Summary
Her præsenterer vi et pålideligt og let assay til at måle glycogenindholdet i cyanobakterielle celler. Fremgangsmåden indebærer udfældning, selekterbar depolymerisering og påvisning af glucoserester. Denne metode er velegnet til både vildtype og genetisk manipulerede stammer og kan lette metabolisme af cyanobakterier.
Abstract
Cyanobakterier akkumulerer glycogen som en vigtig intracellulær kulstof- og energilagring under fotosyntese. Nylige udviklinger i forskning har fremhævet komplekse mekanismer for glykogenmetabolisme, herunder dielcyklusen af biosyntese og katabolisme, redoxregulering og involvering af ikke-kodende RNA. Samtidig gøres der forsøg på at omdirigere kulstof fra glykogen til ønskelige produkter i genetisk manipulerede cyanobakterier for at forbedre produktudbyttet. Flere metoder anvendes til at bestemme indholdet af glycogen i cyanobakterier med variable nøjagtigheder og tekniske kompleksiteter. Her giver vi en detaljeret protokol til pålidelig bestemmelse af glycogenindholdet i cyanobakterier, der kan udføres i et standard life science laboratorium. Protokollen medfører selektiv udfældning af glycogen fra cellelysatet og den enzymatiske depolymerisering af glycogen til dannelse af glucosemonomerer, som detekteres af en glucoseoxIdase-peroxidase (GOD-POD) enzymkoblet assay. Metoden er blevet anvendt til Synechocystis sp. PCC 6803 og Synechococcus sp. PCC 7002, to model cyanobakterielle arter, der er meget udbredt i metabolisk teknik. Endvidere viste fremgangsmåden med succes forskelle i glycogenindholdet mellem vildtypen og mutanterne, der var defekte i regulatoriske elementer eller glykogenbiosyntetiske gener.
Introduction
Cyanobakterier akkumulerer glykogen som den største kulhydratlager af kulstof fra CO 2 fastgjort i lys gennem fotosyntese. Glycogen er en glycan bestående af lineær a-1,4-koblet glucan med grene skabt af a-1,6-koblede glucosylbindinger. Glykogenbiosyntese i cyanobakterier starter med omdannelsen af glucose-6-phosphat til ADP-glucose gennem den sekventielle virkning af phosphoglucomutase og ADP-glucosepyrophosphorylase. Glucosegruppen i ADP-glucose overføres til den ikke-reducerende ende af a-1,4-glucan-rygradet af glycogen med en eller flere glycogensyntaser (GlgA). Efterfølgende introducerer et forgreningsenzymer den a-1,6-bundne glucosylbinding, som yderligere udvides til at frembringe glycogenpartiklen. I mørket brydes glycogen ned af glycogenphosphorylase, glykogenforgreningsenzymer, a-glucanotransferase og maltodextrinphosphorylase i phosphoryleret glucose og fri glucose. Disse foder intO kataboliske veje, herunder oxidative pentosephosphatvejen, Embden-Meyerhof-Parnas-vejen (glycolyse) og Entner-Doudoroff-vejen 1 , 2 , 3 , 4 .
Glykogenmetabolisme i cyanobakterier har skabt stigende interesse i de senere år på grund af muligheden for, at cyanobakterier udvikler sig til mikrobielle cellefabrikker drevet af sollys til fremstilling af kemikalier og brændstoffer. Glykogenmetabolisme kunne modificeres for at øge udbyttet af produkterne, fordi glykogen er den største fleksible carbonpool i disse bakterier. Et eksempel er cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002, som er blevet genetisk manipuleret til at producere mannitol; Den genetiske forstyrrelse af glycogensyntese øger mannitoludbyttet 3 gange 5 . Et andet eksempel er produktionen af bioethanol fra glycogenbelastet vildtYpe Synechococcus sp. PCC 7002 6 . Vildtypecelleglycogenindholdet kan være op til 60% af den tørre vægt af cellen under kvælstofsultation 6 .
Vores forståelse af glykogen metabolisme og regulering har også udvidet de seneste år. Mens glykogen er kendt for at akkumulere i lyset og at blive kataboliseret i mørket, blev detaljeret kinetik af glykogenmetabolisme under dielcyklussen først afsløret i Synechocystis sp. PCC 6803 7 . Derudover er der blevet identificeret adskillige gener, som påvirker akkumuleringen af glycogen. Et bemærkelsesværdigt eksempel er opdagelsen af, at den formodede histidinkinase PmgA og det ikke-kodende RNA PmgR1 danner en regulerende kaskade og styrer akkumuleringen af glycogen. Interessant nok akkumulerer pmgA og pmgR1 deletionsmutanterne dobbelt så meget glycogen som vildtypestammen af Synechocystis sp. PCC 68038 , 9 . Andre regulatoriske elementer er også kendt for at påvirke akkumuleringen af glycogen, herunder den alternative sigma faktor E og transkriptionsfaktoren CyAbrB2 10 , 11 .
Da interessen for glykogenregulering og metabolisme vokser, er en detaljeret protokol, der beskriver bestemmelsen af glycogenindholdet, berettiget. Flere metoder anvendes i litteraturen. Syrehydrolyse efterfulgt af bestemmelsen af monosaccharidindholdet ved hjælp af højtryksanionbytningsvæskekromatografi koblet med en pulseret amperometrisk detektor eller spektrometrisk bestemmelse efter behandling med syre og phenol er almindeligt anvendte metoder til at approximere glycogenindholdet 9 , 10 , 12 , 13 . Imidlertid en højtryksanionbytningsvæskekromatografiC-instrumentet er meget dyrt og diskriminerer ikke glucose afledt af glykogen fra det, som er afledt af andre glucoseholdige glycoconjugater, såsom saccharose 14 , glucosylglycerol 15 og cellulose 16 , 17 , 18 , som er kendt for at akkumulere i nogle cyanobakterielle arter. Syrephenolmetoden kan udføres ved anvendelse af standard laboratorieudstyr. Det anvender imidlertid meget giftige reagenser og skelner ikke glukose afledt fra forskellige glycokonjugater, og det skelner heller ikke glukose fra andre monosaccharider, der udgør cellulære materialer, såsom glycolipider, lipopolysaccharider og ekstracellulære matricer 12 . Især anvendes det varme sur-phenol-assay ofte til bestemmelse af det samlede carbohydratindhold i stedet for til den specifikke bestemmelse af glucoseindholdet 12 . Enzymatisk hyDrolyse af glycogen til glucose ved a-amyloglucosidase efterfulgt af påvisning af glucose gennem et enzymkoblet assay frembringer en kolorimetrisk aflæsning, som er yderst følsom og specifik for glucose afledt af glycogen. Specificiteten kan forbedres yderligere med præferenceudfældningen af glycogen fra cellelysater ved ethanol 5 , 8 , 19 .
Her beskriver vi en detaljeret protokol for et enzymbaseret assay af glycogenindholdet i to af de mest undersøgte cyanobakterielle arter, Synechocystis sp. PCC 6803 og Synechococcus sp. PCC 7002, i vildtype- og mutantstammerne. For at sikre effektiv hydrolyse anvendes en cocktail af a-amylase og a-amyloglucosidase 8 . Den endo-virkende a-amylase hydrolyserer a-1,4-bindingerne i forskellige glucaner til dextriner, der yderligere hydrolyseres tO glucose ved exo-virkende a-amyloglucosidase 20 . De synergistiske virkninger af disse enzymer er velkendte, og disse enzymer anvendes rutinemæssigt til selektiv hydrolyse af stivelse, hvilket er et a-koblet glucan-lignende glycogen uden at påvirke andre glycokonjuganter, såsom cellulose, i plantebiomassen 21 . Den frigivne glucose er kvantitativt detekteret efter et enzymkoblet assay bestående af glucoseoxidase, som katalyserer reduktionen af oxygen til hydrogenperoxid og oxidationen af glucose til en lacton- og peroxidase, der frembringer et pink-farvet kinoniminfarvestof fra hydrogenperoxid, En phenolforbindelse og 4-aminoantipyrin 22 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling
- Cyanobakterielle kulturer
- Grow Synechocystis sp. PCC 6803 ved 30 ° C i flydende BG11 medium 8 , med konstant tilførsel af luft suppleret med 1% (vol / vol) CO 2 . Belyse kulturer kontinuerligt med lys ved en fotosyntetisk fotonfluxtæthed på 50 pmol foton / m2 / s.
- Grow Synechococcus sp. PCC 7002 i flydende A + medium 23 (BG11 medium kan også bruges), med konstant tilførsel af luft suppleret med 1% (vol / vol) CO 2 . Temperaturen skal være 37 ° C. Belyse kulturer kontinuerligt med lys ved en fotosyntetisk fotonfluxtæthed på 150 pmol foton / m2 / s.
- Mål kulturens optiske densitet (OD) ved 730 nm ved brug af en kuvette med en lysbane på 1 cm. Hvis OD-værdien er over 0,8, lav passende fortyndinger for at opnå OD-målinger, der er proportionale med thE celle koncentration.
BEMÆRK: Protokollerne præsenteret nedenfor er egnede til flydende kulturer, med en celletæthed svarende til en OD 730nm værdi på 2 eller højere. Når kulturer i den eksponentielle vækstfase ønskes, som typisk har en OD 730nm- værdi under 1, koncentrerer celletætheden ved centrifugering og resuspension i en buffer eller et medium for at opnå en OD 730nm- værdi på 2 eller højere.
- Buffere og reagenser
- Der fremstilles 50 mM Tris-HCI-buffer ved pH 8.
- Lav 50 mM natriumacetatpuffer ved pH 5.
- Lav en stamopløsning af 8 U / ml amyloglucosidase i 50 mM natriumacetatpuffer, pH 5.
- Lav en stamopløsning af 2 U / ml a-amylase i 50 mM natriumacetatpuffer, pH 5.
- Ved anvendelse af destilleret vand er makeglucose standardopløsninger i koncentrationer mellem 0 og 100 μg / ml.
- Forbered GOD-POD reagens fra D-Glucose Assay Kit (GODPOD Format), fOverholdelse af producentens anvisninger.
2. Bestemmelse af celletørvægt (valgfrit)
- Overfør 2 ml af en kultur eller en cellesuspension (se trin 1.1) til et 2,0 ml rør og centrifuge ved 6.000 xg og 4 ° C i 5 min. Kassér supernatanten.
- Resuspender pelleten i 1 ml vand og centrifuger ved 6000 xg og 4 ° C i 5 minutter. Kassér supernatanten og resuspender cellepelleten i 0,5 ml vand.
- Overfør suspensionen til en forudvejet aluminiumbakke. Overfør bakken til en tørreovn ved 105 ° C til tørring natten over (ca. 18 timer).
KRITISK: Det er vigtigt, at bakken håndteres med tang for at undgå overførsel af materiale fra fingrene. Tør en tom, forudvejet aluminiumbakke under de samme betingelser for at bestemme noget vægttab fra bakkerne under tørring. - Efter tørring fjernes bakken fra ovnen og lader den ligestille ved omgivelsestemperaturOns i 5 min før vejer den med en nøjagtighed på 0,0001 g.
BEMÆRK: Værdien kan bruges til at normalisere glycogenindholdet på celle-tørvægtbasis.
3. Lysis af cyanobakterielle celler
- Overfør 1 ml af en kultur eller en cellesuspension (se trin 1.1) til et 1,5 ml rør og centrifuge ved 6.000 xg og 4 ° C i 10 min. Kassér supernatanten.
- Resuspender pelleten i 1 ml 50 mM Tris-HCI, pH 8 og centrifuge ved 6000 xg og 4 ° C i 10 minutter. Kassér supernatanten og resuspender cellepellet i 1 ml Tris-HCI buffer. Gentag processen.
- Resuspender pelleten grundigt i 500 μl 50 mM Tris-HCI buffer, pH 8.
KRITISK: Resuspender pelletbrønden for en effektiv cellelys. Hold resuspenningen i is. - Lyse de resuspenderede celler ved 4 ° C ved at udføre 30 ultralydscykler, hver cyklus bestående af 30 s ved en frekvens på 20 kHz med den maksimale amplitude,Efterfulgt af 90 s uden.
BEMÆRK: Denne metode kan effektivt lyse Synechococcus sp. PCC 7002.- Alternativt, overfør celle resuspension til et skruehætte rør og tilsæt zirkoniumoxid perler til røret, efter producentens anvisninger. Sæt røret i en vævshomogenisator og lyse cellerne ved 4 ° C ved at udføre 2 cykler med slag, hver cyklus bestående af 5 min ved frekvensindstillingen på 5.
BEMÆRK: Denne metode kan effektivt lyse Synechocystis sp. PCC 6803 og Synechococcus sp. PCC 7002.
- Alternativt, overfør celle resuspension til et skruehætte rør og tilsæt zirkoniumoxid perler til røret, efter producentens anvisninger. Sæt røret i en vævshomogenisator og lyse cellerne ved 4 ° C ved at udføre 2 cykler med slag, hver cyklus bestående af 5 min ved frekvensindstillingen på 5.
- Centrifuger røret, der indeholder lysatet i 10 minutter ved 6000 xg og 4 ° C.
BEMÆRK: Pelleten skal hovedsagelig bestå af storcelleaffald. Hvis der er et betydeligt antal ubrudte celler, gentag trin 3.4. Hold supernatanten på is. - Bestem proteinkoncentrationen ved anvendelse af et kommercielt BCA Protein assay kit.
BEMÆRK: Værdien kan bruges til at normalisere glycogenindholdetPå proteinindhold.
4. Glykogenudfældning
- Fjern chlorophyll a fra cellelysatet ved at blande 900 μl 96% (v / v) ethanol og 100 μl af supernatanten fra trin 3,5 i et 1,5 ml skruehætte rør. Efter lukning af hætten opvarmes røret ved 90 ° C i 10 minutter ved brug af en standard laboratorievarmeblok.
- Inkuber røret på is i 30 minutter.
- Centrifuger røret ved 20.000 xg og 4 ° C i 30 min og fjern forsigtigt supernatanten; Pelleten indeholder glycogen. Tør let pelleten i luft for at fjerne overskydende ethanol.
KRITISK: Overdreven tørring af pelleten skal undgås, ellers bliver det vanskeligt at solubilisere i trin 5.1. - OPTIONAL: Mål absorbansen af supernatanten opnået i trin 4.3 ved 664 nm for at bestemme indholdet af chlorophyll a . Brug en absorptionskoefficient på 84,6 L / g / cm 24 .
BEMÆRK: Værdien kan bruges til normalizE glykogenindholdet.
5. Enzymatisk hydrolyse og glycogenbestemmelse
- Solubiliser pellet opnået i trin 4.3 i 100 μl 50 mM natriumacetat, pH 5, og tilsæt 50 μL 8 U / ml amyloglucosidase og 50 μl 2 U / ml α-amylase. Bland disse materialer godt ved hjælp af en hvirvel.
BEMÆRK: Blanding ved pipettering anbefales ikke, fordi glycogenpellet er viskøs. - Inkuber blandingen ved 60 ° C på en varmeblok i 2 timer for at muliggøre fordøjelsen af glycogen i glucosemolekyler.
- Centrifugere prøven ved 10.000 xg i 5 minutter og overfør supernatanten til et nyt 1,5 ml rør.
6. Bestemmelse af indholdet af total glucose ved anvendelse af GOD-POD-reagensen
- Mål koncentrationen af glucose i supernatanten opnået i trin 5.3 under anvendelse af GOD-POD reagenset. Overfør 100 μL af supernatanten fra trin 5.3 til en brønd i en 96-brønds plade. Som en negativ kontrol,Brug 100 μl 50 mM natriumacetat, pH 5. Til måling af en kalibreringskurve måles også glucosestandardopløsningerne.
- Tilsæt 150 μL GOD-POD reagens til hver prøve og bland hurtigt ved pipettering.
- Inkuber pladen statisk ved 25 ° C i 30 minutter. Optag absorbansværdien ved 510 nm ved hjælp af en pladelæser.
- Beregn koncentrationen af glucose ved hjælp af en kalibreringskurve opnået ud fra glucosestandarderne.
BEMÆRK: Glycogenkoncentrationen i cellelysatet udtrykkes som koncentrationen af glucose (μg / mL).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
10 ml vildtype Synechocystis sp. PCC 6803 blev dyrket under fotototrofiske betingelser indtil OD 730nm- værdien nåede ca. 0,8. Cellerne blev høstet og resuspenderet i 50 mM Tris-HCI, pH 8. OD 730nm- værdien blev justeret til 2-3. Glycogenindholdet blev analyseret efter den ovenfor beskrevne protokol. Glycogenindholdet pr. OD 730 nm var 13 ± 1,8 μg / ml / OD 730 nm ( N = 12). Glycogenindholdet i forhold til proteinindholdet var 0,24 ± 0,03 μg / μg ( N = 12), og glycogenindholdet i forhold til chlorophyll a- indholdet var 5,7 ± 0,6 μg / μg ( N = 12). På grund af den ringe mængde materiale, der blev til rådighed, blev målingen af cellens tørvægt udeladt. I betragtning af at proteinindholdet i cyanobakterier dyrket under sammenlignelige betingelser er ca. 50% af celleets tørvægt 25 </ Sup> estimeres glycogenindholdet til 12% af cellens tørvægt, hvilket er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser 26 .
Detektionsgrænserne for GOD-POD-analysen viste en lineær korrelation mellem glucosekoncentrationen og absorbansen ved 510 nm i glukosekoncentrationsområdet mellem 10 og 100 μg / ml svarende til absorbansværdier på 0,08 og 0,7 ved 510 nm. Minimumsgrænsen er sandsynligvis på grund af den instrumentelle detektionsgrænse. Når der anvendes glukosekoncentrationer højere end 150 μg / ml, dannes mørkegrønne bundfald, hvilket medfører en stor variation i absorbansafregningen. Med hensyn til mængden af anvendte cellematerialer opnåede vi rutinemæssigt reproducerbare glycogenindhold, når OD 730nm- værdien af celle resuspension forud for cellelyse var mellem 2 og 10. Cellususpensioner med en OD 730nm- værdi på 1 eller derunder gav anledning til signaler tæt på Mindste detektionslimiT, hvilket fører til meget variable resultater. Cellresuspension med en OD 730nm- værdi højere end 20 var ikke egnet, fordi cellelysen var ufuldstændig, og enten forlænget lys eller fortynding var påkrævet.
Figur 1 viser repræsentative resultater af glycogenindholdet i Synechocystis sp. PCC 6803 vildtype og to mutantstammer ( ΔpmgA og ΔpmgR1 ). Cellerne dyrket ved den eksponentielle vækstfase blev anvendt. Glycogenindholdet blev normaliseret først ved det totale proteinindhold og blev derefter udtrykt i forhold til værdien for vildtypen. Resultaterne viser, at mutantstammerne har glycogenindhold, som er mindst to gange højere end vildtypestammen.
Derefter blev glycogenindholdet analyseret i stammer af Synechococcus sp. PCC 7002 konstrueret til fremstilling af mannitol 5 . Den første stamme (Glg +) indeholder vildtype glgA1 og glgA2 gener, der koder to funktionelle glycogen-syntaser, mens den anden stamme (Glg -) mangler funktionelle kopier af disse gener 5. Glycogen- og mannitolindholdet blev derefter målt i begge stammer ( figur 2 ). Resultaterne viser, at Glg - manglede en påviselig grad af glycogen, mens det producerede mere mannitol end Glg + -stammen. Dette antyder, at kulhydratet syntetiseret ved fotosyntese omdirigeres til mannitol i mutantstammen, der mangler evnen til at syntetisere glycogen. OD 730nm værdierne fra kulturerne var ca. 10, hvilket gav tilstrækkelige cellematerialer til analyse af celle tørvægt. Glycogenindholdet blev normaliseret under anvendelse af cellens tørvægt.
8 / 56068fig1.jpg "/>
Figur 1: Glycogenindholdet målt i forskellige linjer af Synechocystis sp . PCC 6803. Relative glykogen indhold i WT og i to mutanter (ΔpmgA 9 og ΔpmgR1 8) er vist. Glycogenniveauerne blev normaliseret ved det totale proteinindhold. Midler af tre biologiske replikater er vist med fejlstænger, der repræsenterer standardafvigelser. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Glycogen og mannitolproduktion i genetisk manipuleret Synechococcus sp. PCC 7002 5 . GLG <Sup> +, stammen syntetiserer mannitol og glycogen. Glg - , stammen syntetiserer mannitol men ingen glycogen. De viste værdier er gennemsnittet af tre biologiske replikater, med fejlstænger, der repræsenterer standardafvigelserne. CDW: celle tørvægt, ND: ikke detekteret. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin i protokollen er glykogenudfældning og resuspension. Efter centrifugering efter ethanoludfældning danner glycogen en gennemskinnelig pellet, som løst klæber til væggene i mikrocentrifugerørene. Når der fjernes supernatanten, skal der derfor gives særlig opmærksomhed for ikke at fjerne pelleten. Glykogenpelleten er klæbrig, og opløsning kan være svært, hvis den tørrer ud. Bemærk, at den fuldstændige opløsning af glycogenpelleten er vigtig, fordi ufuldstændig opløseliggørelse vil føre til ineffektiv enzymatisk fordøjelse og derfor medføre store variationer mellem tekniske replikater. Anvendelsen af sonikering forud for solubilisering ved vortexing kan lette processen.
Hvad angår valget af normaliseringsmetode, er celle tørvægt en meget brugt reference. Det er mere besværligt og kræver mere cellebiomasse end bestemmelser om protein og chlorophyllA. Det samlede proteinindhold tilvejebringer en alternativ reference til cellebiomassen og kan bestemmes i en lille skala som beskrevet i den foreliggende protokol. Det totale proteinindhold pr. Tørcellebiomasse ligger typisk i området mellem 40% og 50%, selv om den nøjagtige værdi afhænger af vækstbetingelserne 25 , 28 . Klorofyl a- indholdet kan let bestemmes og kan anvendes som en proxy til cellemængden, som er til stede i prøven. Det er imidlertid velkendt, at mængden af chlorophyll a pr. Celle varierer betydeligt afhængigt af vækstbetingelserne, især som reaktion på skiftende næringsstofkoncentrationer og lysintensiteter 29 .
En af de væsentlige fordele ved den præsenterede teknik med hensyn til andre metoder er, at den er meget selektiv. Hot syren og phenolprotokollen og monosaccharidsammensætningsanalysen følgerSyrehydrolyse er relativt enkle metoder og er blevet anvendt i tidligere undersøgelser 9 , 10 , 12 , 13 . Disse metoder kan imidlertid overvurdere glycogenindholdet, fordi ikke-glycogenglucose og ekstra sukkerarter kan bidrage til måling afhængigt af kulhydratdetekteringsteknikken 12 . Den beskrevne teknik detekterer selektivt glucose i glycogen. Det kan også diskriminere glucose fra cellulose, fordi a-amylase og a-amyloglucosidase ikke hydrolyserer de p-bundne glucosylbindinger, som er til stede i cellulose. I tidligere undersøgelser blev den enzymatiske hydrolyse af glycogen udelukkende udført af a-amyloglucosidase 7 , 27 . Inklusion af den endo-virkende a-amylase sammen med den exo-virkende a-amyloglucosidase, som præsenteret i denne protokol, kan sikre tHan effektiv hydrolyse af glycogen. En lignende selektiv hydrolyse påføres rutinemæssigt på behandlinger af plantebiomasse, hvor kombinationen af a-amylase-a-amyloglucosidase anvendes til hydrolysering af stivelse uden at påvirke andre glucoseholdige polysaccharider, såsom cellulose 21 .
Hovedbegrænsningen af teknikken er, at proceduren er lav gennemstrømning, fordi individuelle prøver behandles separat ved anvendelse af mikrocentrifugerør. Glycogenudfældningstrinnet er den primære faktor, der forhindrer højere gennemstrømning. Implementering som en høj gennemstrømningsprocedure ville kræve brugen af dybbrøndsplader og evnen til at centrifugere disse med høj hastighed (20.000 x g ). Mens centrifuger, som kan centrifugere 96-brøndsplader med den nødvendige hastighed, er tilgængelige, kan de fleste dybbrøndsplader ikke tåle kraft større end 6.000 x g . Derfor kræves det omhyggelige valg af materialer for at tilpasse protokollen til higH-gennemstrømningsanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender Nordisk Energiforskning (AquaFEED, projekt nr. 24), Innovationfonden Danmark (Pant Power, projekt nr. 12-131844) og Villum Fonden (projekt nr. 13363)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QSonica Sonicators Q700 | Qsonica, LLC | NA | QSonica |
| SpectraMax 190 Microplate Reader | Molecular Devices | NA | Eliza plate reader |
| Bullet Blender Storm | Next Advance | BBY24M-CE | Beads beater |
| Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spectrophotometer | Amersham Biosciences | NA | Spectrophotometer |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | Buffer |
| HCl | Merck | 1-00317 | pH adjutment |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | 32319 | Buffer |
| Amyloglycosidase (Rhizopus sp.) | Megazyme | E-AMGPU | Enzyme for glycogen depolymerization |
| α-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis) | Sigma-Aldrich | A3176 | Enzyme for glycogen depolymerization |
| D-Glucose | Merch | 8337 | Standard for the glucose assay |
| Pierce BCA Protein assay kit | Thermo Fisher scientific | 23225 | For determination of protein concentrations |
| Aluminum drying trays, disposable | VWR | 611-1362 | For determination of cell dry weights |
| D-Glucose assay kit (GODPOD format) | Megazyme | K-GLUC | For determination of glucose concentrations |
| Zirconium oxide breads, 0.15 mm | Next Advance | ZrOB015 | Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm |
| RINO tubes | Next Advance | NA | Tubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm |
References
- Chen, X., et al. The Entner-Doudoroff pathway is an overlooked glycolytic route in cyanobacteria and plants. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (19), 5441-5446 (2016).
- Yang, C., Hua, Q., Shimizu, K. Metabolic flux analysis in Synechocystis using isotope distribution from C-13-labeled glucose. Metab Eng. 4 (3), 202-216 (2002).
- Pelroy, R. A., Levine, G. A., Bassham, J. A. Kinetics of light-dark CO2 fixation and glucose assimilation by Aphanocapsa 6714. J Bacteriol. 128, 633-643 (1976).
- You, L., Berla, B., He, L., Pakrasi, H. B., Tang, Y. J. 13C-MFA delineates the photomixotrophic metabolism of Synechocystis. sp. PCC 6803 under light- and carbon-sufficient conditions. Biotechnol J. 9, 684-692 (2014).
- Jacobsen, J. H., Frigaard, N. U. Engineering of photosynthetic mannitol biosynthesis from CO2 in a cyanobacterium. Metab Eng. 21, 60-70 (2014).
- Möllers, K. B., Cannella, D., Jørgensen, H., Frigaard, N. -U. Cyanobacterial biomass as carbohydrate and nutrient feedstock for bioethanol production by yeast fermentation. Biotechnol Biofuels. 7, 64 (2014).
- Angermayr, S. A., et al. Culturing Synechocystis. sp. strain PCC 6803 with N2 and CO 2 in a diel regime reveals multiphase glycogen dynamics with low maintenance costs. Appl Environ Microbiol. 82, 4180-4189 (2016).
- de Porcellinis, A. J., et al. The Non-coding RNA Ncr0700/PmgR1 is required for photomixotrophic growth and the regulation of glycogen accumulation in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Plant Cell Physiol. 57 (10), 2091-2103 (2016).
- Sakuragi, Y. alpha-Tocopherol plays a role in photosynthesis and macronutrient homeostasis of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 that is independent of its antioxidant function. Plant Physiol. 141, 508-521 (2006).
- Osanai, T., et al. Positive regulation of sugar catabolic pathways in the cyanobacterium Synechocystis. sp. PCC 6803 by the group 2 sigma factor sigE. J Biol Chem. 280, 30653-30659 (2005).
- Yamauchi, Y., Kaniya, Y., Kaneko, Y., Hihara, Y. Physiological roles of the cyAbrB transcriptional regulator pair Sll0822 and Sll0359 in Synechocystis sp. strain PCC 6803. J Bacteriol. 193, 3702-3709 (2011).
- Dubois, M., Gilles, K., Hamilton, J., Rebers, P., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal Chem. 28, 350-356 (1956).
- Osanai, T., et al. Genetic engineering of group 2 {sigma} factor SigE widely activates expressions of sugar catabolic genes in Synechocystis species PCC 6803. J Biol Chem. 286, 30962-30971 (2011).
- Miao, X., Wu, Q., Wu, G., Zhao, N. Sucrose accumulation in salt-stressed cells of agp gene deletion-mutant in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. FEMS Microbiol Letters. 218, 71-77 (2003).
- Hagemann, M., Erdmann, N. Activation and pathway of glucosylglycerol synthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Microbiology. 140, 1427-1431 (1994).
- Nobles, D. R., Romanovicz, D. K., Brown, R. M. Cellulose in cyanobacteria. Origin of vascular plant cellulose synthase. Plant Physiol. 127, 529-542 (2001).
- Zhao, C., et al. High-yield production of extracellular type-I cellulose by the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002. Cell Discovery. 1, 15004 (2015).
- Kawano, Y., et al. Cellulose accumulation and a cellulose synthase gene are responsible for cell aggregation in the cyanobacterium Thermosynechococcus vulcanus RKN. Plant Cell Physiol. 52, 957-966 (2011).
- Angermayr, S. A., Gorchs Rovira, A., Hellingwerf, K. J. Metabolic engineering of cyanobacteria for the synthesis of commodity products. Trends Biotechnol. 33, 352-361 (2015).
- Zhang, B., Dhital, S., Gidley, M. J. Synergistic and antagonistic effects of α-amylase and amyloglucosidase on starch digestion. Biomacromolecules. 14, 1945-1954 (2013).
- Harholt, J., et al. ARABINAN DEFICIENT 1 is a putative arabinosyltransferase involved in biosynthesis of pectic arabinan in Arabidopsis. Plant Physiol. 140, 49-58 (2006).
- Fernando, C. D., Soysa, P. Optimized enzymatic colorimetric assay for determination of hydrogen peroxide (H2O2) scavenging activity of plant extracts. MethodsX. 2, 283-291 (2015).
- Jacobsen, J. H., Rosgaard, L., Sakuragi, Y., Frigaard, N. U. One-step plasmid construction for generation of knock-out mutants in cyanobacteria: studies of glycogen metabolism in Synechococcus sp PCC 7002. Photosynth Res. 107 (2), 215-221 (2011).
- Lichtenthaler, H. K. Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes. Methods Enzymol. 148, 350-382 (1987).
- López, C. V. G., del Carmen Cerón García, M., Fernández, F. G. A., Bustos, C. S., Chisti, Y., Sevilla, J. M. F. Protein measurements of microalgal and cyanobacterial biomass. Bioresource Technol. 101, 7587-7591 (2010).
- Hasunuma, T., et al. Dynamic metabolic profiling of cyanobacterial glycogen biosynthesis under conditions of nitrate depletion. J Exp Bot. 64, 2943-2954 (2013).
- Díaz-Troya, S., López-Maury, L., Sánchez-Riego, A. M., Roldán, M., Florencio, F. J. Redox regulation of glycogen biosynthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803: Analysis of the AGP and glycogen synthases. Molecular Plant. 7, 87-100 (2014).
- Parrott, L. M., Slater, J. H. The DNA, RNA and protein composition of the cyanobacterium Anacystis nidulans grown in light- and carbon dioxide-limited chemostats. Arch Microbiol. 127, 53-58 (1980).
- Hihara, Y., Kamei, A., Kanehisa, M., Kaplan, A., Ikeuchi, M. DNA microarray analysis of cyanobacterial gene expression during acclimation to high light. Plant Cell. 13, 793-806 (2001).
