Summary
هنا، نقدم بروتوكول للتصوير الحي من الماوس الانصهار الحنك الثانوي باستخدام المجهر متحد البؤر. هذا البروتوكول يمكن استخدامها في تركيبة مع مجموعة متنوعة من خطوط الماوس مراسل الفلورسنت، ومع مثبطات المسار لبصيرة الميكانيكية. ويمكن تكييف هذا البروتوكول للتصوير الحي في النظم التنموية الأخرى.
Abstract
انصهار الرفوف الحنكية الثانوية لتشكيل الحنك الثانوي سليمة هو عملية رئيسية في تطوير الثدييات وانقطاعه يمكن أن يؤدي إلى الحنك الثانوي الحلق، وهو شذوذ خلقي مشترك في البشر. وقد تم دراسة اندماج الحنك الثانوي على نطاق واسع مما أدى إلى العديد من الآليات الخلوية المقترحة التي قد توسط هذه العملية. ومع ذلك، فقد أجريت هذه الدراسات في الغالب على الأنسجة الجنينية الثابتة في نقاط زمنية التقدمية أثناء التنمية أو في الثقافات المستكشفة الثابتة تحليلها في نقاط زمنية ثابتة. تحليل ثابت محدود لتحليل العمليات التشكلية الديناميكية مثل الانصهار الحنك وما هي أنواع السلوكيات الخلوية الديناميكية توسط الانصهار الحنكي غير مفهومة تماما. نحن هنا وصف بروتوكول للتصوير الحي من السابقين فيفو الانصهار الحنك الثانوي في أجنة الماوس. لدراسة السلوكيات الخلوية من الانصهار الحنك، تم استخدام كيراتين 14 -cre الظهارية لتسمية الخلايا الظهارية الحنك في روسA26- متمغ الأجنة مراسل فلوكس . لتصور أكتين الخيطية، استخدمت الفئران مراسل ليفاكت-مرفبروبي . تم إجراء التصوير الحي من الانصهار الحنك الثانوي عن طريق تشريح الرفوف الحنكية الثانوية انضمت مؤخرا من الجنينية يوم (E) 14.5 مرحلة الأجنة وزراعة في وسائل الإعلام التي تحتوي على الاغاروز على طبق القاع الزجاج لتمكين التصوير مع المجهر متحد البؤر مقلوب. باستخدام هذه الطريقة، لقد اكتشفنا مجموعة متنوعة من السلوكيات الخلوية الرواية خلال الانصهار الحنك الثانوي. إن تقدير كيفية تنسيق سلوكيات الخلايا المتميزة في المكان والزمان يسهم إلى حد كبير في فهمنا لهذه العملية التشكلية الديناميكية. هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على خطوط الماوس متحولة، أو الثقافات تعامل مع مثبطات الدوائية لمواصلة دفع فهم كيفية السيطرة على الانصهار الحنك الثانوي.
Introduction
الأنسجة الانصهار هو خطوة هامة في تطوير أجهزة متعددة. يمكن أن تشوه العيوب البشرية الرئيسية مثل الشفة المشقوقة والحنك، السنسنة المشقوقة وتشوهات القلب من عيوب في انصهار الأنسجة 1 . وقد تم دراسة الماوس الماوس الحنك الانصهار على نطاق واسع لتحديد الآليات الخلوية والجزيئية السيطرة على انصهار الأنسجة في التنمية 2 ، 3 ، 4 . في الماوس، يبدأ تطوير الحنك الثانوي في جميع أنحاء E11.5 مع ثمار الرف الحنكي الثانوي من كل من العمليات الفك العلوي الثنائية. النمو الأولي للرفوف الحنكية يحدث عموديا على طول اللسان، حتى حوالي E14.0، في ذلك الوقت، رفوف الحنك تصبح مرتفعة أفقيا فوق اللسان. يؤدي النمو الموجه وسطيا إلى الاتصال الجسدي بين ظهارة التطبيق من الرفوف الحنكية اثنين، وتشكيل خط الوسط إبيثيليآل سيم (ميس) عند E14.5. يجب إزالة ميس ميس من بين الرفوف الحنكية الثانوية للسماح التقاء الوسيطة وتطوير سليمة، تنصهر تماما الحنك الثانوي من قبل E15.5 3 .
كيف يتم تشكيل طبقة الخلية الظهارية الخلية ميس بين اثنين من رفوف الحنجرة منفصلة، ومن ثم إزالتها لتحقيق كونفلنسي الوسيطة، وكان السؤال الرئيسي في التنمية الحنك. استنادا إلى دراسات الماوس المجهري والإلكترون المجهري (إم) والدراسات ثقافة إكسلانت، والتجارب الوراثة الماوس وظيفية، وقد تورطت العديد من السلوكيات الخلية الأساسية في هذه العملية. الإسقاطات مثل فيلوبوديا من الحافة الإنسية ظهارة مي من كل رف الحنطة يسهل الاتصال الأولي 5 ، 6 ، تليها إقحام هذه الخلايا الظهارية إلى ميس واحد مشترك 6 ، 7 . إزالة المحطة ميس المشتركة الناتجةاقترح المضي قدما بثلاث آليات غير حصرية. وأشارت الدراسات المبكرة التي تستخدم الرصد النسيجي والجسم الحي خارج تتبع المفردات مع الأصباغ الحيوية أن ميس يمكن إزالتها عن طريق الظهارية إلى الانتقال الوسيطة (إمت) من الخلايا ميس 8 ، 9 ، على الرغم من أن في الآونة الأخيرة، تتبع النسب الوراثية للخلايا الظهارية أثار عدم اليقين فيما يتعلق والمساهمة على المدى الطويل من الخلايا الظهارية إلى الحنك الحنكي اللحمة المتوسطة 10 ، 11 ، 12 . وقد أدت أعداد كبيرة من الخلايا الأبوطوزية، وانخفاض في عددهم في بعض المسوخ التي تفشل في الخضوع الصحيح الانصهار الحنك إلى فكرة أن موت الخلايا المبرمج قد يكون المحرك الرئيسي لحل ميس 2 ، 3 . وأخيرا، استنادا في البداية على الدراسات التي تنطوي على وضع العلامات الظهارية والملاحظة ثابتة في تيمبوانتس التقدمية، خلايا ميسقد اقترحت على الهجرة في أبعاد الأوعية و الأمامي الخلفي 11 ، 13 ، ولكن هذه السلوكيات خلية ديناميكية في البداية غير مؤكدة بسبب عدم القدرة على مراقبتها في الأنسجة الحنكية الحية. في الآونة الأخيرة، كنا قادرين على مراقبة مباشرة هذه السلوكيات من خلال تطوير منهجية التصوير الحية الجديدة التي تجمع بين الأساليب الوراثية الماوس من وضع العلامات الفلورسنت مع التصوير المباشر مبائر من الرفوف الحنكية إكسلانتيد.
أولا، لتصور السلوكيات الخلوية الديناميكية في الخلايا الظهارية الحنك أثناء الانصهار الحنك، أنشأنا الماوس مراسل الظهارية محددة عن طريق عبور ROSA26- متمغ الفئران فلوكس مع الفئران Keratin14-كري 14 ، 15 . وأكد التصوير مبائر الحية من ثقافة الحنك إكسلانت من الأجنة الناتجة بعض السلوكيات الخلوية المقترحة سابقا وحددت الأحداث الرواية في عملية الاندماج 6 6 ، 16 . هذا الأسلوب التصوير يمكن استخدامها مع خطوط مراسل أخرى. استخدمنا الفئران المعدلة وراثيا ليفيكت-مرفبروبي 17 ، 18 لدراسة ديناميات الهيكل الخلوي أكتين أثناء عملية الانصهار. ويمكن أيضا للصحفيين الآخرين أن تستخدم لمراقبة جوانب محددة أخرى من الانصهار الحنك ويمكن تكييف هذه الطريقة إما ليزر المسح متحد البؤر المجهري أو الغزل القرص المجهري متحد البؤر، اعتمادا على احتياجات التصوير والمجهر توافر. أصبح التصوير الحي على نحو متزايد نهجا رئيسيا في علم الأحياء التنموي. حزببشكل رئيسي، التشكل القحفي الوجهي هو التشوهات المعقدة والإنسانية التي تؤثر على الوجه شائعة. وهذا مبهجة طريقة التصوير الحية تساعد على تمكين فهم أفضل للآليات التنموية الأساسية الكامنة وكذلك أصول تشوهات القحف القحفي البشري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا لبروتوكولات جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة.
1. إعداد وسائل الإعلام التصوير لايف
- إعداد وسائل الإعلام ثقافة السائل
- إضافة 20٪ مصل بقري جنيني (فبس)، 2 ملي L- الجلوتامين، 100 / مل البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و 200 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك L، 15 هيبيس ملي إلى تعديل دولبيكو النسر المتوسطة (دمم) / F12 وسائل الإعلام.
ملاحظة: تم إجراء وسائل الإعلام التصوير الحية بشكل طيب الحق قبل التصوير. تحتوي هذه الوسائط على الفينول الأحمر الذي قد يؤدي إلى السمية الضوئية على مدى دورات طويلة من التصوير الحي. استبدال الوسائط دون الفينول الأحمر قد يحسن التصوير على المدى الطويل.
- إضافة 20٪ مصل بقري جنيني (فبس)، 2 ملي L- الجلوتامين، 100 / مل البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و 200 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك L، 15 هيبيس ملي إلى تعديل دولبيكو النسر المتوسطة (دمم) / F12 وسائل الإعلام.
- إعداد حل الاغاروز ذوبان منخفضة
- حل 350 ملغ من الاغاروز ذوبان منخفضة في 10 مل من الماء المقطر تعقيمها لجعل حل الأسهم 3.5٪.
- مزيج الحل الاغاروز جيدا واحتضان عند 70 درجة مئوية في حمام مائي لحل الاغاروز تماما.
- تبريد محلول الاغاروز في حمام مائي 37 درجة مئوية قبل إضافته إلى وسائل الإعلام التصوير الحي.
- إضافة 1 مل من الحل الأسهم الاغاروز إلى 5 مل من السائل وسائل الإعلام التصوير الحية لجعل تركيز النهائي (0.6٪).
- الحفاظ على وسائل الإعلام مع الاغاروز في حمام مائي 37 درجة مئوية لمنع التصلب المبكرة.
2. إعداد باليت إكسبلانت ثقافة للعيش التصوير
- تشريح في الآونة الأخيرة التمسك الرفوف الحنفيات الثانوية E14.5
ملاحظة: في تجربتنا التصوير الانصهار يتطلب بدءا مع زوج ملتصق قليلا من رفوف الحنجرة؛ وهذا التماسك يمنع الحركات إكسلانت التي تمنع الانصهار من حدوث أثناء التصوير.- تشريح E14.5 مرحلة الأجنة في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (بس) واختيار بروتين الفلورسنت الأخضر (غفب) -expressing (منK14-لجنة المساواة العرقية. ROSA26-متمغ فلوكس ) أو (البروتين الفلوري الأحمر) RFP- معربا عن ( ليفيكت-مرفروبي ) الأجنة الإيجابية باستخدام المجهر تشريح مجهزة مصابيح الفلورسنت. نقل الأنسجة إلى ما قبل تحسنت وسائل الإعلام ثقافة التصوير الحي دون الاغاروز.
- قطع رأس الجنين وإزالة منطقة الدماغ العلوي باستخدام ملقطين رقم 5 غرامة ( الشكل 1 A-C ). استخدام واحد رقم 5 ملقط لعقد الجنين في حين ملقط رقم 5 أخرى لقطع الأنسجة خارج خارج الرفوف الحنكية.
ملاحظة: مقص غرامة يمكن استخدامها لقطع رأس الجنين (الخطوة الأولى) بدلا من واحد رقم 5 ملقط. ومع ذلك، فإن اثنين من 5 ملقط غرامة تعطي أفضل السيطرة على إجراء تخفيضات دقيقة. - إزالة الفك السفلي بعناية دون الإضرار الرفوف الحنكية كما هو مبين في الشكل 1 D و 1E . لتقليل فرصة الأذى الضارة، والحفاظ على اللسان من خلال تشريح الفك السفلي، ويلوها إزالة دقيق لللسان.
- بعد إزالة الفك السفلي واللسان، وفحص الجانب عن طريق الفم من الحنك الثانوي مع ستيريوميكروسكوب مع مضان لتأكيد إشارة مراسل قوي في ميس ( الشكل 1 M ).
- تشريح الأجزاء الخلفية بما في ذلك هيندبراين وجذع الدماغ بعد إزالة الفك السفلي واللسان ( الشكل 1 F ).
- إزالة كل من الفك العلوي مع الرفوف الحنكية انضمت ( الشكل 1 G ).
- قطع الأمامي العلوي الأنسجة الفك حفظ كل من الحنك الابتدائي والثانوي سليمة ( الشكل 1 H و I ).
- إزالة الحاجز الأنفي على الجانب الأنفي من إكسلانت تعريض ميس.
ملاحظة: هذه الخطوات في وقت لاحق من التشريح تحتاج إلى عناية دقيقة لا لتعطيل الاتصالات بين اثنين من رفوف الحنجرة الثانوية. إزالة الحاجز الأنفي يساعد علىوالحد من إشارة الخلفية من مناطق أخرى، وكذلك الحد من حركة الأنسجة العمودية، مما يسمح التصوير مستقر ( الشكل 1 J-L ). - بعد تشريح الرفوف الحنكية، وفحص إشارة مراسل خط الوسط مرة أخرى للتأكد من أنه لا يوجد أي ضرر للطبقة الظهارية بين الأنسجة.
- إعداد المستكشفين الحنك في طبق الثقافة مع وسائل الإعلام التصوير الحية
- وضع وسائل الإعلام التصوير الحية في 35 ملم طبق الزجاج السفلي.
- وضع تشريح الحنفيات رفوف الجانب عن طريق الفم تواجه أسفل أقرب إلى أسفل الزجاج ممكن للتصوير مع المجهر متحد البؤر مقلوب ( الشكل 1 N ).
- مكان الكريات الجليد الجاف على سطح موصل قريب إلى طبق الثقافة لتسريع صلابة الاغاروز عن طريق خفض درجة الحرارة بسرعة أو وضع طبق الثقافة في 4 درجات مئوية. ويمكن أيضا استخدام لوحة الباردة، مثل واحدة تستخدم لتضمين البارافين في هذا sالمئوية.
ملاحظة: عندما يتم استخدام الثلج الجاف، تحتاج إلى تغيير وسائل الإعلام الاغاروز بعناية لمنع وسائل الإعلام تجميد.
3. متحد البؤر الوقت الفاصل التصوير من باليت إكسبلانت
- التصوير والحصول على البيانات
- بعد الاغاروز شبه صلابة، جبل طبق الثقافة في المجهر متحد البؤر مقلوب مجهزة 37 درجة مئوية غرفة الحضانة. استخدام الضوء الأبيض متحد البؤر المجهر والخلية مراقب الغزل القرص المجهر متحد البؤر.
ملاحظة: استخدمنا وسائل الاعلام المعدلة تحتوي على 15 ملي HEPES بدون غاز CO 2. - وضع هلام البترول بين طبق الثقافة والغطاء باستخدام حقنة لمنع تبخر وسائل الإعلام ( الشكل 1 N ).
ملاحظة: بعض التكثيف على الجزء العلوي من غطاء الطبق الثقافة بعد بين عشية وضحاها (O / N) ثقافة يحدث ولكن حجم وسائل الإعلام لا يتغير مما يشير إلى أن هلام البترول يمنع وسائل الإعلام من التبخر. - تحديد المنطقة ذات الاهتمام مع أهداف التكبير منخفضة (10X) واستخدام أهداف التكبير العالي (الهدف 20X مع تقريب رقمي 3X أو هدف 40X مع إمرسول W) لفترات زمنية طويلة التصوير الحي.
ملاحظة: تشريح الرفوف الحنكية الثانوية ليست مسطحة. الحنك الثانوي هو هيكل منحني وهذا يجعل من الصعب على صورة ميس بأكمله في نفس الطائرة. التكبير المنخفض (10X) التصوير يمكن أن تسمح التصوير الحنك كله ولكن 40X الأهداف سوف توفر أفضل دقة الصورة لدراسة الحركات الخلوية مفصلة في مواقف Z أعمق. انحناء مرتفع في منطقة الحنك الأوسط. الأمامي والحنك الخلفي مسطحة نسبيا مقارنة مع الحنك الأوسط. نحن غالبا ما صورة نحو منتصف الأمامي من الحنك الثانوي لتجنب المناطق من أكبر انحناء. - مسح عدة Z مداخن مع 5 ميكرون كل خطوة لمدة 16-24 ساعة باستخدام الإثارة الليزر المناسبة (488 نانومتر ل غفب و 532/561 نانومتر ل رفب) ( الشكل 2 ).
ملاحظة: للحد من السمية الضوئية المحتملة، استخدم الحد الأدنى من قوة الليزر ووقت التعرض. هذا مهم خصوصا في حالة التصوير متعدد الألوان. استخدام 22٪ من 552 نانومتر قوة الليزر ل غشاء الطماطم (مت)، 30٪ من 495 نانومتر ليزر قوة غشاء غشاء (مغ) و 25٪ من 561 نانومتر ليزر قوة غشاء رف. وكان متوسط وقت التعرض 550 مللي ثانية. - استخدام برنامج تحليل الصور لأداء تتبع الخلية والتحليل الكمي.
- بعد الاغاروز شبه صلابة، جبل طبق الثقافة في المجهر متحد البؤر مقلوب مجهزة 37 درجة مئوية غرفة الحضانة. استخدام الضوء الأبيض متحد البؤر المجهر والخلية مراقب الغزل القرص المجهر متحد البؤر.
4. تحليل صورة البيانات
ملاحظة: هنا، تم استخدام إماريس. ويمكن أيضا إجراء تحليلات بيانات مماثلة مع حزم برامج إيماجيج أو فولوسيتي.
- تقديم السطوح ثلاثية الأبعاد (3D) من تسلسل الصورة.
ملاحظة: هذا القسم يتيح توليد سطح من فيلم ولدت مع إشارة غفب غشاء.- انقر على تعديل | عرض عرض التكيف واستخدام شريط التمرير المدرج البياني لضبط كثافة الإشارة بحيث إشارة غشاء واضح من خلالخارج طول الفيلم ( الشكل 3 A ).
- تصحيح إشارة ابيض باستخدام صورة معالجة | تصحيح التوهين . ضبط الجبهة كثافة وكثافة عودة القيم بحيث إشارة غشاء واضح طوال طول الفيلم. قد تكون هناك حاجة لبعض التجارب والخطأ في تحديد هذه القيم.
مالحظة: ستكون قيمة الكثافة الخلفية) الموضع األعمق Z (أقل من قيمة كثافة الشدة) موضع Z (بسبب اختراق الليزر المحدود. وبالتالي يمكن تغيير هذه القيم أيضا لتطبيع كثافة الإشارة في السلسلة Z. قد يتم تعديل كلا القيمين لتحقيق تصحيح التبييض. ويسمى تصحيح التوهين أيضا تصحيح التوهين الصادر عن الإنبعاثات 19 . - من أجل توليد سطح من إشارة الغشاء، حدد سورباس | السطوح ، واختيار قناة المصدر ونوع عتبة (كثافة مطلقة) وتحت إعدادات خوارزمية سيlect تقسيم منطقة ذات اهتمام فقط وعملية الصورة بأكملها أخيرا ، تليها النقر على السهم إلى الأمام. الاستمرار في دفع السهم إلى الأمام (استخدام الإعدادات الافتراضية، أو تحديد المساحة السطحية مستويات التفاصيل وطريقة العتبة من قبل التجربة والخطأ)، والتحقق مما إذا كان السطح ولدت يعكس إشارة مضان. لتحديد منطقة اهتمام، حدد المنطقة والوقت (ق) ليتم عرضها من خلال الاقتصاص X، Y، Z المواضع.
ملاحظة: حدد عملية الصورة بأكملها أخيرا بحيث يتم تطبيق التعديلات وعتبات في جميع أنحاء الفيلم بأكمله. - إنشاء سطح عن طريق النقر على زر السهم إلى الأمام مرة أخرى. ثم ضبط عتبة عن طريق تغيير الرسم البياني في الفلاتر لتتوافق مع إشارة الغشاء.
- بعد إنشاء السطح، واختيار السطح في السطوح / إعدادات لتصور إشارة السطح والانتهاء من عملية توليد السطح عن طريق دفع مزدوج فوروزر السهم ( الشكل 3 ب ).
- انتقل إلى سورفيس | تحرير وانقر فوق قناع الكل في خصائص قناع لإنشاء صورة قناة مقنعة.
- بعد النقر على موافق، سيتم فتح نافذة قناة قناع تلقائيا؛ حدد قناة غفب، تعيين فوزيلس خارج السطح إلى أقصى قيمة شدة إشارة (وجدت في تحرير | تعديل العرض ) وفوزيلس داخل السطح إلى الحد الأدنى من قيمة غفب كثافة (وجدت أيضا في تحرير | ضبط العرض )، في إعدادات قناع لتوليد قناع لإشارة الغشاء.
- كما سيتم عرض قناع إشارة الغشاء في طريقة العرض فولوم ، توليد الصور مقلوب باستخدام معالجة الصور | تغيير التباين | عكس ( الشكل 3 C ).
- الكشف عن البقع من صور سطح مقلوب.
ملاحظة: يسمح هذا القسم مركز كل خلية لتكونملحوظ مع بقعة فريدة من نوعها وتعقب على مساحة والزمان.- حدد سورباس سين | البقع | إنشاء ؛ في خوارزمية إعدادات اختيار شريحة فقط منطقة اهتمام ، عملية الصورة بأكملها أخيرا وتتبع البقع (مع مرور الوقت) .
- انقر على السهم للأمام وحدد منطقة اهتمام؛ حدد المنطقة والوقت (ق) لتتبع البقع. الاستمرار في دفع السهم إلى الأمام، واختيار قناة ملثمين كقناة المصدر وتحديد يقدر زي قطر البقع.
- كما النقر على زر السهم إلى الأمام سوف تفتح تلقائيا نافذة مرشح. ضبط عتبة الكشف عن بقعة عن طريق تغيير القيم في الرسم البياني لتوليد بقع واحدة في مركز كل خلية ( الشكل 3 D ).
- كما النقر على زر السهم إلى الأمام مرة أخرى سيتم فتح نافذة خوارزمية .، واختيار الانتعاش التلقائي نموذج تتبع الحركة 20 وتحديد الحد الأقصى تتبع ديموقف وحجم الفجوة القصوى لربط المسارات التي تصبح متقطعة لفترة قصيرة من الزمن.
- كما النقر على زر السهم إلى الأمام مرة أخرى سيتم فتح نافذة الفلاتر، تعيين عتبة مدة المسار عن طريق ضبط الرسم البياني بحيث يتم تتبع كل خلية. يؤدي النقر على زر السهم المزدوج إلى وضع اللمسات الأخيرة على الكشف الفوري.
- من أجل تصحيح الانجراف الأنسجة، انقر البقع | محرر المسار وحدد الانجراف الصحيح . سيتم فتح نافذة خوارزمية تلقائيا. حدد الانجراف الانتقالي المحدد، وقم بتضمين النتيجة بالكامل ، وتصحيح مواضع الكائنات .
- توليد المؤامرات الفضل للتحليل الكمي.
ملاحظة: سكاتيربلوت البرنامج هو أداة لتوليد متعددة الأبعاد (X، Y، Z، اللون والمقياس) الرسوم البيانية مع كائنات متعددة. هذه المؤامرات مفيدة لعرض اتجاهات العديد من تحركات الخلية مع مرور الوقت.- جعل 2D أو 3D المؤامرات من بيانات تتبع الخلية باستخدامفانتيج-إضافة جديد الخيال مؤامرة القائمة ( الشكل 3 E و 3F ).
- حدد حجم أو البقع واختر إنشاء / فئة ونوع المؤامرة
- ضبط القيم المؤامرة لإنشاء الرسوم البيانية الفضل مختلفة.
- تصدير الرسوم البيانية باستخدام وظيفة لقطة .
ملاحظة: يمكن أيضا تصدير البيانات الإحصائية كجدول بيانات لمزيد من التحليل الكمي عن طريق النقر أرقام أرقام المنطقة | حفظ .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كشف التصوير المباشر للثقافة ألكسندر الحنك العديد من العمليات الخلوية التوسط الانصهار الحنك 6 . يتم إجراء الاتصالات الأولية بين الخلايا الظهارية اثنين من نتوءات غشاء ( الشكل 2 B-2E ). عندما تلتقي طبقتان الظهارية، فإنها تشكل ميس متعددة الطبقات الطبقات تليها إقحام لجعل ميس واحدة طبقة الخلية المتكاملة من خلال التقارب الظهارية ( الشكل 2 A-2E والشكل 2 K-2O ). الخلايا الظهارية في مستويات Z أعمق كما تشرد تدريجيا إلى الجانب عن طريق الفم من ميس المساهمة في عملية التقارب الظهارية ( الشكل 2 K ). لوحظ ترحيل خلية موجهة من الخلف في ميس الحنك الأوسط ( الشكل 2 F-2J ). وبالإضافة إلى ذلك، وجدنا الخلايا الظهارية إكست أحداث روسيون خلال الانصهار الحنك مما يشير إلى أن الخلايا الظهارية في ميس يمكن إزالتها من خلال هذه العملية النشطة ( الشكل 2 س، 2T ). سوف التماس الظهارية متكاملة كسر في نهاية المطاف إلى أسفل لتحقيق كونفلنسي الوسيطة ( الشكل 2 S، 2T ).
أظهر ليفيت-مرفروبي الحنك أرتين إعادة الهيكلة الهيكلية الحيوية خلال اندماج الحنك 6 . أخصب أكتين الخيطية على الحدود بين الظهارية والمناطق الوسيطة تشكيل هيكل تشبه كابل على طول المحور الأمامي الخلفي ( الشكل 2 K-2T) . انقباض أكتوميوسين يدفع التقارب الظهارية و ميس الكسر لأن تثبيط الكيميائية إما النشاط ميوسين أو البلمرة أكتين منعت هذه العمليات الديناميكية 6 .
هين-بادج = "1"> تم استخدام البرنامج لتتبع السلوكيات الخلوية أثناء اندماج الحنك. أفضل طريقة لتتبع الخلية يعتمد على إشارة المراسل. إذا تم استخدام الماوس مراسل النووي، يمكن للبرنامج تتبع مركز إشارات الفلورسنت ومراكز الخلوية 21 . يمكن غفب النووية الماوس مراسل مثل ROSA26 غفب-نلس-لاش ( غنز) 22 يمكن استخدامها لتسمية الخلايا الظهارية باستخدام خطوط كري الأنسجة محددة؛ في أيدينا، وعرض هذا المراسل النووي محددة تبيض أسرع على مدى فترة طويلة تستخدم في التصوير الحي. لذلك، استخدمنا غشاء غفب مراسل ( ROSA26-متمغ فلوكس ) لمتابعة حركات الخلايا الظهارية في دراساتنا. وهذا يتطلب طريقة لتحديد وتعقب الخلايا الفردية عن طريق إشارة الغشاء. لحل هذه المشكلة، استخدمنا طريقة تتبع الخلية المعدلة ( الشكل 3 والبروتوكول القسم 4 ).
كونتنت "فو: كيب-together.within-بادج =" 1 ">
الشكل 1 : عرض تخطيطي للماوس الثانوي تشريح الحنك. ( A ) عرض جانبي لجنين الماوس E14.5. لتشريح الرفوف الحنكية، تم قطع الرأس على طول الخط الأبيض المنقط الأول، # 1. ( B، C ) تمت إزالة الدماغ العلوي (فوق الخط الأبيض الثاني، رقم 2). ( D، E )، أورال، حظ، بسبب، تشريح، هيد. تم تشريح الفك السفلي السفلي (# 3) وتمت إزالة اللسان (رقم 4). ( F ) الجزء الخلفي من الرأس على طول الخط # 5 تم قطع. ( جي ) تم إزالة كلا الفك العلوي (# 6، # 7) والجزء الأمامي من الفك العلوي (رقم 8). ( جل ) تم إزالة الحاجز الأنفي (رقم 9) إشارات ( M ) غفب في ميس من الحنك تشريح من K14-كري. ROSA26 متمغ الجنين الماوس. ( N ) الإعداد التصوير لايف. الجانب الشفوي من بالأكلت أكسلانت كانت تواجه أسفل إلى تصوير مع المجهر متحد البؤر مقلوب. يشار إلى ميس مع الرؤوس البيضاء ( في ). يشار إلى منطقة تصويرها من قبل صناديق بيضاء منقط في L و M. الحانات مقياس = 2 سم في A، 1 سم في بي، 500 ميكرون في جم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 : التصوير لايف من الثقافات الحشيشة إكسلانت. ( إ ) التصوير المباشر للحنك الثانوي الأمامي من K14-كري. ROSA26 ممغ إكسلانت (5 ميكرون عمق). يظهر رأس السهم الأبيض نتوء غشاء من الخلايا الظهارية ( فج ) التصوير الحي من الحنك الأوسط من K14-كري. ROSA26 ممغ إكسلانت (5 ميكرون د epth). الأسهم البيضاء تشير إلى اتجاه هجرات الخلايا من الأمامي إلى الحنك الخلفي. ( كو ) التصوير المباشر للحنك الأمامي من ليفاكت-مرفروبي إكسلانت (5 ميكرون عمق). تشريد الخلايا الظهارية (السهم الأصفر) إلى سطح الفم والتقارب لتشكيل ميس متكاملة مع هياكل أكتين مثل كابل في خط الوسط. ( بت ) التصوير الحي من الحنك الأمامي من ليفاكت-مرفروبي إكسلانت (25 ميكرون عمق). يشير السهم الأحمر إلى حدث بثق الخلية ( Q، T ). نقاط الكسر المستقبلية من التماس يشار إليها من قبل اثنين من الأسهم العمودية البيضاء في S و T. الحانات مقياس = 20 ميكرون. وتستمد جميع بيانات التصوير الحية في هذا الرقم من التجارب التي نشرت سابقا في 6 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
-page = "1"> 
الشكل 3 : تحليل البيانات. ( أد ) لتتبع الخلايا الظهارية مع إشارات غفب غشاء من K14-كري. ROSA26 متمغ الحشيشة إكسلانت ( A )، تم إنشاء سطح عن طريق تقديم حجم غفب إشارة غشاء ( B ). تم إنشاء الصور المقلوبة بعد إخفاء السطح الذي تم إنشاؤه ( C ). تم تحديد المراكز الخلوية من الصور المقلوبة باستخدام وظيفة الكشف عن البقع في إماريس ( D ). ( E ) 3D تسمح تسمح تتبع حركات الخلايا في اتجاهات متعددة. A: الأمامي، P: الخلفي، N: الأنف، O: عن طريق الفم ( F ) تحليل 2D يولد مؤامرة الفضل تظهر الخلايا المهاجرة من الأمامي إلى الاتجاه الخلفي في ميس الحنك الأوسط. الحانات مقياس = 20 ميكرون في م، 10 ميكرون في إف.s / ftp_upload / 56041 / 56041fig3large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيديو الشكل 1: التصوير الحي K14-كري. ROSA26-ممغ فلوكس الحنك الأمامي (5 ميكرون عمق). تم التقاط الصور كل 10 دقيقة (10 دقيقة / إطار) لمدة 16 ساعة 20 دقيقة، شريط مقياس = 25 ميكرون. هذا الفيديو هو Z- موقف مختلفة من فيلم نشرت سابقا في المرجع 6 . الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)
فيديو الشكل 2: التصوير الحي K14-كري. ROSA26-متمغ فلوكس الحنك الأوسط (5 ميكرون عمق). تم التقاط الصور كل 15 دقيقة (15 دقيقة / الإطار) لمدة 13 ساعة 30 دقيقة، شريط مقياس = 25 ميكرون. تم نشر هذا الفيديو سابقا في المرجع 6 . الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)
فيديو الشكل 3: التصوير لايف من ليفيتاك-مرفروبي الحنك الأمامي (5 ميكرون عمق).
أخذت الصور كل 10 دقيقة (10 دقيقة / إطار) لمدة 7 ساعة و 50 دقيقة. شريط مقياس = 20 ميكرون. تم نشر هذا الفيديو سابقا في المرجع 6 . الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)
فيديو الشكل 4: التصوير لايف من ليفيتاك-مرفروبي الحنك الأمامي (25 ميكرون عمق).
أخذت الصور كل 10 دقيقة (10 دقيقة / إطار) لمدة 7 ساعة و 50 دقيقة. شريط مقياس = 20 ميكرون. هذا الفيديو هو Z- موقف مختلفة من فيلم نشرت سابقا في المرجع 6 . الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التصوير الحي من التشكل الأنسجة مع 3D ثقافة الجهاز إكسلانت يمكن أن توفر معلومات مفصلة بشأن العمليات الخلوية التي لا يمكن أن تظهر في تحليل تلطيخ التقليدية من أقسام الأنسجة الثابتة. باستخدام في المختبر ثقافة إكسلانت من الماوس الحنك الثانوي الجنينية، لاحظنا العديد من السلوكيات الخلوية مثيرة للاهتمام مما يقودنا إلى اقتراح آلية جديدة من الاندماج الحنك الذي ينطوي على التقارب الظهارية وقذف الخلايا.
أحد التحديات الشائعة في الدراسات من هذا النوع هو فوتوبلاشينغ من خلال الإثارة الليزر المستمر على مدى فترة طويلة من الزمن. في دراساتنا، تم استخدام الضوء الأبيض متحد البؤر وغزل القرص المجهر متحد البؤر. ويمكن تصحيح بعض الانخفاض في كثافة الإشارة مع مرور الوقت عن طريق تبييض التصحيحات في برنامج التصوير (لاس-أف) (البروتوكول 4.1). لأن التبييض التصحيح محدود، فمن المهم أن يحسن بعناية قوة الليزر والتعرض الوقت في كل نظام التصوير. فحصنا أيضاأن اندماج الحنك يحدث عادة في وسائل الإعلام التصوير الحي بعد 3 ثقافة اليوم 6 .
وهناك قضية مشتركة ثانية في التصوير الحي هو انجراف الأنسجة. فمن الأهمية بمكان لتقليل الانجراف للحصول على صور متسقة أثناء التصوير الحي لأن التغيرات في المستوى البؤري يمكن أن تربك فهم التغيرات المورفولوجية مع مرور الوقت. في حين السيطرة الانجراف الحراري لا يمكن أن يتحقق في العديد من المجاهر متحد البؤر (التركيز المحدد في المجهر)، والانجراف من الأنسجة النسبية إلى أسفل الزجاج لا يمكن تصحيحها من قبل هذه الأساليب. استخدام الاغاروز، فضلا عن وضع إكسلانت ضد القاع الزجاج يساعد على تقليل هذا، ولكن لا يزال يجب أن تؤخذ الرعاية فقط لتحليل تلك الأفلام التي تحافظ على موقف ثابت نسبيا. ويمكن تحديد ذلك باتباع نقاط تحكم متعددة في مجال التصوير عبر الزمن لتحديد ما إذا كانت تظل ثابتة أو تتحرك مع اتجاه مماثل أو تتحرك بشكل مختلف. إلى حد ما، باستخدام مرحلة ما بعد المعالجة فونكتيونس تسمح تصحيح بعض الانجراف الأنسجة في التصوير الحي (بروتوكول 4.2).
تم استخدام الاغاروز ذوبان منخفضة في تركيز النهائي من 0.6٪ في وسائل الإعلام التصوير الحي لشل حركة الأنسجة المستكشفة. عندما اختبرنا تركيزات أعلى من الاغاروز، يبدو أنها تضعف التشكل الأنسجة ربما بسبب القيود الميكانيكية. ولذلك فمن المهم استخدام تركيز الاغاروز الصحيح لتقليل الانجراف الأنسجة في حين لا تثير التشكل المقلقة.
بسبب عمق التصوير متحد البؤر، وهذا الأسلوب لا تفرض حدودا في فحص الطائرات Z عميقة جدا من الانصهار الحنك. باستخدام كل من الضوء الأبيض والغزل القرص المجاهر متحد البؤر، إشارة من 100 ميكرون أعماق يمكن تصوير بنجاح على الرغم من أن الصورة بدأت تصبح مملة وخافت وراء هذا الحد. لأن الانصهار الحنك هو عملية تقدمية في المحاور الأنتونية و الأمامي الخلفي، ونحن نقترح أن التصوير مواقف متعددة يسمح على نحو فعال التصوير من قسم مختلفهس من الانصهار الحنك، ولكن اثنين من الفوتون أو ورقة ضوء المجهر متحد البؤر يمكن استخدامها في المستقبل لتحسين عمق التصوير. في معظم تجاربنا، تم تصوير الجانب الفموي من المستكشفين الحنك. تصوير الجانب الأنفي من المستكشف الحنك صعب لأن الحاجز الأنفي هو تنصهر أو قريبة جدا من الرفوف الحنكية الثانوية. في محاولاتنا لصورة الانصهار من الجانب الأنفي، كان من الضروري أيضا لإزالة الأنسجة الأنفية إضافية لذلك لم تتداخل مع إشارة من ظهارة الحنك. على الرغم من الممكن، والتصوير الجانب الأنفي من الحنك إكسلانت كان من الصعب بسبب تشريح الحاجز الأنفي في كثير من الأحيان تسبب ضررا للمستكشفين الحنك.
تصوير لايف من إإكسبلانتس الأنسجة الماوس مراسل هو وسيلة قوية لدراسة آليات الخلوية من التشكل الأنسجة خلال التطور الجنيني. باستخدام تقنيات المجهري متحد البؤر وتحليل التصوير الكمي، والعمليات التنموية الأساسية مثل الانصهار الحنك الثانوي يمكن أن يكونالتحقيق على المستوى الخلوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر M. دوغلاس بينسون لإجراء محادثات أولية بشأن التصوير الحنك الثانوي. ونحن نعترف أيضا ديفيد كاستانيدا كاستيلانوس (لايكا) وكريس رييكين (زايس) لمساعدتهم على ضبط ظروف التصوير في المجهر متحد البؤر. نحن نقدر لينزي هاميلتون (بيتبلان) للحصول على اقتراحات مفيدة لتحليل الصور الكمية باستخدام برنامج إماريس. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / نيدر R01 DE025887.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 | Life technology | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Life technology | 16000-044 | |
| L-glutamine | Life technology | 25030-081 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A4544-100G | |
| Pennicillin/Streptomycin | Life technology | 15140-122 | |
| Low melting agarose | BioExpress | E-3111-125 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Petrolieum Jelly (Vaseline) | Sigma | 16415-1Kg | |
| Mice | |||
| Keratin14-cre | MGI: J:65294 | Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc | |
| ROSA26mTmG | MGI: J:124702 | Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo | |
| Lifeact-mRFPruby | MGI: J:164274 | Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows | |
| Microscope | |||
| White Light SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss Microscopy |
References
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).
- Dudas, M., Li, W. -Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. Palatal fusion - where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birth defect. Acta Histochem. 109, 1-14 (2007).
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139, 231-243 (2012).
- Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and Molecular Mechanisms of Palatogenesis. Curr Top Dev Biol. 115, 59-84 (2015).
- Taya, Y., O'Kane, S., Ferguson, M. W. Pathogenesis of cleft palate in TGF-b3 knockout mice. Development. 126, 3869-3879 (1999).
- Kim, S., et al. Convergence and Extrusion Are Required for Normal Fusion of the Mammalian Secondary Palate. PLOS Biol. 13, 100122 (2015).
- Yoshida, M., et al. Periderm cells covering palatal shelves have tight junctions and their desquamation reduces the polarity of palatal shelf epithelial cells in palatogenesis. Genes Cells. 17, 455-472 (2012).
- Fitchett, J., Hay, E. Medial edge epithelium transforms to mesenchyme after embryonic palatal shelves fuse. Dev. Biol. 131, 455-474 (1989).
- Akira, N., et al. The expression of TGF-beta3 for epithelial-mesenchyme transdifferentiated MEE in palatogenesis. J Mol Hist. 41, 343-355 (2010).
- Sani, F. V., et al. Fate-mapping of the epithelial seam during palatal fusion rules out epithelial-mesenchymal transformation. Dev. Biol. 285, 490-495 (2005).
- Jin, J. -Z., Ding, J. Analysis of cell migration, transdifferentiation and apoptosis during mouse secondary palate fusion. Development. 133, 3341-3347 (2006).
- Xu, X., et al. Cell autonomous requirement for Tgfbr2 in the disappearance of medial edge epithelium during palatal fusion. Dev. Biol. 297, 238-248 (2006).
- Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro: an analysis by Dil labelling and confocal microscopy. Development. 114, 379-388 (1992).
- Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Dassule, H., Lewis, P., Bei, M., Mass, R., McMahon, A. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127, 4775-4785 (2000).
- Eisenhoffer, G., et al. Crowding induces live cell extrusion to maintain homeostatic cell numbers in epithelia. Nature. 484, 501-546 (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Riedl, J., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7, 168-169 (2010).
- Can, A., et al. Attenuation correction in confocal laser microscopes: a novel two-view approach. J Microsc. 211, (2003).
- Veenman, C., Reinders, M., Backer, E. Resolving motion correspondence for densely moving points. IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 23, 54-72 (2001).
- Udan, R., Piazza, V., Hsu, C., Hadjantonakis, A., Dickinson, M. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141, 4406-4414 (2014).
- Stoller, J., et al. Cre reporter mouse expressing a nuclear localized fusion of GFP and beta-galactosidase reveals new derivatives of Pax3-expressing precursors. Genesis. 46, 200-204 (2008).
