、類似の傾向で移動するか、または異なって移動するかを判断することによって判断することができる。ある程度は、後処理fuライブイメージングにおけるいくつかの組織ドリフトの補正が可能である（プロトコル4.2）。
外植片組織を固定化するために、低融点アガロースをライブイメージング培地中で最終濃度0.6％で使用した。高濃度のアガロースを試験すると、おそらく機械的制約のために組織形態形成を損なうように見えた。したがって、正しいアガロース濃度を使用して形態形成を妨げないで組織のドリフトを最小限に抑えることが重要です。
共焦点イメージングの深さのために、この方法は口蓋の融合の非常に深いZ面を調べる際に限界があります。 WHITE LIGHTとスピニングディスク共焦点顕微鏡の両方を使用して、100μmの深度からの信号をうまくイメージ化することができましたが、イメージはこの限界を超えて鈍くてかすかになり始めました。口蓋融合は、口腔および前後軸の進行過程であるため、複数の位置を画像化することにより、異なる部位造影の深さを改善するために、2光子または光シート共焦点顕微鏡法を将来使用することができる。我々の実験のほとんどでは、口蓋外植片の経口側を画像化した。鼻中隔が融合しているか、二次口蓋棚に非常に近いので、口蓋外植片の鼻側の画像化は困難である。鼻側からの融合を画像化する試みにおいて、口腔上皮からのシグナルを妨害しないように余分な鼻組織を除去することも必要であった。可能であれば、口蓋外植片の鼻側を画像化することは困難であった。なぜなら、鼻中隔の解剖はしばしば口蓋外植片を損傷させたからである。
レポーターマウス組織外植体のライブイメージングは、胚発生中の組織形態形成の細胞機構を研究する強力な方法である。共焦点顕微鏡法および定量的イメージング分析を使用して、二次口蓋融合などの基本的な発達過程は、細胞レベルで調査した。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
我々は二次口蓋イメージングに関する最初の会話のためのダグラス・ベンソン博士に感謝します。また、共焦点顕微鏡法で撮像条件を調整する助けとなるDavid Castaneda-Castellanos（Leica）とChris Rieken（Zeiss）も認めています。 Imarisソフトウェアを使用した定量的画像解析の参考になるLynsey Hamilton（Bitplane）に感謝します。この研究は、NIH / NIDCR R01 DE025887によって資金提供された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 | Life technology | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Life technology | 16000-044 | |
| L-glutamine | Life technology | 25030-081 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A4544-100G | |
| Pennicillin/Streptomycin | Life technology | 15140-122 | |
| Low melting agarose | BioExpress | E-3111-125 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Petrolieum Jelly (Vaseline) | Sigma | 16415-1Kg | |
| Mice | |||
| Keratin14-cre | MGI: J:65294 | Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc | |
| ROSA26mTmG | MGI: J:124702 | Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo | |
| Lifeact-mRFPruby | MGI: J:164274 | Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows | |
| Microscope | |||
| White Light SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss Microscopy |
References
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).
- Dudas, M., Li, W. -Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. Palatal fusion - where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birth defect. Acta Histochem. 109, 1-14 (2007).
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139, 231-243 (2012).
- Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and Molecular Mechanisms of Palatogenesis. Curr Top Dev Biol. 115, 59-84 (2015).
- Taya, Y., O'Kane, S., Ferguson, M. W. Pathogenesis of cleft palate in TGF-b3 knockout mice. Development. 126, 3869-3879 (1999).
- Kim, S., et al. Convergence and Extrusion Are Required for Normal Fusion of the Mammalian Secondary Palate. PLOS Biol. 13, 100122 (2015).
- Yoshida, M., et al. Periderm cells covering palatal shelves have tight junctions and their desquamation reduces the polarity of palatal shelf epithelial cells in palatogenesis. Genes Cells. 17, 455-472 (2012).
- Fitchett, J., Hay, E. Medial edge epithelium transforms to mesenchyme after embryonic palatal shelves fuse. Dev. Biol. 131, 455-474 (1989).
- Akira, N., et al. The expression of TGF-beta3 for epithelial-mesenchyme transdifferentiated MEE in palatogenesis. J Mol Hist. 41, 343-355 (2010).
- Sani, F. V., et al. Fate-mapping of the epithelial seam during palatal fusion rules out epithelial-mesenchymal transformation. Dev. Biol. 285, 490-495 (2005).
- Jin, J. -Z., Ding, J. Analysis of cell migration, transdifferentiation and apoptosis during mouse secondary palate fusion. Development. 133, 3341-3347 (2006).
- Xu, X., et al. Cell autonomous requirement for Tgfbr2 in the disappearance of medial edge epithelium during palatal fusion. Dev. Biol. 297, 238-248 (2006).
- Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro: an analysis by Dil labelling and confocal microscopy. Development. 114, 379-388 (1992).
- Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Dassule, H., Lewis, P., Bei, M., Mass, R., McMahon, A. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127, 4775-4785 (2000).
- Eisenhoffer, G., et al. Crowding induces live cell extrusion to maintain homeostatic cell numbers in epithelia. Nature. 484, 501-546 (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Riedl, J., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7, 168-169 (2010).
- Can, A., et al. Attenuation correction in confocal laser microscopes: a novel two-view approach. J Microsc. 211, (2003).
- Veenman, C., Reinders, M., Backer, E. Resolving motion correspondence for densely moving points. IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 23, 54-72 (2001).
- Udan, R., Piazza, V., Hsu, C., Hadjantonakis, A., Dickinson, M. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141, 4406-4414 (2014).
- Stoller, J., et al. Cre reporter mouse expressing a nuclear localized fusion of GFP and beta-galactosidase reveals new derivatives of Pax3-expressing precursors. Genesis. 46, 200-204 (2008).
