Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Semi-automatiske Biopanning af bakteriel Display biblioteker for peptid affinitet reagens opdagelse og analyse af resulterende isolater

Published: December 6, 2017 doi: 10.3791/56061
Automatic Translation
1, 1, 1
1Sensors and Electron Devices Directorate, US Army Research Laboratory

Summary

Biopanning bakteriel display biblioteker er en gennemprøvet teknik til opdagelsen af peptid affinitet reagenser, en robust alternativ til antistoffer. Den semi-automatiske sorteringsmetoden heri er strømlinet biopanning for at mindske forekomsten af falske positiver. Her viser vi den tankeproces og metoder, der anvendes i evaluering af kandidater og minimere downstream analyse.

Abstract

Biopanning bakteriel display biblioteker er en gennemprøvet teknik for peptid affinitet reagens opdagelse for anerkendelse af både biotiske og abiotiske mål. Peptid affinitet reagenser kan anvendes til lignende applikationer til antistoffer, herunder sensing og therapeutics, men er mere robust og udføre i mere ekstreme miljøer. Specifikke berigelse af peptid capture agenter til et protein mål af interesse er forbedret ved hjælp af semi-automatiserede metoder som forbedre bindende og vaske trin og derfor reducere forekomsten af falsk positive bindemidler. En semi-automatiseret sortering metode er beskrevet heri til brug med en kommerciel automatiseret magnetisk aktiveret celle sortering enhed med en uhindret bakteriel visning sortering bibliotek udtryk for tilfældige 15-mer peptider. Med mindre ændringer, disse metoder er extendable hen til andre automatiske enheder, andre sortering biblioteker og andre organismer. Hovedformålet med dette arbejde er at give en omfattende metode og udlægge tankeproces anvendes i analysere og minimere den resulterende pulje af ansøgere. Disse teknikker omfatter analyse af-celle bindende ved hjælp af fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS), til at vurdere affinitet og specificitet under sortering og i at sammenligne individuelle kandidater, og analysen af peptid sekvenser til at identificere tendenser og konsensus sekvenser for forståelse og potentielt forbedre affinitet til og specificitet for mål af interesse.

Introduction

Biopanning er en gennemprøvet teknik for affinitet reagens opdagelse, med bakteriel display biblioteker en bekvem kilde for peptid affinitet reagenser 1,2,3,4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24. På samme måde til phage display 25,26 og gær vise 27,28, peptider er udsat på celleoverfladen og er tilgængelige til at binde til både biotiske og abiotiske mål med disse interaktioner drevet af både peptid rygraden og de unikke egenskaber af aminosyre sidekæder 29. I modsætning til phage display, bakterier, selv er selvkopierende og indeholde alle genetiske materiale kræves for display uden eluering af bundne phage og geninfektion af celler. I modsætning til gær display er bakteriel display hurtigere på grund af den hurtige (ca 20 min. 30) fordobling tid af Escherichia coli. De resulterende peptid affinitet reagenser kan produceres fra celle til brug i en bred vifte af sensing platforme 16,17,26 og har potentiale til brug som levende materialer når vises cellen 2 , 31 , 32. i forhold til monoklonale antistoffer for anerkendelse af bestemte mål, peptider er meget mindre og mere fleksible, og peptid display biblioteker kan nemt manipuleres på DNA niveau for at undgå specifikke aminosyrer, som cystein 33 . Peptider er i stigende grad udnyttet til therapeutics 34,35,36 og andre applikationer, hvor antistoffer vil typisk blive udnyttet på grund af deres lethed af discovery, reproducerbare syntetisk (off-celle ) produktion og overlegen vedligeholdelse af ydeevnen i ekstreme miljøer, giver en funktionel reagens selv efter udsættelse for høje temperaturer eller langtidsopbevaring uden køling 37,38. Evnen til at overvinde kølekæden for opbevaring af reagenser er af særlig interesse for den Department of Defense, for eksempel, som skal fungere i ekstreme miljøer. Termisk stabilitet var derfor en ønskelig funktion for affinitet reagenser erkender de valgte mål som eksempler i dette håndskrift.

For nylig, biopanning bakteriel display biblioteker er blevet endnu mere enkel og pålidelig med brugen af halvautomatiske magnetisk aktiveret celle sortering (MACS eller MCS) metoder 9,14,39. Disse metoder har påvist for biologiske mål ved hjælp af flere lignende sortering platforme med forskellige fordele, herunder en kommercielt tilgængelig automatiseret magnetisk aktiveret celle sortering (autoMACS eller autoMCS) instrument (se tabel over materialer) 1,14,15 og mere specialiserede enheder, der omslutte prøven i et engangs patron 7,9 eller chip 39, en værdifuld specifikation til brug med organismer eller toksiner, der er biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2) eller højere7. Disse semi-automatiserede metoder kan udvides for at sortere for peptider stand til at binde til abiotiske materialer, hvis materialerne er magnetisk eller har mulighed for at være belagt på en magnetisk bead, og til brug med forskellige organismer (såsom anaerobe bakterier) Hvis sortering og vækstbetingelser er ændret. Ud over sortering bakteriel display biblioteker, er kommerciel autoMCS instrument bruges her også blevet brugt i en del for de indledende trin i opdagelsen af menneskelige single-kæde antistof fragmenter vises på overfladen af gær, efterfulgt af yderligere isolation Brug af fluorescerende aktiveret celle sortering (FACS) 40. De primære fordele til semi-automation er faldet sortering tid og indsats, og mere robust og reproducerbare afskaffelse af ubundne celler fra de magnetiske perler under vask skridt, fører til reduceret falske positiver, færre krævede sortering runder, og mindre kompliceret down-stream analyse 9,14. I tilfælde af kommerciel autoMCS instrument, der er flere forudinstallerede programmer, som kan være optimalt for forskellige applikationer, såsom negative forsortering (nedbrydning), prioritering af renhed, minimering af slutprøven volumen, og øge eller aftagende følsomhed for isolation af sjældne celler 41.

Fokus for dette arbejde er at vise metodologien for biopanning en bakteriel display bibliotek ved hjælp af kommercielt tilgængelige autoMCS instrument og udlægge tankeproces anvendes i analysere og minimere den resulterende pulje af ansøgere i for at lette udvidelsen til andre programmer. Display biblioteket bruges her (se tabel over materialer) 12,13 indeholder ca. 109- 1011 unikke 15-mer peptider vises via en modificeret version af bakteriel ydre membran protein OmpX i en Ufikseret naturen på celleoverfladen, der forventes at være repræsentativ for den gratis peptid i løsning hvis fremstillet syntetisk. Dette protein stillads indeholder desuden en positiv kontrol P2X peptid på C-terminus for overvågning udtryk via binding til YPet Mona. Dog bør en købt eller roman bibliotek med passende mangfoldighed og andre karakteristika, der er nødvendige for den specifikke anvendelse ønskes arbejde på samme måde med denne biopanning fremgangsmåde, selv om nogle mindre ændringer kan være påkrævet. En skematisk af protokollens biopanning er illustreret i figur 1. Derudover protokollen kunne tilpasses til andre automatiske magnetisk sortering platforme og andre sortering strategier. Manuel magnetisk sortering med en benchtop magnet er påvist med succes, omend med mere kompliceret og tidskrævende downstream analyse skal skyldes øget falske positiver 14, og alligevel giver et alternativ til den autoMCS trin hvis ingen automatiseret magnetiske celle sortering enhed er tilgængelig.

Protocol

1. Biopanning bakteriel Display biblioteker benytter autoMCS

Bemærk: Denne autoMCS-baseret sortering protokol har været tidligere beskrevne 14, og en mere grundig "udvidet protokol for nye brugere" er tilgængelig i de supplerende materialer til dette manuskript for yderligere detaljer, herunder en forklaring af potentiale ændringer. Hvis en autoMCS enhed er tilgængelig for sortering, se den supplerende protokol fra Sarkes et al. 2015 da en manuel sortering protokol er også beskrevet i at arbejde 14. AutoMCS protokol tilpasset forudsat her er blevet yderligere til at omfatte yderligere negative sortering trin for forbedret specificitet 1,15. En skematisk af protokollens biopanning er illustreret i figur 1.

  1. Negative sortering for at fjerne bindemidler kan krydsreagere med magnetiske perler
    1. Podes 500 mL af Luria bouillon Miller (LB) indeholdende relevante antibiotika med ca 1 x 1011celler af en forskelligartet bakteriel visning sortering bibliotek (se tabel over materialer).
      Bemærk: Den bakterielle display peptid bibliotek bruges her (se tabel over materialer) indeholder ca. 109- 1011unikke medlemmer 8,12 , og er vokset i LB indeholdende 25 µg/mL chloramphenicol (LB Cm25). Den resterende del af denne protokol vil antage, at dette bibliotek anvendes.
    2. Der inkuberes ved 37 ° C under omrystning ved 225 RPM, indtil kulturen når en OD600 på 0,5 - 0,55. Fremkalde peptid udtryk med 0,04% w/v L-arabinose ved at fortynde en 4% stock 1: 100, rysten på 225 RPM i 45 min. ved 37 ° C.
    3. Sted induceret kultur på is. Centrifugeres ca 2 x 1011 celler på 6000 x g i 20 min. ved 4 ° C. Fjern supernatanten og resuspend celler i 1,5 mL PBS ved forsigtigt hvirvlende.
      Bemærk: En OD600 af 1,0 ca svarer til 1 x 109 celler/mL for E. coli.
      Bemærk: må ikke VORTEX som dette kan lyse celler; resuspend manuelt eller ved kortvarigt ryster på ≤ 225 RPM, 4° C.
    4. Overfør celler til microcentrifuge røret og spin på 6.000 x g i 5 min på RT eller 4 ° C. Fjern supernatanten. Celle resuspenderes i 1 mL fosfatbufferet saltopløsning (PBS) indeholdende 0,5% bovint serumalbumin (BSA; PBS-B).
    5. Vask 300 µL af streptavidin-belagte perler (ca 3 x 109 perler, se tabel over materialer) i 1 mL PBS-B og centrifugeres i 5 min. ved ≥5, 000 x g (på RT). Placer røret i en bænk top magnetiske partikel separator. Fjern forsigtigt supernatanten, undgå pelleten.
    6. Resuspend perler i celle plus PBS-B blanding forberedt ovenfor. Der inkuberes ved 4° C på en roterende platform for 45 min. sted prøver på is.
    7. Tænd autoMCS instrument til at initialisere systemet. Prime linjerne ved hjælp af producentens run og vask buffere (se tabel over materialer) ved at vælge "Vask nu" nederst på skærmen i menuen "Adskillelse" og derefter "Skylle" og "Kør".
    8. Prime system med PBS-B, ved hjælp af PBS-B som både Wash Buffer og kører Buffer i de næste skridt. Vælg menuen "Separation" i det øverste navigationspanel, og vælg "Vask nu". Vælg "Skyl" og "Kør" for at prime system med friske PBS-B.
    9. Overføre celle og perle blanding fra inkubation skridt til en 15 mL konisk slange. Placere dette rør i slidsen til prøven, og tømme 15 mL konisk rør i positive og negative valg slots, en pre kølet (4 ° C) reol (se tabel over materialer). Placer rack på instrument platform.
    10. Tildele en adskillelse program for hver prøve på rack (op til 5 prøver kan være sorteret i en køre). Tilføje en "Skyl" trin mellem hver prøve og efter den sidste prøve. Vælg "Kør" for at starte celleseparering. Vælg "OK" for at bekræfte, at nok buffer er tilgængelige.
      Bemærk: "Posselds" adskillelse program fungerer godt for sortering af negative og positive sortering runde 1 og "Posseld" er at foretrække for sortering runder 2-4, men begge disse programmer har været anvendt for alle negative og positive sortering runder 14 ,15 og andre programmer kan vise sig bedre til et bestemt program (beskrevet yderligere i diskussion).
    11. Når programmet er færdig, Fjern rack og bevare den passende fraktion. Her, for en negativ form, bevare negative fraktioner (der indeholder celler uden perler). Anbring på is.
    12. Bruge negative slags fraktion i sin helhed til podes 1L LB Cm25 med 0,2% w/v D-glucose. Vokse natten over ved 37 ° C, rysten på 225 RPM.
    13. Før du slukker autoMCS instrument, skal du ændre de køre og vask buffere til producentens run og vask buffere (se tabel over materialer). Vælg "Vask nu", derefter "Skylle" og "Kør". Når du er færdig, Sørg for der er 70% ethanol i linjen dekontaminering og derefter trykke på ikonet"magt" i øverste højre hjørne af skærmen og vælg "Ja".
    14. Når nedlukningen af systemet er komplet (flaskerne vil være lilla), slukke for maskinen.
    15. Den næste dag, brug den overnight kultur for at gøre fryser bestande med omkring 1 x 1011celler pr. hætteglas i LB med 15% glycerol. Derudover, eller alternativt bruge denne kultur i det næste trin: yderligere negative sortering (afsnit 1.2) eller den første runde af positive sortering (afsnit 1.3).
  2. Negative sortering for at fjerne bindemidler kan krydsreagere med andre mål af interesse
    Bemærk: Punkt 1.2 kan hoppet, hvis ikke yderligere negative sortering er behov for eller ønskes. I så fald fortsætte til afsnit 1.3. Resterende binding til enhver uønskede mål kan vurderes ved FACS som i punkt 2: FACS analyse af sortering runder.
    1. Gentag vækst og induktion trin 1.1.1 - 1.1.3, begynder med en frossen status over for negative sortering mod et specifikt protein mål, såsom en lignende protein med potentiale til at også binde til opdagede peptider 1,15, streptavidin-forarmet bibliotek fra trin 1.1.15 eller den overnight kultur fra trin 1.1.12 (ved hjælp af OD600 at vurdere og podes med 1 x 1011 celler).
    2. Overfør celler til microcentrifuge røret og spin på 6.000 x g i 5 min på RT eller 4 ° C. Fjern supernatanten. Resuspend celle pellet i 1 mL PBS, som indeholder 600 nM biotinylated cross-reactive protein mål. Der inkuberes ved 4 ° C i 45 min på en roterende platform.
      Bemærk: 600 nM er en foreslået start koncentration, som kan ændres, hvis en kendt ydelse er observeret. Biotinylation af protein mål kan nås og kvantificerede ved hjælp af reagenserne foreslog i tabellen af materialer.
    3. I mellemtiden, vaske 100 µL af streptavidin-belagte perler (omkring 1 x 109 perler) i 1 mL PBS-B og centrifugeres i 5 min på ≥ 5000 x g (på RT). Sted rør i en bænk top magnetiske partikel separator og omhyggeligt Fjern supernatanten, undgå pelleten.
    4. Centrifugeres target-bundet celler på 6.000 x g i 5 min (RT eller 4° C), Fjern supernatanten, og celle resuspenderes i 1 mL PBS-B. Resuspend perler i hele mængden af vasket celler til cross-reactive protein mål. Der inkuberes ved 4° C på en roterende platform i 30 min.
    5. Sted prøve på ice og komplet trin 1.1.7 - 1.1.15 for en negativ form, gør passende fryser bestande. Fortsætte til afsnit 1.3 for et positivt, hvis alle ønskede negative sortering er opnået, eller Gentag afsnit 1.2 til negativ form mod en anden potentiel cross-reactive protein.
  3. Runde 1 positiv form
    Bemærk: Runde 1 positiv sortering mod et specifikt protein mål er svarende til en negativ form mod et bestemt sortering mål (Se 1.2) undtagen at den perle-holdige, positive fraktion bevares.
    1. Podes 500 mL af LB Cm25 med ca 1 x 1011celler af en forskelligartet bakteriel visning sortering bibliotek, der har været streptavidin-forarmet og dyrkes natten (fra trin 1.1.12) eller frosne (fra trin 1.1.15) og optøede på is, eller der har været yderligere forarmet af bindemidler til andre cross-reactive protein mål (fra trin 1.2.5), som ønsket.
    2. Der inkuberes ved 37 ° C under omrystning ved 225 RPM, indtil kulturen når en OD600 på 0,5 - 0,55. Fremkalde peptid udtryk med 0,04% w/v L-arabinose ved at fortynde en 4% stock 1: 100, rysten på 225 RPM i 45 min. ved 37 ° C.
    3. Sted induceret kultur på is. Centrifugeres ca 2 x 1011 celler på 6.000 x g i 20 min. ved 4 ° C. Fjern supernatanten og resuspend celler i 1,5 mL PBS ved forsigtigt hvirvlende (manuelt eller ved kortvarigt ryster på ≤ 225 RPM, 4° C).
    4. Overfør celler til microcentrifuge røret og spin på 6.000 x g i 5 min på RT eller 4 ° C. Fjern supernatanten.
    5. Resuspend celle pellet i 1 mL PBS, som indeholder 600 nM biotinylated protein mål af interesse. Der inkuberes ved 4 ° C i 45 min på en roterende platform.
      Bemærk: 600 nM er en foreslået start koncentration, som kan ændres, hvis en kendt ydelse er observeret. Biotinylation af protein mål kan nås og kvantificerede ved hjælp af reagenserne foreslog i tabellen af materialer.
    6. I mellemtiden, vaske 100 µL af streptavidin-belagte perler (omkring 1 x 109 perler) i 1 mL PBS-B og centrifugeres i 5 min på ≥ 5000 x g (på RT). Placer røret i en bænk top magnetiske partikel separator, og fjern forsigtigt supernatanten, undgå pelleten.
    7. Når inkubering med målet er komplet, centrifugeres target-bundet celler på 6.000 x g i 5 min (RT eller 4° C) til at fjerne enhver ubundne target protein. Fjern supernatanten og celle resuspenderes i 1 mL PBS-B. Resuspend perler i hele mængden af vasket celler, protein mål. Der inkuberes ved 4° C på en roterende platform for 30 min. sted på is.
    8. Tænd autoMCS instrument til at initialisere systemet. Prime linjerne ved hjælp af producentens run og vask buffere (se tabel over materialer) ved at vælge "Vask nu" nederst på skærmen i menuen adskillelse og derefter "Skylle" og "Kør".
    9. Prime system med PBS-B, ved hjælp af PBS-B som både Wash Buffer og kører Buffer i de næste skridt. Vælg menuen adskillelse fra den øverste navigationslinje og vælg vask nu. Vælg skyl og Kør til prime system med friske PBS-B.
    10. Overføre celle og perle blanding af inkubation skridt ovenfor til en 15 mL konisk slange, skylning rør med en ekstra 500 µl af PBS-B og samle vask med prøven. Placere dette rør i slidsen til prøven, og tømme 15 mL konisk rør i positive og negative valg slots, en pre kølet (4 ° C) reol (se tabel over materialer). Placer rack på instrument platform.
    11. Tildele en adskillelse program for hver prøve på rack (op til 5 prøver kan være sorteret i en køre). Tilføje en "Skyl" trin mellem hver prøve og efter den sidste prøve. Vælg "Kør" for at starte celleseparering. Vælg "OK" eller "Fortsæt" for at bekræfte, at nok buffer er tilgængelige.
      Bemærk: "Posselds" adskillelse program fungerer godt for sortering af negative og positive sortering runde 1 og "Posseld" er at foretrække for sortering runder 2-4, men begge disse programmer har været anvendt for alle negative og positive sortering runder 14 , 15 og andre programmer kan vise sig bedre til et bestemt program (beskrevet yderligere i diskussion).
    12. Når programmet er færdig, Fjern rack og bevare den passende fraktion. Her, for en positiv form, bevare positive fraktioner (der indeholder celler og perler). Anbring på is.
    13. Før du slukker autoMCS instrument, skal du ændre de køre og vask buffere til producentens run og vask buffere (se tabel over materialer). Vælg "Vask nu", derefter "Skylle" og "Kør". Når du er færdig, Sørg for der er 70% ethanol i linjen dekontaminering og derefter trykke på ikonet"magt" i øverste højre hjørne af skærmen og vælg "Ja".
    14. Når nedlukningen af systemet er komplet (flaskerne vil være lilla), slukke for maskinen.
    15. Bruge positive slags fraktion i sin helhed til podes 1L LB Cm25 med 0,2% w/v D-glucose. Vokse natten over ved 37 ° C, rysten på 225 RPM.
    16. Den næste dag, brug den overnight kultur for at gøre fryser bestande i LB indeholdende 15% glycerol og/eller fortsat positive sortering runde 2 i afsnit 1.4.
  4. Efterfølgende Positive sortering runder
    Bemærk: Typisk fire sortering runder anbefales, selv om tre sortering runder er normalt tilstrækkeligt 14,15. Når at stoppe sortering er bistået af beskrevet FACS-analyse af sortering runder i afsnit 2. Koncentrationer af mål og magnetisk bead volumen falde med hver efterfølgende positive sortering runde.
    1. Ved hjælp af overnight kultur fra den tidligere sortering runde (eller en frossen celle bestand fra denne runde), podes 5 mL LB Cm25 med 100 µl celler (1:50 fortynding). Der inkuberes ved 37° C under omrystning ved 225 RPM, indtil kulturen når en OD600 på 0,5 - 0,55.
    2. Fremkalde peptid udtryk med 0,04% w/v L-arabinose, rysten på 225 RPM i 45 min. ved 37° C. Sted induceret celler på is.
      Bemærk: Denne inducerede kultur kan også bruges til at vurdere bindende affinitet og specificitet for sortering runde det stammer fra, som beskrevet i afsnit 2 nedenfor.
    3. Centrifugeres 1 x 108 celler på 6.000 x g i 5 min på RT eller 4 ° C. Fjern supernatanten og resuspend celle pellet i 50 µL PBS indeholdende halv koncentration af biotinylated protein mål lægges til den forrige runde af sortering (derfor 300 nM til runde 2, 150 nM til runde 3 og 75 nM for runde 4 fra vores foreslåede udgangspunkt). Inkuber i 45 min på is (eller ved 4 ° C en roterende platform).
    4. I mellemtiden, vask streptavidin-belagte perler (15 µL til runde 2, 8 µL til runde 3 og 4 µL til runde 4) i 1 mL PBS-B og centrifugeres i 5 min på ≥ 5000 x g (på RT). Sted rør i en bænk top magnetiske partikel separator og omhyggeligt Fjern supernatanten, undgå pelleten. Resuspend perler i 50 µL PBS-B.
    5. Efter 45 min inkubation med mål i trin 1.4.3, centrifugeres celler på 6.000 x g i 5 min på RT eller 4° C, Fjern supernatanten, og pelleten celler i de 50 µL vasket perler fra 1.4.4. Hold prøve på ice og komplet trin 1.3.7 - 1.3.13 for en positiv form.
    6. Podes en 5 mL kultur LB Cm25 suppleret med 0,2% w/v D-glucose med den hele positive, perle-holdige fraktion fra sorteringen.
    7. Den næste dag, bruge den overnight kultur at gøre fryser bestande i LB indeholdende 15% glycerol og/eller fortsætte til den næste positive sortering runde, vende tilbage til trin 1.4.1.
      Bemærk: Ved hjælp af den inducerede kultur fra 1.4.2 for at vurdere bindende affinitet og specificitet som beskrevet i afsnit 2 nedenfor kan hjælpe afgøre, hvornår de skal stoppe sortering. Hvis to sortering runder i træk viser lignende bindende affinitet, eller en senere runde viser faldt bindende affinitet for mål af interesse, dette et ønskeligt sted for at stoppe sortering. Efter sidste runde, men vende tilbage til trin 1.4.1 stopper ved 1.4.2.

2. FACS analyse af sortering runder

  1. Ved hjælp af de inducerede celler fra trin 1.4.2 for hver sortering runde- eller identiske kulturer, tilføje 5 µL induceret celler til 25 µL af hver af følgende udarbejdet løsninger til bindende vurdering (Se også tabel over materialer): PBS alene; PBS med 150 nM YPet Mona (YPet 12,13, positiv kontrol for udtryk), hvis de findes; 900 nM protein target konjugeret med et fluorescerende farvestof, som Amin-reaktiv farvestof med emission/excitation på 493 nm⁄518 nm (Target-488); 900 nM cross-reactive protein målet (r) anvendes til negative sortering mærket med den samme fluorescerende farvestof (Cross-Reactive Protein-488); og 900 nM streptavidin-R-phycoerythrin (SAPE). Der inkuberes i isbad i 45 min.
    Bemærk: Hvis fortsat direkte fra trin 1.4.2, dette skridt vil altid ske dagen efter biopanning for at runde blev afsluttet, da biblioteket ned-udvalgt var vokset natten derefter podes og induceret den følgende dag. Kulturer, dyrket og induceret ligeledes fra frosne sortering runde bestande kan også bruges; i så fald kan alle runder testet og sammenlignet i et enkelt eksperiment.
  2. Centrifuge celler på 6.000 x g i 5 min på RT eller 4° C. Fjern supernatanten og gemme prøver på is.
    Bemærk: Celle pellets kan opbevares på is, indtil alle prøverne er klar til analyse.
  3. Tænd FACS instrument, åbne software, opstart af systemet, og kalibrere instrument efter producentens instruktioner 43,44.
  4. I FACS-softwaren, klik på "Administrator" og klik på ønskede mappe eller oprette en "ny mappe". Klik på "Nyt eksperiment" ikonet øverst til venstre på skærmen. Højreklik på ikonet for at "omdøbe" eksperiment. Inden for dette eksperiment, skal du klikke på "Global regneark".
  5. Klik på ikonet "Dot Plot", og klik derefter på den globale regneark regneark til at oprette denne scatterplot. Klik på dot plot grafen, selv, så vælg "inspektør" ikonet øverst til venstre på skærmen og justere akser til biexponential skærmen ved at markere afkrydsningsfelterne ud for "Y akse" og "X-aksen" i det åbne vindue. Luk vinduet biexponential skærm ved at klikke på X.
  6. Oprette et "nye rør" ved at klikke på ikonet øverst til venstre på skærmen og omdøbe modellen med relevante oplysninger ved at højreklikke på ikonet prøvemateriale under "globale regnearket" og vælge "Omdøb". Udvide modellen ved at klikke på (+) tegn, så Dobbeltklik på ikonet tube, Højreklik på den og igen vælge "omdøbe" for at beskrive prøven.
  7. Brug denne dot plot grafen med standard SSC-A vs FSC-A til at køre en negativ kontrolprøve i PBS alene ved dobbelt klikker oven på rør eller vælge pilen ud for det. Lige før du kører prøven, resuspenderes celle i 500 µL is kold FACS kører bufferen og overføre prøven til et FACS tube (se tabel over materialer), blanding af pipettering og svippede røret. Placer de resuspenderede celler på indsprøjtning prøveglas (sidde) af instrumentet. Tryk på "erhverve Data" med "Begivenheder til Display" på 30.000-50.000 og "Begivenheder til post" på 10.000, flow hastighed, lav (til at starte; øge hvis nødvendigt), og "Sidde flush" valgt.
    Bemærk: Passende hastighed (lav, medium eller høj) er den hastighed, hvormed antallet af begivenheder/s er ca mellem 200 og 2000.  Bruge dette område til alle trin.
  8. Mens erhverve, justere photomultiplier tube (PMT) spænding tærskel, om nødvendigt ved at vælge fanen "Threshold" Klik på og ændre "værdien". Justere spænding for frem og side scatter (FSC og SSC), således at negativ kontrol celler i PBS alene falde lidt nedenfor midten.
    Bemærk: Yderligere parametre (f.eks. VSK) kan tilføjes i fanen "Threshold" ved hjælp af ikonet "Tilføj". Typisk ydelse spændinger på omkring 700 V til 1000 v for både SSC og FSC arbejder godt for E. coli.
  9. Hvis prøven læsning ordentligt, justere flow for at vise 200-2000 begivenheder/s og tryk på "postdata". Når du er færdig registrering, fjerne tube fra SIT og Anbring på is.  Vælg "Polygon Gate" ikon og bruge musen til at tegne en gate omkring størstedelen af cellen befolkningen i scatterplot. Højreklik på dot plot og vælge "Vis befolkningen hierarki".
  10. Brug denne "P1" gate som forælder ved at klikke på "P1" i hierarkiet befolkning. Opret en ny dot plot efter trin 2,5. Højreklik på hver akse og ændre y-aksen til FITC-A og x-aksen til FSC-A. Gate den negative kontrol (PBS alene) ved hjælp af ikonet "polygon gate" med port så stramt som muligt omkring den øverste og venstre side af befolkningen.
    Bemærk: dobbelt tjek hierarkiet befolkning til at sikre, at P1 gate er en forælder til P2 gate. Hvis det ikke er, vil det fremgå i overensstemmelse med P1 gate og "Alle begivenheder" er overordnet; slette porten og genskabe det efter trin 2.10.
  11. Vælg "P2" i hierarkiet befolkning, højreklik, og vælg "invertere gate". Højreklik på handlingen dot med P2 gate og vælge "Vis befolkninger". Vælg befolkninger "P2" og "Ikke P2" for display (mindre end 1% af befolkningen skulle falde uden for porten).
  12. Lige falde i hak dot plottet med P2 gate og vælg "Opret statistik View". Højreklik på statistikvinduet og vælg "Rediger statistik View". Klik på fanen "Populationer" og tilføje eller fjerne populationer, som ønsket, herunder den overordnede befolkning, P1 (P2 og ikke P2 bør allerede vist). Klik på fanen "Statistik" og tilføje "FITC-A Median" og nogen andre statistikker af interesse. Luk vinduet ved at trykke på OK.
  13. Oprette en lignende dot plot grafen for PE-A vs FSC-A og porten ved hjælp af PBS alene prøve (tidligere plots kan dubleres og ændret). Brug dette regneark til at køre alle prøver (herunder negativ kontrol cellerne inkuberes med hver fluorophore-mærket target) på denne måde, optagelse ca. 10.000 begivenheder for hver.
    Bemærk: Cellerne der falder uden for porten efter inkubation med Target-488 protein, den positive kontrol, etc. er bindemidler til at protein, og værdien fra "Ikke PX" (hvor X er antallet af befolkningens låge for at grafen) skal registreres som % bundet YPet. Når du bruger SAPE som en negativ kontrol bruge PE-A vs FSC-A plot. Median fluorescens-intensiteten (MFI) af P1 skal også registreres, da dette giver oplysninger ud over % bindende, at vise omfanget af bindende forholdsmæssigt, og er mere robust tilstedeværelse af outliers 45. Median fluorescens intensitet kan være normaliserede (nMFI) ved at dividere MFI for hver peptid af MFI et stillads kun negativ kontrol (med ingen N-terminale peptid), eller en klon, der indeholder en peptid sekvens, der ikke binder målet for renter, efter inkubation med samme mål konjugeret med den samme fluorophore 14. Hvis disse negative kontrol celler er tilgængelige, kan uninduced cellerne inkuberes med samme mål og mærket med det samme fluorophore også bruges til normalisering.

3. sekvens analyse af potentielle kandidater og vurdering af bindende affinitet

  1. Peptid sekvens bestemmelse
    1. Vælg og sekvens snesevis eller hundredvis af bakteriel kolonier fra den endelige round(s) af biopanning (typisk runder 3 og/eller 4 er tilstrækkelig 14).
    2. Analysere sekvensen data ved hjælp af den makro-filen, som vi har udviklet (jf. supplerende oplysninger for kode, "Sub eCPX_Sequencing") til specifikt analysere de sekvenser, der er genereret fra biopanning biblioteket 15mer bakteriel display vises i tabellen af materialer. Bruge regneark softwaren vises i tabellen af materialer eller andre foretrukne kompatibel software.
      Bemærk: En række værktøjer er tilgængelige online, kan også støtte i DNA sekvens analyse 47. Hvis det foretrækkes, bruge en anden etableret metode til Sekvensanalyse og springe til trin 3.1.3.
      1. Hent den sekvens filer (.seq filer, tekstdokumenter også arbejde) og trække dem ind i en ny mappe. Hvis det er nødvendigt, flytter eller kopierer mappen til computerens harddisk (i modsætning til en netværksmappe) for forbedret hastighed.
      2. Åbn et nyt regneark vindue. Sørg for at aktivere makroer og aktiverer alle funktioner, hvis disse beskeder poppe op.
        Bemærk: Trin 3-6 under bør kun skal fuldføres første gang makroen bruges. Til efterfølgende analyse, simpelthen "opstille den makro" starter på trin 7.
      3. Kopier hele indholdet af den makro findes i filen "Sub-eCPX_Sequencing".
        Bemærk: Den aktuelle version er sat op med flankerende sekvenser for biblioteket 15-mer fremgår af tabel af materialer og vil omsætte aminosyrer mellem dem. Ekstra sekvenser kan være indtastet ved at kopiere 5' flankerende sekvenser i kolonne A og 3' flankerende sekvenser i kolonne B i regneark, op til 10 sekvenser for hver, før du kører makroen.
      4. I filen tomt regneark, skal du vælge fanen "View", så Dobbeltklik på "Makroer." Vælg mappen personal.xlb. Hvis dette ikke er tilgængelig, indspille en makro først for at gøre denne indst.
      5. Klik på "Opret" eller "Træd ind i", afhængigt af hvad kan fremhæves. Indsæt hele makroen i modulet.
      6. Klik på Gem-ikonet eller gå til fil, gemme. Exit modulet. Hvis et vindue popper op, skal du trykke på OK.
      7. Makroen: gå til den mappe, hvor desired.seq filer er placeret. Klik på bar ved siden af symbolet for mappen på toppen for at se mappeplacering. Kopiere den.
      8. Gå til vinduet nye regneark. Vælg fanen Vis, og dobbeltklik på makroer. Vælg "eCPX_Sequencing" fra listen og klik på "Kør."
      9. I boksen at popper op, indsætte filen placering kopieret i trin 7 og slå postere. Makroen bør begynde at gå gennem sekvenserne og organisere dem i tabeller på forskellige ark.
      10. Brug arket "Over tabellen" til at bestemme, hvis det bliver nødvendigt at kontrollere sporingsfiler for fejl og foretage korrektioner manuelt (hvis sekvenser indeholder "X" eller kunne ikke oversættes).
        Bemærk: Tabellen"Resumé" viser de oversatte peptid sekvenser, sorteret efter aminosyresekvens (fra A til Z), medmindre en sekventering fejl forhindrede oversættelse. Et "X" betegner en enkelt aminosyre, som ikke kunne bestemmes.
    3. Når sekvenserne er oversat, organiseret, og sekventering fejl rettet, tjekke listen sorteret peptid sekvens på arket "Over tabellen" for enhver gentagne sekvenser.
    4. Vokse overnight kulturer for omkostningsstyring kolonier af interesse (herunder gentager og/eller peptider med mærkbar tendenser på et minimum) i 5 mL LB Cm25 ved 37 ° C, rysten på 225 RPM, og gemme fryser lagre den næste dag i LB indeholdende 15% glycerol, som i trin 1.4.7. test peptider med gentagne sekvenser for bindende affinitet og specificitet ved hjælp af FACS metoderne beskrevet i afsnit 3.3 og bruge FASTA format på listen sekvens (fuld liste og gentager kun) til at justere sekvenser ved hjælp af foretrukne tilpasning og analyse programmer, som i afsnit 3.2.
  2. Sekvens justering ved hjælp af Clustal Omega, Kalign og lignende programmer
    1. Kopiere sekvenser i FASTA format fra FASTA regnearket på makroen, eller ellers skal du oprette en liste over FASTA filer fra sekvenser skal justeres (som dem fra trin 3.1.3).
      Bemærk: Kolonne A indeholder FASTA filer i numerisk rækkefølge efter "Seq #" mens kolonne B viser dem sorteret efter "AA sekvens" fra "Over tabellen" ark. Listen over peptid sekvenser sorteret efter aminosyresekvens vil vise ubrugelig sekvenser øverst som tomme vektor (som "# Tom") og de sekvenser, hvor hverken søgekriterier 5' eller 3' blev fundet (som "# værdi"). Denne funktion giver mulighed for nem opdatering eller fjernelse af disse sekvenser fra analysen.
    2. Åbn Clustal Omega48 eller Kalign49 software ved at gå til hjemmeside 50,51, eller bruge andre foretrukne software for sequence alignment. Kopiere og indsætte listen FASTA sekvens og input det i boksen nedenfor "sekvenser i enhver understøttet format". Ændre "hul åbne straf" til 30 under "flere indstillinger" i Kalign (dette ikke er muligt i Clustal Omega), men ellers beholde standardindstillinger før du klikker på "Send".
    3. Analysere sekvens justering ved hjælp af Jalview 52,53 software direkte inden for Clustal Omega og Kalign online software ved at vælge fanen "resultat oversigt" over justeringen og derefter klikke på ikonet "Jalview".
      Bemærk: Hvis det foretrækkes, eller til analyse af sekvens alignments genereret af alternative programmer, download 54 softwaren separat og kopiere og indsætte justeringen i vinduet analyse, som åbnes ved at klikke på "File", "Input justering", og " fra lærebog". Dette giver mulighed for at nemt afgøre, om en konsensus sekvens er til stede i input sekvens justering.
  3. Sammenligning af bindende affinitet og specificitet ved hjælp af FACS
    1. Podes 5 mL LB Cm25 suppleret med 0,2% w/v D-glucose med hver enkelte isolat af interesse (fra trin 3.1.4 og/eller kolonier af interesse fra yderligere Sekvensanalyse i afsnit 3.2, etc.) og en passende negativ kontrol (display Stillads kun eller et peptid, der ikke binder målet, som er beskrevet i note for trin 2.13). Vokse natten over ved 37 ° C, rysten på 225 RPM.
    2. Bruge overnight kulturer til podes 3 mL LB Cm25 med 60 µl celler (1:50 fortynding). Der inkuberes ved 37° C under omrystning ved 225 RPM, indtil kulturen når en OD600 på 0,5 - 0,55. Fremkalde peptid udtryk med 0,04% w/v L-arabinose plus 2 mM EDTA (for lettelse af peptid skærm 42), ryste på 225 RPM i 45 min. ved 37 ° C.
    3. Sted induceret kulturer på is. For hver isolat, tilføje 5 µL celler til 25 µL PBS alene eller PBS indeholdende: 150 nM YPet 12,13 (positiv kontrol for udtryk), hvis de findes; 250 nM Target-488; 250 nM Cross-Reactive de(n)-488; og 250 nM SAPE (Se 2.1 for flere detaljer). Der inkuberes i isbad i 45 min.
    4. Centrifuge celler på 6.000 x g i 5 min på RT eller 4° C. Fjern forsigtigt supernatanten ved at trække væske fra den modsatte side af toerstoffet. Gemme celle pellets på is indtil alle prøver og er klar til analyse.
    5. Resuspend hver celle pellet i 500 µL is kold FACS kører buffer, blande godt af pipettering og svippede rør, lige før læsning ved hjælp af en flow forskellige (se tabel over materialer).
      Bemærk: Se trin 2.13 konstaterer for yderligere forklaring af gating og beregning af nMFI til at sammenligne bindende affinitet og specificitet. Non-ringbind eller uspecifikke bindemidler kan nu fjernes fra yderligere analyse, og de højeste affinitet bindemidler bør revurderes af sekvens justering efter punkt 3.2 at lede efter yderligere tendenser, der kan have været overset i den oprindelige sekventeret befolkning. Punkt 3.2 og 3.3 kan gentages efter behov som nye tendenser og konsensus sekvenser er noteret. Denne analyse kan omfatte mere tilfældige sekvenser, hvis tendenser ikke ses.

Representative Results

Med brug af automatiserede magnetisk aktiveret celle sortering (autoMCS) i stedet for manuel magnetiske celle sortering, reduceres falsk negative kandidater betydeligt under biopanning af bakteriel display biblioteker 9,14. Negative sortering trin kan også være tilføjes efter behov for at reducere ikke-specifikke bindemidler til mål for interesse, og det er foreslået på et minimum for at tilføje en negativ form mod den magnetiske perler sig op foran. Dette negative valg mod de magnetiske perler, selv blev afsluttet før fire runder af biopanning den valgte bakteriel vise bibliotek for beskyttende antigen (PA) bindemidler, som vist i figur 2, og før ekstra negative valg mod rivax og fire runder af positive udvalg for abrax, som vist i figur 3. Perlerne anvendes her er konjugeret til streptavidin til opsamling af biotinylated proteiner, så utilsigtet isolation af peptider binding til streptavidin, sig selv er en bekymring og overvåges ved hjælp af FACS med streptavidin-konjugeret til Phycoerythrin (figur 3 , SAPE). Minimum binding til streptavidin, bør testes for nogen lovende individuelle kandidater ved vurderingen af binding til target proteinet. Både procent bindende og nMFI for SAPE bør lave værdier i alle sorterings runder. Binding til streptavidin kan øges lidt med hver sortering runde, som opstod i figur 3, fordi befolkningen er gentagne gange udsat for de streptavidin-belagt magnetiske perler efter hver sortering runde. Hvis niveauet af baggrunden streptavidin bindende bliver problematisk at downstream analyse, kan yderligere negative sortering mod de magnetiske perler udføres efter den positive sortering runde hvor streptavidin bindende befolkning steget i for at mindske downstream screening af falske positiver. Når proteiner eller materialer, der er tilgængelige som specifikt kunne forstyrre downstream brug af peptid til en specifik anvendelse, eller som forventes at krydsreagere med affinitet reagenser til målet på grund af strukturelle og/eller sekvens lighed, yderligere negative sortering imod protein eller materiale anbefales. Et eksempel er, negative sortering mod rivax før isolation af abrax bindende peptider, på grund af strukturel lighed og sekvens homologi af disse to proteiner 1,15. Igen, cross-reactive binding til proteiner bruges til negativ sortering trin kan kontrolleres under analysen af sortering runder ved hjælp af FACS (figur 3Rivax-488). I bedste fald er procent bindende og nMFI lav, som i dette eksempel.

Når det er tilgængeligt, kan en fast positiv kontrol peptid, som P2X peptid på C-terminus af display skafottet produceret af bakteriel display biblioteket anvendes i de repræsentative resultater her, hjælpe med at afgøre, om manglen på bindende affinitet i FACS-analyse er på grund af manglende udtryk i displayet stillads selv, snarere end mangel på affinitet af peptide(s) for destinationen. I figur 2 og figur 3, YPet Mona bindende til dette P2X peptid overvåges og demonstrerer, at de tidlige runder af sortering express skafottet dårligt. Dette er sandsynligvis overvejende på grund af den høje frekvens af stop kodon i N-terminale peptider i biblioteket tilfældigt, hvilket betyder at stillads, selv ikke blev produceret. Andre virkninger kan desuden bidrage, såsom tilstedeværelsen af peptider med uventede toksiske virkninger til E. coli, eller nedsat vækst eller peptid display satser for andre årsager (f.eks mutationer i den bakterielle genom). Tilsætning af EDTA under induktion kan forbedre udtryk i løbet af disse tidlige runder af sortering 42, men endnu ikke er blevet testet. Binding til YPet Mona i hver biopanning er befolkning forbedret betydeligt ved runde 3. Sammenligning figur 2 til figur 3, er det også tydeligt, at udtrykket niveau kan forbedres ved at øge induktion tid til 90 min (som i figur 2YPet Mona) snarere end 45 min (som i figur 3YPet Mona), selv om 45 min er det typisk tilstrækkeligt. Bemærk, at nMFI for YPet Mona er normaliseret til YPet Mona bindende niveau af negative kontrol cellerne, så værdierne nær 1,0 er typisk hvis udtryk er acceptabel. Normalisere YPet Mona MFI at PBS alene MFI fra samme prøve er også en gyldig måde at sammenligne relative udtryk niveauer, men giver meget højere værdier (Sammenlign figur 2 og figur 3 med resultater fra Sarkes mfl. 2015 15).

Berigelse af biblioteket for peptider binding til specifikke mål for interesse opnås typisk indenfor tre positive sortering runder, men fortsætter med at en fjerde runde af sortering kan være gavnlig, som vist i figur 2 og figur 3 . Her procent bundet celler og nMFI fortsætter med at stige fra runde 3 runde 4 for både eksempel mål, PA og abrax, som er emballeret i rødt i figur 2 og figur 3, henholdsvis. De højeste affinitet peptid sekvenser kan allerede være til stede i runde 3 men er tilbøjelige til at berige i runde 4, som hjælper i down-udvælgelse af potentielle kandidater 14. Analyse af sekvenser fra runde 4 tendens til at afsløre gentagne sekvenser, og disse gentagne sekvenser er et fremragende udgangspunkt for affinitet og specificitet analyse og konsensus sekvens bestemmelse. Makroen eCPX_Sequencing leveres som et supplement til dette manuskript hjælper med at strømline denne indledende analyse, som vist i figur 4. Begyndelsen med en mappe med .seq eller tekstfiler, DNA-sekvensen, der ligger mellem valgte 5' og 3' sekvenser er oversat, arrangeret af aminosyresekvens og analyseres for antal individuelle aminosyrerester i hver peptid. Den sorterede liste over isolerede peptid sekvenser, kan som vist på skærmbilledet Resumé tabel ark i figur 4, bruges til nemt bestemme hvilke sekvenser gentage og med hvilken hyppighed. Cellerne i regnearket indeholder gentagne sekvenser er skitseret i forskellige farver for nemmere at analysere. Det anbefales at tjekke disse gentagne sekvenser for konsensus sekvenser og andre tendenser. Dette er hjulpet af sequence alignment software som Kalign og Clustal Omega, og analyse kan udføres på hele sekvensen output (herunder både gentagne og ikke-gentagne sekvenser på den frekvens, de dukkede op) og på listen ned-valgt af gentagne sekvenser (med eller uden deres relative hyppighed). Repræsentative resultater til PA og abrax gentagne sekvenser, uden at tage frekvens i betragtning, er vist i figur 5A og 5B, henholdsvis. Bemærk, at i figur 5A for PA mål, flere af de enkelte gentagne sekvenser, selv indeholde konsensus sekvens WFCFTC (eller en lignende sekvens), understreget med rødt, som blev fastsat ved at anvende Jalview software analyse til en Kalign sekvens justering af de gentagne sekvenser. Denne konsensus, var som WXCFTC, tidligere bestemt til at være en PA bindende konsensus, som giver tillid til den sortering metode 9. I figur 5B, hvor gentagne sekvenser for abrax mål blev analyseret på samme måde, var resultatet helt anderledes. Først, var der kun fem sekvenser, der gentages i runde 4 af biopanning for abrax bindemidler, i modsætning til de femten gentagne sekvenser isoleret fra runde 4 af biopanning for PA bindemidler (selv om 44% flere kolonier var også sekventeret for PA). For det andet er ingen af de fem gentagne sekvenser indeholdt den mest lovende "konsensus" sekvens (FWAWF, understregede i lilla), selv om kandidaten AX-A15 indeholdt den sekvens, der bedst matcher (FWDTWF). Yderligere analyse, herunder bindende affinitet og specificitet bestemmelse, bidraget til at skabe konsensus blandt FWDTWF bestemmes ud fra de øverste fem kandidater til abrax binding i figur 5 c, som forklaret nedenfor.

En repræsentativ koloni fra hver gentaget sekvens kan analyseres yderligere på celle affinitet og specificitet ved hjælp af FACS, som i figur 6A for de gentagne sekvenser fra biopanning til abrax bindende peptider. Her er det klart, at alle fem gentagne sekvenser har højere affinitet til abrax, det planlagte mål, end rivax, strukturelt lignende protein bruges til negative sortering eller streptavidin, som er til stede under slags på grund af de magnetiske perler bruges til biopanning. Dette er i overensstemmelse med de allerede lovende resultater for affinitet og specificitet af sortering runder vist i figur 3, hvor det er klart, at berigelse for binding til den tilsigtede mål, abrax, stiger med hver runde af biopanning mens affinitet for det tilsvarende protein, rivax, er ikke. Dog en tilfredsstillende konsensus sekvens ikke var bestemt for den abrax form ved hjælp af gentagne sekvenser fra runde 4 alene (figur 5B og ovenstående diskussion). Vender tilbage til de 100 sekventeret kolonier fra round 4, dog blev det bemærket øje når søger sekvenser svarende til det bedste match for den forudsagte konsensus en ekstra kandidat, AX-A12, indeholdt den FWDTWF sekvens, der blev noteret i isolere AX-A15 , og at en anden kandidat, AX-A14, indeholdt en lignende sekvens, DWNTWF. Disse og andre sekvenser, der enten findes ligheder med de gentagne sekvenser, demonstrerede ligheder med andre ikke-gentaget sekvenser eller blev udvalgt tilfældigt, blev analyseret af FACS for bindende affinitet og specificitet. De testede rangeres i Sarkes et al. 2016 1 og de top 5 bindemidler fra denne analyse er vist i fig. 6B, med konsensus sekvens bestemmes til at være FWDTWF, vist i figur 5 c.

En lignende analyse af bindende affinitet for gentagne peptid sekvenser i runde 4 af biopanning for peptider, som genkender PA target afslørede, at de bedste bindemidler som rangordnes efter forholdet mellem PA-488 nMFI:SAPE nMFI, indeholdt WXCFTC konsensus eller en lignende sekvens (tabel 1). Ved hjælp af dette forhold, sekvenser selv organiseret i dem, der indeholdt konsensussen og dem, der ikke gjorde. Topkandidater, alle indeholdende sekvenser relateret til konsensus, blev analyseret på samme måde til de metoder, der er beskrevet ovenfor for abrax i figur 6, som præsenteres i Sarkes et al. 2015 14. Disse resultater viser, at for nogle mål, analyse af peptider med gentagne sekvenser kan være tilstrækkelige til at indhente bindemidler med betydelig affinitet og specificitet for valgte mål og bestemme en sekvens på konsensus, der kan være i sig selv tilstrækkelig for bindende. Bemærk dog, at antallet af gentagelser ikke nødvendigvis afspejler relative bindingsaffinitet for mål af interesse (tabel 1). Når analyse af gentagne sekvenser alene ikke er tilstrækkelig til at bestemme et mønster, er det nyttigt at alternere mellem Sekvensanalyse og bindende analyse at indsnævre puljen af kandidater og revurderer tendenser blandt disse kandidater med højere affinitet . Selv når en tendens er observeret fra analysere de gentagne sekvenser alene, kan yderligere ikke-gentaget sekvenser vise de samme tendenser, eller andre tendenser, ved yderligere undersøgelse.

Figure 1
Figur 1: skematisk i biopanning protokol for bakteriel display biblioteker. Som illustreret her, biopanning bakteriel display biblioteker er en cyklisk proces. Hver celle i biblioteket bakteriel display indeholder (se tabel over materialer) plasmid DNA, som er bevaret så længe cellerne dyrkes i overværelse af antibiotika som plasmidet indeholder en resistens-genet (choloramphenicol i dette tilfælde). Hver plasmid koder også display stillads protein, som udsætter en tilfældig peptid til ydersiden af cellen. Da hver celle bør kun indeholde en enkelt plasmid DNA sekvens, skal hver celle kun vise en enkelt peptid, flere steder i cellemembranen. Afhængig af bibliotek mangfoldighed i begyndelsen af biopanning og efter hver sortering runde, DNA-sekvens kan eller kan ikke være unik fra celle til celle. Biopanning begynder med vækst og induktion af celle biblioteket til at vise enkelte peptider på deres ydre membran. Disse peptider kan derefter interagere target protein (som er biotinylated eller ellers markeret til opsamling). For magnetisk aktiveret celle sortering (MCS), ubundet protein fjernes, og cellerne inkuberes med magnetiske perler, der er belagt med en fange protein (streptavidin i dette eksempel, som har en stærk interaktion med biotin). Hele kulturen udsættes derefter for en magnet til at adskille bundne celler fra ubundne celler. Ved hjælp af en automatiseret magnetisk sortering enhed foretrækkes for celleseparering at mindske falske positiver. Illustreret her er en positiv form, hvori de celler, der er bundet til og co elueres med de magnetiske perler bevares. For en negativ form, som vi udfører typisk op foran, er processen den samme bortset fra at de celler, der er skyllet ud af de magnetiske perler bevares i stedet. Biblioteket brøkdel af interesse, bundet (positiv form) eller ubundne (negative slags), er vokset natten over og bruges i den næste runde af sortering. Hver efterfølgende runde af positive biopanning kræver et fald i koncentration og perle destinationsdiskenheden at forbedre strenghed. Efter hver runde af biopanning vurderes affinitet og specificitet af peptider for protein mål ved hjælp af fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) til at afgøre, hvornår de skal stoppe biopanning og begynder at undersøge individuelle kandidater. Efter behov, udføres DNA-sekventering og peptid Sekvensanalyse. Disse analyse trin kan være i sig selv en cyklisk proces, navnlig for at afsløre tendenser i de enkelte isolater efter den afsluttende runde af biopanning. På dette tidspunkt er peptid sekvens tendenser og/eller konsensus korreleret med bindende affinitet og specificitet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: eksempeldata for FACS analyse af sortering runder: PA target. Bindende affinitet som fastsat af FACS er vist efter 4 runder af biopanning (positiv form) den valgte bakteriel vise bibliotek for peptider binding til target, beskyttende antigen (PA). Dette blev udført efter første udfører en negativ form mod de streptavidin-belagt magnetiske perler. For bindende vurdering, celler blev induceret med 0,4% L-arabinose i 90 min. før inkubation med mål og control løsninger og analysere af FACS. Bindende affinitet analyse for det planlagte mål er boxed i rød. Vist her er scatter parceller af FITC-A vs FSC-A og værdier for procent celler (i forhold til den låge negative kontrol inkuberes med PBS alene) og normaliserede median fluorescens intensitet (nMFI, i forhold til peptid-fri negativ kontrol inkuberes med den samme fluorophore-mærket protein) af inducerede celler, der blev udruget i 45 min med: PBS buffer alene, 150 nM YPet Mona (positiv kontrol for peptid udtryk) eller 250 nM PA-488 (mærket målet). Bemærk den stigende berigelse i bindende affinitet for mål af interesse efter hver runde af biopanning. I modsætning til figur 3, blev alle autoMCS celle separationer afsluttet ved hjælp af programmet Posselds. En del af disse data kan også visualiseres i scatter parceller af FITC-H vs FSC-H i Sarkes et al. 2015 14 til sammenligning til FITC-A vs FSC-A parceller vist her. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: eksempeldata for FACS analyse af sortering runder: abrax target. På samme måde til figur 2, vist her er sammenlignende bindende affinitet for en komplet biopanning eksperiment, som bestemmes af FACS. Bakteriel display bibliotek blev udsat for negative sortering mod streptavidin-belagt magnetiske perler, som i figur 2, men overgik derefter til en ekstra runde af negative sortering mod en homolog protein med lignende struktur og funktion, rivax, før du udfører 4 runder af positive biopanning for peptider bindende til det tilsigtede mål, abrax. For bindende vurdering, celler blev induceret med 0,4% L-arabinose for 45 min før bindende mål, positiv kontrol og negativ kontrol og læsning på FACS. Bindende affinitet til det tilsigtede mål er boxed i rød. Vist her er scatter parceller af FITC-A vs FSC-A (eller PE-A vs FSC-A for SAPE) og værdier for procent celler bundet (i forhold til den låge negative kontrol inkuberes med PBS alene) og nMFI af induceret celler, der blev udruget i 45 min med : PBS buffer alene, 150 nM YPet Mona (positiv kontrol for peptid udtryk), 250 nM Abrax-488 (mærket protein mål), 250 nM Rivax-488 (mærket potentielle cross-reactive protein target) eller 250 nM SAPE (negativ kontrol for direkte binding til streptavidin-belagt magnetiske perler). Bemærk den stigende berigelse i bindende affinitet for mål af interesse, abrax, efter hver runde af biopanning, og minimal bindende affinitet for strukturelt lignende protein, rivax. I modsætning til figur 2, positive biopanning runde 1 blev udført ved hjælp af autoMCS Posselds program mens efterfølgende sortering runder blev afsluttet ved hjælp af programmet Posseld, som foreslået for biopanning i dette håndskrift. Disse data kan også visualiseres i scatter parceller af FITC-H vs FSC-H i Sarkes et al. 2016 15 for sammenligning til FITC-A vs FSC-A parceller vist her. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: eksempel Sekvensanalyse output ved hjælp af "eCPX_Sequencing" makro. Vist er et screenshot af 48 sekventeret kolonier fra runde 4 i biopanning biblioteket valgte bakteriel display for PA bindemidler ved hjælp af metoden Posselds. Arket "Over tabellen" er vist her. Bemærk at kolonierne var nummereret i alfabetisk orden efter deres givne filnavn under sekventering processen og at boksene omkring sekvenser, der gentages mindst en gang er skitseret i forskellige farver til lettere dataanalyse. Makroen eCPX_Sequencing leveres som en supplerende kodefil. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Sequence alignment og konsensus bestemmelse for to forskellige protein mål. Alle billeder, der vises her blev genereret ved hjælp af Jalview software med Clustal_X farve efter justering sekvenser ved hjælp af Kalign online analyse software 51. A) justering af gentagne sekvenser fra PA biopanning runde 4 (svarer til tabel 1). B) justering af gentagne sekvenser fra abrax biopanning runde 4 (svarer til figur 6A). C) justering af top 5 kandidater fra abrax biopanning runde 4, som bestemmes af FACS analyse af individuelle kandidater (svarer til figur 6B). Den røde linje understreger konsensus sekvens i A og C, mens den lilla linje b understreger forstadiet til konsensus sekvens bestemmes for abrax bindende ved behandlingen af gentagne sekvenser kun fremhæve potentialet skal teste bindende affinitet ved hjælp af FACS, før en konsensus kan bestemmes i nogle tilfælde. Lignende alignments genereret med forskellige analyse software kan ses i Sarkes et al. 2015 14 og Sarkes et al. 2016 1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: eksempel bindende affinitet og specificitet for enkelte kandidater analyseret ved hjælp af FACS. Vist her er normaliseret median fluorescens intensitet (nMFI) bestemmes ved hjælp af FACS for A) gentagne sekvenser og B) de top 5 kandidater, som bestemt af sammenlignende bindende affinitet for target, abrax, fra runde 4 af biopanning. Dataene repræsenterer gennemsnittet (søjler) og standardafvigelse (fejllinjer) af tre uafhængige Repliker eksperimenter. Bemærk, at alle kandidater vist er helt specifik for abrax (abrax-488, grønne barer) over et strukturelt lignende protein, rivax (Rivax-488, røde søjler), og streptavidin negativ kontrol (SAPE, sorte bjælker). Selv om to af de gentagne sekvenser i en (AX-07 og AX-15) var også blandt top 5 kandidaterne i B, kan sammenligning af resultater i A og B viser, analyse af gentagne sekvenser alene ikke være nok at isolere de højeste affinitet peptider. Data, der vises her blev tilpasset fra Sarkes et al. 2016 1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Table 1
Tabel 1: forholdet mellem specifikke binding til ikke-specifik binding for individuelle gentage kandidater. I dette eksempel er er antallet gentagne sekvenser og forholdet mellem PA (target) nMFI til SAPE (negativ kontrol) nMFI vist for de gentagne kandidat sekvenser fra PA biopanning runde 4. Disse data blev sorteret efter relative PA nMFI:SAPE nMFI forhold og analyseret for tilstedeværelsen af den kendte WXCFTC konsensus eller en lignende sekvens, som er vist i fed skrift og understreget. Bemærk, at sekvenser selv organisere disse kandidater med enigheden, der har den højeste PA nMFI:SAPE nMFI forholdet, og derfor interagere mere specifikt med målet. De viste resultater er fra en enkelt FACS eksperiment. Peptider med laveste affinitet for målet blev udelukket fra yderligere replikater og analyser, der blev offentliggjort i Sarkes et al. 2015 14.

Suppplemental fil 1: Venligst klik her for at downloade denne fil.

Suppplemental fil 2: Venligst klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Biopanning bakteriel display biblioteker har været en succesfuld tilgang til isolering af affinitet reagenser, og peptider tilbyder et nyttigt alternativ til antistoffer for anerkendelse, når bestemte kriterier er nødvendige, såsom stabilitet i ekstreme miljøer. Biopanning af disse biblioteker er blevet strømlinet ved hjælp af autoMCS metoder beskrevet her, og en kommercielt tilgængelig autoMCS platform udvider denne teknologi til et meget bredere publikum. I forhold til traditionelle skiftevis MCS/FACS sortering metoder for bakteriel display biblioteker, autoMCS metoder er billigere, fordi de ikke kræver investering i en dyrere FACS instrument i stand til at sortere og isolere de bundne celler, i stedet for typen af flow Flowcytometret, der bruges her, som kun er i stand til at analyse 14. Kritiske trin til vellykket biopanning af autoMCS omfatter adskillelse program udvalg, negative sortering mod potentielle cross-reaktanter at mindske falske positiver, overvågning bibliotek berigelse ved hjælp af FACS til at bestemme, hvornår de skal stoppe biopanning, og Smart analyse af kandidatdatabase at undgå besværlige screening af hundredvis af ansøgere.

Eksemplerne beskrevet heri viser vellykkede biopanning af det valgte bakterielle display bibliotek for to separate mål, PA og abrax, men med lidt forskellige analyse strategier på grund af forskelle i peptid sekvenser for hver pulje af kandidater efter fire runder af biopanning. PA var det mere ligetil med Sekvensanalyse viser klart tendenserne fra de peptid sekvenser, der gentages mindst en gang i 144 kolonier. Dette var alene nok til at bestemme en konsensus sekvens PA Target, og disse kolonier, der indeholdt konsensussen eller en lignende sekvens var de bedste kandidater med hensyn til forholdet mellem binding til PA versus binding til streptavidin negativ kontrol. Dette vil dog ikke altid være tilfældet. Abrax Target, sekventering 100 kolonier førte til fem gentagne sekvenser men tendensen i disse sekvenser var mindre klart, end en tendens til at indeholde aromatisk aminosyrerester og aspartinsyre eller asparagin. Den forudsagte "konsensus" fra de gentagne sekvenser kun kunne have været produceret og testet for affinitet til abrax, men da ingen overordnet sekvenser indeholdt den nøjagtige konsensus sekvens, vi vendte tilbage til listen over sekventeret kolonier og observeret, at andre kandidater, der havde flere tendenser til fælles med hinanden. Faktisk indeholdt to kolonier en lignende sekvens til "konsensus" fra det gentager alene, (FWDTWF i stedet for FWAWF), der havde den samme tendens af tryptofan og fenylalanin aspartinsyre rester, men med forskellig afstand. En af disse peptider var en gentaget sekvens, den ene var ikke. Disse to sekvenser, sammen med en tredje sekvens, som indeholder en lignende variant, var blandt de top 5 bindemidler testet med hensyn til affinitet for abrax. Den øverste bindemiddel samlede, AX-A05, vises også lignende tendenser. Resultaterne for abrax viser, at en tilgang, som veksler flere gange mellem Sekvensanalyse og affinitet og specificitet analyse undertiden vil være påkrævet, afhængigt af den valgte mål. Resultaterne for abrax mål viser også grad af specificitet, der kan opnås over en meget lignende protein (rivax 1,15).

AutoMCS programmer valgt til vores undersøgelser var Posselds og Posseld, som begge er til positiv udvælgelse af mærket målceller med lav frekvens, mindre end 5% af den oprindelige befolkning. I begge tilfælde passerer celler gennem to magnetiske kolonner. I forbindelse med programmet Posselds dog passere celler langsommere gennem den første kolonne til at øge eksponeringen tid 41. Ud over programmet beskrivelser af fabrikant af den kommercielle autoMCS enhed (Se Materialer tabel) 41, disse programmer blev valgt efter en indledende sammenligning af flere potentielle programmer. Hvert program evne til at undgå at trække ud af falske positiver fra en homogen kultur af negativ kontrol celler og med held isolere en kendt bindemiddel til et mål af interesse fra en blandingskultur, med negative kontrol celler spiket med en faldende procentdel af den kendte bindemiddel, blev sammenlignet. Hvis væsentligt afviger fra de programmer, der er beskrevet her, kunne en lignende sammenligning være nyttigt i programmet udvalg for det nye program. Dog tidligere offentliggjorte resultater at sammenligne disse to programmer (Posseld og Posselds) til isolation af peptid affinitet reagenser for PA viste, at bruge et af disse programmer for alle fire runder af biopanning førte til isolation af peptider med lignende affinitet og specificitet for PA og bestemmelse af WXCFTC konsensus. De væsentligste forskelle var at Posseld, med dens hurtigere strømningshastighed, sorteret hurtigere og bindende affinitet for målet var derfor højere efter kun to runder af biopanning, mens ved hjælp af Posselds førte til flere unikke sekvenser efter fire runder af biopanning 14. lære af dette, strategien blev ændret lidt når biopanning for abrax bindende peptider at indarbejde begge fordele: Posselds blev brugt til runde 1 for at give mere eksponeringstid under dette kritiske trin hvor mangfoldighed er højest, men så den programmet var skiftet til Posseld for hurtigere isolering af de højeste affinitet bindemidler under runder 2-4 1,15. Dette syntes at være ideel til abrax, især da nMFI og procent bindende var begge højere for abrax sortering runde 4 i forhold til PA sortering runde 4 med enten programmet (figur 2 og figur 3 og Sarkes et al. 2015 14), men en direkte sammenligning ved hjælp af en strategi kontra den anden med den samme mål ville være behov for en mere afgørende sammenligning. Hvilket program er bedst for et bestemt program kan afhænge af den individuelle mål, sortering biblioteket anvendes og niveau af peptid udtryk, der er opnået med nogen ændring i betingelserne beskrevet her.

Ikke diskuteret her er potentielle resultater fra biopanning med abiotiske materialer, men vi har også brugt den samme bakterielle display bibliotek for biopanning mod bulk aluminium 2. Denne undersøgelse blev ikke udført ved hjælp af autoMCS, men lignende undersøgelser kan opnås ved hjælp af autoMCS, hvis materialet er tilgængelig på, eller kunne belagt på eller konjugeret med et magnetisk bead. I bulk aluminium undersøgelse var individuelle aminosyre analyse og sekundær struktur modellering nyttige i at forstå, hvad kørte bindingsaffinitet for de isolerede peptider, da ingen konsensus sekvens var fast besluttet på 2. Selv med biologiske mål, kan dette være nødvendigt at forstå, hvad der driver det bindende affinitet for nogle mål, hvilket er grunden til regnearket genereret fra makroen "eCPX_Sequencing" indeholder en fane med enkelte rester frekvens analyse. Hvis ingen gentagne sekvenser ses ud over manglen konsensus, og rest frekvens viser ingen mønster, men kan andre typer af analyse være påkrævet. Derudover kan yderligere sortering runder være nødvendigt at undgå screening et meget større antal kandidater til down-udvalg af dem med tilstrækkelig affinitet til det ønskede mål.

Med den øgede tilgængelighed af næste generation sequencing, kunne en mere grundig undersøgelse udføres til at bestemme de mest lovende kandidater før testning affinitet og at bestemme omfanget af berigelse efter hver runde af biopanning. Sekvenser går videre til bindende analyse trin kan dog skal gendannes ved kloning, hvis de ikke er af tilstrækkelig høj frekvens til let isolere med rutinemæssig koloni sekventering af snesevis eller hundredvis af kolonier. Som denne teknologi forskud, bliver billigere og mere rutine, og især med mulighed for kolonien isolation, vil det sandsynligvis være den bedste måde at analysere biopanning data. Det kan føre til udredning af de måde enkelte sekvenser, og hele biblioteket, udvikles. Derudover kan bakterierne i biblioteket sortering mutere over tid, som kunne skævhed sortering mod celler med hurtigere vækst priser eller bakterier, der overexpress genomisk proteiner stand til at binde et materiale selv uden display stillads og peptid udtryk, for instans. Derfor, når lovende kandidater opstår, er det værd at isolere plasmid DNA, retransforming friske E. coli, og bekræfter peptid bindende via FACS. Hvis planlægger at bruge peptid i en celle-fri format, vurderes også affinitet til den gratis peptid. For eksempel, var peptid affinitet reagenser opdaget gennem bakteriel display for target SEB syntetisk fremstillet off-celle og analyseret ved mere traditionelle metoder såsom enzym-forbundet immunosorbant assay (ELISA), og på celle (via FACS) og off-celle (via ELISA) affinitet blev sammenlignet ved hjælp af Kds bestemmes af begge metoder 7.

Selv om styrken af biotin-streptavidin interaktion gør det en ideel strategi for erobringen af protein mål og bundne peptider, kan denne procedure ændres til andre fange strategier. Direkte kobling af protein til magnetiske perler, som epoxy og carboxylsyre perler, har været en succes og fjerner en bindende trin. Dog kan direkte udlæg hindre potentielle bindingssteder i en specifik eller ikke-specifik måde, afhængigt af vedhæftet fil strategi. En yderligere fordel ved at bruge streptavidin perler er at mindre stabil protein mål kan være frisk biotinylated i 30 min eller opbevares frosset, hvis det er nødvendigt, mens perlerne, selv har tendens til at kræve længere inkubering med protein for danne tvaerbindinger og er generelt opbevares ved 2-8° C. Den foreslåede start koncentration af biotinylated protein målrette her, 600 nM, er det lykkedes for flere mål, men det kan være muligt at isolere peptid capture reagenser med øget affinitet, hvis denne koncentration er reduceret. Denne metode kan desuden udvidet til at omfatte og modificeret til andre bakterielle display biblioteker og andre organismer. For eksempel, kan disse trin udføres i mangel af ilt til brug med anaerober eller i andre miljøer til brug med extremophiles til at isolere peptider med unikke egenskaber. Peptider og/eller konsensus bestemmes for et bestemt mål af interesse kan være potentielt bruges på celle som et levende materiale, eller fremstilles syntetisk ud-celle. Syntetisk fremstillet peptider kan yderligere modnet for udviklingen af endnu højere affinitet og mere robust Protein katalyseret Capture (PCC) agenter til brug i sensorer, eller for andre applikationer, hvor antistoffer vil typisk blive brugt til bindende eller anerkendelse 38,55. Molecular modeling kan også bruges til at hjælpe med at bestemme bindende placering af peptid med sit mål, som for nylig blev uropført den abrax bindende peptider og konsensus fremgår af figur 5 c 1. Samlet set biopanning bakteriel display biblioteker for peptid affinitet reagenser er en hurtig, enkel og kraftfulde alternativ til produktion af antistoffer for anerkendelse og påvisning af protein mål, og denne semi-automatiske biopanning tilgang har produceret pålidelige resultater med vidtrækkende applikationer.

Disclosures

Forfatterne har intet at videregive

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende støtten af US Army Research Laboratory (ARL) postdoc Fellowship Program, administreret af Oak Ridge associeret universiteter gennem en kontrakt med ARL, takket være udnævnelsen af Dr. Justin P. Jahnke. Resterende midler blev leveret af sensorer og elektron enheder direktorat på ARL. Forfatterne vil også gerne takke Daugherty Lab på UCSB til deling af bakteriel display bibliotek og information til kloning YPet Mona reagens, Dr. Bryn Adams for støtte i kloning YPet Mona reagens på ARL, Dr. Joshua Kogot for hans første arbejde på og uddannelse i biopanning af bakteriel display biblioteker, Alena ro i Edgewood kemiske og biologiske Center for deling plasmider bruges til at udtrykke og rense abrax og rivax proteiner, Brandi Dorsey for teknisk støtte til dyrkning af PA bindende peptider, Qin Guo for teknisk support af foreløbige forsøg til isolation af abrax bindende peptider, og Dr. Jessica Terrell til nyttige drøftelser om dette håndskrift.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545 Automated cell separator for use with magnetic beads
Luria Broth, Miller (LB) Fisher Scientific BP1426-500 Growth medium
Chloramphenicol Fisher BioReagents BP904-100 Antibiotic
Agar Fisher Scientific BP2641-500 Thickening/geling agent
eCPX 3.0 Bacterial Display Peptide Library Cytomx Therapeutics N/A; http://cytomx.com/contact/ On-cell peptide display library. Provided by collaborators at USCB.
L-arabinose Sigma A3256-500G Sugar, for induction of protein expression
Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (PBS) Amresco 0780-10L Buffer
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, No-Weigh Thermo Scientific PI21327 Adds biotin molecule to primary amines
Pierce Biotin Quantitation Kit Thermo Scientific PI28005 Ensures biotin molecule is covalently bound to protein
Dynabeads MyOne Strepavidin T1 Beads Invitrogen 65601 Magnetic beads for capture of biotin-congugated proteins
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A9647-100G Protein, used as blocking agent for non-specific binding
D-glucose Sigma G8270-1KG Sugar, for growth and impeding inducible protein expression
Ypet Mona UCSB and ARL N/A Positive control for monitoring expression of eCPX 3.0. Produced by authors and collaborators; see references 12 and 13.
Dylight 488 NHS Ester Thermo Scientific 46403 For conjugating protein target to fluorophore
Streptavidin, R-Phycoerythrin conjugate (SAPE) Thermo Scientific S866 Negative control for monitoring non-specific binding to streptavidin
BD FACSFlow Becton, Dickinson, and Company 342003 Buffer for running FACS instrument
autoMACS Columns Miltenyi Biotech 130-021-101 For MACS Separation
autoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer Miltenyi Biotech 130-091-221 For autoMACS instrument maintenance. Hazard: contains 0.09% azide.
autoMACS Pro Washing Solution Miltenyi Biotech 130-092-987 For autoMACS instrument maintenance
70% Ethanol VWR E505-4L Decontamination of autoMACS
Glycerol Sigma G6279-1L For bacterial freezer stocks
Chill 15 rack Miltenyi Biotec 130-092-952 For MACS Separation
BD FACSCanto II Becton, Dickinson, and Company 744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview For assessment of peptide binding to target
BD FACSDiva Software Becton, Dickinson, and Company 659523 For assessment of peptide binding to target
Dynabeads MPC-S magnetic particle concentrator Thermo Scientific A13346 Bench top cell separator for use with magnetic beads
Colony Sequencing Genewiz N/A; https://www.genewiz.com/ DNA and Colony Sequencing Services
Excel Microsoft 323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400 For use with sequence analysis macro
Anthrax Protective Antigen (PA) List Biological Laboratories, Inc. 171 Target protein used as example for representative results.
Abrax ECBC and ARL N/A Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.
Rivax ECBC and ARL N/A Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sarkes, D. A., Hurley, M. M., Stratis-Cullum, D. N. Unraveling the Roots of Selectivity of Peptide Affinity Reagents for Structurally Similar Ribosomal Inactivating Protein Derivatives. Molecules. 21 (11), 1504 (2016).
  2. Adams, B. L., Finch, A. S., Hurley, M. M., Sarkes, D. A., Stratis-Cullum, D. N. Genetically Engineered Peptides for Inorganics: Study of an Unconstrained Bacterial Display Technology and Bulk Aluminum Alloy. Adv. Mater. 25 (33), 4585-4591 (2013).
  3. Bessette, P. H., Rice, J. J., Daugherty, P. S. Rapid isolation of high-affinity protein binding peptides using bacterial display. Protein Eng. Des. Sel. 17 (10), 731-739 (2004).
  4. Daugherty, P. S. Protein engineering with bacterial display. Curr. Opin. Struct. Biol. 17 (4), 474-480 (2007).
  5. Getz, J. A., Schoep, T. D., Daugherty, P. S. Peptide Discovery Using Bacterial Display and Flow Cytometry. Methods Enzymol. 503, 75 (2012).
  6. Kenrick, S. A., Daugherty, P. S. Bacterial display enables efficient and quantitative peptide affinity maturation. Protein Eng. Des. Sel. 23, 9-17 (2010).
  7. Kogot, J. M., et al. Screening and characterization of anti-SEB peptides using a bacterial display library and microfluidic magnetic sorting. J. Mol. Recognit. 27 (12), 739-745 (2014).
  8. Kogot, J. M., Pennington, J. M., Sarkes, D. A., Stratis-Cullum, D. N., Pellegrino, P. M. Population Enrichment and Isolation with Magnetic Sorting, DTIC Document No. ARL-TN-0452. Report No. ARL-TN-0452. , US Army Research Laboratory, Sensors and Electron Devices Directorate. Adelphi, MD. (2011).
  9. Kogot, J. M. Screening of peptide libraries against protective antigen of Bacillus anthracis in a disposable microfluidic cartridge. PLOS ONE. 6 (11), e26925 (2011).
  10. Little, L. E., Dane, K. Y., Daugherty, P. S., Healy, K. E., Schaffer, D. V. Exploiting bacterial peptide display technology to engineer biomaterials for neural stem cell culture. Biomaterials. 32 (6), 1484-1494 (2011).
  11. Pennington, J. M., Kogot, J. M., Sarkes, D. A., Pellegrino, P. M., Stratis-Cullum, D. N. Isolation and characterization of anti-SEB peptides using magnetic sorting and bacterial peptide display library technology. SPIE Defense, Security, and Sensing. 83581Z-1-83581Z-6 International Society for Optics and Photonics. , (2012).
  12. Rice, J. J., Daugherty, P. S. Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides. Protein Eng. Des. Sel. 21 (7), 435-442 (2008).
  13. Rice, J. J., Schohn, A., Bessette, P. H., Boulware, K. T., Daugherty, P. S. Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands. Protein Sci. 15 (4), 825-836 (2006).
  14. Sarkes, D. A., Dorsey, B. L., Finch, A. S., Stratis-Cullum, D. N. Method for Discovery of Peptide Reagents Using a Commercial Magnetic Separation Platform and Bacterial Cell Surface Display Technology. J. Anal. Bioanal. Tech. 6 (4), 1 (2015).
  15. Sarkes, D. A. Rapid discovery of peptide capture candidates with demonstrated specificity for structurally similar toxins. SPIE Commercial+ Scientific Sensing and Imaging. 986305-1-986305-10 International Society for Optics and Photonics. , (2016).
  16. Stratis-Cullum, D., Kogot, J. M., Sarkes, D. A., Val-Addo, I., Pellegrino, P. M. Chapter 30, Bacterial display peptides for use in biosensing applications. On Biomimetics. Pramatarova, L. , InTech. 629-642 (2011).
  17. Stratis-Cullum, D. N., Finch, A. S. Current Trends in Ubiquitous Biosensing. J. Anal. Bioanal. Tech. S7 (009), (2013).
  18. Rockberg, J., Löfblom, J., Hjelm, B., Uhlén, M., Ståhl, S. Epitope mapping of antibodies using bacterial surface display. Nature Methods. 5 (12), 1039-1045 (2008).
  19. Francisco, J. A., Campbell, R., Iverson, B. L., Georgiou, G. Production and fluorescence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing a functional antibody fragment on the external surface. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10444-10448 (1993).
  20. Georgiou, G. Display of heterologous proteins on the surface of microorganisms: from the screening of combinatorial libraries to live recombinant vaccines. Nat. Biotechnol. 15 (1), 29-34 (1997).
  21. Löfblom, J., Wernérus, H., Ståhl, S. Fine affinity discrimination by normalized fluorescence activated cell sorting in staphylococcal surface display. FEMS Microbiol. Lett. 248 (2), 189-198 (2005).
  22. Kjærgaard, K., Sørensen, J. K., Schembri, M. A., Klemm, P. Sequestration of zinc oxide by fimbrial designer chelators. Appl. Environ. Microbiol. 66 (1), 10-14 (2000).
  23. Kishimoto, J., Fukuma, Y., Mizuno, A., Nemoto, T. K. Identification of the pentapeptide constituting a dominant epitope common to all eukaryotic heat shock protein 90 molecular chaperones. Cell stress & chaperones. 10 (4), 296-311 (2005).
  24. Westerlund-Wikström, B. Peptide display on bacterial flagella: principles and applications. International journal of medical microbiology. 290 (3), 223-230 (2000).
  25. Gaskin, D. J., Starck, K., Turner, N. A., Vulfson, E. N. Phage display combinatorial libraries of short peptides: ligand selection for protein purification. Enzyme Microb. Technol. 28 (9), 766-772 (2001).
  26. Goldman, E. R. Phage-displayed peptides as biosensor reagents. J. Mol. Recognit. 13 (6), 382-387 (2000).
  27. Boder, E. T., Wittrup, K. D. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat. Biotechnol. 15 (6), 553-557 (1997).
  28. Cherf, G. M., Cochran, J. R. Applications of Yeast Surface Display for Protein Engineering. Yeast Surface Display: Methods, Protocols, and Applications. , 155-175 (2015).
  29. London, N., Movshovitz-Attias, D., Schueler-Furman, O. The structural basis of peptide-protein binding strategies. Structure. 18 (2), 188-199 (2010).
  30. Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
  31. Jahnke, J. P., Terrell, J. L., Smith, A. M., Cheng, X., Stratis-Cullum, D. N. Influences of Adhesion Variability on the "Living" Dynamics of Filamentous Bacteria in Microfluidic Channels. Molecules. 21 (8), 985 (2016).
  32. Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature materials. 13 (5), 515-523 (2014).
  33. Löfblom, J., Frejd, F. Y., Ståhl, S. Non-immunoglobulin based protein scaffolds. Current opinion in biotechnology. 22 (6), 843-848 (2011).
  34. Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies. Drug Discov. Today. 9 (12), 525-529 (2004).
  35. Pini, A., Falciani, C., Bracci, L. Branched peptides as therapeutics. Current Protein and Peptide Science. 9 (5), 468-477 (2008).
  36. Gongora-Benitez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. Peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2013).
  37. Coppock, M. B., et al. Peptide-based protein capture agents with high affinity, selectivity, and stability as antibody replacements in biodetection assays. SPIE Sensing Technology+ Applications. 910711-1-910711-6 International Society for Optics and Photonics. , (2014).
  38. Coppock, M. B. Protein Catalyzed Capture Agents with Tailored Performance for In Vitro and In Vivo Applications. Peptide Science. , (2016).
  39. Bessette, P. H., Hu, X., Soh, H. T., Daugherty, P. S. Microfluidic library screening for mapping antibody epitopes. Anal. Chem. 79 (5), 2174-2178 (2007).
  40. Chao, G. Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display. Nat. Protoc. 1 (2), 755-768 (2006).
  41. Miltenyi Biotec GmbH. autoMACS™ Pro Separator User Manual, Version 1.1. , Miltenyi Biotec GmbH. Bergisch Gladbach, Germany. (2007).
  42. Henriques, S. T., et al. A novel quantitative kinase assay using bacterial surface display and flow cytometry. PLOS ONE. 8 (11), e80474 (2013).
  43. BD FACSCanto II Operator Course Workbook. , Becton, Dickinson and Company. (2007).
  44. BD FACSCanto II Instructions For Use. , Becton, Dickinson and Company. (2007).
  45. Chan, L. Y., Yim, E. K., Choo, A. B. Normalized Median Fluorescence: An Alternative Flow Cytometry Analysis Method for Tracking Human Embryonic Stem Cell States During Differentiation. Tissue Eng. Part C Methods. 19 (2), 156-165 (2012).
  46. Genewiz. DNA Sequencing Services. , Available from: https://www.genewiz.com/ (2017).
  47. Honegger, A., PluÈckthun, A. Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool. Journal of molecular biology. 309 (3), 657-670 (2001).
  48. Sievers, F., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol. Syst. Biol. 7 (1), 539 (2011).
  49. Lassmann, T., Sonnhammer, E. L. Kalign-an accurate and fast multiple sequence alignment algorithm. BMC bioinformatics. 6 (1), 298 (2005).
  50. EMBL-EBI. Clutal Omega. , Available from: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ (2017).
  51. EMBL-EBI. Kalign. , Available from: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/kalign/ (2017).
  52. Clamp, M., Cuff, J., Searle, S. M., Barton, G. J. The jalview java alignment editor. Bioinformatics. 20 (3), 426-427 (2004).
  53. Waterhouse, A. M., Procter, J. B., Martin, D. M., Clamp, M., Barton, G. J. Jalview Version 2-a multiple sequence alignment editor and analysis workbench. Bioinformatics. 25 (9), 1189-1191 (2009).
  54. Jalview. , Available from: http://www.jalview.org/Download (2017).
  55. Farrow, B., et al. A chemically synthesized capture agent enables the selective, sensitive, and robust electrochemical detection of anthrax protective antigen. ACS Nano. 7 (10), 9452-9460 (2013).

Tags

Biokemi spørgsmålet 130 bakteriel display biopanning peptid affinitet reagens autoMACS biosensing
Semi-automatiske Biopanning af bakteriel Display biblioteker for peptid affinitet reagens opdagelse og analyse af resulterende isolater
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sarkes, D. A., Jahnke, J. P.,… More

Sarkes, D. A., Jahnke, J. P., Stratis-Cullum, D. N. Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates. J. Vis. Exp. (130), e56061, doi:10.3791/56061 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter