Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול הדמיה חיה של היתוך חיך העכבר העכבר באמצעות מיקרוסקופיה confocal. פרוטוקול זה ניתן להשתמש בשילוב עם מגוון רחב של שורות העכבר כתב פלואורסצנטי, עם מעכבי נתיב עבור תובנה מכניסטית. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם עבור הדמיה חיה במערכות התפתחותיות אחרות.
Abstract
ההיתוך של המדפים הפלטליים המשניים כדי ליצור את החיך המשני השלם הוא תהליך מפתח בהתפתחות יונקים והפרעותיו יכולות להוביל לחיך משני שסוע, אנומליה מלידה נפוצה אצל בני אדם. מיצוי החיך המשני נחקרה בהרחבה ומובילה למספר מנגנונים סלולריים מוצעים שעשויים לתווך את התהליך. עם זאת, מחקרים אלה בוצעו בעיקר על רקמות עובריים קבוע בשעה timepoints פרוגרסיבי במהלך הפיתוח או בתרבויות explant קבוע ניתח על נקודות זמן סטטיות. ניתוח סטטי מוגבל עבור ניתוח של תהליכים מורפוגנטיים דינמיים כגון היתוך החיך ואילו סוגים של התנהגויות הסלולר דינמי לתווך היתוך palatal אינו מובן לחלוטין. כאן אנו מתארים פרוטוקול הדמיה חיה של היתוך חיך vivo לשעבר משני עוברים עכבר. כדי לבחון התנהגויות הסלולר של היתוך החיך, אפיתל ספציפי קראטין 14-Cre שימש התווית חיך אפיתל תאים ב ROSA26-mTmG עובר לכתב flox. כדי להמחיש אקטין נימי, עכברים LifeACT-mRFPruby כתב שימשו. הדמיה חיה של היתוך החיך המשניים בוצעה על ידי לנתח לאחרונה מדבקות paltal משני דבקו של היום עובריים 14.5 שלב ו culturing ב המכילים agarose התקשורת על צלחת תחתית זכוכית כדי לאפשר הדמיה עם מיקרוסקופ confocal הפוך. באמצעות שיטה זו, גילינו מגוון רחב של התנהגויות הסלולר הרומן במהלך היתוך החיך המשני. הערכה של התנהגויות תאים ברורים מתואמים בחלל ובזמן תורמת רבות להבנתנו את התהליך המורפוגנטי הדינמי הזה. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על עכבר מוטציה קווים, או תרבויות שטופלו מעכבי פרמקולוגי כדי לקדם את ההבנה מראש של איך פיוזון החיך המשני נשלטת.
Introduction
היתוך רקמות הוא צעד חשוב בפיתוח של איברים מרובים. מומים מולדים אנושיים עיקריים כגון שפה שסועה וחך, ספינה ביפידה ומומים של הלב יכולים לנבוע מליקויים בהרכב רקמות 1 . עכבר חך היתוך משני כבר למד בהרחבה כדי לזהות את המנגנונים המולקולריים הסלולר השליטה היתוך רקמות בפיתוח 2 , 3 , 4 . בעכבר, פיתוח החיך המשני מתחיל סביב E11.5 עם תולדה של מדף palatal משני מכל אחד התהליכים הבילטראליים דו צדדי. הגידול הראשוני של המדפים paltal מתרחשת אנכית לאורך הלשון, עד E14.0 בערך, אז, המדפים paltal להיות מורם אופקית מעל הלשון. תוצאות רפואיות מכוונות מבחינה רפואית במגע פיזי בין אפיתל ההטיה של שני המדפים הפאלטליים, המרכיבים את האפיתלי של קו האמצעאל תפר (MES) ב E14.5. MES המתערב יש להסיר בין המדפים paltal משני כדי לאפשר מפגש mesenchymal ופיתוח של החיך המשני שלם, התמזגו לחלוטין על ידי E15.5 3 .
איך משותף אפיתל תא MES שכבת נוצר בין שני מדפים נפרדים paltal, ולאחר מכן הוסר כדי להשיג confluency mesenchymal, כבר שאלה מרכזית בפיתוח החיך. בהתבסס על מחקרים מיקרוסקופיים של עכברים ומיקרוסקופים אלקטרומגנטיים (EM), מחקרי תרבות אקספאנטיים וניסויים פונקציונליים של גנטיקה של עכברים, מספר התנהגויות תא בסיסיות היו מעורבים בתהליך זה. פילופודיה כמו תחזיות מן האפיתל קצה המדיאלי MEE של מדף כל palatal מאפשר מגע ראשוני 5 , 6 , ואחריו intercalation של תאים אלה אפיתל משותף MES 6 , 7 . הסרת MES המשותף שהתקבלהוצע להמשיך בשלושה מנגנונים לא בלעדיים. מחקרים מוקדמים המעסיקים תצפיות היסטולוגיות ושושלת אקסו vivo עוקבים אחר צבעים חיוניים הצביעו על כך שה- MES יכול להיות מוסר על ידי אפיתל ל- mesenchymal transtemal (EMT) בתאי MES 8 , 9 , אם כי לאחרונה, מעקב גנטי אחר של תאי אפיתל העלה את אי-הוודאות לגבי התרומה ארוכת הטווח של תאים אפיתל המדף palesalyme 10 , 11 , 12 . מספר משמעותי של תאים אפופטוטיים, וכן ירידה במספר מוטציות מסוימות שלא מצליחים לעבור היתוך החיך הנכון הוביל לרעיון כי אפופטוזיס עשוי להיות נהג מרכזי של MES פירוק 2 , 3 . לבסוף, מבוסס בתחילה על מחקרים מעורבים תיוג אפיתל תצפית סטטית ב timepoints פרוגרסיבי, תאים MESהוצעו להגר בממדים 11 ו -13 , 13 , 13 , אך התנהגויות תא דינמיות כאלה לא אושרו בתחילה בשל חוסר היכולת להתבונן בהן ברקמה חיה. לאחרונה, הצלחנו לבחון באופן ישיר את ההתנהגויות הללו על ידי פיתוח מתודולוגיה חדשה של הדמיה חיה המשלבת שיטות גנטיות עכבר של תיוג פלואורסצנטי עם הדמיה חיה confocal של מדפים paltal explanted.
ראשית, כדי לחזות התנהגויות הסלולר דינמיות בתאי האפיתל חיך במהלך היתוך חיך, יצרנו עכבר עיתונאי ספציפי האפיתל על ידי חציית ROSA26-mTmG עכברי flox עם Keratin14-Cre עכברי 14, 15. Confocal הדמיה חיה של החיך explant התרבות של העוברים שהתקבלו אישר כמה התנהגויות הסלולר הציע בעבר זיהו אירועים רומן בתהליך היתוך 6 6 , 16 . שיטה זו הדמיה ניתן להשתמש עם שורות כתב אחרים; אנו ניצלו Lifeact-mRFPruby עכברים מהונדסים 17 , 18 לבחון את הדינמיקה cytoskeletal אקטין במהלך תהליך היתוך. כתבים אחרים יכולים לשמש גם כדי לבחון היבטים ספציפיים אחרים של היתוך החיך ואת שיטה זו ניתן להתאים גם לייזר מיקרוסקופ סריקה מיקרוסקופית או ספינינג דיסק confocal, בהתאם לצרכים הדמיה וזמינות מיקרוסקופ. הדמיה חיה הופכת יותר ויותר לגישה של קיסטון בביולוגיה התפתחותית. Partiבאופן חלקי, מורפוגנזה craniofacial מורכבת ומומים מולדים אנושיים המשפיעים על הפנים הם נפוצים. שיטה זו הדמיה חיה confocal יעזור לאפשר הבנה משופרת של מנגנוני התפתחות בסיסיים הבסיסית כמו גם מקורות של הפרעות craniofacial האדם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לפרוטוקולים של אוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו מוסדיים טיפול בבעלי חיים ושימוש ועדת.
1. הכנת מדיה הדמיה חיה
- הכנת מדיה תרבותית נוזלית
- הוסף 20% בסרום שור העובר (FBS), 2 מ"מ L- גלוטמין, 100 פניקסילין U / מ"ל, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 200 מיקרוגרם / מ"ל חומצה L-ascorbic, 15 מ"מ HEPES כדי Dulbecco השתנה הנשר בינוני (DMEM) / F12 כְּלֵי תִקְשׁוֹרֶת.
הערה: מדיה הדמיה חיה נעשה טרי לפני ההדמיה. מדיה זו מכילה פנול אדום אשר עלול להוביל phototoxicity לאורך זמן קורסים של הדמיה חיה. החלפת מדיה ללא פנול אדום עשוי לשפר הדמיה לטווח ארוך.
- הוסף 20% בסרום שור העובר (FBS), 2 מ"מ L- גלוטמין, 100 פניקסילין U / מ"ל, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 200 מיקרוגרם / מ"ל חומצה L-ascorbic, 15 מ"מ HEPES כדי Dulbecco השתנה הנשר בינוני (DMEM) / F12 כְּלֵי תִקְשׁוֹרֶת.
- הכנה של פתרון נמס נמוך agarose
- ממיסים 350 מ"ג של agarose התכה נמוכה 10 מ"ל של מים מזוקקים autoclaved לעשות פתרון המניות 3.5%.
- מערבבים את הפתרון agarose היטב דגירה על 70 מעלות צלזיוס באמבט מים לפזר את agarose לחלוטין.
- מגניב את הפתרון agarose באמבט מים 37 מעלות צלזיוס לפני הוספת אותו מדיה הדמיה חיה.
- הוסף 1 מ"ל של פתרון המניות agarose ל 5 מ"ל של התקשורת הדמיה חיה נוזלי לעשות ריכוז סופי (0.6%).
- שמור על התקשורת עם agarose באמבט מים 37 מעלות צלזיוס כדי למנוע התמצקות מוקדמת.
2. הכנה של חקר Explant תרבות עבור הדמיה חיה
- דיסקציה של מדפים פלמטליים משניים E14.5 שדבקו לאחרונה
הערה: הניסיון שלנו הדמיה היתוך דורש מתחיל עם זוג הדבק מעט של מדפים paltal; זה דבקות מונע תנועות explant המונעים היתוך התרחשות במהלך הדמיה.- לנתח עוברי שלב E14.5 ב 1x פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) ולבחור חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) -expressing (מK14-Cre; ROSA26-mTmG flox ) או (חלבון פלואורסצנטי אדום) RFP- להביע (מ Lifeact-mRFPruby ) עוברים חיוביים באמצעות מיקרוסקופ לנתח מצויד מנורות פלורסנט. העברת רקמות חימם מראש מדיה חיה מדיה ללא agarose.
- חותכים את הראש העובר ולהסיר את האזור המוח העליון באמצעות שני מלקחיים מס '5 בסדר ( איור 1 A-C ). השתמש אחד מלקחיים מס '5 להחזיק את העובר בעוד מלקחיים מס' 5 אחרים לחתוך רקמות נוספות מחוץ המדפים paltal.
הערה: מספריים בסדר ניתן להשתמש כדי לחתוך ראש העובר (הצעד הראשון) במקום אחד מלקחיים מס '5. עם זאת, שני מלקחיים בסדר בסדר ייתן שליטה טובה יותר כדי לבצע חתכים מדויקים. - הסר את המנדלי בזהירות מבלי לפגוע מדפים palatal כפי שמוצג באיור 1 D ו 1E . כדי להפחית את הסיכוי של חיך מזיק, לשמור את הלשון דרך דיסקציה של המנדלי, Fהסיר בזהירות את הלשון.
- לאחר הסרת המנדט ואת הלשון, לבחון את הצד הפומי של החיך המשני עם stereomicroscope עם הקרינה כדי לאשר אות כתב חזק MES ( איור 1 M ).
- לנתח את החלקים האחורי כולל המוח האחורי גזע המוח לאחר הסרת המנדלי ואת הלשון ( איור 1 F ).
- הסר את שני מקסילות עם מדפים paltal דבקות ( איור 1 G ).
- חותכים את הלסת העליונה הלסת העליונה שמירה הן החיך העיקרי המשני שלם ( איור 1 H ואני ).
- הסר מחיצת האף בצד האף של explant לחשוף את MES.
הערה: אלה צעדים מאוחר יותר של דיסקציות צריך תשומת לב זהירה לא להפריע את הקשר בין שני מדפים palatal משני. הסרת מחיצת האף עוזרלהפחית את האות רקע מאזורים אחרים וגם להפחית את תנועת רקמות אנכית, המאפשר הדמיה יציבה ( איור 1 J-L ). - לאחר לנתח את המדפים paltal, לבחון את האות כתב קו האמצע שוב כדי לוודא כי אין נזק לשכבת אפיתל בין הרקמות.
- הגדרת explants החיך בצלחת תרבות עם מדיה הדמיה חיה
- שים מדיה הדמיה חיה לתוך צלחת 35 מ"מ תחתית זכוכית.
- שים מדפים palatal לנתח את הצד הפה פונה כלפי מטה קרוב לתחתית זכוכית ככל האפשר עבור הדמיה עם מיקרוסקופ confocal הפוך ( איור 1 N ).
- המקום יבש כדורי קרח על משטח מוליך בקרבת צלחת תרבות לזרז מיצוק agarose ידי הפחתת טמפרטורה מהירה או לשים את צלחת התרבות ב 4 ° C. צלחת קרה, כגון אחד המשמש להטבעה פרפין יכול לשמש גם זהTage.
הערה: כאשר נעשה שימוש בקרח יבש, יש צורך לפקח בזהירות על שינוי המדיה של agarose כדי למנוע הקפאת חומרי הדפסה.
3. Confocal זמן לשגות הדמיה של Palate Explant
- הדמיה רכישת נתונים
- לאחר agarose היה מוצק למחצה, הר צלחת תרבות במיקרוסקופ confocal הפוך מצויד 37 ° C הדגירה קאמרית. השתמש מיקרוסקופ confocal אור לבן הצופה התא ספינינג דיסק מיקרוסקופ confocal.
הערה: השתמשנו מדיה שונה המכיל 15 מ"מ HEPES ללא CO 2 גז. - שים ג'לי נפט בין צלחת תרבות לכסות באמצעות מזרק כדי למנוע אידוי של התקשורת ( איור 1 נ ).
הערה: כמה עיבוי על גבי צלחת תרבות לכסות אחרי לילה (O / N) תרבות מתרחשת אבל את עוצמת הקול של התקשורת אינו משתנה המציין כי ג 'ל נפט מונע התקשורת מתאדים. - אתר את אזור העניין עם מטרות הגדלה נמוכה (10x) והשתמש ביעדי הגדלה גבוהים יותר (יעד 20x עם זום דיגיטלי 3x או מטרה 40x עם Immersol W) עבור זמן לשגות הדמיה חיה.
הערה: המדפים המשניים המשולשים המשניים אינם שטוחים. החיך המשני הוא מבנה מעוקל וזה מקשה על התמונה MES כולו באותו מטוס. הגדלה נמוכה (10x) הדמיה יכולה לאפשר הדמיה חיך שלם אבל מטרות 40x יספק רזולוציה טובה יותר תמונה לבחון תנועות הסלולר מפורט בעמדות Z עמוקים יותר. העקמומיות גבוהה באזור החיך האמצעי. החיך הקדמי והאחורי שטוח יחסית לחך האמצעי. לעתים קרובות אנו מדמיינים לעבר אמצע הקדמי של החיך המשני, כדי למנוע אזורים של עקמומיות גדולה. - סרוק מספר Z ערימות עם 5 מיקרומטר כל צעד במשך 16-24 שעות באמצעות עירור לייזר תקין (488 ננומטר עבור GFP ו 532/561 ננומטר עבור RFP) ( איור 2 ).
הערה: כדי להפחית פוטוטוקסיטיות פוטנציאלית, השתמש בזרימת לייזר מינימלית וזמן חשיפה. זה חשוב במיוחד במקרה של הדמיה רב צבע. השתמש 22% של 552 ננומטר כוח לייזר עבור membraneTomato (mT), 30% של 495 ננומטר כוח לייזר עבור membraneGFP (mG) ו 25% של 561 ננומטר כוח לייזר עבור membraneRFP. זמן החשיפה הממוצע היה 550 מילישניות. - השתמש בתוכנת ניתוח תמונה לבצע מעקב תא וניתוח כמותי.
- לאחר agarose היה מוצק למחצה, הר צלחת תרבות במיקרוסקופ confocal הפוך מצויד 37 ° C הדגירה קאמרית. השתמש מיקרוסקופ confocal אור לבן הצופה התא ספינינג דיסק מיקרוסקופ confocal.
4. נתונים ניתוח תמונה
הערה: כאן, Imaris היה בשימוש. ניתוח נתונים דומה עשוי להתבצע גם עם ImageJ או חבילות תוכנה Volocity.
- טיוח 3 מימדי (3D) משטחים מתוך רצפים התמונה.
הערה: סעיף זה מאפשר את יצירתו של משטח מסרט שנוצר עם אות קרום GFP.- לחץ על ערוך | הצג כוונון תצוגה והשתמש במחוון ההיסטוגרמה כדי לכוון את עוצמת האות כך שצליל הממברנה יהיה צלולאת אורך הסרט ( איור 3 א ).
- נכון אות מולבן באמצעות תמונה עיבוד | תיקון הנחתה . כוונן את עוצמת החזית ואת עוצמת העוצמה בחזרה כך שהקרום יהיה ברור לאורך הסרט. ייתכן שיהיה צורך בניסוי ובשגיאה בהגדרת ערכים אלה.
הערה: הערך Intensity Back (עומק Z) יהיה נמוך יותר מערך Intensity Front (משטח Z) עקב חדירת לייזר מוגבלת. ערכים אלה יכולים גם להשתנות כדי לנרמל את עוצמת האות בסדרה Z. שני הערכים עשויים להיות מותאמים כדי להשיג תיקון הלבנה. תיקון הנחתה נקרא גם תיקון הנחתה פליטה 19 . - על מנת ליצור משטח מתוך אות הממברנה, בחרו באפשרות Surpass משטחים , בחר ערוץ מקור וסוג סף (עוצמה מוחלטת) ומתחת להגדרות האלגוריתםהרצאה פלח רק אזור עניין ואת התהליך של התמונה כולה סוף סוף , ואחריו לחיצה על החץ הקדמי; המשך לדחוף את החץ הקדמי (השתמש בהגדרות ברירת המחדל, או ציין את 'שטח פני השטח' ואת שיטת הסף על ידי ניסוי וטעייה), ובדוק אם המשטח שנוצר משקף את אות הקרינה. כדי לציין אזור של עניין, בחר אזור וזמנים שיוצגו על ידי חיתוך X, Y, Z מיקומים.
הערה: בחר התהליך של התמונה כולה בסופו של דבר, כך התאמות וספים יחולו על פני הסרט כולו. - צור משטח על ידי לחיצה על לחצן החץ קדימה שוב. ואז להתאים את הסף על ידי שינוי ההיסטוגרמה במסננים כדי להתאים את האות הממברנה.
- לאחר השטח נוצר, לבחור משטח משטחים / הגדרות לדמיין את האות פני השטח ולסיים את תהליך יצירת פני השטח על ידי לחיצה על פעמיים עבורלחצן חץ ארד ( איור 3 ב ).
- עבור אל פני השטח ערוך ולחץ על ' מסכה' במסך ' מאפיינים' כדי ליצור תמונת ערוץ במסכה.
- לאחר לחיצה על אישור, חלון ערוץ Mask ייפתח באופן אוטומטי; בחר את ערוץ ה- GFP, להגדיר voxels מחוץ לפני השטח לעוצמה מקסימלית עוצמת האות (נמצא התאמה עריכת תצוגה ) ו voxels בתוך השטח לערך המינימום GFP עוצמת (נמצא גם ערוך | התאמת תצוגה ), במסך הגדרות כדי ליצור מסכה של האות קרום.
- כאשר המסכה של אות הממברנה תוצג בתצוגת Volume , צור תמונות הפוכות באמצעות עיבוד תמונה שינוי ניגודיות | הפוך ( איור 3 ג ).
- איתור כתמים מתוך תמונות פני השטח הפוכה.
הערה: סעיף זה מאפשר למרכז של כל תא להיותמסומן עם נקודה ייחודית במעקב על שטח וזמן.- בחר סורק סצינה כתמים | יצירה ; ב הגדרות אלגוריתם לבחור פלח רק אזור של עניין , תהליך של התמונה כולה סוף סוף ולעקוב אחר כתמים (לאורך זמן) .
- לחץ על החץ הקדמי וציין אזור של עניין; בחר את האזור ואת הזמן (ים) כדי לעקוב אחר כתמים; להמשיך לדחוף את החץ הקדמי, לבחור את ערוץ רעולי פנים כערוץ המקור ולקבוע את הקוטר XY משוער של כתמים.
- לחיצה על לחצן החץ הקדמי תפתח באופן אוטומטי חלון מסנן; להתאים את סף איתור ספוט על ידי שינוי ערכים היסטוגרמה ליצור כתמים בודדים במרכז כל תא ( איור 3 ד ).
- כמו לחיצה על כפתור החץ קדימה שוב יפתח את החלון אלגוריתם ., לבחור אוטומטית מעקב אחר תנועה מודל 20 ולציין את המעקב המקסימלי מעקבהעמידה וגודל הפער המרבי לחיבור רצועות שהופכות רציפות לתקופה קצרה של זמן.
- כמו לחיצה על כפתור החץ קדימה שוב יפתח את החלון מסננים, להגדיר את סף משך המסלול על ידי התאמת ההיסטוגרמה כך שכל תא הוא במעקב. לחיצה על לחצן החץ הכפול קדימה תגרום לסיום איתור נקודות.
- על מנת לתקן את להיסחף רקמות, לחץ על כתמים עקוב אחר עורך ובחר נקה להיסחף . חלון אלגוריתם ייפתח באופן אוטומטי; בחר את ההיסחפות בחר , כולל את התוצאה כולה , וכן לתקן אובייקטים מיקומים .
- יצירת מגרשים תצפית לניתוח כמותי.
הערה: Scatterplot של התוכנית הוא כלי ליצירת רב מימדי (X, Y, Z, צבע קנה מידה) גרפים עם אובייקטים מרובים. מגרשים אלה שימושיים לצפייה במגמות של תנועות תאים רבות לאורך זמן.- הפוך 2D או 3D מגרשים של מעקב אחר נתונים באמצעות התאVantage-להוסיף לתפריט העלילה ניו Vantage (E איור 3 ו 3F).
- בחר Volume או Spots ובחר Create / Category and Plot Type
- התאם ערכי מגרש ליצירת תרשימי Vantage שונים.
- ייצוא תרשימים באמצעות פונקציית Snapshot .
הערה: נתונים סטטיסטיים ניתן גם לייצא כמו גיליון אלקטרוני לניתוח כמותי נוסף על ידי לחיצה על שטח המספרים שטח שמור .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הדמיה חיה של החיך explant תרבות חשף תהליכים סלולריים מרובים מתווכים היתוך החיך 6 . הקשר הראשוני בין שני תאים אפיתל מבוצעים על ידי בליטות הממברנה ( איור 2 B-2E ). כאשר שני שכבות אפיתל נפגשים, הם יוצרים מרובת תאים מרובד MES ואחריו intercalation לעשות משולבת תא יחיד שכבת MES באמצעות התכנסות אפיתל ( איור 2 A-2E ואיור 2 K-2O ). תאי אפיתל ברמות Z עמוקות יותר גם נעקרו בהדרגה לצד הפה של MES התורם תהליך ההתכנסות אפיתל ( איור 2 K ). גירוי התנועתיות המכוונת למחלת העצם נצפתה באמצע החיך MES ( איור 2 F-2J ). בנוסף, מצאנו אקסטל תא ext אירועי היתוך במהלך היתוך החיך המרמז על כך תאים אפיתל ב MES ניתן להסיר על ידי תהליך זה פעיל ( איור 2 ש ', 2T ). התפר אפיתל משולב בסופו של דבר להישבר להשיג confluency mesenchymal ( איור 2 S, 2T ).
Lifeact-mRFPruby החיך הראה דינמי אקטין cytoskeletal סידורים במהלך היתוך החיך 6 . אקטין filamentous הפך מועשר על הגבול בין אזורי אפיתל ו mesenchymal להרכיב מבנה דמוי כבל לאורך הציר הקדמי-אחורי ( איור 2 K-2T) . התכווצות Actomyosin כוננים ההתכנסות epithelial ושבירה MES כי עיכוב כימי של פעילות מיוזין או פילמור אקטין חסם תהליכים דינמיים אלה 6 .
Hin-page = "1"> התוכנה שימשה להתחקות אחר התנהגויות הסלולר במהלך היתוך החיך. השיטה הטובה ביותר למעקב תא תלוי האות הכתב. אם עכבר כתב הגרעין משמש, התוכנית יכולה לעקוב אחר מרכז של אותות ניאון כמו מרכזי הסלולר 21 . הגרעין הגרעיני GFP כתב כגון ROSA26 GFP-NLS-lacZ ( GNZ) 22 ולכן ניתן להשתמש כדי לתווית תאים אפיתל באמצעות רקמות ספציפיות Cre; בידינו, זה כתב הגרעין הספציפי הציג הלבנה מהירה יותר לאורך זמן הקורס משמש הדמיה חיה. לכן, אנו ניצלו את הממברנה- GFP כתב ( ROSA26-mTmG flox ) לעקוב אחר תנועות תא אפיתל במחקר שלנו. זה נדרש שיטה לזיהוי ותחקור תאים בודדים על ידי אות קרום. כדי לפתור בעיה זו, השתמשנו בשיטת מעקב תא שונה ( איור 3 ופרוטוקול סעיף 4 ).
Content "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
איור 1 : תצוגה סכמטית של דיסקציה חך משניים העכבר. ( A ) בצד תצוגה של עוברי העכבר E14.5. כדי לנתח מדפים paltal, הראש נחתך לאורך הקו הראשון מקווקו לבן, # 1. ( B, C ) הוסר המוח העליון (מעל הקו הלבן השני, מס '2). ( D, E ) מבט אוראלי של ראש גזור. המנדט התחתון (# 3) היה גזור הלשון (# 4) הוסרה. ( F ) החלק האחורי של הראש לאורך הקו מס '5 נחתך. ( GI ) הן maxillae (# 6, # 7) ואת החלק הקדמי של הלסת העליונה (# 8) הוסרו. ( JL ) מחיצת האף (# 9) הוסר ( M ) האותות GFP ב MES של החיך גזור מ K14-cre; ROSA26 mTmG עוברי העכבר. ( N ) הגדרת הדמיה חיה. הצד האוראלי של החבראכל explant היה פונה כלפי מטה כדי להיות צילמו עם מיקרוסקופ confocal הפוך. MES מסומן עם ראשי חץ לבנים ( FI ). השטח הדמיה מסומן על ידי קופסאות מנוקדות לבן L ו- M סולם ברים = 2 ס"מ A, 1 ס"מ ב- BI, 500 מיקרומטר JM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2 : הדמיה חיה של תרבויות explant החיך. ( AE ) הדמיה חיה של החיך המשני הקדמי מ k14-cre; ROSA26 mTmG explant (5 מיקרומטר עומק). ראש חץ לבן מראה בליטה קרום תא אפיתל ( FJ ) הדמיה חיה של החיך האמצעי מ K14-Cre; ROSA26 mTmG explant (5 מיקרומטר ד Epth). חצים לבנים מצביעים על כיוון נדידות התאים מהחך הקדמי ועד החך. ( KO ) הדמיה חיה של החיך הקדמי מ Lifeact-mRFPruby explant (5 מיקרומטר עומק). תזוזה תא אפיתל (חץ צהוב) על פני הפה והתכנסות כדי ליצור MES משולב עם מבנים כמו אקטין כבל בקו האמצע. ( PT ) הדמיה חיה של החיך הקדמי מ Lifeact-mRFPruby explant (25 מיקרומטר עומק). החץ האדום מציין אירוע שחול תא ( Q, T ). נקודות שבירה עתידיות של התפר מסומנים על ידי שני חצים אנכיים לבנים S ו- T. סולם ברים = 20 מיקרומטר. כל נתוני הדמיה חיים נתון זה נגזר ניסויים שפורסמו בעבר ב 6 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
-Page = "1"> 
איור 3 : ניתוח נתונים. ( AD ) כדי לעקוב אחר תאים אפיתל עם אותות GFP ממברנה מ K14-cre; ROSA26 mTmG החיך explant ( A ), משטח נוצר על ידי נפח טיוח של האות GFP הממברנה ( B ). תמונות הפוכות נוצרו לאחר מיסוך המשטח שנוצר ( C ). מרכזים סלולריים זוהו מהתמונות הפוכות באמצעות פונקציית איתור הנקודות באימאריס ( D ). ( ה ) שחזור 3D לאפשר מעקב אחר תנועות התא במספר כיוונים. A: הקדמי, P: אחורית, N: האף, O: אוראלי ( F ) ניתוח 2D מייצר מגרש תצפית מראה תאים נודדים מן הקדמי לכיוון אחורי באמצע החיך MES. סולם ברים = 20 מיקרומטר AD, 10 מיקרומטר EF.S / ftp_upload / 56041 / 56041fig3large.jpg "target =" _ blank "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 1: הדמיה חיה של K14-Cre; ROSA26-mTmG החיך הקדמי flox (5 מיקרומטר עומק). תמונות נתפסו כל 10 דקות (10 דקות / מסגרת) במשך 16 שעות 20 דקות, קנה מידה בר = 25 מיקרומטר. סרטון זה הוא מיקום Z שונה של סרט שפורסם בעבר בהתייחסות 6 . לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד).
איור 2: הדמיה חיה של K14-Cre; ROSA26-mTmG flox החיך האמצעי (עומק 5 מיקרומטר). תמונות נתפסו כל 15 דקות (15 דקות / מסגרת) במשך 13 שעות 30 דקות, קנה מידה בר = 25 מיקרומטר. סרטון זה פורסם בעבר בהתייחסות 6 . לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד).
איור וידאו 3: הדמיה חיה של LifeACT-mRFPruby החיך הקדמי (עומק 5 מיקרומטר).
תמונות נלקחו כל 10 דקות (10 דקות / מסגרת) במשך 7 שעות 50 דקות. סולם בר = 20 מיקרומטר. סרטון זה פורסם בעבר בהתייחסות 6 . לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד).
איור 4: הדמיה חיה של LifeACT-mRFPruby החיך הקדמי (25 מיקרומטר עומק).
תמונות נלקחו כל 10 דקות (10 דקות / מסגרת) במשך 7 שעות 50 דקות. סולם בר = 20 מיקרומטר. סרטון זה הוא מיקום Z שונה של סרט שפורסם בעבר בהתייחסות 6 . לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הדמיה חיה של morphogenesis רקמות עם 3D תרבות explant איבר יכול לספק מידע מפורט לגבי תהליכים תאיים כי לא ניתן להציג ניתוח מכתים קונבנציונלי של קטעי רקמה קבועה. שימוש בתרבות explant חוץ גופית של החיך העכברי העכבר העכבר, ראינו כמה התנהגויות הסלולר מעניין מוביל אותנו להציע מנגנון חדש של היתוך החיך המערבת התכנסות epithelial ו שחול התא.
אחד האתגרים הנפוצים במחקרים מסוג זה הוא photobleaching על ידי עירור לייזר מתמשך במשך זמן רב. במחקרינו נעשה שימוש במיקרוסקופ קונוקולרי של אור לבן ובמיקרוסקופ קונוקולרי של דיסק מסתובב. ירידה מסוימת בעוצמת האות לאורך זמן ניתנת לתיקון על ידי תיקוני הלבנה בתוכנת ההדמיה (LAS-AF) (פרוטוקול 4.1). בגלל תיקון הלבנה מוגבל, חשוב בזהירות לייעל את כוח הלייזר ואת זמן החשיפה בכל מערכת הדמיה. בדקנו גםכי היתוך החיך מתרחשת בדרך כלל בתקשורת הדמיה חיה לאחר תרבות 3 יום 6 .
בעיה נפוצה שנייה בהדמיה חיה היא להיסחף רקמות. זה קריטי כדי למזער סחף כדי לקבל תמונות עקביות במהלך הדמיה חיה, כי שינויים במישור המוקד יכול לבלבל הבנה של שינויים morphogenetic לאורך זמן. בעוד שליטה סחיפה תרמית יכולה להיות מושגת במיקרוסקופים confocal רבים (המיקוד מוגדר במיקרוסקופ), נסחף הרקמה יחסית לתחתית זכוכית לא יכול להיות מתוקן על ידי שיטות אלה. ניצול agarose, כמו גם הצבת explant נגד זכוכית התחתונה מסייע למזער את זה, אבל עדיין צריך לקחת רק כדי לנתח את הסרטים לשמור על עמדה קבועה יחסית. זה יכול להיקבע על ידי ביצוע מספר נקודות שליטה בתחום הדמיה על פני זמן כדי לקבוע אם הם נשארים קבועים, לנוע עם מגמה דומה, או לזוז אחרת. במידה מסוימת, באמצעות פוסט שלאחר עיבודהמכרזים מאפשרים תיקון של רקמה כלשהי בהדמיה חיה (פרוטוקול 4.2).
נמוכה agarose ההיתוך שימש בריכוז סופי של 0.6% בתקשורת הדמיה לחיות כדי לשתק את הרקמות explant. כאשר בדקנו ריכוזים גבוהים יותר של agarose, הם נראו לפגוע במורפוגנזה רקמה כנראה בגלל אילוץ מכני. לכן חשוב להשתמש ריכוז agarose הנכון כדי למזער רקמות להסחף בזמן לא מטריד מורפוגנזה.
בשל עומק הדמיה confocal, שיטה זו מציבה גבולות בבדיקת מטוסי Z עמוקים מאוד של היתוך החיך. שימוש בשני אור לבן ו מסתובב confocal מיקרוסקופים הדיסק, אות מעומקים 100 מיקרומטר יכול להיות צילמו בהצלחה למרות התמונה החלה להיות משעמם חלש מעבר למגבלה זו. בגלל היתוך החיך הוא תהליך פרוגרסיבי של הצירים ו anteroposterior, אנו מציעים כי הדמיה עמדות מרובות ביעילות מאפשר הדמיה של מחלקה שוניםHS של היתוך החיך, אבל שני פוטון או אור גיליון confocal מיקרוסקופ עשוי להיות מועסק בעתיד כדי לשפר את עומק ההדמיה. במרבית הניסויים שלנו צולם הצד הפומי של חקר החיך. הדמיה של צד האף של חך explant קשה כי מחיצת האף הוא התמזגו או קרוב מאוד המדפים paltal משני. בניסיונות שלנו היתוך תמונה מן הצד האף, זה היה גם צורך להסיר את רקמת האף נוספת כך שזה לא להפריע את האות מן אפיתל החיך. אם כי אפשרי, הדמיה בצד האף של חך explant היה קשה, כי דיסקציה של מחיצת האף לעתים קרובות גרמה נזק לחך explants.
הדמיה חיה של explants רקמה העכבר הוא שיטה רבת עוצמה ללמוד מנגנונים הסלולר של מורפוגנזה רקמות במהלך ההתפתחות העוברית. שימוש בטכניקות מיקרוסקופיה confocal וניתוח הדמיה כמותית, תהליכים התפתחותיים בסיסיים כגון היתוך החיך המשני יכול להיותנחקר ברמה התאית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים למ 'דאגלס בנסון לשיחות ראשוניות בנושא הדמיה משנית של החיך. כמו כן, אנו מודים דוד Castandeda-Castellanos (לייקה) וכריס Rieken (Zeiss) על עזרתם כדי להתאים את תנאי הדמיה במיקרוסקופ confocal. אנו מעריכים את Lynsey Hamilton (Bitplane) להצעות מועילות לניתוח תמונות כמותי באמצעות תוכנת Imaris. עבודה זו מומנה על ידי NIH / NIDCR R01 DE025887.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 | Life technology | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Life technology | 16000-044 | |
| L-glutamine | Life technology | 25030-081 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A4544-100G | |
| Pennicillin/Streptomycin | Life technology | 15140-122 | |
| Low melting agarose | BioExpress | E-3111-125 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Petrolieum Jelly (Vaseline) | Sigma | 16415-1Kg | |
| Mice | |||
| Keratin14-cre | MGI: J:65294 | Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc | |
| ROSA26mTmG | MGI: J:124702 | Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo | |
| Lifeact-mRFPruby | MGI: J:164274 | Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows | |
| Microscope | |||
| White Light SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss Microscopy |
References
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).
- Dudas, M., Li, W. -Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. Palatal fusion - where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birth defect. Acta Histochem. 109, 1-14 (2007).
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139, 231-243 (2012).
- Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and Molecular Mechanisms of Palatogenesis. Curr Top Dev Biol. 115, 59-84 (2015).
- Taya, Y., O'Kane, S., Ferguson, M. W. Pathogenesis of cleft palate in TGF-b3 knockout mice. Development. 126, 3869-3879 (1999).
- Kim, S., et al. Convergence and Extrusion Are Required for Normal Fusion of the Mammalian Secondary Palate. PLOS Biol. 13, 100122 (2015).
- Yoshida, M., et al. Periderm cells covering palatal shelves have tight junctions and their desquamation reduces the polarity of palatal shelf epithelial cells in palatogenesis. Genes Cells. 17, 455-472 (2012).
- Fitchett, J., Hay, E. Medial edge epithelium transforms to mesenchyme after embryonic palatal shelves fuse. Dev. Biol. 131, 455-474 (1989).
- Akira, N., et al. The expression of TGF-beta3 for epithelial-mesenchyme transdifferentiated MEE in palatogenesis. J Mol Hist. 41, 343-355 (2010).
- Sani, F. V., et al. Fate-mapping of the epithelial seam during palatal fusion rules out epithelial-mesenchymal transformation. Dev. Biol. 285, 490-495 (2005).
- Jin, J. -Z., Ding, J. Analysis of cell migration, transdifferentiation and apoptosis during mouse secondary palate fusion. Development. 133, 3341-3347 (2006).
- Xu, X., et al. Cell autonomous requirement for Tgfbr2 in the disappearance of medial edge epithelium during palatal fusion. Dev. Biol. 297, 238-248 (2006).
- Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro: an analysis by Dil labelling and confocal microscopy. Development. 114, 379-388 (1992).
- Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Dassule, H., Lewis, P., Bei, M., Mass, R., McMahon, A. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127, 4775-4785 (2000).
- Eisenhoffer, G., et al. Crowding induces live cell extrusion to maintain homeostatic cell numbers in epithelia. Nature. 484, 501-546 (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Riedl, J., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7, 168-169 (2010).
- Can, A., et al. Attenuation correction in confocal laser microscopes: a novel two-view approach. J Microsc. 211, (2003).
- Veenman, C., Reinders, M., Backer, E. Resolving motion correspondence for densely moving points. IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 23, 54-72 (2001).
- Udan, R., Piazza, V., Hsu, C., Hadjantonakis, A., Dickinson, M. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141, 4406-4414 (2014).
- Stoller, J., et al. Cre reporter mouse expressing a nuclear localized fusion of GFP and beta-galactosidase reveals new derivatives of Pax3-expressing precursors. Genesis. 46, 200-204 (2008).
