Summary
Burada, konfokal mikroskopi kullanarak fare sekonder damak füzyonunun canlı görüntülemesi için bir protokol sunmaktayız. Bu protokol, çeşitli floresan muhabir fare hatları ve mekanik içgörü için yol inhibitörleri ile birlikte kullanılabilir. Bu protokol, diğer gelişimsel sistemlerde canlı görüntüleme için uyarlanabilir.
Abstract
Sağlam sekonder damak oluşturmak için ikinci helezoni rafların kaynaştırılması, memeli gelişiminde kilit bir süreçtir ve bozulması, insanlarda yaygın görülen konjenital bir anomali yarık yarık damganın oluşmasına neden olabilir. İkincil damak füzyonu kapsamlı olarak incelenmiş ve bu süreçte aracılık yapabilen birkaç önerilen hücresel mekanizma ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, bu çalışmalar çoğunlukla, gelişme sırasındaki aşamalı zaman noktalarında sabit embriyonik dokularda veya statik zaman noktalarında analiz edilen sabit eksplant kültürlerinde gerçekleştirilmiştir. Statik analiz, damak füzyonu gibi dinamik morfogenetik süreçlerin analizi için sınırlıdır ve palatal füzyona ne tür dinamik hücresel davranışlar araştırabilir tam olarak anlaşılamamıştır. Burada fare embriyolarında ex vivo sekonder damak füzyonunun canlı görüntülenmesi için bir protokol açıklanmaktadır. Damak füzyonun hücresel davranışlarını incelemek için epitel özgü Keratin14 -cre ROS içinde damak epitel hücreleri etiketlemek için kullanıldıA26-mTmG flox raportör embriyoları. Filamentöz aktini görselleştirmek için, Lifeact-mRFPruby raportör fareleri kullanıldı. İkincil damak füzyonunun canlı görüntülemesi, embriyonik gün (E) 14.5 evre embriyolarının yakın zamanda yapışmış sekonder palal raflarını ve ters çevrilmiş bir konfokal mikroskop ile görüntülemeyi mümkün kılmak için agaroz içeren ortamda bir cam alt çanakta kültürleyerek diseke ederek gerçekleştirildi. Bu yöntemi kullanarak, ikinci damak füzyonu sırasında çeşitli yeni hücresel davranışlar tespit ettik. Farklı hücre davranışlarının uzayda ve zaman içinde nasıl koordine edildiğine dair bir değerlendirme, bu dinamik morfogenetik süreci anlamamıza büyük ölçüde katkıda bulunur. Bu protokol, mutant fare hatlarına veya ikincil damak füzyonunun nasıl kontrol edildiğini daha iyi anlamak için farmakolojik inhibitörlerle tedavi edilen kültürlere uygulanabilir.
Introduction
Doku füzyonu çoklu organların gelişiminde önemli bir adımdır. Yarık dudak ve damak, spina bifida ve kalp malformasyonları gibi temel insan doğum kusurları, doku füzyonu 1'deki kusurlardan kaynaklanabilir. Fare sekonder damak füzyonu, gelişmede doku füzyonunu kontrol eden hücresel ve moleküler mekanizmaları tanımlamak için kapsamlı olarak incelenmiştir 2 , 3 , 4 . Fare, sekonder damak gelişimi E11.5 civarında başlar ve bilateral maksiller süreçlerin her birinde ikinci bir palale rafının büyümesi ile başlar. Palatal rafların başlangıçtaki büyümesi, yaklaşık olarak E14.0 olana kadar dil boyunca dikey olarak gerçekleşir; bu esnada, palatal raflar, dilin üstünde yatay olarak yükselir. Medial yönelimli büyüme, iki palatal rafın uygun epitelleri arasında fiziksel temasa neden olur ve orta hat epiteli oluştururE15.5 adresindeki Al Seam (MES). Müdahale eden MES, mezenkimal konfluansa ve tamamen sağlam erimiş ikinci taliatın gelişmesine E15.5 3 izin verecek şekilde ikincil palatal raflar arasında kaldırılmalıdır.
Paylaşılan bir epitelial MES hücre tabakası, iki ayrı palet rafı arasında nasıl oluşturulur ve daha sonra mezenkimal konfluansı sağlamak için alınır damak gelişiminde merkezi bir sorundur. Fare histolojik ve elektron mikroskobu (EM) çalışmaları, eksplant kültürü çalışmaları ve fonksiyonel fare genetiği deneylerine dayanarak, bu süreçte birkaç temel hücre davranışı dahil edilmiştir. Her bir palatal rafın medial kenar epitelyumundan Filopodia benzeri projeksiyonlar ilk temas 5 , 6'yı kolaylaştırır ve bunu takiben bu epitelyal hücrelerin ortak bir tek MES 6 , 7'ye interkalasyonu sağlanır. Ortaya çıkan paylaşılan MES'in kaldırılmasıÜç özel olmayan mekanizma ile devam etmesi önerildi. Histolojik gözlem ve yaşamsal boyalarla eks vivo soy araştırması kullanan erken çalışmalar, MES hücrelerinin epitelial mezenşimal geçiş (EMT) ile ortadan kaldırılabileceğini, ancak son zamanlarda epitelyal hücrelerin genetik soy taklidinin belirsizliği arttırdığını gösterdi ( 8 , 9) Epitel hücrelerinin palatal raf mezenkimine uzun süreli katkısı 10 , 11 , 12 . Önemli sayıda apoptotik hücre ve bazı mutantlarda uygun damak füzyonuna girilemeyen sayıda azalma, apoptozun MES çözünmesinin önemli bir sürücüsü olabileceği fikrini ortaya çıkarmıştır 2 , 3 . Sonunda, başlangıçta epitelial etiketleme ve progresif zaman noktalarında statik gözlemi içeren çalışmalara dayanan MES hücreleriOronazal ve anteroposterior boyutlarda 11 , 13'e göç etmeleri önerildi, ancak bu tür dinamik hücre davranışları canlı palat dokuda gözlemlenememesi nedeniyle başlangıçta doğrulanmadı. Son zamanlarda, eksplant edilen palet raflarının konfokal canlı görüntülemesi ile flüoresan etiketlemenin fare genetik yöntemlerini birleştiren yeni bir canlı görüntüleme metodolojisi geliştirerek bu davranışları doğrudan gözlemledik.
İlk olarak, damak füzyonu sırasında damak epitel hücrelerindeki dinamik hücresel davranışları görselleştirmek için Keratin14-cre fareleri 14 , 15 ile ROSA26- mTmG flox farelerini geçerek bir epitelyal spesifik raportör fare ürettik . Elde edilen embriyoların damak eksplant kültürünün konfokal canlı görüntülemesi, önceden önerilen bazı hücresel davranışları doğruladı ve füzyon işleminde yeni olayları saptadı 6 6, 16 tahrik eden bir ana mekanizma oldu. Bu görüntüleme yöntemi, diğer muhabir hatlarıyla kullanılabilir; Füzyon işlemi sırasında aktin sitoskelet dinamikleri incelemek için , Lifeact-mRFPruby transgenik fareler 17 , 18'i kullandık. Diğer gazeteciler damak füzyonunun diğer özel yönlerini gözlemlemek için de kullanılabilir ve bu yöntem görüntüleme ihtiyaçlarına ve mikroskop kullanılabilirliğine bağlı olarak lazer tarama konfokal mikroskopi veya eğirme disk konfokal mikroskopi için uyarlanabilir. Canlı görüntüleme gittikçe gelişme biyolojisinde temel taş yaklaşımı haline geliyor. PartiCularly, craniofacial morfogenezis karmaşıktır ve insanın yüzünü etkileyen doğum kusurları yaygındır. Bu konfokal canlı görüntüleme yöntemi, insan kraniofasial anormalliklerinin kökenlerinin yanı sıra temel temel gelişim mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasına yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri, San Francisco Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi'ndeki Kaliforniya Üniversitesi protokollerine uygun olarak gerçekleştirildi.
1. Canlı Görüntüleme Ortamının Hazırlanması
- Sıvı kültür ortamının hazırlanması
- Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) / F12'ye% 20 sığır fetüsü serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U / mL penisilin, 100 ug / mL streptomisin, 200 ug / mL L-askorbik asit, 15 mM HEPES ekleyin. medya.
NOT: Canlı görüntüleme ortamı, görüntülemeden hemen önce yapılmıştır. Bu ortam, fenol-kırmızı içerir ve bu da uzun süren canlı görüntüleme kurslarında fototoksisiteye neden olabilir. Fenol-kırmızısı olmayan ortamlar için yer değiştirme, uzun vadeli görüntülemeyi geliştirebilir.
- Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) / F12'ye% 20 sığır fetüsü serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U / mL penisilin, 100 ug / mL streptomisin, 200 ug / mL L-askorbik asit, 15 mM HEPES ekleyin. medya.
- Düşük erime noktalı agaroz çözeltisinin hazırlanması
- 350 mg düşük erime noktalı agarozu,% 3.5 stok solüsyonu yapmak için 10 mL otoklavlanmış damıtılmış suda eritin.
- Agaroz çözeltisini iyice karıştırın ve agarozu tamamen çözmek için 70 ° C'de bir su banyosunda inkübe edin.
- Canlı görüntüleme ortamına ilave etmeden önce 37 ° C su banyosu içinde agaroz çözeltisini soğutun.
- Nihai bir konsantrasyon (% 0.6) yapmak için sıvı canlı görüntüleme maddesinin 5 mL'sine 1 mL agaroz stok solüsyonu ekleyin.
- Prematüre katılaşmayı önlemek için ortamı agaroz ile 37 ° C su banyosunda tutun.
2. Canlı Görüntüleme için Palat Eksplant Kültürü Hazırlanması
- Yakın zamanda yapışık E14.5 orta kulak raflarının diseksiyonu
NOT: Tecrübelerimize göre, görüntüleme kaynaştırması biraz yapışık palatal raflarla başlamayı gerektirir; Bu yapışma, füzyonun görüntüleme sırasında meydana gelmesini önleyen eksplant hareketlerini önler.- E14.5 evre embriyolarını 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde parçalayın ve yeşil flüoresan proteini (GFP) ifade edenK14-CRE; ROSA26-mTmG flox ) veya (Kırmızı floresan protein) RFP ifade eden ( Lifeact-mRFPruby'den ) pozitif embriyoların, flüoresan lambalarla donatılmış bir diseksiyon mikroskopu kullanılarak sentezlenmesi. Agaroz olmadan önceden ısıtılmış canlı görüntüleme kültür ortamına doku aktarın.
- Embriyo başını kesin ve iki ince No. 5 forseps kullanarak üst beyin alanını çıkarın ( Şekil A-C ). Embriyo tutmak için bir No.5 forseps kullanın, diğer No.5 ise forma raflarının dışındaki ekstra dokuları kesmek için forseps kullanın.
NOT: İnce makas, bir No. 5 forseps yerine embriyo kafasını kesmek için kullanılabilir (ilk adım). Bununla birlikte, iki ince 5 forseps hassas kesim yapmak için daha iyi kontrol sağlayacaktır. - Şekil 1 D ve 1E'de gösterildiği gibi palatal raflara zarar vermeden çene kemiğini dikkatle çıkarın. Damakların hasar görme olasılığını azaltmak için mandibuların diseksiyonu ile dili tutun, fDilin dikkatli bir şekilde çıkarılmasıyla ollowed.
- Mandibula ve dil çıkarıldıktan sonra, orta damarın ağız tarafını, MES'de güçlü muhabir sinyalini teyit etmek için flüoresanlı bir stereomikroskop ile inceleyin ( Şekil 1 M ).
- Mandibula ve dil çıkardıktan sonra arka bacak ve beyin sapı da dahil olmak üzere arka kısımları ayırın ( Şekil 1 F ).
- Her iki maksilayı yapışık rafta raflarla çıkarın ( Şekil 1 G ).
- Ön üst çene dokusunu kesin ve birincil ve ikincil damağı tutun ( Şekil 1 H ve I ).
- Ekstraktanın burun tarafındaki nazal septumu MES'i açığa çıkarın.
NOT: Diseksiyonların sonraki bu aşamaları, iki ikincil palet rafı arasındaki temasları bozmamaya dikkat etmelidir. Nazal septumun çıkarılması,Diğer alanlardan arka plan sinyalini düşürmek ve aynı zamanda dikey doku hareketini azaltarak kararlı görüntülemeye olanak tanır ( Şekil 1 J-L ). - Palatal rafları parçaladıktan sonra, dokular arasındaki epitel tabakasına herhangi bir hasar gelmediğinden emin olmak için, orta hat bildirici sinyalini tekrar inceleyin.
- Canlı görüntüleme ortamı ile kültür çanağında damak eksplantlarının hazırlanması
- 35 mm cam alt çanağa canlı görüntüleme ortamı koyun.
- Ayna konfokal mikroskop ( Şekil 1 N ) ile görüntüleme için mümkün olduğu kadar cam altına yakın olarak disseke palate raflar oral yan koyun.
- Sıcaklığı düşürerek hızla agaroz katılaşmayı hızlandırmak veya kültür çanağını 4 ° C'ye koymak için kültür çanağının yakınında iletken bir yüzeye kuru buz peletleri yerleştirin. Parafin yerleştirme için kullanılan gibi soğuk bir tabaka da bu işlemde kullanılabilirbir avantajdır.
NOT: Kuru buz kullanıldığında, donma ortamını önlemek için agaroz ortam değişimi dikkatle izlenmelidir.
3. Palat Explantının Konfokal Zaman Aşımı Görüntüleme
- Görüntüleme ve Veri Toplama
- Agaroz yarı katılaştıktan sonra, 37 ° C inkübasyon odası ile donatılmış ters çevrilmiş konfokal mikroskopta kültür çanağı monte edin. Beyaz ışık konfokal mikroskop ve hücre gözlemci dönen disk konfokal mikroskop kullanın.
NOT: CO 2 gazı olmadan 15 mM HEPES içeren değiştirilmiş bir ortam kullandık. - Ortamın buharlaşmasını önlemek için bir şırınga kullanarak kültür çanağı ile örtü arasında petrol jeli koyun ( Şekil 1 N ).
NOT: Gece boyunca (O / N) kültürden sonra kültür çanağı örtüsünün üzerinde yoğunlaşma meydana gelir ancak ortam hacmi değişmez ve petrol jölesinin ortamın buharlaşmasını engellediğini gösterir. - Düşük büyütme hedefleri (10x) ile ilgi alanını bulun ve zaman atlamalı canlı görüntüleme için daha yüksek büyütme hedefleri (3x dijital zumlu 20x objektif veya Immersol W ile 40x objektif) kullanın.
NOT: Kesilen ikincil palet rafları düz değildir. İkincil damak kavisli bir yapıdadır ve bu da tüm MES'i aynı düzlemde görüntülemeyi zorlaştırmaktadır. Düşük büyütme (10x) görüntüleme bütün damak görüntülemesine izin verebilir, ancak 40x hedefler daha derin Z konumlarındaki ayrıntılı hücresel hareketleri incelemek için daha iyi görüntü özünürlüğü sağlayacaktır. Orta damak bölgesindeki eğrilik yüksektir. Ön ve arka damak orta damağa kıyasla nispeten düzdür. En büyük eğrilik bölgelerini önlemek için sık sık sekonder damağın orta önüne doğru görüntü oluştururuz. - Uygun lazer uyarımını kullanarak (GFP için 488 nm ve RFP için 532/561 nm) ( Şekil 2 ), 16-24 saat boyunca her bir adımda 5 μm'lik çoklu Z yığınlarını tarayın ( Şekil 2 ).
NOT: Potansiyel fototoksisiteyi azaltmak için, minimum lazer gücü ve maruz kalma süresi kullanın. Bu, özellikle çok renkli görüntüleme durumunda önemlidir. Membran Domates (mT) için 552 nm lazer gücünün% 22'sini, membrGFP için 495 nm lazer gücünün% 30'unu (mG) ve membrRFP için 561 nm lazer gücünün% 25'ini kullanın. Ortalama pozlama süresi 550 ms idi. - Hücre izleme ve niceliksel analiz yapmak için görüntü analiz yazılımını kullanın.
- Agaroz yarı katılaştıktan sonra, 37 ° C inkübasyon odası ile donatılmış ters çevrilmiş konfokal mikroskopta kültür çanağı monte edin. Beyaz ışık konfokal mikroskop ve hücre gözlemci dönen disk konfokal mikroskop kullanın.
4. Veri İmaj Analizi
NOT: Burada Imaris kullanıldı. Benzer veri analizleri ImageJ veya Volocity yazılım paketleri ile de yapılabilir.
- Görüntü dizilerinden 3 boyutlu (3B) yüzeyler oluşturma.
NOT: Bu bölüm zar GFP sinyaliyle üretilen bir filmden bir yüzey oluşturulmasını sağlar.- Düzenle | Görüntü Ayarı'nı gösterin ve sinyal yoğunluğunu membran sinyalinin temizlenebilmesi için histogram sürgüsünü kullanınFilmin uzunluğuna dikkat edin ( Şekil 3A ).
- Görüntü kullanarak doğru ağartılmış sinyali düzeltin İşleme | Zayıflama Düzeltmesi . Filmin uzunluğu boyunca membran sinyalinin net olması için Yoğunluk Ön ve Yoğunluk Geri değerlerini ayarlayın. Bu değerlerin belirlenmesinde bazı deneme yanılma gerekebilir.
NOT: Sınırlı Lazer Penetrasyonu nedeniyle Yoğunluk Arka (Derin Z konumu) değeri Yoğunluk Cephesinden (Zemin Z konumu) daha düşük olacaktır. Bu nedenle, bu değerler Z serisindeki sinyal yoğunluğunu normalleştirmek için de değiştirilebilir. Her iki değer de ağartma düzeltmesini sağlamak için ayarlanabilir. Zayıflatma düzeltme de Emisyon zayıflama düzeltmesi 19 olarak adlandırılır. - Membran sinyalinden bir yüzey oluşturmak için Geçme | Yüzeyler , bir kaynak kanalı ve Eşik türü (Mutlak Yoğunluk) seçin ve Algoritma Ayarları'nın altındakilect Yalnızca bir İlgi Çekici Bölgeyi Bölümlendir Ve Sonunda bütün görüntünün işlenmesi , ardından ileri ok üzerine tıklama; (Varsayılan ayarları kullanın veya Yüzey Alan Ayrıntı Seviyeleri ve Eşik Değerleme yöntemini deneme yanılma ile belirleyin) oluşturulan yüzeyin flüoresans sinyalini yansıtıp yansıtmadığını kontrol edin. Bir İlgi Alanı belirtmek için, X, Y ve Z konumlarını kırparak oluşturulacak bölge ve saatleri seçin.
NOT: Seçin Tüm görüntünün süreci sonunda filmler arasında ayarlamalar ve eşikler uygulanacak. - Yeniden ileri ok düğmesini tıklayarak bir yüzey oluşturun. Filtrelerdeki histogramı zar sinyaline karşılık gelecek şekilde değiştirerek eşiği ayarlayın.
- Yüzey oluşturulduktan sonra yüzey sinyalini görselleştirmek ve yüzey oluşturma işlemini bitirmek için Yüzeyler / Ayarlar'da yüzey seçinArd ok düğmesi ( Şekil 3 B ).
- Yüzeye Git | Düzenleyin ve maskeli bir kanal resmini oluşturmak için Maske Özellikleri tüm Maske tıklayın.
- Tamam'a tıkladıktan sonra Maske Kanalı penceresi otomatik olarak açılır; GFP kanalını seçin, yüzeyin dışındaki vokselleri, maksimum sinyal yoğunluğu değerine ( Düzen | Ekran ayarında bulunur ) ve yüzeyin içindeki vokselleri minimum GFP yoğunluğuna ayarlayın (aynı zamanda Düzenle | Ekran ayarı ), Membran Sinyali maskesini oluşturmak için Maske Ayarları'nda .
- Zar sinyalinin maskesi Hacim görünümünde görüntüleneceği için, Görüntü İşleme | Kontrast Değiştir | Ters çevirme ( Şekil 3 C ).
- Ters yüzey görüntülerinden lekeleri algılama.
NOT: Bu bölüm, her bir hücrenin merkezininBenzersiz bir nokta ile işaretlenmiş ve zaman ve mekan üzerinde izlenmektedir.- Sahneyi Aşmak'ı seçin | Noktalar | Yarat ; Algoritma Ayarlarında, sadece bir İlgi Alanı , Sonunda Görüntünün Süreci ve Zamanla İz Noktalarını Parçalamayı seçin .
- İleri oku tıklayın ve bir İlgi Alanı belirtin; Noktaları izlemek için bölge ve saati seçin; Ileri oku itmeye devam edin, maskelenmiş kanalı bir kaynak kanalı olarak seçin ve noktaların XY çapını belirleyin.
- İleri ok düğmesini tıklattığınızda otomatik olarak bir filtre penceresi açılır; Her hücrenin merkezinde tek noktalar oluşturmak için histogramdaki değerleri değiştirerek nokta tespit eşiğini ayarlayın ( Şekil 3 D ).
- İleri ok düğmesini tekrar tıklattığınızda Algoritma penceresi açılır. Autoregressive hareket izleme modeli 20'yi seçin ve maksimum izleme titreşimini belirtin.Duruş ve maksimum boşluk boyutu ile kısa süre kesintili olan izleri birbirine bağlar.
- İleri ok düğmesini tekrar tıklattığınızda Filters (Filtreler) penceresi açılır, her hücre takip edilecek şekilde histogramı ayarlayarak parça süresi eşiğini ayarlayın. İleri çift ok düğmesini tıklamak spot algılamayı tamamlar.
- Doku kaymasını düzeltmek için Noktalar | Editör'ü izle ve Doğru Drift'i seçin. Bir Algoritma penceresi otomatik olarak açılacaktır; Translasyonel sürüklenmeyi seç , tüm sonucu ekle ve Nesneleri düzelt konumunu seçin .
- Kantitatif analiz için vantage grafikleri üretme.
NOT: Programın Dağılım Plakası, birden çok nesneyle çok boyutlu (X, Y, Z, Renkli ve Ölçekli) grafikler üretmek için kullanılan bir araçtır. Bu arsalar birçok hücre hareketinin zaman içindeki eğilimlerini izlemek için yararlıdır.- Kullanarak hücre izleme verilerinin 2D veya 3D parsellerini yapınVantage-New Vantage plot menüsünü ekleyin ( Şekil 3 E ve 3F ).
- Cilt veya Noktalar seçin ve Oluştur / Kategori ve Arsa Türü'nü seçin
- Farklı Vantage grafikleri oluşturmak için Plot Değerlerini Ayarlayın.
- Enstantane işlevini kullanarak grafikleri dışa aktarın.
NOT: İstatistiksel veriler, daha fazla niceliksel analiz için, Plot Numbers Area | Kurtar
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dudak eksplant kültüründe canlı görüntüleme, damak füzyonuna aracılık eden çok hücresel süreçleri ortaya koymuştur 6 . İki epitel hücresi arasındaki ilk temaslar membran çıkıntıları ile yapılır ( Şekil 2 B-2E ). İki epitelyal katman buluştuğunda, epitelyal yakınsak yoluyla entegre bir tek hücre katmanı MES yapmak için interkalasyonun ardından çok hücreli tabakalı bir MES oluştururlar ( Şekil 2 A-2E ve Şekil 2 K-20 ). Daha derin Z seviyelerindeki epitel hücreleri, ilerleyen bir şekilde, epitelyal yakınsama sürecine katkıda bulunan MES'in oral yanına da kaydırılır ( Şekil 2 K ). Orta damak MES'de posteriordan hücre migrasyonu gözlendi ( Şekil 2 F-2J ). Buna ek olarak, epitelyal hücre ekstresini buldukDudak füzyonu esnasındaki erime olayları, MES'deki epitelyal hücrelerin bu aktif süreçle uzaklaştırılabileceğini düşündürmektedir ( Şekil 2 Q, 2T ). Entegre epitel dikiş, mezenkimal konfluansı elde etmek için sonuçta bozulacaktır ( Şekil 2 S, 2T ).
Lifeact-mRFPruby damak, damak füzyonu 6 sırasında dinamik aktin sitoskeletal yeniden düzenlemeler gösterdi. Filamentöz aktin, epitelyal ve mezenkimal alanlar arasındaki sınırda zenginleşerek, anterior-posterior eksen boyunca bir kablo benzeri yapı oluşturdu ( Şekil 2 K-2T) . Akutomiyozin kontraktilitesi epitelyal yakınsaklığı ve MES kırılmasını harekete geçirir, çünkü miyozin aktivitesinin veya aktin polimerizasyonunun kimyasal inhibisyonu bu dinamik işlemleri 6 engelledi.
Hin-page = "1"> Yazılım, damak füzyonu sırasında hücresel davranışları izlemek için kullanıldı. Hücre takibi için en iyi yöntem muhabir sinyaline bağlıdır. Bir nükleer muhabir faresi kullanılırsa, program hücresel merkezler 21 olarak floresan sinyallerinin merkezini izleyebilir. Bu nedenle, ROSA26 GFP-NLS-lacZ ( GNZ) 22 gibi Nükleer GFP raportör fare, dokuya özgü Cre çizgilerini kullanarak epitel hücrelerini etiketlemek için kullanılabilir; Bu özel nükleer muhabir elimizde, canlı görüntülemede kullanılan uzun süre boyunca hızlı beyazlatma sergiledi. Bu nedenle, çalışmalarımızda epitel hücresi hareketlerini izlemek için membran-GFP raportörünü ( ROSA26-mTmG flox ) kullandık. Bu, ayrı bir hücrenin bir zar sinyaliyle tanımlanması ve izlenmesi için bir yöntem gerektirdi. Bu sorunu çözmek için modifiye bir hücre izleme yöntemi kullandık ( Şekil 3 ve Protokol 4 ).
Içerik "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Şekil 1 : Fare sekonder damak diseksiyonunun şematik görünüşü. ( A ) E14.5 fare embriyo yandan görünüşü. Paltal rafları ayırmak için, baş ilk beyaz noktalı çizgi, # 1 boyunca kesildi. ( B, C ) Üst beyin (ikinci beyaz çizginin üstünde # 2) kaldırıldı. ( D, E ) Kesilen kafa Oral görüş. Alt mandibula (# 3) diseke edildi ve dilden (# 4) çıkarıldı. ( F ) 5 numaralı hattın başının arka kısmı kesildi. ( GI ) Hem üst çene (# 6, # 7) hem de üst çene (# 8) ön kısmı çıkarıldı. ( JL ) Nazal septum (# 9) bir K14-cre'den disseka damağının MES'inde ( M ) GFP sinyalleri alındı ; ROSA26 mTmG fare embriyo. ( N ) Canlı görüntüleme ayarı. Ahbabın sözlü yanıYedi eksplant ters çevrilmiş konfokal mikroskop ile görüntülenecek şekilde bakıyordu. MES, beyaz ok uçlarıyla ( FI ) gösterilir. Görüntüleme alanı, L ve M'de beyaz noktalı kutularla gösterilir. Ölçek çubukları A'da 2 cm, BI'de 1 cm, JM'de 500 μm'dir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Diyatik dışı eksplant kültürlerinin canlı görüntülemesi. ( AE ) K14-cre'den ön orta damakta canlı görüntüleme ; ROSA26 mTmG eksplant (5 μm derinlik). Beyaz ok ucu, bir epitel hücresinden ( FJ ) bir membran çıkıntısı göstermektedir. K14-cre'den orta damak canlı görüntüsü ; ROSA26 mTmG eksplant (5 μm depth). Beyaz oklar önten arka damağa hücre göçlerinin yönünü göstermektedir. ( KO ) Lifeact-mRFPruby eksplanttan anterior damakta canlı görüntüleme (5 μm derinlik). Oral yüzeyde epitel hücre yer değişimi (sarı ok) ve orta hatta kablo benzeri aktin yapıları ile entegre MES oluşturmak için yakınsaklık. ( PT ) Lifeact-mRFPruby eksplanttan anterior damakta canlı görüntüleme (25 μm derinlik). Kırmızı ok hücre ekstrüzyon olayını ( Q, T ) gösterir. Dikişin gelecek kırılma noktaları, S ve T'de iki dikey beyaz okla gösterilir. Ölçek çubukları = 20 μm. Bu şekildeki tüm canlı görüntüleme verileri, daha önce 6'da yayınlanan denemelerden elde edilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Sayfalık = "1"> 
Şekil 3 : Veri analizi. ( AD ) K14-cre'den gelen membran GFP sinyalleri ile epitel hücrelerini izlemek için ; ROSA26 mTmG damak eksplant ( A ), Bir yüzey zarı GFP sinyalinin hacim oluşturma yoluyla üretildi ( B ). Ters görüntüler, oluşturulan yüzeyi maskeledikten sonra üretildi ( C ). Imaris ( D ) 'de bir noktalar tespit fonksiyonu kullanarak hücrelerin merkezleri inverted görüntülerden tanımlandı. ( E ) 3D rekonstrüksiyon, hücrenin hareketlerini birden fazla yönde izlemenize izin verir. A: anterior, P: posterior, N: nazal, O: oral ( F ) 2D analizi, orta damak MES'de anteriordan posterior yönde göç eden hücreleri gösteren bir vantage çizimi oluşturur. Ölçek çubukları AD'de 20 μm, EF'de 10 μm'dir.S / ftp_upload / 56041 / 56041fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bu figürde daha büyük bir versiyon görmek için lütfen tıklayınız.
Video Şekil 1: K14-cre'nin canlı görüntülemesi ; ROSA26-mTmG flox anterior damak (5 μm derinlik). Görüntüler 16 saat 20 dakika boyunca her 10 dakikada bir (10 dakika / çerçeve) yakalandı, Ölçek çubuğu = 25 μm. Bu video daha önce referans 6'da yayınlanan bir filmin farklı bir Z konumudur. Bu videoyu izlemek için lütfen tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklayın.)
Video Şekil 2: K14-cre canlı görüntüleme ; ROSA26-mTmG flox Orta damak (5 μm derinlik). Görüntüler her 15 dakikada bir (15 dakika / çerçeve) 13 saat 30 dakika boyunca yakalanmıştır, Ölçek çubuğu = 25 μm. Bu video daha önce 6 referanslı yayınlandı. Bu videoyu izlemek için lütfen tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklayın.)
Video Şekil 3: Lifeact-mRFPruby anterior damak canlı görüntüleme (5 μm derinlik).
Görüntüler 7 saat 50 dakika boyunca her 10 dakikada bir (10 dakika / çerçeve) çekildi. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu video daha önce 6 referanslı yayınlandı. Bu videoyu izlemek için lütfen tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklayın.)
Video Şekil 4: Lifeact-mRFPruby anterior damak canlı görüntüleme (25 μm derinlik).
Görüntüler 7 saat 50 dakika boyunca her 10 dakikada bir (10 dakika / çerçeve) çekildi. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu video daha önce referans 6'da yayınlanan bir filmin farklı bir Z konumudur. Bu videoyu izlemek için lütfen tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklayın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3D organ eksplant kültürü ile doku morfogenezinin canlı görüntülemesi, sabit doku kesitlerinin konvansiyonel boyama analizinde gösterilemeyen hücresel proseslerle ilgili ayrıntılı bilgi sağlayabilir. Fare embriyonik sekonder damakta in vitro eksplant kültürü kullanarak, epitelyal yakınsama ve hücre ekstrüzyonu içeren damak füzyonu için yeni bir mekanizma önermek için birkaç ilginç hücre davranışları gözlemledik.
Bu tip çalışmalarda karşılaşılan sık görülen bir zorluk, uzun süren bir süre boyunca sürekli lazer uyarımları ile foto-ağartma yöntemidir. Çalışmalarımızda, beyaz ışık konfokal ve dönen diskli bir konfokal mikroskop kullanıldı. Sinyal yoğunluğunun zaman içindeki azalması, görüntüleme yazılımında (LAS-AF) ağartma düzeltmeleri ile düzeltilebilir (Protokol 4.1). Beyazlatma düzeltmesi sınırlı olduğundan, her görüntüleme sisteminde dikkatlice lazer gücünü ve pozlama süresini optimize etmek önemlidir. Ayrıca kontrol ettikDamak füzyonu 3 günlük kültürden sonra canlı görüntüleme ortamında normal olarak gerçekleşir 6 .
Canlı görüntülemede ikinci bir yaygın konu doku kaymasıdır. Canlı görüntüleme esnasında tutarlı görüntüler elde etmek için sürüklenmeyi en aza indirmek kritik önem taşır, çünkü odak düzlemindeki değişiklikler zaman içindeki morfogenetik değişiklikleri anlamakta zorluk çekebilir. Termal sürüklenmeyi kontrol etmek, birçok konfokal mikroskopta (Kesin odak, mikroskopta) elde edilebilirken, cam taban ile ilişkili olarak dokunun kayması bu yöntemlerle düzeltilemez. Agarozun kullanımı ve eksplantın cam tabanına yerleştirilmesi bunun en aza indirgenmesine yardımcı olur, ancak yine de sadece nispeten sabit bir konumda tutan filmleri analiz etmek için özen gösterilmelidir. Görüntüleme alanındaki birden çok kontrol noktasını takip edip, sabit kalmalarını, benzer bir eğilimle hareket ettiklerini veya farklı şekilde hareket ettiklerini belirlemek için bu süre belirlenebilir. Bir ölçüde, post-processing fu'yu kullanarakİğneler, canlı görüntülemede bazı doku sürüklenmelerinin düzeltilmesine izin verir (Protokol 4.2).
Düşük çözünen agaroz, eksplant dokularını hareketsiz kılmak için canlı görüntüleme ortamında% 0.6 nihai konsantrasyonda kullanılmıştır. Yüksek konsantrasyonlarda agaroz test edildiğinde, muhtemelen mekanik kısıtlamaya bağlı olarak doku morfolojik oluşumunu bozduğu görülmüştür. Bu nedenle, morfogenezi rahatsız etmeden doku sürüklenmesini en aza indirgemek için doğru agaroz yoğunluğunu kullanmak önemlidir.
Konfokal görüntüleme derinliğine bağlı olarak, bu yöntem damak füzyonunun çok derin Z planlarını incelemede sınırlar getirir. WHITE LIGHT ve spinning disk konfokal mikroskoplarını kullanarak, görüntü bu sınıra kadar donuk ve solgunlaşmaya başlamış olsa da, 100 μm derinliklerden gelen sinyal başarılı bir şekilde görüntülendi. Dudak füzyonu, oronazal ve anteroposterior eksenlerde ilerleyici bir süreç olduğundan, çoklu pozisyonların görüntülenmesinin, farklı bölümlerinHs damak füzyonu, ancak görüntülemenin derinliğini geliştirmek için gelecekte iki-fotonlu veya hafif levha konfokal mikroskopi kullanılabilir. Deneyimlerimizin çoğunda, damak eksplantlarının ağız tarafı görüntülendi. Damak eksplantının burun tarafının görüntülenmesi zordur, çünkü nazal septum kaynaştırılır veya ikincil damar raflarına çok yakın olur. Burun kısmından fuzyonu görüntüleme girişimlerinde, ekstra burun dokusunun damak damar epitelinden gelen sinyal ile etkileşime girmemesi için çıkarılması da gerekiyordu. Nazal septumun diseksiyonu damak eksplantlarına hasar yarattığından damak eksplantının burun tarafının görüntülenmesi mümkün olsa da, mümkün olmuştur.
Reporter fare doku eksplantlarının canlı görüntülemesi embriyonik gelişim sırasında doku morfogenezinin hücresel mekanizmalarını incelemek için güçlü bir yöntemdir. Konfokal mikroskopi teknikleri ve kantitatif görüntüleme analizi kullanarak, sekonder damak füzyonu gibi temel gelişimsel süreçlerHücresel düzeyde araştırıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
İkincil damak görüntüleme ile ilgili ilk görüşmelerde M. Douglas Benson'a teşekkür ediyoruz. Aynı zamanda, konformasyon mikroskopisinde görüntüleme koşullarını ayarlamaya yardımlarından dolayı David Castaneda-Castellanos (Leica) ve Chris Rieken'i (Zeiss) kabul ediyoruz. Imaris yazılımını kullanarak niceliksel görüntü analizi için yararlı öneriler için Lynsey Hamilton'u (Bitplane) takdir ediyoruz. Bu çalışma NIH / NIDCR R01 DE025887 tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 | Life technology | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Life technology | 16000-044 | |
| L-glutamine | Life technology | 25030-081 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A4544-100G | |
| Pennicillin/Streptomycin | Life technology | 15140-122 | |
| Low melting agarose | BioExpress | E-3111-125 | |
| 35 mm glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Petrolieum Jelly (Vaseline) | Sigma | 16415-1Kg | |
| Mice | |||
| Keratin14-cre | MGI: J:65294 | Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc | |
| ROSA26mTmG | MGI: J:124702 | Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo | |
| Lifeact-mRFPruby | MGI: J:164274 | Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows | |
| Microscope | |||
| White Light SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss Microscopy |
References
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).
- Dudas, M., Li, W. -Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. Palatal fusion - where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birth defect. Acta Histochem. 109, 1-14 (2007).
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139, 231-243 (2012).
- Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and Molecular Mechanisms of Palatogenesis. Curr Top Dev Biol. 115, 59-84 (2015).
- Taya, Y., O'Kane, S., Ferguson, M. W. Pathogenesis of cleft palate in TGF-b3 knockout mice. Development. 126, 3869-3879 (1999).
- Kim, S., et al. Convergence and Extrusion Are Required for Normal Fusion of the Mammalian Secondary Palate. PLOS Biol. 13, 100122 (2015).
- Yoshida, M., et al. Periderm cells covering palatal shelves have tight junctions and their desquamation reduces the polarity of palatal shelf epithelial cells in palatogenesis. Genes Cells. 17, 455-472 (2012).
- Fitchett, J., Hay, E. Medial edge epithelium transforms to mesenchyme after embryonic palatal shelves fuse. Dev. Biol. 131, 455-474 (1989).
- Akira, N., et al. The expression of TGF-beta3 for epithelial-mesenchyme transdifferentiated MEE in palatogenesis. J Mol Hist. 41, 343-355 (2010).
- Sani, F. V., et al. Fate-mapping of the epithelial seam during palatal fusion rules out epithelial-mesenchymal transformation. Dev. Biol. 285, 490-495 (2005).
- Jin, J. -Z., Ding, J. Analysis of cell migration, transdifferentiation and apoptosis during mouse secondary palate fusion. Development. 133, 3341-3347 (2006).
- Xu, X., et al. Cell autonomous requirement for Tgfbr2 in the disappearance of medial edge epithelium during palatal fusion. Dev. Biol. 297, 238-248 (2006).
- Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro: an analysis by Dil labelling and confocal microscopy. Development. 114, 379-388 (1992).
- Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Dassule, H., Lewis, P., Bei, M., Mass, R., McMahon, A. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127, 4775-4785 (2000).
- Eisenhoffer, G., et al. Crowding induces live cell extrusion to maintain homeostatic cell numbers in epithelia. Nature. 484, 501-546 (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Riedl, J., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7, 168-169 (2010).
- Can, A., et al. Attenuation correction in confocal laser microscopes: a novel two-view approach. J Microsc. 211, (2003).
- Veenman, C., Reinders, M., Backer, E. Resolving motion correspondence for densely moving points. IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 23, 54-72 (2001).
- Udan, R., Piazza, V., Hsu, C., Hadjantonakis, A., Dickinson, M. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141, 4406-4414 (2014).
- Stoller, J., et al. Cre reporter mouse expressing a nuclear localized fusion of GFP and beta-galactosidase reveals new derivatives of Pax3-expressing precursors. Genesis. 46, 200-204 (2008).
