Summary
هنا، نقدم مقايسة موثوقة وسهلة لقياس محتوى الجليكوجين في الخلايا السيانوباكتريال. الإجراء ينطوي على هطول الأمطار، اختيار البلمرة، والكشف عن بقايا الجلوكوز. هذا الأسلوب هو مناسبة لكل من ويلديب والسلالات المعدلة وراثيا ويمكن أن تسهل الهندسة الأيضية من البكتيريا الزرقاء.
Abstract
البكتيريا الزرقاء تتراكم الجليكوجين كخلايا رئيسية داخل الخلايا وتخزين الطاقة أثناء عملية التمثيل الضوئي. وقد أبرزت التطورات الأخيرة في مجال البحوث آليات معقدة من استقلاب الجليكوجين، بما في ذلك دورة بيل من التخليق الحيوي والهدم، وتنظيم الأكسدة، ومشاركة الحمض النووي الريبي غير الترميز. وفي الوقت نفسه، تبذل جهود لإعادة توجيه الكربون من الجليكوجين إلى المنتجات المرغوبة في البكتيريا الزرقاء المعدلة وراثيا لتعزيز غلة المنتج. وتستخدم عدة طرق لتحديد محتويات الجليكوجين في البكتيريا الزرقاء، مع دقة متغيرة والتعقيدات التقنية. هنا، ونحن نقدم بروتوكول مفصل لتحديد موثوق من محتوى الجليكوجين في البكتيريا الزرقاء التي يمكن أن يؤديها في مختبر علوم الحياة القياسية. بروتوكول ينطوي على هطول الأمطار انتقائية من الجليكوجين من المحللة الخلية والبوليمرية إنزيمية من الجليكوجين لتوليد مونومرات الجلوكوز، والتي يتم الكشف عنها من قبل الثور الجلوكوزإديس-بيروكسيديز (الله-بود) انزيم يقترن الفحص. تم تطبيق هذه الطريقة على سينكوسيستيس سب. يك 6803 و سينيكوكوكوس سب. يك 7002، نوعين من الأنواع السيانوباكتريال التي تستخدم على نطاق واسع في الهندسة الأيضية. وعلاوة على ذلك، أظهرت الطريقة بنجاح الاختلافات في محتويات الجليكوجين بين ويلديب والمسوخ المعيبة في العناصر التنظيمية أو الجينات الجينية الجليكوجين.
Introduction
البكتيريا الزرقاء تراكم الجليكوجين كمخزن الكربوهيدرات كبير من الكربون CO 2 من الثابت في الضوء من خلال عملية التمثيل الضوئي. الجليكوجين هو غليكان يتكون من الخطي α-1،4 مرتبطة الجلوكان مع الفروع التي تم إنشاؤها من قبل روابط α-1،6 مرتبطة الجلوكوزيل. الجليكوجين الحيوي في البكتيريا الزرقاء يبدأ مع تحويل الجلوكوز 6-الفوسفات إلى أدب الجلوكوز من خلال العمل المتسلسل من فسفوغلوكوموتاس و أدب الجلوكوز بيروفوسفوريلاز. يتم نقل شدة الجلوكوز في أدب الجلوكوز إلى نهاية غير الحد من العمود الفقري α-1،4-غلوكان من الجليكوجين من قبل واحد أو أكثر من سينثاسيس الجليكوجين (غلغا). في وقت لاحق، إنزيمات المتفرعة إدخال α-1،6 ربط الجلوكوزيل الربط، الذي هو أبعد من ذلك لتوليد الجسيمات الجليكوجين. في الظلام، يتم تقسيم الجليكوجين أسفل الفوسفوريلاز الجليكوجين، الانزيمات جليكوجين التحضير، α غلوكانوترانزفيراس، و فسفوريلاز مالتو ديكسترين إلى الجلوكوز فسفوريلاتد والجلوكوز الحر. هذه الخلاصة إنتo مسارات تقويضية، بما في ذلك مسار فوسفات البنتوز المؤكسد، ومسار إمبدين-مايرهوف-بارناس (التحلل)، ومسار إنتنر-دودوروف 1 ، 2 ، 3 ، 4 .
وقد اكتسب استقلاب الجليكوجين في البكتيريا الزرقاء اهتماما متزايدا في السنوات الأخيرة بسبب إمكانية أن تتطور البكتيريا الزرقاء إلى مصانع خلايا ميكروبية مدفوعة بأشعة الشمس لإنتاج المواد الكيميائية والوقود. ويمكن تعديل عملية التمثيل الغذائي الجليكوجين لزيادة العائد من المنتجات، لأن الجليكوجين هو أكبر تجمع الكربون المرن في هذه البكتيريا. مثال على ذلك هو سيانوباكتريوم سينيكوكوكوس سب. يك 7002، التي تم هندستها وراثيا لإنتاج مانيتول؛ والخلل الجيني من تخليق الجليكوجين يزيد من مانيتول العائد 3 أضعاف 5 . مثال آخر هو إنتاج الإيثانول الحيوي من ويلدت الجليكوجين المحملةيب سينيكوكوكوس سب. يك 7002 6 . قد يكون محتوى غليكوجين الخلية ويلديب تصل إلى 60٪ من الوزن الجاف للخلية خلال المجاعة النيتروجين 6 .
وقد توسع أيضا فهمنا لأيض الجليكوجين والتنظيم في السنوات الأخيرة. في حين من المعروف أن الجليكوجين تتراكم في الضوء، و كابوليزد في الظلام، حركية مفصلة من استقلاب الجليكوجين خلال دورة دييل كشفت مؤخرا فقط في سينكوسيستيس سب. يك 6803 7 . وعلاوة على ذلك، تم تحديد العديد من الجينات التي تؤثر على تراكم الجليكوجين. ومن الأمثلة البارزة على ذلك اكتشاف أن الكيناز الهستيدين المفترض بمغا والرنا غير المشفر PmgR1 تشكيل سلسلة تتالي والسيطرة على تراكم الجليكوجين. ومن المثير للاهتمام، وpmgA وpmgR1 المسوخ الحذف تتراكم ضعف كمية الجليكوجين لان السلالة wildtype من Synechocystis س. يك 68038 ، 9 . ومن المعروف أيضا أن العناصر التنظيمية الأخرى تؤثر على تراكم الجليكوجين، بما في ذلك عامل سيغما البديل E والعامل النسخي CyAbrB2 10 ، 11 .
كما الفائدة في تنظيم الجليكوجين والتمثيل الغذائي تنمو، وبروتوكول مفصل يصف تحديد محتوى الجليكوجين هو ما يبرره. وتستخدم عدة طرق في الأدب. يتبع التحليل المائي الحمضي الذي يتبعه تحديد محتوى السكريات الأحادية من خلال كروماتوجرافيا السائل الأنيوني ذات الضغط العالي إلى جانب كاشف أمبيروميتري نابض أو تحديد مطياف بعد المعاملات مع حامض والفينول على نطاق واسع أساليب لتقريب محتوى الجليكوجين 9 ، 10 ، 12 ، 13 . ومع ذلك، فإن الضغط العالي أنيون الصرف الكروماتوجرافي السائلc مكلفة جدا ولا تميز الجلوكوز المستمدة من الجليكوجين من تلك المستمدة من غيرها من غليكوكونجوغاتس التي تحتوي على الجلوكوز، مثل السكروز 14 ، الجلوكوسيل غليسيرول 15 ، والسليلوز 16 ، 17 ، 18 ، والتي من المعروف أن تتراكم في بعض الأنواع السيانوبكتيرية. طريقة حمض الفينول يمكن أن يؤديها باستخدام معدات المختبرات القياسية. ومع ذلك، فإنه يستخدم الكواشف عالية السمية ولا يميز الجلوكوز المستمدة من غليكوكونغاتاتس مختلفة، كما أنه لا يميز الجلوكوز من السكريات الأخرى التي تشكل المواد الخلوية، مثل السكر الشحمي، عديدات السكاريد الدهنية، والمصفوفات خارج الخلية 12 . والجدير بالذكر أن مقايسة الحمض الفينول الساخن غالبا ما تستخدم لتحديد محتوى الكربوهيدرات الكلي بدلا من التحديد المحدد لمحتوى الجلوكوز 12 . الأنزيمية هيدروليسيس من الجليكوجين إلى الجلوكوز بواسطة α-أميلوغلوكوسيداس تليها الكشف عن الجلوكوز من خلال مقايسة الإنزيم يقترن قراءات اللونية التي هي حساسة للغاية ومحددة للجلوكوز المستمدة من الجليكوجين. ويمكن تعزيز خصوصية أبعد من ذلك مع هطول الأمطار التفضيلية من الجليكوجين من ليسيتس الخلية عن طريق الإيثانول 5 ، 8 ، 19 .
هنا، نحن تصف بروتوكول مفصل لمقايسة القائم على الإنزيم من محتوى الجليكوجين في اثنين من الأنواع الدرامية سيانوباكتريال الأكثر دراسة على نطاق واسع، سينكوسيستيس سب. يك 6803 و سينيكوكوكوس سب. يك 7002، في ويلديب وسلالات متحولة. من أجل ضمان التحلل المائي الفعال، يتم استخدام كوكتيل من α- الأميليز و α-أميلوغلوكوسيداز 8 . تحلل α- الأميليز إندو المفعول α-1،4-الروابط في مختلف الجلوكان في ديكسترينز، والتي هي أكثر تحلل tس الجلوكوز بواسطة إكسو-أكتينغ α-أميلوغلوكوسيداز 20 . الآثار المتآزرة لهذه الانزيمات معروفة جيدا، وتستخدم هذه الانزيمات بشكل روتيني للتحلل المائي الانتقائي للنشا، وهو غلوكان مرتبط α مثل الجليكوجين، دون التأثير على غليكوكونوجانتس أخرى، مثل السليلوز، في الكتلة الحيوية النباتية 21 . تم الكشف عن الجلوكوز صدر كميا بعد مقايسة انزيم مقترنة تتكون من أوكسيديز الجلوكوز الذي يحفز خفض الأكسجين إلى بيروكسيد الهيدروجين وأكسدة الجلوكوز إلى لاكتون والبيروكسيديز - التي تنتج صبغة كينونيمين الوردي اللون من بيروكسيد الهيدروجين، مركب الفينول، و 4-أمينوانتيبيرين 22 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد
- ثقافات السيانوباكتريال
- تنمو سينكوسيستيس سب. يك 6803 عند 30 درجة مئوية في السائل BG11 المتوسطة 8 ، مع إمدادات ثابتة من الهواء تستكمل مع 1٪ (الخامس / الخامس) كو 2 . تضيء الثقافات باستمرار مع الضوء في كثافة تدفق الفوتون الضوئي من 50 ميكرومتر الفوتون / م 2 / ثانية.
- تنمو سينيكوكوكوس سب. بك 7002 في السائل A + المتوسطة 23 (BG11 المتوسطة ويمكن أيضا أن تستخدم)، مع إمدادات ثابتة من الهواء تستكمل مع 1٪ (الخامس / الخامس) كو 2 . يجب أن تكون درجة الحرارة 37 درجة مئوية. تضيء الثقافات باستمرار مع الضوء في كثافة تدفق الفوتون الضوئي من 150 ميكرومتر الفوتون / م 2 / ثانية.
- قياس الكثافة البصرية (أود) من الثقافة في 730 نانومتر باستخدام كوفيت مع مسار الضوء من 1 سم. إذا كانت قيمة أود أعلى من 0.8، وجعل التخفيفات المناسبة للحصول على قياسات أود التي تتناسب مع ثه تركيز الخلية.
ملاحظة: البروتوكولات المعروضة أدناه هي مناسبة للثقافات السائلة، مع كثافة الخلية المقابلة لقيمة أود 730nm 2 أو أعلى. عند الرغبة في الثقافات في مرحلة النمو الأسي، والتي عادة ما يكون لها أود 730nm قيمة أقل من 1، وتركز كثافة الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق في المخزن المؤقت أو المتوسطة لتحقيق قيمة أود 730nm 2 أو أعلى.
- المخازن المؤقتة والكواشف
- جعل 50 ملي العازلة تريس-حمض الهيدروكلوريك في درجة الحموضة 8.
- جعل 50 ملي العازلة خلات الصوديوم في درجة الحموضة 5.
- جعل حل المخزون من 8 U / مل أميلوجلوكوسيداز في 50 ملي الصوديوم خلات العازلة، ودرجة الحموضة 5.
- جعل حل الأسهم من 2 U / مل α الأميليز في 50 ملي الصوديوم العازلة خلات، ودرجة الحموضة 5.
- باستخدام الماء المقطر، والحلول القياسية مكلغلوكوس بتركيزات تتراوح بين 0 و 100 ميكروغرام / مل ،.
- إعداد غود بود كاشف من D- الجلوكوز فحص مجموعة (تنسيق غودبود)، صبعد تعليمات الشركة المصنعة.
2. تحديد الوزن الجاف الخلية (اختياري)
- نقل 2 مل من ثقافة أو إعادة تعليق الخلية (انظر الخطوة 1.1) إلى أنبوب 2.0 مل وأجهزة الطرد المركزي في 6،000 x ج و 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف.
- ريسوسبيند بيليه في 1 مل من الماء وأجهزة الطرد المركزي في 6000 x ج و 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف و ريسوسبيند بيليه الخلية في 0.5 مل من الماء.
- نقل التعليق إلى علبة الألومنيوم قبل وزنها. نقل الدرج إلى فرن التجفيف في 105 درجة مئوية للتجفيف بين عشية وضحاها (حوالي 18 ساعة).
حرجة: من المهم أن يتم التعامل مع علبة مع ملقط لتجنب نقل المواد من الأصابع. قم بتجفيف صينية ألمنيوم فارغة قبل وزنها تحت نفس الظروف لتحديد أي خسارة في الوزن من الصواني أثناء التجفيف. - بعد التجفيف، قم بإخراج الدرج من الفرن والسماح له بالتوازن في كونديتي المحيطلمدة 5 دقائق قبل وزنه بدقة 0.0001 غرام.
ملاحظة: يمكن استخدام القيمة لتطبيع محتوى الجليكوجين على أساس الوزن الجاف الخلية.
3. تحلل الخلايا السيانوباكتريال
- نقل 1 مل من ثقافة أو إعادة تعليق الخلية (انظر الخطوة 1.1) إلى أنبوب 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي في 6،000 x ج و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف.
- ريسوسبيند بيليه في 1 مل من 50 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8، وأجهزة الطرد المركزي في 6000 x ج و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف و ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل من العازلة تريس-حمض الهيدروكلوريك. كرر العملية.
- ريسوسبيند تماما بيليه في 500 ميكرولتر من 50 ملي العازلة تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.
الحرجة: ريسوسبيند بيليه جيدا لتحلل خلية فعالة. الحفاظ على إعادة تعليق في الجليد. - ليس الخلايا معلق في 4 درجات مئوية عن طريق أداء 30 دورات من أولتراسونيكاتيون، كل دورة تتكون من 30 ثانية على تردد 20 كيلوهرتز مع السعة القصوى،تليها 90 ثانية دون.
ملاحظة: يمكن لهذه الطريقة ليز بكفاءة سينيكوكوكوس سب. يك 7002.- بدلا من ذلك، نقل إعادة تعليق الخلية إلى أنبوب المسمار غطاء وإضافة الخرز أكسيد الزركونيوم إلى أنبوب، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تعيين أنبوب في الخالط الأنسجة ويزيل الخلايا في 4 درجات مئوية عن طريق أداء 2 دورات الضرب، كل دورة تتكون من 5 دقائق في إعداد التردد من 5.
ملاحظة: يمكن لهذه الطريقة ليز بكفاءة سينكوسيستيس سب. يك 6803 و سينيكوكوكوس سب. يك 7002.
- بدلا من ذلك، نقل إعادة تعليق الخلية إلى أنبوب المسمار غطاء وإضافة الخرز أكسيد الزركونيوم إلى أنبوب، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تعيين أنبوب في الخالط الأنسجة ويزيل الخلايا في 4 درجات مئوية عن طريق أداء 2 دورات الضرب، كل دورة تتكون من 5 دقائق في إعداد التردد من 5.
- الطرد المركزي أنبوب يحتوي على المحللة لمدة 10 دقيقة في 6000 زغ و 4 درجة مئوية.
ملاحظة: يجب أن تتكون بيليه أساسا من الحطام الخلية الكبيرة. إذا كان هناك عدد كبير من الخلايا غير المتقطعة، كرر الخطوة 3.4. الحفاظ على طاف على الجليد. - تحديد تركيز البروتين باستخدام مجموعة فحص البروتين بكا التجارية.
ملاحظة: يمكن استخدام القيمة لتطبيع محتوى الجليكوجينعلى أساس محتوى البروتين.
4. الجليكوجين هطول الأمطار
- إزالة الكلوروفيل أ من المحللة الخلية عن طريق خلط 900 ميكرولتر من 96٪ (الخامس / الخامس) الإيثانول و 100 ميكرولتر من طاف من الخطوة 3.5 في أنبوب 1.5 مل المسمار غطاء. بعد إغلاق الغطاء، حرارة الأنبوب في 90 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة باستخدام كتلة التدفئة مختبر القياسية.
- احتضان الأنبوب على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- الطرد المركزي أنبوب في 20،000 زغ و 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وإزالة بعناية طاف. بيليه يحتوي على الجليكوجين. تجفيف طفيفة بيليه في الهواء لإزالة الإيثانول الزائد.
حرجة: التجفيف المفرط للبيليه يجب تجنبها، وإلا يصبح من الصعب أن سولوبيليز في الخطوة 5.1. - اختياري: قياس الامتصاصية من طاف حصلت عليه في الخطوة 4.3 في 664 نانومتر لتحديد الكلوروفيل المحتوى. استخدم معامل امتصاص 84.6 لتر / جم / سم 24 .
ملاحظة: يمكن استخدام القيمة إلى نورماليزه محتوى الجليكوجين.
5. الأنزيمية التحلل وتحديد الجليكوجين
- سولوبيليز بيليه التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.3 في 100 ميكرولتر من 50 ملم خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 5، وإضافة 50 ميكرولتر من 8 U / مل أميلوجلوكوسيداز و 50 ميكرولتر من 2 U / مل α- الأميليز. مزيج هذه المواد بشكل جيد باستخدام دوامة.
ملاحظة: خلط بواسطة بيبتينغ لا ينصح لأن بيليه الجليكوجين هو لزج. - احتضان الخليط في 60 درجة مئوية على كتلة التدفئة لمدة 2 ساعة لتمكين هضم الجليكوجين إلى جزيئات الجلوكوز.
- الطرد المركزي العينة في 10،000 x ج لمدة 5 دقائق ونقل طاف إلى أنبوب 1.5 مل جديد.
6. تحديد محتوى الجلوكوز الكلي باستخدام كاشف الله بود
- قياس تركيز الجلوكوز في طاف تم الحصول عليها في الخطوة 5.3 باستخدام الكاشف بود-غود. نقل 100 ميكرولتر من طاف من الخطوة 5.3 إلى بئر في لوحة 96 جيدا. وكسيطرة سلبية،استخدام 100 ميكرولتر من 50 ملم خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 5. لتوليد منحنى المعايرة، وأيضا قياس الحلول القياسية الجلوكوز.
- إضافة 150 ميكرولتر من الله-بود كاشف لكل عينة ومزج بسرعة عن طريق بيبتينغ.
- احتضان لوحة ثابتة في 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. سجل قيمة الامتصاصية في 510 نانومتر باستخدام قارئ لوحة.
- حساب تركيز الجلوكوز باستخدام منحنى المعايرة التي تم الحصول عليها من معايير الجلوكوز.
ملاحظة: يتم التعبير عن تركيز الجليكوجين في المحللة الخلية كما تركيز الجلوكوز (ميكروغرام / مل).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
10 مل من ويلديب سينيكوسيستيس سب. تمت زراعة بك 6803 تحت ظروف فوتووتوتروفيك حتى وصلت قيمة 730nm أود حوالي 0.8. تم حصاد الخلايا ومعلق في 50 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8. تم تعديل قيمة 730nm أود إلى 2-3. تم تحليل محتوى الجليكوجين بعد البروتوكول الموصوف أعلاه. كان محتوى الجليكوجين في أود 730nm 13 ± 1.8 ميكروغرام / مل / أود 730nm ( N = 12). وكان محتوى الجليكوجين بالنسبة لمحتوى البروتين 0.24 ± 0.03 ميكروغرام / ميكروغرام (N = 12)، ومحتوى الجليكوجين نسبة إلى الكلوروفيل كان المحتوى 5.7 ± 0.6 ميكروغرام / ميكروغرام (N = 12). ونظرا لكمية صغيرة من المواد المتاحة، تم حذف قياس الوزن الجاف الخلية. وبالنظر إلى أن محتوى البروتين في البكتيريا الزرقاء المزروعة في ظل ظروف مماثلة حوالي 50٪ من وزن الخلية الجاف 25 </ سوب>، ويقدر محتوى الجليكوجين أن يكون 12٪ من الوزن الجاف الخلية، وهو ما يتفق مع الدراسات السابقة 26 .
وأظهرت حدود الكشف من فحص غود بود ارتباط خطي بين تركيز الجلوكوز وامتصاصية في 510 نانومتر في نطاق تركيز الجلوكوز بين 10 و 100 ميكروغرام / مل، المقابلة لقيم الامتصاصية من 0.08 و 0.7 في 510 نانومتر. الحد الأدنى هو المرجح بسبب حد الكشف عن الأدوات. عندما تم استخدام تركيزات الجلوكوز أعلى من 150 ميكروغرام / مل، راسبات خضراء داكنة تشكلت، مما تسبب في تباين كبير في قراءات الامتصاصية. فيما يتعلق كمية المواد المستخدمة الخلية، ونحن الحصول روتينيا محتويات الجليكوجين استنساخه عندما كانت قيمة أود 730nm من إعادة تعليق الخلية قبل تحلل الخلايا بين 2 و 10. أدت إعادة تعليق الخلية مع قيمة 730nm أود 1 أو أقل إلى إشارات قريبة من الحد الأدنى ليمي الكشفt، مما يؤدي إلى نتائج متغيرة للغاية. إعادة تعليق الخلية مع قيمة أود 730nm أعلى من 20 لم تكن مناسبة لأن تحلل الخلية كان غير مكتمل، وإما تحلل طويلة أو التخفيفات المطلوبة.
ويبين الشكل 1 نتائج ممثل محتويات الجليكوجين في سينكوسيستيس سب. يك 6803 ويلديب واثنين من سلالات متحولة ( ΔpmgA و ΔpmgR1 ). تم استخدام الخلايا المزروعة في مرحلة النمو الأسي. تم تطبيع محتويات الجليكوجين أولا عن طريق محتويات البروتين الكلي وأعربت في وقت لاحق نسبة إلى قيمة ويلديب. وأظهرت النتائج أن سلالات متحولة لديها محتويات الجليكوجين التي هي على الأقل اثنين أضعاف من سلالة ويلديب.
بعد ذلك، تم تحليل محتوى الجليكوجين في سلالات سينيكوكوكوس سب. يك 7002 المهندسة لإنتاج مانيتول 5 . تحتوي السلالة الأولى (غلغ + ) على الجين الجلدي غلغا 1 و GlgA2 اللذين يشفران سينثاسين وظيفيين للجليكوجين ، في حين تفتقر السلالة الثانية (غلغ - ) إلى نسخ وظيفية لهذه الجينات 5 . ثم تم قياس محتويات الجليكوجين ومانيتول في كل من سلالات ( الشكل 2 ). وأظهرت النتائج أن غلغ - تفتقر إلى مستوى للكشف عن الجليكوجين، في حين أنتجت مانيتول أكثر من سلالة غلغ + . هذا يشير إلى أن الكربوهيدرات توليفها بواسطة التمثيل الضوئي يتم توجيهها إلى مانيتول في سلالة متحولة التي تفتقر إلى القدرة على توليف الجليكوجين. وكانت القيم أود 730nm من الثقافات حوالي 10، وتوفير ما يكفي من المواد الخلوية لتحليل الوزن الجاف الخلية. تم تطبيع محتويات الجليكوجين باستخدام الوزن الجاف للخلية.
8 / 56068fig1.jpg "/>
الشكل 1: محتويات الجليكوجين تقاس في خطوط مختلفة من سينكوسيستيس سب . يك 6803. وترد محتويات الجليكوجين النسبية في وت وفي اثنين من المسوخ ( ΔpmgA 9 و ΔpmgR1 8 ). تم تطبيع مستويات الجليكوجين من محتويات البروتين الكلي. وتظهر وسائل ثلاثة مكررات البيولوجية، مع أشرطة الخطأ تمثل الانحرافات المعيارية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إنتاج الجليكوجين والمانيتول في التلاعب وراثيا سينيكوكوكوس سب. يك 7002 5 . GLG <سوب> +، سلالة توليف مانيتول والجليكوجين. غلغ - ، سلالة مانيتول توليف ولكن لا الجليكوجين. والقيم المبينة هي متوسط ثلاث مكررات بيولوجية، حيث تمثل أشرطة الخطأ الانحرافات المعيارية. سدو: الوزن الجاف الخلية، ند: لم يتم الكشف عنها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوات الحاسمة داخل البروتوكول هي الجليكوجين هطول الأمطار وإعادة تعليق. بعد الطرد المركزي التالية هطول الإيثانول، الجليكوجين يشكل بيليه شفافة التي تلتزم بشكل فضفاض إلى جدران أنابيب ميكروسنتريفوج. لذلك، عند إزالة طاف، يجب إيلاء اهتمام خاص حتى لا إزالة بيليه. الجليكوجين بيليه لزجة، و يمكن أن يكون من الصعب انحلال إذا كان يجف. لاحظ أن الانحلال الكامل من بيليه الجليكوجين مهم لأن الانحلال غير مكتملة سيؤدي إلى الهضم الأنزيمي غير فعالة، وبالتالي سوف تؤدي إلى اختلافات كبيرة بين مكررات التقنية. تطبيق سونيكاتيون قبل سولوبيليزاتيون من قبل فورتيكسينغ قد تسهل العملية.
وفيما يتعلق باختيار طريقة التطبيع، فإن الوزن الجاف للخلايا هو مرجع يستخدم على نطاق واسع. وهو أكثر شاقة ويتطلب المزيد من الكتلة الحيوية الخلية من تحديدات البروتين والكلوروفيلأ . يوفر محتوى البروتين الكلي مرجعا بديلا للكتلة الحيوية الخلية ويمكن تحديدها على نطاق صغير، كما هو موضح في هذا البروتوكول. محتوى البروتين الكلي لكل الكتلة الحيوية الخلية الجافة هو عادة في نطاق يتراوح بين 40٪ و 50٪، على الرغم من أن القيمة الدقيقة تعتمد على ظروف النمو 25 ، 28 . الكلوروفيل المحتوى يمكن تحديد بسهولة، ويمكن استخدامها كبديل لكمية الخلايا موجودة في العينة. ومع ذلك، فمن المعروف جيدا أن كمية الكلوروفيل في الخلية يختلف بشكل كبير على ظروف النمو، لا سيما في استجابة لتغير تركيز المغذيات وشدة الضوء (29).
واحدة من المزايا الهامة للتقنية المعروضة فيما يتعلق بطرق أخرى هي أنها انتقائية للغاية. حمض الساخنة والفينول بروتوكول وتحليل تكوين أحادي السكاريد التاليةالتحلل الحمضي هي أساليب بسيطة نسبيا، وقد استخدمت في الدراسات السابقة 9 ، 10 ، 12 ، 13 . ومع ذلك، يمكن لهذه الأساليب المبالغة في تقدير محتوى الجليكوجين لأن الجلوكوز غير الجليكوجين والسكريات الإضافية يمكن أن تسهم في قياس، اعتمادا على تقنية الكشف عن الكربوهيدرات 12 . تقنية وصفها بالكشف عن الجلوكوز بشكل انتقائي في الجليكوجين. ويمكن أيضا أن تميز الجلوكوز من السليلوز، لأن α- الأميليز و α-أميلوغلوكوسيداز لا تحلل β ربط الجلوكوزيل present الموجودة في السليلوز. في الدراسات السابقة، تم تنفيذ التحلل الأنزيمي من الجليكوجين فقط بواسطة α-أميلوغلوكوسيداز 7 ، 27 . إدراج α- الأميليز إندو المفعول جنبا إلى جنب مع α- أميلوغلوكوسيداز إكسو المفعول، كما هو موضح في هذا البروتوكول، يمكن ضمان رانه التحلل المائي الفعال من الجليكوجين. ويتم تطبيق التحليل المائي الانتقائي المماثل بشكل روتيني على معالجات الكتلة الحيوية النباتية، حيث يتم استخدام مزيج من α- أميلاز α-أميلوجلوكوسيداز لتحلل النشا دون التأثير على السكريات الأخرى المحتوية على الجلوكوز، مثل السليلوز 21 .
القيد الرئيسي للتقنية هو أن الإجراء منخفض الإنتاجية لأن عينات فردية تتم معالجتها بشكل منفصل باستخدام أنابيب ميكروسنتريفوج. خطوة هطول الجليكوجين هي العامل الأساسي الذي يمنع إنتاجية أعلى. وسيتطلب التنفيذ كإجراء عالي الإنتاجية استخدام ألواح الآبار العميقة والقدرة على الطرد المركزي بسرعة عالية (000 20 × ز ). في حين أجهزة الطرد المركزي التي يمكن أجهزة الطرد المركزي 96-لوحات جيدا بالسرعة اللازمة متوفرة، فإن معظم لوحات عميق جيدا لا يمكن أن تتسامح مع قوة أكبر من 6000 × ز . وبالتالي، مطلوب اختيار دقيق من المواد على التكيف مع بروتوكول ل هيغh- تحليل الإنتاجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
ويعترف المؤلفون ببحوث الطاقة الشمالية (أكوفيد، مشروع رقم 24)، و إنوفاتيونفوندن الدنمارك (بانت باور، مشروع رقم 12-131844)، و فيلوم فوندن (مشروع رقم 13363)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QSonica Sonicators Q700 | Qsonica, LLC | NA | QSonica |
| SpectraMax 190 Microplate Reader | Molecular Devices | NA | Eliza plate reader |
| Bullet Blender Storm | Next Advance | BBY24M-CE | Beads beater |
| Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spectrophotometer | Amersham Biosciences | NA | Spectrophotometer |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | Buffer |
| HCl | Merck | 1-00317 | pH adjutment |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | 32319 | Buffer |
| Amyloglycosidase (Rhizopus sp.) | Megazyme | E-AMGPU | Enzyme for glycogen depolymerization |
| α-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis) | Sigma-Aldrich | A3176 | Enzyme for glycogen depolymerization |
| D-Glucose | Merch | 8337 | Standard for the glucose assay |
| Pierce BCA Protein assay kit | Thermo Fisher scientific | 23225 | For determination of protein concentrations |
| Aluminum drying trays, disposable | VWR | 611-1362 | For determination of cell dry weights |
| D-Glucose assay kit (GODPOD format) | Megazyme | K-GLUC | For determination of glucose concentrations |
| Zirconium oxide breads, 0.15 mm | Next Advance | ZrOB015 | Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm |
| RINO tubes | Next Advance | NA | Tubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm |
References
- Chen, X., et al. The Entner-Doudoroff pathway is an overlooked glycolytic route in cyanobacteria and plants. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (19), 5441-5446 (2016).
- Yang, C., Hua, Q., Shimizu, K. Metabolic flux analysis in Synechocystis using isotope distribution from C-13-labeled glucose. Metab Eng. 4 (3), 202-216 (2002).
- Pelroy, R. A., Levine, G. A., Bassham, J. A. Kinetics of light-dark CO2 fixation and glucose assimilation by Aphanocapsa 6714. J Bacteriol. 128, 633-643 (1976).
- You, L., Berla, B., He, L., Pakrasi, H. B., Tang, Y. J. 13C-MFA delineates the photomixotrophic metabolism of Synechocystis. sp. PCC 6803 under light- and carbon-sufficient conditions. Biotechnol J. 9, 684-692 (2014).
- Jacobsen, J. H., Frigaard, N. U. Engineering of photosynthetic mannitol biosynthesis from CO2 in a cyanobacterium. Metab Eng. 21, 60-70 (2014).
- Möllers, K. B., Cannella, D., Jørgensen, H., Frigaard, N. -U. Cyanobacterial biomass as carbohydrate and nutrient feedstock for bioethanol production by yeast fermentation. Biotechnol Biofuels. 7, 64 (2014).
- Angermayr, S. A., et al. Culturing Synechocystis. sp. strain PCC 6803 with N2 and CO 2 in a diel regime reveals multiphase glycogen dynamics with low maintenance costs. Appl Environ Microbiol. 82, 4180-4189 (2016).
- de Porcellinis, A. J., et al. The Non-coding RNA Ncr0700/PmgR1 is required for photomixotrophic growth and the regulation of glycogen accumulation in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Plant Cell Physiol. 57 (10), 2091-2103 (2016).
- Sakuragi, Y. alpha-Tocopherol plays a role in photosynthesis and macronutrient homeostasis of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 that is independent of its antioxidant function. Plant Physiol. 141, 508-521 (2006).
- Osanai, T., et al. Positive regulation of sugar catabolic pathways in the cyanobacterium Synechocystis. sp. PCC 6803 by the group 2 sigma factor sigE. J Biol Chem. 280, 30653-30659 (2005).
- Yamauchi, Y., Kaniya, Y., Kaneko, Y., Hihara, Y. Physiological roles of the cyAbrB transcriptional regulator pair Sll0822 and Sll0359 in Synechocystis sp. strain PCC 6803. J Bacteriol. 193, 3702-3709 (2011).
- Dubois, M., Gilles, K., Hamilton, J., Rebers, P., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal Chem. 28, 350-356 (1956).
- Osanai, T., et al. Genetic engineering of group 2 {sigma} factor SigE widely activates expressions of sugar catabolic genes in Synechocystis species PCC 6803. J Biol Chem. 286, 30962-30971 (2011).
- Miao, X., Wu, Q., Wu, G., Zhao, N. Sucrose accumulation in salt-stressed cells of agp gene deletion-mutant in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. FEMS Microbiol Letters. 218, 71-77 (2003).
- Hagemann, M., Erdmann, N. Activation and pathway of glucosylglycerol synthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Microbiology. 140, 1427-1431 (1994).
- Nobles, D. R., Romanovicz, D. K., Brown, R. M. Cellulose in cyanobacteria. Origin of vascular plant cellulose synthase. Plant Physiol. 127, 529-542 (2001).
- Zhao, C., et al. High-yield production of extracellular type-I cellulose by the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002. Cell Discovery. 1, 15004 (2015).
- Kawano, Y., et al. Cellulose accumulation and a cellulose synthase gene are responsible for cell aggregation in the cyanobacterium Thermosynechococcus vulcanus RKN. Plant Cell Physiol. 52, 957-966 (2011).
- Angermayr, S. A., Gorchs Rovira, A., Hellingwerf, K. J. Metabolic engineering of cyanobacteria for the synthesis of commodity products. Trends Biotechnol. 33, 352-361 (2015).
- Zhang, B., Dhital, S., Gidley, M. J. Synergistic and antagonistic effects of α-amylase and amyloglucosidase on starch digestion. Biomacromolecules. 14, 1945-1954 (2013).
- Harholt, J., et al. ARABINAN DEFICIENT 1 is a putative arabinosyltransferase involved in biosynthesis of pectic arabinan in Arabidopsis. Plant Physiol. 140, 49-58 (2006).
- Fernando, C. D., Soysa, P. Optimized enzymatic colorimetric assay for determination of hydrogen peroxide (H2O2) scavenging activity of plant extracts. MethodsX. 2, 283-291 (2015).
- Jacobsen, J. H., Rosgaard, L., Sakuragi, Y., Frigaard, N. U. One-step plasmid construction for generation of knock-out mutants in cyanobacteria: studies of glycogen metabolism in Synechococcus sp PCC 7002. Photosynth Res. 107 (2), 215-221 (2011).
- Lichtenthaler, H. K. Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes. Methods Enzymol. 148, 350-382 (1987).
- López, C. V. G., del Carmen Cerón García, M., Fernández, F. G. A., Bustos, C. S., Chisti, Y., Sevilla, J. M. F. Protein measurements of microalgal and cyanobacterial biomass. Bioresource Technol. 101, 7587-7591 (2010).
- Hasunuma, T., et al. Dynamic metabolic profiling of cyanobacterial glycogen biosynthesis under conditions of nitrate depletion. J Exp Bot. 64, 2943-2954 (2013).
- Díaz-Troya, S., López-Maury, L., Sánchez-Riego, A. M., Roldán, M., Florencio, F. J. Redox regulation of glycogen biosynthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803: Analysis of the AGP and glycogen synthases. Molecular Plant. 7, 87-100 (2014).
- Parrott, L. M., Slater, J. H. The DNA, RNA and protein composition of the cyanobacterium Anacystis nidulans grown in light- and carbon dioxide-limited chemostats. Arch Microbiol. 127, 53-58 (1980).
- Hihara, Y., Kamei, A., Kanehisa, M., Kaplan, A., Ikeuchi, M. DNA microarray analysis of cyanobacterial gene expression during acclimation to high light. Plant Cell. 13, 793-806 (2001).
