Summary
여기, 시아 노 박테리아 세포에서 글리코겐 함량을 측정하기위한 신뢰할 수 있고 쉬운 분석법을 제시합니다. 이 과정은 침전, 선택 가능한 해중합 및 포도당 잔류 물의 검출을 수반한다. 이 방법은 야생형 및 유 전적으로 변형 된 균주 모두에 적합하며 시아 노 박테리아의 대사 공학을 촉진 할 수 있습니다.
Abstract
시아 노 박테리아는 글리코겐을 광합성 과정에서 주요 세포 내 탄소와 에너지 저장 물질로 축적합니다. 최근의 연구 결과는 생합성 및 이화 과정의 산화 환원 조절, 산화 환원 조절 및 비 암호화 RNA의 관련을 포함한 글리코겐 대사의 복잡한 기전을 강조했다. 동시에, 생산량을 향상시키기 위해 글리코겐의 탄소를 유 전적으로 생산 된 시아 노 박테리아의 바람직한 제품으로 방향을 바꾸려는 노력이 이루어지고 있습니다. 여러 방법이 다양한 정확도와 기술적 복잡성을 지닌 시아 노 박테리아의 글리코겐 함량을 결정하는 데 사용됩니다. 여기, 표준 생명 과학 실험실에서 수행 할 수있는 시아 노 박테리아의 글리코겐 함량을 신뢰할 수있게 결정하기위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 프로토콜은 세포 lysate에서 글리코겐의 선택적 석출과 글루코스 단량체를 생성하는 글리코겐의 효소 해중합을 포함하며, 이는 글루코스 옥시idase-peroxidase (GOD-POD) 효소 커플 링 분석. 이 방법은 Synechocystis sp. PCC 6803 및 Synechococcus sp. PCC 7002, 신진 대사 공학에서 널리 사용되는 두 개의 모델 시아 노 박테리아 종. 또한,이 방법은 조절 요소 또는 글리코겐 생합성 유전자가 결핍 된 야생형과 돌연변이 체 사이에서 글리코겐 함량의 차이를 성공적으로 나타냈다.
Introduction
남조류는 광합성 광 고정 CO 2에서 탄소의 주요 탄수화물 저장소로서 글리코겐을 축적. 글리코겐은 α-1,6- 연결 글루코 실 결합에 의해 생성 된 가지를 갖는 선형 α-1,4- 결합 글루칸으로 구성된 글리 칸이다. 시아 노 박테리아에서의 글리코겐 생합성은 포스 포 글루코 튜 타제와 ADP- 글루코스 피로 인산화 효소의 순차적 작용을 통해 글루코오스 -6- 인산을 ADP- 글루코스로 전환시키는 것으로 시작한다. ADP- 포도당의 글루코오스 잔기는 하나 이상의 글리코겐 합성 효소 (GlgA)에 의해 글리코겐의 α-1,4- 글루칸 백본의 비 환원 말단으로 전달된다. 이어서, 분지 효소가 α-1,6- 결합 된 글루코 실 결합을 도입하고, 글리코겐 입자를 생성하도록 추가 확장시킨다. 어둠 속에서 글리코겐은 글리코겐 포스 포 릴라 제, 글리코겐 탈 분기 효소, α- 글루 카노 트랜스퍼 라제 및 말토 덱스트린 포스 포 릴라 제에 의해 인산화 된 글루코오스와 유리 글루코스로 분해됩니다. 이러한 피드 int산화성 오탄당 인산 경로, Embden-Meyerhof-Parnas 경로 (glycolysis), Entner-Doudoroff 경로 1 , 2 , 3 , 4를 포함한 이화 경로.
시아 노 박테리아의 글리코겐 대사는 시아 노 박테리아가 햇빛에 의해 화학 물질과 연료를 생산하는 미생물 세포 공장으로 발전 할 가능성이 있기 때문에 최근 몇 년 동안 관심이 증가하고 있습니다. 글리코겐은이 박테리아에서 가장 큰 유연한 탄소 저장고이기 때문에 글리코겐 대사가 생성물의 수율을 높이기 위해 변형 될 수 있습니다. 예는 cyanobacterium Synechococcus sp. 만니톨을 생산하기 위해 유 전적으로 조작 된 PCC 7002; 글리코겐 합성의 유전 파괴는 만니톨 수율 3 ~ 5 배 증가한다. 또 다른 예는 글리코겐이 함유 된 야생에서 바이오 에탄올을 생산하는 것입니다ype Synechococcus sp. PCC 7002 6 . 야생형 세포 글리코겐 함량은 질소 기아 동안 세포의 건조 중량의 60 %까지 될 수 있습니다 6 .
최근 글리코겐 대사와 조절에 대한 우리의 이해 또한 넓어졌습니다. 글리코겐은 빛에 축적되어 어둠 속에서 대사되는 것으로 알려져 있지만, 딜주기 동안의 글리코겐 대사의 상세한 동역학은 최근 Synechocystis sp.에서 드러났다. PCC 6803 7 . 또한, 글리코겐의 축적에 영향을 미치는 몇 가지 유전자가 확인되었습니다. 주목할만한 예는 추정 히스티딘 키나아제 PmgA와 비 암호화 RNA PmgR1이 조절 캐스케이드를 형성하고 글리코겐의 축적을 제어한다는 발견이다. 흥미롭게도, pmgA 및 pmgR1 결실 돌연변이 체는 Synechocystis sp.의 야생형 균주의 2 배의 글리코겐을 축적한다. PCC 68038 , 9 . 기타 규제 요소는 대체 시그마 인자 E와 전사 인자 CyAbrB2 (10), (11)을 포함하여 글리코겐의 축적에 영향을 미치는 것으로 알려져있다.
글리코겐 조절 및 신진 대사에 대한 관심이 증가함에 따라 글리코겐 함량의 결정을 설명하는 상세한 프로토콜이 보증됩니다. 여러 가지 방법이 문헌에서 사용된다. 산에 의한 가수 분해와 펄스에 의한 암페어 검출기 또는 산과 페놀로 처리 한 분광 측정으로 결합 된 고압 음이온 교환 액체 크로마토 그래피를 통한 모노 사카 라이드 함량 측정은 글리코겐 함량 9 , 10 , 12 , 13 을 근사하는 데 널리 사용되는 방법입니다. 그러나, 고압 음이온 교환 액체 크로마토 그래프c기구는 매우 고가이며 일부 시아 노 박테리아 종에 축적되는 것으로 알려진 수크로오스 14 , 글루코 실 글리세롤 15 및 셀룰로오스 16 , 17 , 18 과 같은 다른 글루코오스 - 함유 글리코 콘쥬 게이트로부터 유도 된 것에서 글리코겐 유래의 글루코 구별하지 않는다. 산 - 페놀 방법은 표준 실험실 장비를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 그러나, 그것은 매우 독성 시약을 사용하고 다른 glycoconjugates에서 파생 된 포도당을 구별하지 않으며, 당분자, lipopolysaccharides 및 세포 외 매트릭스 12 같은 세포 물질을 구성하는 다른 monosaccharides에서 포도당을 구분하지 않습니다. 특히, 고온 산 - 페놀 분석은 포도당 함량의 특정 측정보다는 총 탄수화물 함량의 측정에 종종 사용됩니다 12 . 효소 적알파 - 아밀로 글루코시다 아제에 의한 글리코겐의 글루코오스로의 효소 - 결합 분석을 통한 글루코스 검출은 글리코겐으로부터 유도 된 글루코스에 매우 민감하고 특이적인 비색계 판독 값을 생성한다. 에탄올 5 , 8 , 19에 의한 세포 용 해물로부터의 글리코겐의 특이 적 침전으로 특이성을 더욱 향상시킬 수있다.
여기에서 가장 널리 연구 된 시아 노 박테리아 종인 Synechocystis sp.에서 글리코겐 함량의 효소 기반 분석을위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. PCC 6803 및 Synechococcus sp. PCC 7002, 야생형 및 돌연변이 균주에서. 효율적인 가수 분해를 보장하기 위해 α- 아밀라아제와 α- 아밀로 글루코시다 아제의 칵테일을 사용합니다 8 . Endo-acting α- 아밀라아제는 다양한 글루칸의 α-1,4- 결합을 덱스트린으로 가수 분해하여 더 가수 분해됩니다엑소 아밀 글루코시다 제 20 을 엑소 - 작용하여 포도당을 생성한다. 이러한 효소의 상승 효과는 잘 알려져 있으며 식물 바이오 매스 21 의 셀룰로오스와 같은 다른 당 결합제에 영향을 미치지 않으면 서 글리코겐과 같은 α 결합 글루칸 인 전분의 선택적 가수 분해에 일상적으로 사용됩니다. 방출 된 포도당은 과산화수소에서 산소의 환원과 포도당의 락톤으로의 산화를 촉진하는 포도당 산화 효소와 과산화수소로부터 핑크색 퀴 노니 민 염료를 생성하는 과산화 효소로 구성된 효소 결합 분석법에 따라 정량적으로 검출됩니다. 페놀 화합물, 4- 아미노 안티피린 22 .
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Protocol
1. 준비
- 시아 노 박테리아 배양
- 성장 Synechocystis sp. 1 % (v / v) CO 2가 보충 된 일정한 공기 공급으로 30 ℃에서 액체 BG11 배지 8 에서 PCC 6803. 50 μmol photon / m 2 / s의 광합성 광자 자속 밀도에서 빛으로 문화를 지속적으로 조명하십시오.
- 성장하는 Synechococcus sp. PCA 7002는 1 % (v / v) CO 2가 보충 된 일정량의 공기가 공급되는 액체 A + 배지 23 (BG11 배지도 사용 가능). 온도는 37 ° C이어야합니다. 150 μmol photon / m 2 / s의 광합성 광자 자속 밀도에서 빛으로 문화를 지속적으로 조명하십시오.
- 1cm의 빛 경로와 함께 큐벳을 사용하여 730 nm에서 문화의 광학 밀도 (OD)를 측정합니다. OD 값이 0.8 이상이면 적절한 희석을하여 th에 비례하는 OD 측정 값을 얻으십시오e 세포 농도.
참고 : 아래 제시된 프로토콜은 액체 배양에 적합하며 OD 730nm 값이 2 이상인 세포 밀도가 있습니다. 전형적으로 1보다 작은 OD 730nm 값을 갖는 지수 성장 단계의 배양 물을 원심 분리 및 완충액 또는 배지에서 재현 탁하여 OD 730nm 값이 2 이상이 되도록 세포 밀도를 농축시킨다.
- 완충액 및 시약
- pH 8에서 50 mM Tris-HCl 완충액을 만든다.
- pH 5에서 50 mM 나트륨 아세테이트 완충액을 만든다.
- 50 MM 나트륨 아세테이트 완충액 (pH 5)에 8 U / mL amyloglucosidase의 저장 용액을 만든다.
- 50 MM 나트륨 아세테이트 완충액 (pH 5)에 2 U / mL의 α- 아밀라아제의 저장 용액을 만든다.
- 증류수를 사용하여 0 ~ 100 μg / mL 농도의 메이크 루카스 표준 용액을 만듭니다.
- D- 포도당 분석 키트 (GODPOD 형식)에서 GOD-POD 시약 준비, f제조업체의 지시를 따르십시오.
2. 세포 건조 중량의 결정 (선택 사항)
- 배양액 또는 세포 재 현탁액 2 mL (1.1 단계 참조)를 2.0 mL 튜브에 옮기고 6,000 xg 및 4 ° C에서 5 분간 원심 분리한다. 뜨는 물을 버린다.
- 물 1 ML에 펠렛을 Resuspend 및 5 분 6,000 XG 및 4 ° C에서 원심 분리기. 뜨는을 버리고 물 0.5 ML에 세포 펠렛을 resuspend.
- 현가 장치를 미리 무게를 측정 한 알루미늄 트레이에 옮깁니다. 하룻밤 건조 (약 18 시간)하기 위해 트레이를 105 ℃의 건조 오븐으로 옮긴다.
중요 : 손가락에서 재료가 전달되지 않도록 트레이를 집게로 다루는 것이 중요합니다. 동일한 조건에서 비어있는 사전 무게가있는 알루미늄 트레이를 건조시켜 건조 중에 용지함의 중량 손실을 확인합니다. - 건조 후 오븐에서 트레이를 꺼내어 주변 온도에서 평형을 유지하게하십시오5 분간 정치 한 후 0.0001 g의 정확도로 계량하십시오.
참고 :이 값은 셀 건조 중량 기준으로 글리코겐 함량을 표준화하는 데 사용할 수 있습니다.
3. 시아 노 박테리아 세포의 용해
- 배양 물 또는 세포 재 현탁액 (1 단계 참조) 1 mL를 1.5 mL 튜브에 옮기고 6,000 xg 및 4 ° C에서 10 분간 원심 분리한다. 뜨는 물을 버린다.
- 50mM Tris-HCl, pH 8 1 ML에 펠렛을 Resuspend하고 10 분 동안 6,000 XG와 4 ° C에서 원심 분리기. 상층 액을 버리고 Tris-HCl 완충액 1 mL에 세포 펠렛을 재현 탁한다. 과정을 반복하십시오.
- 철저히 50 MM 트리스 - HCl 버퍼, 산도 8 500 μL에 펠렛을 resuspend.
중요 : 효율적인 세포 용해를 위해 펠렛을 잘 부유시킵니다. 얼음에 resuspension을 보관하십시오. - 4에서 resuspended 세포를 lyse ° C ultrasonication의 30주기를 수행하여, 각주기는 최대 진폭과 20 kHz의 주파수에서 30 초 구성된,없이 90 초.
참고 :이 방법은 Synechococcus sp.를 효율적으로 용해 할 수 있습니다. PCC 7002.- 또는 세포 resuspension을 나사 캡 튜브로 옮기고 제조업체의 지침에 따라 튜브에 지르코늄 산화물 비즈를 추가하십시오. 조직 homogenizer에 튜브를 설정하고 4에서 세포를 해동 ° C의 두주기를 실행하여 각주기는 5의 주파수 설정에서 5 분으로 구성된 각주기.
참고 :이 방법은 효율적으로 Synechocystis sp. PCC 6803 및 Synechococcus sp. PCC 7002.
- 또는 세포 resuspension을 나사 캡 튜브로 옮기고 제조업체의 지침에 따라 튜브에 지르코늄 산화물 비즈를 추가하십시오. 조직 homogenizer에 튜브를 설정하고 4에서 세포를 해동 ° C의 두주기를 실행하여 각주기는 5의 주파수 설정에서 5 분으로 구성된 각주기.
- 6,000 xg 및 4 ° C에서 10 분 동안 용 해물이 담긴 튜브를 원심 분리하십시오.
참고 : 펠렛은 주로 큰 세포 파편으로 구성되어야합니다. 상당한 수의 끊어지지 않은 셀이 있으면 3.4 단계를 반복하십시오. 얼음에 뜨는 것을 유지하십시오. - 상용 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질 농도를 결정하십시오.
참고 :이 값은 글리코겐 함량을 표준화하는 데 사용할 수 있습니다단백질 함량 기준.
4. 글리코겐 침강
- 96 % (V / V) 에탄올과 1.5 ML 스크류 캡 튜브에서 단계 3.5에서 뜨는의 100 μL의 900 μL를 혼합하여 세포 lysate에서 엽록소 a 를 제거합니다. 뚜껑을 닫은 후 표준 실험실 가열 블록을 사용하여 90 ° C에서 10 분간 가열합니다.
- 30 분 동안 얼음에 튜브를 품어.
- 튜브를 20,000 xg 및 4 ° C에서 30 분간 원심 분리하고 조심스럽게 상등액을 제거합니다. 펠렛은 글리코겐을 함유하고있다. 과량의 에탄올을 제거하기 위해 펠렛을 가볍게 건조시킵니다.
중요 : 펠릿의 과도한 건조는 피해야하며, 그렇지 않으면 단계 5.1에서 용해시키기가 어려워진다. - 선택적 : 엽록소에게 콘텐츠를 결정하기 위해 664 nm에서의 단계 4.3에서 얻어진 상청액의 흡광도를 측정한다. 84.6 L / g / cm 24 의 흡수 계수를 사용하십시오.
참고 :이 값은 normalize에 사용될 수 있습니다.e 글리코겐 함량.
5. 효소 가수 분해 및 글리코겐 결정
- 단계 4.3에서 얻은 펠렛을 50 MM 나트륨 아세테이트 (pH 5) 100 μL에서 용해시키고 8 U / mL 아밀로 글루코시다 아제 50 μL와 2 U / mL α- 아밀라아제 50 μL를 첨가한다. 소용돌이를 사용하여 이러한 물질을 잘 혼합하십시오.
참고 : 글리코겐 펠렛이 점성을 띄기 때문에 피펫 팅을 통한 혼합은 권장하지 않습니다. - 글루코오스 분자로 glycogen의 소화를 가능하게하기 위해 2 시간 가열 블록에 60 ° C에서 혼합물을 품어.
- 샘플을 10,000 xg에서 5 분간 원심 분리하고 상층 액을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮긴다.
6. GOD-POD 시약을 사용하여 총 포도당 함량 측정
- GOD-POD 시약을 사용하여 단계 5.3에서 얻은 상청액의 포도당 농도를 측정합니다. 단계 5.3의 상층 액 100 μL를 96- 웰 플레이트의 웰에 옮긴다. 부정적인 통제로서,50 mM sodium acetate (pH 5) 100 μL를 사용하십시오. 검량선을 생성하려면 혈당 표준 용액도 측정하십시오.
- 각 샘플에 GOD-POD 시약 150 μL를 넣고 pipetting으로 신속하게 혼합하십시오.
- 플레이트를 25 ° C에서 30 분 동안 정치한다. 플레이트 판독기를 사용하여 510 nm에서 흡광도 값을 기록하십시오.
- 포도당 표준에서 얻은 검량선을 사용하여 포도당의 농도를 계산하십시오.
참고 : 세포 용 해물의 글리코겐 농도는 글루코스 농도 (μg / mL)로 표시됩니다.
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Representative Results
10 mL의 야생형 Synechocystis sp. PCC 6803은 OD 730nm 값이 약 0.8에 도달 할 때까지 광 자기 영양 조건 하에서 성장시켰다. 세포를 수확하고 50 mM Tris-HCl, pH 8에 재현 탁시켰다. OD 730 nm 값을 2-3으로 조정 하였다. 상기 한 프로토콜에 따라 글리코겐 함량을 분석 하였다. OD 730nm 당 글리코겐 함량은 13 ± 1.8 μg / mL / OD 730 nm ( N = 12)이었다. 글리코겐 함량은 단백질 함량에 비례하여 0.24 ± 0.03 μg / μg ( N = 12)이었고 엽록소 a 함량에 대한 글리코겐 함량은 5.7 ± 0.6 μg / μg ( N = 12)이었다. 사용 가능한 물질의 양이 적기 때문에 셀 건조 중량의 측정이 생략되었습니다. 유사한 조건 하에서 배양 박테리아의 단백질 함량은 건조 세포 중량 25 <약 50 % 인 것을 감안할 때/ SUP>, 글리코겐 함유량은 26 이전의 연구와 일치 세포 건조 중량의 12 %로 추정된다.
GOD-POD 분석의 검출 한계는 10에서 100 μg / mL 사이의 포도당 농도 범위에서 510 nm에서 포도당 농도와 흡광도 사이의 선형 상관 관계를 나타내며 510 nm에서 0.08과 0.7의 흡광도 값에 해당합니다. 최소 한계는 도구 적 탐지 한계로 인한 것 같습니다. 150 μg / mL보다 높은 포도당 농도가 사용되면 짙은 녹색 침전물이 형성되어 흡광도 판독 값에 큰 변화를 일으 킵니다. 사용 된 세포 물질의 양에 관해서, 우리는 세포 용해 전에 세포 재 현탁의 OD 730nm 값이 2와 10 사이 일 때 재현 가능한 글리코겐 함량을 일상적으로 얻었다. OD 730nm 값이 1 이하인 세포 재 팽창 은 최소 검출 한계높은 변하기 쉬운 결과로 이끌어내는 t. OD 730nm 값이 20보다 높은 세포 재 현탁은 세포 용해가 불완전하고, 용해 또는 희석이 필요했기 때문에 적합하지 않았다.
그림 1 은 Synechocystis sp.에서 글리코겐 함량의 대표적인 결과를 보여줍니다. PCC 6803 야생형 및 2 개의 돌연변이 균주 ( ΔpmgA 및 ΔpmgR1 ). 지수 성장 단계에서 성장한 세포를 사용 하였다. 글리코겐 함량은 총 단백질 함량에 의해 먼저 정상화되었고이어서 야생형에 대한 값에 비례하여 표현되었다. 결과는 돌연변이 균주가 야생형 균주보다 적어도 2 배 높은 글리코겐 함량을 갖는다는 것을 보여준다.
다음으로, 글리코겐 함량을 Synechococcus sp. 만니톨 5 를 생산하도록 설계된 PCC 7002 . 첫번째 변형 (GLG +)는 두 기능 글리코겐 합성 효소를 코딩하는 야생형과 glgA1 glgA2 유전자를 포함하는 변형 제 (GLG -) 반면 5 유전자의 기능적 카피 없다. 글리코겐과 만니톨 함량은 두 균주 모두에서 측정되었다 ( 그림 2 ). 는 GLG + 균주보다 더 만니톨을 생산하면서, 글리코겐의 검출 수준이 부족 - 결과는 GLG는 것을 보여준다. 이것은 광합성에 의해 합성 된 탄수화물이 글리코겐 합성 능력이없는 돌연변이 주에서 만니톨로 방향이 바뀐다는 것을 시사합니다. 배양 물의 OD 730nm 값은 세포 건조 중량 분석을위한 충분한 세포 물질을 제공하면서 약 10이었다. 글리코겐 함량은 세포 건조 중량을 사용하여 표준화 하였다.
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그림 1 : Synechocystis sp . 의 다른 라인에서 측정 된 글리코겐 함량 PCC 6803. WT와 두 개의 돌연변이 체 ( ΔpmgA 9 와 ΔpmgR1 8 )의 상대적인 글리코겐 함량이 표시되어있다. 글리코겐 수준은 총 단백질 함량에 의해 표준화되었다. 3 개의 생물학적 복제물의 수단이 표시되며, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 유 전적으로 조작 된 Synechococcus sp.의 글리코겐 및 만니톨 생산 PCC 7002 5 . Glg <만니톨과 글리코겐을 합성하는 균주. Glg - 는 글리코겐이없고 만니톨을 합성하는 균주입니다. 표시된 값은 표준 편차를 나타내는 오차 막대와 함께 세 번의 생물학적 복제의 평균값입니다. CDW : 세포 건조 중량, ND : 검출되지 않음. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
프로토콜 내에서 중요한 단계는 글리코겐 침전 및 재 부유입니다. 에탄올 침전 후 원심 분리 후, 글리코겐은 미세 원심 분리 튜브의 벽에 느슨하게 부착되는 반투명 펠렛을 형성한다. 따라서 상등액을 제거 할 때 pellet을 제거하지 않도록 특별한주의가 필요합니다. 글리코겐 펠렛은 끈적 거리며, 건조되면 가용화가 어려울 수 있습니다. 글리코겐 펠렛의 완전한 가용화는 중요하지 않은데, 이는 불완전한 가용화로 인해 비효율적 인 효소 분해가 유발 될 것이고, 따라서 기술 복제간에 큰 차이가 발생할 수 있기 때문이다. 볼 텍싱에 의한 가용화 전에 초음파 처리를 적용하면 공정을 촉진시킬 수있다.
표준화 방법의 선택과 관련하여 셀 건조 중량은 널리 사용되는 참고 자료입니다. 단백질과 엽록소의 측정보다 더 힘들고 더 많은 세포 바이오 매스가 필요하다.a . 전체 단백질 함량은 세포 바이오 매스에 대한 대안적인 참조를 제공하며, 본 프로토콜에 기술 된 바와 같이 소규모로 결정될 수있다. 건조 셀 바이오 매스 당 총 단백질 함량은 일반적으로 40 % ~ 50 % 범위이지만 정확한 값은 성장 조건에 따라 다릅니다 25 , 28 . 엽록소 의 함량은 쉽게 측정 할 수 있으며 시료에 존재하는 세포 양에 대한 대용 암호로 사용할 수 있습니다. 그러나, 웰 당 세포 엽록소 a의 양이 매우 특히 영양소 농도 및 광 강도 (29)의 변화에 따라, 성장 조건에 따라 변화하는 것이 알려져있다.
다른 방법과 관련하여 제시된 기술의 중요한 장점 중 하나는 매우 선택적이라는 것입니다. 고온 산 및 페놀 프로토콜 및 단당류 조성 분석산 가수 분해는 비교적 간단한 방법이며 이전의 연구 9 , 10 , 12 , 13 에서 사용되어왔다. 그러나 이러한 방법은 비 글리코겐 포도당과 추가 당분이 탄수화물 검출 기술에 따라 측정에 기여할 수 있기 때문에 글리코겐 함량을 과대 평가할 수 있습니다 12 . 설명 된 기술은 글리코겐의 포도당을 선택적으로 검출합니다. 또한 α- 아밀라아제와 α- 아밀로 글루코시다 아제가 셀룰로오스에 존재하는 β 연결 글루코 실 결합을 가수 분해하지 않기 때문에 셀룰로오스와 포도당을 구별 할 수 있습니다. 이전 연구에서 글리코겐의 효소 가수 분해는 α-amyloglucosidase 7 , 27에 의해서만 수행되었다. 이 프로토콜에 제시된 바와 같이 exo-acting α-amyloglucosidase와 함께 endo-acting α-amylase를 포함하면 t글리코겐의 효율적인 가수 분해. 유사한 선택적 가수 분해가 식물 바이오 매스의 처리에 일상적으로 적용되며, α- 아밀라아제 α- 아밀로 글루코시다 제의 조합은 셀룰로오스 21 과 같은 다른 글루코오스 - 함유 다당류에 영향을 미치지 않고 전분을 가수 분해하는데 사용된다.
이 기술의 주된 한계는 개별 시료가 미세 원심 분리 튜브를 사용하여 개별적으로 처리되기 때문에 절차가 낮은 처리량이라는 것입니다. 글리코겐 침전 단계는 높은 처리량을 방해하는 주요 요인입니다. 처리량이 많은 절차로 구현하려면 deep-well 플레이트를 사용해야하며이를 고속 (20,000 x g )으로 원심 분리 할 수 있어야합니다. 필요한 속도로 96- 웰 플레이트를 원심 분리 할 수있는 원심 분리기를 사용할 수 있지만 대부분의 심층 플레이트는 6,000 x g 이상의 힘을 견딜 수 없습니다. 그러므로, 물질에 대한 신중한 선택은 프로토콜을 high- 처리량 분석.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 노르딕 에너지 리서치 (AquaFEED, 프로젝트 번호 24), 덴마크 Innovationfonden Denmark (프로젝트 번호 12-131844), Villum Fonden (프로젝트 번호 13363)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QSonica Sonicators Q700 | Qsonica, LLC | NA | QSonica |
| SpectraMax 190 Microplate Reader | Molecular Devices | NA | Eliza plate reader |
| Bullet Blender Storm | Next Advance | BBY24M-CE | Beads beater |
| Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spectrophotometer | Amersham Biosciences | NA | Spectrophotometer |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | Buffer |
| HCl | Merck | 1-00317 | pH adjutment |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | 32319 | Buffer |
| Amyloglycosidase (Rhizopus sp.) | Megazyme | E-AMGPU | Enzyme for glycogen depolymerization |
| α-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis) | Sigma-Aldrich | A3176 | Enzyme for glycogen depolymerization |
| D-Glucose | Merch | 8337 | Standard for the glucose assay |
| Pierce BCA Protein assay kit | Thermo Fisher scientific | 23225 | For determination of protein concentrations |
| Aluminum drying trays, disposable | VWR | 611-1362 | For determination of cell dry weights |
| D-Glucose assay kit (GODPOD format) | Megazyme | K-GLUC | For determination of glucose concentrations |
| Zirconium oxide breads, 0.15 mm | Next Advance | ZrOB015 | Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm |
| RINO tubes | Next Advance | NA | Tubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm |
References
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