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Biochemistry

Cyanobacteria में ग्लाइकोजन सामग्री का निर्धारण

Published: July 17, 2017 doi: 10.3791/56068
Automatic Translation
1, 2, 3
1Carlsberg Research Laboratory, 2Department of Biology, University of Copenhagen, 3Copenhagen Plant Science Center, Department of Plant and Environmental Sciences, University of Copenhagen

Summary

यहाँ, हम cyanobacterial कोशिकाओं में ग्लाइकोजन सामग्री को मापने के लिए एक विश्वसनीय और आसान परख प्रस्तुत करते हैं। प्रक्रिया में वर्षा होती है, चुनिंदा डिपोलीराइज़ेशन और ग्लूकोज अवशेषों का पता लगाना होता है। यह विधि, दोनों जंगली और आनुवंशिक रूप से इंजीनियर तनाव के लिए उपयुक्त है और साइनाबैक्टेरिया के चयापचय इंजीनियरिंग की सुविधा प्रदान कर सकती है।

Abstract

स्योनोबैक्टीरिया प्रकाश संश्लेषण के दौरान ग्लाइकोजन को एक प्रमुख इंट्रासेल्युलर कार्बन और ऊर्जा भंडार के रूप में जमा करता है। अनुसंधान में हाल के घटनाक्रमों में ग्लाइकोजन चयापचय के जटिल तंत्र पर प्रकाश डाला गया है, जिसमें बायोसिंथिथिस और अपचयता, रेडॉक्स विनियमन, और गैर-कोडिंग आरएनए की भागीदारी शामिल है। इसी समय, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर साइनोबैक्टेरिया में ग्लाइकोजन से वांछनीय उत्पादों से कार्बन को उत्पाद की पैदावार बढ़ाने के लिए पुनर्रचना करने के प्रयास किए जा रहे हैं। वैरिएबल एनालिसिस और तकनीकी जटिलताओं के साथ, साइनोबैक्टीरिया में ग्लाइकोजन सामग्री को निर्धारित करने के लिए कई विधियों का उपयोग किया जाता है। यहां, हम साइनोबैक्टेरिया में ग्लाइकोजन सामग्री के विश्वसनीय निर्धारण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जो एक मानक जीवन विज्ञान प्रयोगशाला में किया जा सकता है। प्रोटोकॉल में ग्लूकोज मोनोमर पैदा करने के लिए सेल लाइसैस से ग्लाइकोजन की चयनात्मक वर्षा होती है और ग्लाइकोजन के एंजाइमेटिक डेपोलिमराइजेशन को ग्लूकोज बैल से पता चलता है।इडेज़-पेरोक्सीडेज़ (ईद्भ-पीओडी) एंजाइम युग्मित परख। इस विधि को सिनेकोसिस्टिस एसपी पर लागू किया गया है पीसीसी 6803 और सिनेकोकोकस एसपी पीसीसी 7002, दो मॉडल साइनोबैक्टीरियल प्रजातियां जो चयापचय इंजीनियरिंग में व्यापक रूप से उपयोग की जाती हैं। इसके अलावा, विधि ने विनियमन तत्वों या ग्लाइकोजन बायोसिंथेटिकल जीन में जंगली प्रकार और म्यूटेंट दोषपूर्ण के बीच ग्लाइकोजन सामग्री में सफलतापूर्वक अंतर दिखाया।

Introduction

सियोनोबैक्टीरिया ग्लाइकोजन को कार्बन डाइऑक्साइड कार्बन डाइऑक्साइड के रूप में संचित करता है जिससे प्रकाश संश्लेषण के माध्यम से सीओ 2 से तय होता है। ग्लाइकोजन एक ग्लाइकिन है जिसमें रैखिक α-1,4 लिंक किए गए ग्लूकेन होते हैं, जिसमें α-1.6 लिंक किए गए ग्लूकोसिल लिंक द्वारा बनाई गई शाखाएं होती हैं। साइनोबैक्टीरिया में ग्लाइकोजन बायोसिंथेसिस ग्लूकोस -6-फॉस्फेट को एडीपी-ग्लूकोज में रूपांतरण के साथ शुरू होता है जिससे फॉस्फोलाल्मुटस और एडीपी-ग्लूकोस पाइरोफॉस्फोरोलेज़ की अनुक्रमिक क्रिया होती है। एडीपी-ग्लूकोस में ग्लूकोज मूव को एक या एक से अधिक ग्लाइकोजीन सिन्नेसेस (ग्लग्जे) द्वारा ग्लाइकोजन के α-1,4-ग्लूकेन रीढ़ की नॉन-कमी करने वाले अंत में स्थानांतरित किया जाता है। इसके बाद, एक शाखाएं एंजाइमों ने α-1.6 लिंक किए गए ग्लूकोसिल लिंकेज को पेश किया, जो कि ग्लाइकोजन कण उत्पन्न करने के लिए आगे बढ़ाया गया है। अंधेरे में, ग्लाइकोजन फॉस्फोरिलेटेड ग्लूकोस और फ्री ग्लूकोज में गिलीकोजेन फॉस्फोराइलेज़, ग्लाइकोजन डिब्रानिंग एंजाइम, α-ग्लुकानोट्रांसफेरेज और माल्टो-डेक्स्ट्रिन फोस्फोरायलेज़ द्वारा टूट जाता है। ये फ़ीड आईएनजीओ ऑक्सीडेटिव पेंटोस फॉस्फेट मार्ग सहित एम्बैडेन-मेयरहोफ-पर्नास मार्ग (ग्लाइकोलिसिस), और एंटर-डौदोरॉफ मार्ग 1 , 2 , 3 , 4 सहित अपाचे पथिक मार्ग।

साइनोबैक्टीरिया में ग्लाइकोजन चयापचय हाल के वर्षों में बढ़ती हुई दिलचस्पी है क्योंकि साइनोबैक्टीरिया के लिए रसायनों और ईंधन का उत्पादन करने के लिए सूर्य के प्रकाश द्वारा संचालित माइक्रोबियल सेल कारखानों में विकसित होने की संभावना है। गिलेकोजेन चयापचय को उत्पादों की उपज बढ़ाने के लिए संशोधित किया जा सकता है, क्योंकि ग्लाइकोजन इन बैक्टीरिया में सबसे बड़ा लचीला कार्बन पूल है। एक उदाहरण साइनोबैक्टीरियम सिनेकोकोकस एसपी है पीसीसी 7002, जो आनुवंशिक रूप से मनिइटोल का उत्पादन करने के लिए इंजीनियर किया गया है; ग्लाइकोजन संश्लेषण के आनुवंशिक विघटन से मनिइटल उपज 3 गुना 5 बढ़ जाता है। एक अन्य उदाहरण ग्लाइकोजन-लोडेड वाइल्ड से बायोएथेनॉल का उत्पादन होता हैयाप साइनेकोकोकस एसपी पीसीसी 7002 6 नाइट्रोजन भुखमरी 6 के दौरान सेलुलिक सेल ग्लिसोजेन सामग्री कोशिका का सूखा वजन का 60% तक हो सकता है।

हाल के वर्षों में ग्लाइकोजन चयापचय और विनियमन की हमारी समझ भी बढ़ी है। जबकि ग्लाइकोजन को प्रकाश में जमा करने के लिए जाना जाता है और डायल चक्र के दौरान ग्लाइकोजन चयापचय के अंधेरे, विस्तृत कैनेटीक्स में अपचय किया गया था, केवल हाल ही में साइनेकोसिस्टिस एसपी में पता चला था। पीसीसी 6803 7 इसके अलावा, ग्लाइकोजन के संचय को प्रभावित करने वाले कई जीन की पहचान की गई है। एक उल्लेखनीय उदाहरण यह है कि खोजपूर्ण हिस्टिडाइन किनेज पीएमजीए और गैर-कोडिंग आरएनए पीएमजीआर 1 एक विनियामक झरना बनाते हैं और ग्लाइकोजन के संचय को नियंत्रित करते हैं। दिलचस्प बात यह है pmgA और pmgR1 विलोपन उत्परिवर्ती Synechocystis एसपी की wildtype तनाव के रूप में ज्यादा ग्लाइकोजन के रूप में दो बार जमा। पीसीसी 68038 , 9 अन्य नियामक तत्व ग्लाइकोजन के संचय को प्रभावित करने के लिए भी जाना जाता है जिसमें वैकल्पिक सिग्मा फैक्टर ई और ट्रांस्क्रिप्शनल फैक्टर CyAbrB2 10 , 11 शामिल हैं ।

ग्लाइकोजन विनियमन और चयापचय में वृद्धि के रूप में, ग्लाइकोजन सामग्री के निर्धारण का वर्णन करने वाला एक विस्तृत प्रोटोकॉल निश्चिंत है। साहित्य में कई तरीकों का इस्तेमाल किया जाता है एसिड हाइड्रोलिसिस, एसिड और फ़िनॉल के उपचार के बाद स्पंदित एम्परोमेट्रिक डिटेक्टर या स्पेक्ट्रोमेट्रिक निर्धारण से मिलकर उच्च-दबाव वाले आयनों विनिमय तरल क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से मोनोसैकराइड सामग्री के निर्धारण के बाद 9 , 10 , 12 , 13 के ग्लाइकोण सामग्री का अनुमान लगाने के लिए व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाता है। हालांकि, एक उच्च दबाव वाले आयनों विनिमय तरल क्रोमैटोग्राफीसी उपकरण बहुत महंगा है और ग्लाइकोजन से प्राप्त ग्लूकोज को अन्य ग्लूकोज युक्त ग्लाइकोनज्यूगेट्स जैसे कि सूक्रोज 14 , ग्लूकोजिलजीलेसरॉल 15 और सेल्यूलोज 16 , 17 , 18 , से उत्पन्न नहीं किया जाता है, जो कि कुछ साइनोबैक्टीरियल प्रजातियों में जमा करने के लिए जाना जाता है। मानक प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग कर एसिड-फ़िनॉल विधि का प्रदर्शन किया जा सकता है। हालांकि, यह अत्यधिक विषैले अभिकर्मकों का उपयोग करता है और विभिन्न ग्लाइकोकनजुगेट्स से प्राप्त ग्लूकोज को अलग नहीं करता है, न ही ग्लूकोज़ अन्य मोनोसेकेराइड से अलग करता है जो सेल्युलर सामग्री, जैसे कि ग्लाइकोलिपिड्स, लिपोपॉलीसेकेराइड और बाह्य मैट्रिक्स 12 का प्रतिनिधित्व करता है। विशेष रूप से, गर्म एसिड-फिनोल परख अक्सर ग्लूकोज सामग्री 12 के विशिष्ट निर्धारण के लिए कुल कार्बोहाइड्रेट सामग्री के निर्धारण के लिए उपयोग किया जाता है। एंजाइमेटिक हाग्लोकोस के ग्लोकोस को α-amyloglucosidase द्वारा ड्रॉलिसेज, एक एंजाइम-युग्मित परख के माध्यम से ग्लूकोज का पता लगाने के बाद एक रंगमेट्रिक रीडआउट उत्पन्न होता है जो ग्लाइकोजन से प्राप्त ग्लूकोज के लिए अत्यधिक संवेदनशील और विशिष्ट होता है। विशिष्टता को एलेनॉल 5 , 8 , 1 9 द्वारा सेल lysates से ग्लाइकोजन की तरजीही वर्षा के साथ बढ़ाया जा सकता है।

यहां, हम सबसे अधिक व्यापक रूप से अध्ययन किए गए साइनोबैक्टीरियल प्रजातियों में दो ग्लाइकोजन सामग्री के एंजाइम-आधारित परख के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, सिनेकोसिस्टिस एसपी पीसीसी 6803 और सिनेकोकोकस एसपी पीसीसी 7002, जंगली और उत्परिवर्ती उपभेदों में। कुशल हाइड्रोलिसिस को सुनिश्चित करने के लिए, α-amylase और α-amyloglucosidase का एक कॉकटेल 8 प्रयोग किया जाता है। एंडो-अभिनय α-amylase dextrins में विभिन्न ग्लूकेन्स में α-1,4-संबंधों को हाइड्रोलाइज करता है, जो कि अधिक हाइड्रोलाइज्ड होते हैंओ एक्सी-अभिनय α-amyloglucosidase 20 द्वारा ग्लूकोज इन एंजाइमों के synergistic प्रभाव अच्छी तरह से जाना जाता है, और इन एंजाइमों को स्टार्च के चयनात्मक हाइड्रोलिसिस के लिए नियमित रूप से इस्तेमाल किया जाता है, जो ग्लाइकोजन की तरह एक α-जुड़े ग्लुकन है, जो कि प्लांट बायोमास 21 में सेलूलोज़ जैसे अन्य ग्लाइकोन्जुगेंट्स को प्रभावित किए बिना। ग्लूकोज ऑक्सीडेज से युक्त एक एंजाइम-युग्मित परख के बाद जारी ग्लूकोज को मात्रात्मक रूप से पता चला है- जो हाइड्रोजन पेरोक्साइड में ऑक्सीजन की कमी और लैक्टोन- और पेरॉक्सिडेस के ग्लूकोज के ऑक्सीकरण को उत्प्रेरित करता है- जो हाइड्रोजन पेरोक्साइड से गुलाबी रंग का क्विनोनिमिन डाई पैदा करता है, एक phenolic यौगिक, और 4-aminoantipyrine 22

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Protocol

1. तैयारी

  1. सायनोबैक्टीरियल संस्कृतियों
    1. साइनेकोसिस्टिस एसपी बढ़ाएं पीसीसी 6803 30 डिग्री सेल्सियस तरल बीजी 11 मध्यम 8 में , 1% (वी / वी) सीओ 2 के पूरक के साथ वायु की निरंतर आपूर्ति के साथ। 50 μmol photon / m 2 / एस के प्रकाश संश्लेषक फोटॉन फ्लक्स घनत्व पर लगातार प्रकाश के साथ संस्कृतियों को उजागर करें
    2. सिनेकोकोकस एसपी विकसित करें पीसीसी 7002 में तरल ए + मध्यम 23 (बीजी 11 माध्यम भी इस्तेमाल किया जा सकता है), 1% (वी / वी) सीओ 2 के साथ पूरक हवा में लगातार आपूर्ति के साथ तापमान 37 डिग्री सेल्सियस होना चाहिए 150 μmol फोटॉन / मी 2 / s की संश्लेषक फोटोन प्रवाह घनत्व में प्रकाश के साथ लगातार संस्कृतियों प्रकाशित करते हैं।
    3. संस्कृति का ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) 730 एनएम पर 1 सेमी के प्रकाश पथ के साथ क्युवेट का उपयोग करके उपाय करें। यदि ओडी वैल्यू 0.8 से ऊपर है, तो ओडी मापन प्राप्त करने के लिए उपयुक्त dilutions करें जो वें के आनुपातिक हैंई सेल एकाग्रता
      नोट: नीचे दी गई प्रोटोकॉल तरल संस्कृतियों के लिए उपयुक्त हैं, एक सेल घनत्व के साथ जो ओडी 730 एनएम मूल्य के 2 या उससे अधिक के बराबर है । जब घातीय वृद्धि चरण में संस्कृतियां वांछित होती हैं, जो आमतौर पर 1 से नीचे एक ओडी 730 एनएम वैल्यू होता है, तो बफर या मध्यम में सेंटीफ्यूजेशन और रिसास्प्शन द्वारा सेल घनत्व पर ध्यान केंद्रित किया जाता है जो कि ओडी 730 एनएम मूल्य 2 या अधिक प्राप्त करने के लिए होता है।
  2. बफर और अभिकर्मकों
    1. पीएच 8 में 50 एमएम ट्राइस-एचसीएल बफर बनाएं
    2. पीएच 5 में 50 एमएम सोडियम एसीटेट बफर बनाएं।
    3. 50 एमएम सोडियम एसीटेट बफर, पीएच 5 में 8 यू / एमएल एमीलोोग्लुकोसिडेस का स्टॉक समाधान करें।
    4. 50 एमएम सोडियम एसीटेट बफर, पीएच 5 में 2 यू / एमएल α-एमाइलेज का स्टॉक समाधान करें।
    5. 0 और 100 माइक्रोग्राम / एमएल के बीच आसुत जल, मेन्ग्लुकोस मानक समाधान का उपयोग सांद्रता पर।
    6. ई-पीओडी अभिकर्मक डी-ग्लूकोज परख किट (ईसाईओपीओडी प्रारूप) से तैयार करें, चनिर्माता की शिक्षा को देखते हुए

2. सेल सूखी वजन का निर्धारण (वैकल्पिक)

  1. एक संस्कृति के 2 एमएल या एक सेल रीसस्पेंशन (2.0 कदम देखें) को 2.0 एमएल ट्यूब और 6,000 xg पर 4 डिग्री सेल्सियस और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरण करें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें
  2. 1 एमएल पानी और अपकेंद्रित्र में गोली 6,000 xg पर और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रीससपेंड करें सतह पर तैरनेवाला त्याग दें और 0.5 मिलीलीटर पानी में सेल गोली resuspend।
  3. निलंबन को पूर्व-तौला एल्यूमीनियम ट्रे में स्थानांतरित करें रात भर सुखाने (लगभग 18 घंटे) के लिए 105 डिग्री सेल्सियस पर एक सुखाने ओवन में ट्रे स्थानांतरित करें।
    गंभीर: यह महत्वपूर्ण है कि उंगलियों से सामग्री के हस्तांतरण से बचने के लिए ट्रे को संदंश के साथ संभाला जाता है सुखाने के दौरान ट्रे से किसी भी वजन घटाने को निर्धारित करने के लिए, एक समान, पूर्व-तौला एल्यूमीनियम ट्रे को उसी परिस्थितियों में ड्राई करें।
  4. सुखाने के बाद, ट्रे को ओवन से हटा दें और इसे परिवेश में गले लगाने के लिए अनुमति दें5 मिनट के लिए औंस के साथ 0.0001 ग्राम की सटीकता के साथ वजन।
    नोट: मान का उपयोग सेल-सूखी-वजन आधार पर ग्लाइकोजन सामग्री को सामान्य करने के लिए किया जा सकता है।

3. सायनोबैक्टीरियल कोशिकाओं का लसीकरण

  1. एक संस्कृति के 1 एमएल या एक सेल रीसस्पेंशन (1.5 कदम देखें) को 1.5 एमएल ट्यूब और 6,000 xg पर 4 डिग्री सेल्सियस और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरण करें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें
  2. 50 एमएम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 8, और अपकेंद्रित्र में 6 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1 एमएल की गोली को फिर से खोलें। सतह पर तैरनेवाला को त्यागें और ट्रिस-एचसीएल बफर के 1 एमएल में सेल गोली resuspend। प्रक्रिया को दोहराएं।
  3. 500 एमएल ट्राइस-एचसीएल बफर, पीएच 8 में 500 μL में गोली को अच्छी तरह से रीसस्पेंड करें।
    गंभीर: एक कुशल सेल lysis के लिए अच्छी तरह से गोली resuspend। बर्फ में resuspension रखें
  4. Ultrasonication के 30 चक्र प्रदर्शन करके 4 डिग्री सेल्सियस पर पुन: पेश किए गए कोशिकाओं को लुसे, प्रत्येक चक्की में अधिकतम आयाम के साथ 20 किलोहर्ट्ज़ की आवृत्ति पर 30 एस होते हैं,इसके बाद 9 0 के बिना
    नोट: इस पद्धति से साइनेकोकोक्सास एसपी का कुशलतापूर्वक वर्णन किया जा सकता है पीसीसी 7002
    1. वैकल्पिक रूप से, सेल रीसस्पेंशन को एक स्क्रू-कैप ट्यूब में ट्रांसफर कर दें और निर्माता के निर्देशों के बाद, ट्यूब में जिरकोनीय ऑक्साइड मोती जोड़ें। एक ऊतक होमोजिनायझर में ट्यूब सेट करें और पिटाई के 2 चक्र प्रदर्शन करके 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को लाइसेज करें, प्रत्येक चक्र जिसमें 5 मिनट की आवृत्ति 5 की आवृत्ति होती है।
      नोट: इस पद्धति से साइनेकोसिस्टिस सपा को प्रभावी ढंग से व्याख्या कर सकते हैं। पीसीसी 6803 और सिनेकोकोकस एसपी पीसीसी 7002
  5. 10 मिनट के लिए 6000 xg और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए लिसेडेट युक्त ट्यूब को अपकेंद्रित करें
    नोट: गोली मुख्य रूप से बड़े सेल मलबे से मिलनी चाहिए। यदि अस्थिर कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण संख्या है, तो चरण 3.4 दोहराएं। सतह पर तैरनेवाला बर्फ पर रखें
  6. एक वाणिज्यिक बीसीए प्रोटीन परख किट का उपयोग कर प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें।
    नोट: मान का उपयोग ग्लाइकोजन सामग्री को सामान्य करने के लिए किया जा सकता हैप्रोटीन सामग्री के आधार पर

4. ग्लाइकोन वर्षा

  1. क्लोरोफिल ए को सेल लिसैट से 96 μL (v / v) इथेनॉल के 900 μL और 1.5 एमएल स्क्रू-कैप ट्यूब में 3.5 चरण से सतह पर तैरने वाले के 100 μL मिलाकर निकाल दें। टोपी को बंद करने के बाद, मानक प्रयोगशाला हीटिंग ब्लॉक का उपयोग करके 10 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब गर्मी।
  2. 30 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब सेते हैं
  3. ट्यूब 20,000 xg और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला को हटा दें; गोली में ग्लाइकोजन होता है हल्के से हवा में गोली को अधिक इथेनॉल हटाने के लिए सूखा।
    गंभीर: गोली के अत्यधिक सुखाने से बचा जाना चाहिए, अन्यथा यह कदम 5.1 में सुलझाना मुश्किल हो जाता है।
  4. वैकल्पिक: सतह पर तैरनेवाला 664 एनएम पर कदम 4.3 में प्राप्त की अवशोषण को मापने क्लोरोफिल एक सामग्री का निर्धारण करने के लिए। 84.6 एल / जी / सीसी 24 के एक अवशोषण गुणांक का उपयोग करें
    नोट: मान सामान्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैई ग्लाइकोजन सामग्री

5. एंजाइमेटिक हाइड्रोलिसिस और ग्लाइकोजन निर्धारण

  1. 50 एमएम सोडियम एसीटेट, पीएच 5 में 100 μL में चरण 4.3 में प्राप्त गोली को सुलझाना, और 50 μL का 8 यू / एमएल एमीलोोग्लुकोसैडस और 50 μL 2 यू / एमएल α-amylase जोड़ें। एक भंवर का उपयोग करके अच्छी तरह से इन सामग्रियों को मिलाएं
    नोट: pipetting द्वारा मिश्रण की सिफारिश नहीं है क्योंकि ग्लाइकोजन गोली चिपचिपा है।
  2. ग्लूकोज के अणुओं में ग्लाइकोजन के पाचन को सक्षम करने के लिए 2 घंटे के लिए हीटिंग ब्लॉक पर 60 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण को सेते।
  3. नमूना को 5 मिनट के लिए 10,000 xg में अपकेंद्रित्र करें और सतह पर तैरनेवाला को एक नया 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।

6. भगवान-पीओडी अभिकर्मक का उपयोग कुल ग्लूकोज सामग्री का निर्धारण

  1. भगवान-पीओडी अभिकर्मक का उपयोग करते हुए चरण 5.3 में प्राप्त सतह पर तैरने वाले में ग्लूकोज की एकाग्रता को मापें। सतह पर तैरने वाले की 100 μL चरण 5.3 से 96-अच्छी तरह से एक थाली में अच्छी तरह से स्थानांतरित करें। नकारात्मक नियंत्रण के रूप में,50 एमएम सोडियम एसीटेट के 100 μL का उपयोग करें, पीएच 5. एक अंशांकन वक्र पैदा करने के लिए, ग्लूकोज मानक समाधान भी मापें।
  2. प्रत्येक नमूने के लिए भगवान-पीओडी अभिकर्मक के 150 μL जोड़ें और जल्दी से pipetting द्वारा मिश्रण।
  3. 30 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर स्थैतिक प्लेट सेते एक प्लेट रीडर का उपयोग करते हुए 510 एनएम पर शोषक मूल्य को रिकॉर्ड करें।
  4. ग्लूकोज मानकों से प्राप्त अंशांकन वक्र का उपयोग करके ग्लूकोज की एकाग्रता की गणना करें।
    नोट: सेल lysate में ग्लाइकोजन एकाग्रता ग्लूकोज (μg / एमएल) की एकाग्रता के रूप में व्यक्त की है।

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Representative Results

10 एमएल ऑफ़ बेन्लीइप साइनेकोसिस्टिस एसपी ओसी 730 एनएम वैल्यू लगभग 0.8 तक पहुंचने तक पीसीओसी 6803 फोटोओोटोट्रोपिक स्थितियों के तहत उगाए गए थे। कोशिकाओं को 50 एमएम ट्राइस-एचसीएल, पीएच 8 में पकाया गया और पुन: पेश किया गया। ओडी 730 एनएम मूल्य 2-3 से समायोजित किया गया। ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के बाद ग्लाइकोजन सामग्री का विश्लेषण किया गया था। ओडी 730 एनएम प्रति ग्लाइकोजन सामग्री 13 ± 1.8 माइक्रोग्राम / एमएल / ओडी 730 एनएम ( एन = 12) थी। प्रोटीन सामग्री को ग्लाइकोजन सामग्री सापेक्ष 0.24 ± 0.03 माइक्रोग्राम / माइक्रोग्राम (N = 12), और क्लोरोफिल को ग्लाइकोजन सामग्री सापेक्ष एक सामग्री 5.7 ± 0.6 माइक्रोग्राम / माइक्रोग्राम (N = 12) था। उपलब्ध सामग्री की छोटी मात्रा के कारण, सेल सूखा वजन की माप को हटा दिया गया था। यह देखते हुए कि तुलनात्मक परिस्थितियों में सियानोबैक्टीरिया में प्रोटीन की मात्रा खेती की जाती है, सेल सूखा वजन 25 < लगभग 50% है/ Sup>, ग्लाइकोजन सामग्री सेल सूखी वजन का 12% होने का अनुमान है, जो पिछले अध्ययन 26 के अनुरूप है।

ईसा-पीओडी परख की पहचान सीमाएं ग्लूकोज की एकाग्रता और अवशोषण के बीच ग्लूकोज की एकाग्रता सीमा के बीच 10 और 100 माइक्रोग्राम / एमएल के बीच ग्लूकोज एकाग्रता और अवशोषण के बीच एक रैखिक सहसंबंध दिखाती है, जो कि 0.08 के अवशोषण मूल्यों और 5.7 एनएम पर 0.7 के अवशोषण मूल्य के बराबर होती है। वाद्य पहचान सीमा के कारण न्यूनतम सीमा होने की संभावना है। जब 150 माइक्रोग्राम / एमएल से अधिक ग्लूकोज सांद्रता का इस्तेमाल किया गया था, तो गहरे हरे रंग की गड़बड़ी का निर्माण हुआ, जिससे अवशोषण पढ़ना में एक बड़ा बदलाव आया। सेल सामग्री के उपयोग की मात्रा के संबंध में, हम नियमित रूप से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य ग्लाइक्जेन सामग्री प्राप्त करते हैं, जब कोशिका विश्लेषण से पहले सेल पुनर्सुशन के ओडी 730 एनएम मूल्य 2 और 10 के बीच था। 1 या नीचे के एक ओडी 730 एनएम मूल्य के साथ सेल पुन: न्यूनतम पता लगानाटी, उच्च चर परिणामों के लिए अग्रणी। एक ओडी 730 एनएम मूल्य 20 से अधिक के साथ सेल रिसासपेंशन उपयुक्त नहीं था क्योंकि सेल lysis अधूरा था, और विस्तारित lysis या dilutions की आवश्यकता थी।

चित्रा 1 चित्रा 1 साइनेकोसिस्टिस एसपी में ग्लाइकोजन सामग्री के प्रतिनिधि परिणामों को दर्शाता है पीसीसी 6803 प्रकार और दो उत्परिवर्ती उपभेद ( ΔpmgA और ΔpmgR1 )। घातीय वृद्धि चरण में विकसित कोशिकाओं का उपयोग किया गया था। ग्लाइकोजन सामग्री को कुल प्रोटीन सामग्री के द्वारा पहले सामान्यीकृत किया गया था और बाद में इसे wildtype के मूल्य के सापेक्ष व्यक्त किया गया था। परिणाम बताते हैं कि उत्परिवर्ती उपभेदों में ग्लाइकोजन सामग्री होती है जो कि जंगली तनाव से कम से कम दो गुना अधिक होती है।

इसके बाद, सिलेकोकोकास एसपी के तनाव में ग्लाइकोजन सामग्री का विश्लेषण किया गया पीसीसी 7002 ने मनितालोल 5 का उत्पादन किया । पहले तनाव (glg +), दो कार्यात्मक ग्लाइकोजन synthases एन्कोडिंग wildtype glgA1 और glgA2 जीन होते हैं जबकि दूसरे तनाव (glg -) इन जीनों 5 के कार्यात्मक प्रतियां का अभाव है। ग्लाइकोजन और मैनिटोल सामग्री को तब दोनों नस्लों ( चित्रा 2 ) में मापा गया। परिणाम बताते हैं कि ग्ल्ग - ग्लाइकोजन का एक पता लगाने योग्य स्तर की कमी है, जबकि यह ग्लैग + तनाव की तुलना में अधिक मनिइटोल का उत्पादन करता है। इससे पता चलता है कि प्रकाश संश्लेषण द्वारा संश्लेषित कार्बोहाइड्रेट को उत्परिवर्ती तनाव में मनिइटोल पर पुनर्निर्देशित किया गया है जो कि ग्लाइकोजन को संश्लेषित करने की क्षमता का अभाव है। संस्कृतियों के ओडी 730 एनएम मूल्य लगभग 10 थे, सेल सूखे वजन विश्लेषण के लिए पर्याप्त सेल सामग्री प्रदान करते थे। सेल सूखे वजन का उपयोग करके ग्लाइकोजन सामग्री को सामान्यीकृत किया गया था।

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चित्र 1: ग्लाइकोजन सामग्री Synechocystis एसपी के विभिन्न लाइनों में मापा जाता है। पीसीसी 6803. डब्ल्यूटी में रिलेटिव ग्लाइकोजन सामग्री और दो म्यूटेंट ( ΔpmgA 9 और ΔpmgR1 8 ) में दिखाया गया है। कुल प्रोटीन सामग्री द्वारा ग्लाइकोजन स्तर सामान्यीकृत थे तीन जैविक प्रतिकृतियों का मतलब दिखाया गया है, त्रुटि के साथ मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2 चित्रा 2: आनुवंशिक रूप से छेड़छाड़ Synechococcus एसपी में ग्लाइकोजन और mannitol उत्पादन। पीसीसी 7002 5 glg <Sup> +, मैनिनटोल और ग्लाइकोजन को संश्लेषण करने का तनाव। ग्लैग - , मर्निटॉल को संश्लेषण करने वाले तनाव लेकिन कोई ग्लाइकोजन नहीं। दर्शाए गए मान, तीन जैविक प्रतिकृतियों के औसत होते हैं, जो मानक विचलनों का प्रतिनिधित्व करने वाले त्रुटि सलाखों होते हैं। सीडीडब्ल्यू: सेल सूखी वजन, एनडी: पता नहीं चला। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम ग्लाइकोजन वर्षा और resuspension हैं। इथनॉल वर्षा के बाद सेंटीफ्यूगेशन के बाद, ग्लाइकोजन एक पारभासी गोली बनाती है जो कि सूक्ष्मदर्शी ट्यूबों की दीवारों का ढीला पालन करता है। इसलिए, जब सतह पर तैरने वाले को हटाते हैं, तो विशेष ध्यान देने की आवश्यकता होती है ताकि गोली निकाला न जाए। ग्लाइकोजन गोली चिपचिपा है, और solubilization मुश्किल हो सकता है अगर यह बाहर dries। ध्यान दें कि ग्लाइकोजन गोली का पूरा समाधान महत्वपूर्ण है क्योंकि अपूर्ण solubilization अक्षम एंजाइमेटिक पाचन का कारण होगा और इसलिए तकनीकी प्रतिकृतियों के बीच बड़े भिन्नता को जन्म देगा। Vortexing द्वारा solubilization से पहले sonication के आवेदन प्रक्रिया की सुविधा हो सकती है।

सामान्यीकरण विधि की पसंद के संबंध में, सेल सूखे वजन एक व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला संदर्भ है। यह अधिक श्रमसाध्य है और प्रोटीन और क्लोरोफिल के निर्धारण से अधिक सेल बायोमास की आवश्यकता होती हैए कुल प्रोटीन सामग्री सेल बायोमास के लिए एक वैकल्पिक संदर्भ प्रदान करता है और वर्तमान प्रोटोकॉल में वर्णित अनुसार, एक छोटे पैमाने पर निर्धारित किया जा सकता है। सूखी सेल बायोमास प्रति कुल प्रोटीन सामग्री आमतौर पर 40% और 50% के बीच की सीमा में है, हालांकि सटीक मूल्य वृद्धि की स्थिति 25 , 28 पर निर्भर करता है। क्लोरोफिल एक सामग्री आसानी से निर्धारित किया जा सकता है और नमूना में उपस्थित सेल राशि के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, यह अच्छी तरह से ज्ञात है कि सेल प्रति क्लोरोफिल एक की राशि काफी विकास की स्थिति पर निर्भर करता है विशेष रूप से पोषक तत्व सांद्रता और प्रकाश तीव्रता 29 बदलने के जवाब में, है।

अन्य विधियों के संबंध में प्रस्तुत तकनीक के महत्वपूर्ण लाभों में से एक यह है कि यह अत्यधिक चयनात्मक है। गर्म एसिड और फिनोल प्रोटोकॉल और मोनोसैक्राइड संरचना विश्लेषण निम्नलिखितएसिड हाइड्रोलिसिस अपेक्षाकृत सरल तरीके हैं और पिछला अध्ययन 9 , 10 , 12 , 13 में इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, इन तरीकों से ग्लाइकोजन सामग्री को अधिक अनुमान लगाया जा सकता है क्योंकि कार्बोहाइड्रेट का पता लगाने तकनीक 12 के आधार पर गैर-ग्लाइकोजीन ग्लूकोज और अतिरिक्त शक्कर माप में योगदान दे सकते हैं। वर्णित तकनीक चुनिंदा ग्लाइकोजन में ग्लूकोज का पता लगाता है। यह सेलूलोज़ से ग्लूकोज को भी भेद कर सकता है, क्योंकि सेलुलोज में मौजूद α-amylase और α-amyloglucosidase β- जुड़े ग्लुकोसिल संपर्कों को हाइड्रोलाइज नहीं करते। पिछले अध्ययनों में, ग्लाइकोजन का एंजाइमिक हाइड्रोलिसिस पूरी तरह से α-amyloglucosidase 7 , 27 द्वारा किया गया था। एक्सो-अभिनय α-amyloglucosidase के साथ मिलकर एंडो अभिनय α-amylase के शामिल, के रूप में इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत, यह सुनिश्चित कर सकते हैंवह ग्लाइकोजन के कुशल हाइड्रोलिसिस एक समान चयनात्मक हाइड्रोलिसिस नियमित रूप से संयंत्र बायोमास के उपचार के लिए लागू किया जाता है, जिसमें α-amylase α-amyloglucosidase का संयोजन अन्य ग्लूकोज युक्त polysaccharides, जैसे कि सेल्यूलोज 21 को प्रभावित किए बिना स्टार्च को हाइड्रोलाइज करता है।

तकनीक की मुख्य सीमा यह है कि प्रक्रिया कम-थ्रुपुट है क्योंकि व्यक्तिगत नमूनों को सूक्ष्मदर्शीय ट्यूबों का उपयोग करके अलग से संसाधित किया जाता है। ग्लाइकोन वर्षा चरण उच्च थ्रूपुट को रोकने के लिए प्राथमिक कारक है। उच्च-थ्रूपुट प्रक्रिया के रूप में कार्यान्वयन के लिए गहरे-अच्छी प्लेटों के उपयोग की आवश्यकता होती है और इन्हें उच्च गति (20,000 x g ) में अपकेंद्रित करने की क्षमता होती है। जबकि सेंट्रीफ्यूज जो आवश्यक गति से 96-अच्छी प्लेटें अपकेंद्रित कर सकते हैं, वहीं सबसे गहरे-अच्छी प्लेटें 6,000 x g से अधिक बल बर्दाश्त नहीं कर सकती हैं। इसलिए, सामग्री के सावधानीपूर्वक विकल्प को उच्चतम प्रोटोकॉल के लिए अनुकूल करने के लिए आवश्यक हैएच-थ्रूपुट विश्लेषण

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों ने नॉर्डिक एनर्जी रिसर्च (एक्वाफेड, प्रोजेक्ट नं। 24), इनोवेशनफोन्डेन डेनमार्क (पेंट पावर, प्रोजेक्ट नं। 12-131844), और विल्लुम फ़ॉंडेन (परियोजना संख्या 13363) को स्वीकार किया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QSonica Sonicators Q700 Qsonica, LLC NA QSonica
SpectraMax 190 Microplate Reader  Molecular Devices NA Eliza plate reader
Bullet Blender Storm Next Advance BBY24M-CE Beads beater
Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spectrophotometer Amersham Biosciences NA Spectrophotometer
Tris  Sigma-Aldrich T1503 Buffer
HCl Merck 1-00317 pH adjutment
Sodium acetate Sigma-Aldrich 32319 Buffer
Amyloglycosidase (Rhizopus sp.) Megazyme E-AMGPU Enzyme for glycogen depolymerization
α-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis) Sigma-Aldrich A3176 Enzyme for glycogen depolymerization
D-Glucose Merch 8337 Standard for the glucose assay
Pierce BCA Protein assay kit  Thermo Fisher scientific 23225 For determination of protein concentrations
Aluminum drying trays, disposable VWR 611-1362 For determination of cell dry weights
D-Glucose assay kit (GODPOD format) Megazyme K-GLUC For determination of glucose concentrations
Zirconium oxide breads, 0.15 mm Next Advance ZrOB015 Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm
RINO tubes Next Advance NA Tubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm

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References

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जैव रसायन अंक 125 साइनोबैक्टीरिया, ग्लाइकोजन ग्लूकोज ऑक्सीडेज पेरॉक्सिडेस एमाइलेज एमीलोोग्लुकोसिडेस
Cyanobacteria में ग्लाइकोजन सामग्री का निर्धारण
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De Porcellinis, A., Frigaard, N. U., … More

De Porcellinis, A., Frigaard, N. U., Sakuragi, Y. Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria. J. Vis. Exp. (125), e56068, doi:10.3791/56068 (2017).

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