Summary
Hier presenteren we een betrouwbare en gemakkelijke analyse om het glycogeengehalte in cyanobacteriële cellen te meten. De procedure omvat precipitatie, selecteerbare depolymerisatie en de detectie van glucose residuen. Deze methode is geschikt voor zowel wildtype als genetisch gemanipuleerde stammen en kan de metabolische techniek van cyanobacteriën vergemakkelijken.
Abstract
Cyanobacteriën accumuleren glycogeen als een belangrijke intracellulaire koolstof- en energieopslag tijdens fotosynthese. Recente ontwikkelingen in onderzoek hebben gemarkeerde complexe mechanismen van glycogeenmetabolisme, waaronder de dielcyclus van biosynthese en catabolisme, redoxregulatie en de betrokkenheid van niet-coderende RNA. Tegelijkertijd worden inspanningen gedaan om koolstof van glycogeen naar gewenste producten in genetisch gemanipuleerde cyanobacteriën door te geven om productopbrengsten te verbeteren. Verschillende methoden worden gebruikt om de glycogeeninhoud in cyanobacteriën te bepalen, met variabele nauwkeurigheden en technische complexiteiten. Hier geven we een gedetailleerd protocol voor de betrouwbare bepaling van het glycogeengehalte in cyanobacteriën die in een standaard life science laboratorium kunnen worden uitgevoerd. Het protocol omvat de selectieve precipitatie van glycogeen uit het cellysaat en de enzymatische depolymerisatie van glycogeen om glucosemonomeren te genereren, die worden gedetecteerd door een glucose-oxIdase-peroxidase (GOD-POD) enzym gekoppelde assay. De methode is toegepast op Synechocystis sp. PCC 6803 en Synechococcus sp. PCC 7002, twee soorten cyanobacteriën die veel gebruikt worden in de metabolische techniek. Bovendien vertoonde de werkwijze succesvol verschillen in de glycogeeninhoud tussen de wildtypen en mutanten die defect zijn in regulatorische elementen of glycogeenbiosynthetische genen.
Introduction
Cyanobacteriën accumuleren glycogeen aangezien de belangrijkste koolhydratenopslag van koolstof uit CO 2 in licht door fotosynthese wordt vastgesteld. Glycogeen is een glycan die bestaat uit lineair a-1,4-gebonden glucan met takken die zijn gecreëerd door a-1,6-gekoppelde glucosyl bindingen. Glycogene biosynthese bij cyanobacteriën begint bij de omzetting van glucose-6-fosfaat in ADP-glucose door de sequentiële werking van fosfoglucomutase en ADP-glucose pyrophosphorylase. De glucosegroep in ADP-glucose wordt overgebracht naar het niet-reducerende einde van het a-1,4-glucan ruggengraat van glycogeen door één of meer glycogensynthasen (GlgA). Vervolgens introduceren een vertakende enzymen de a-1,6-gekoppelde glucosylkoppeling, die verder wordt uitgebreid om het glycogeenpartikel te genereren. In het donker wordt glycogeen afgebroken door glycogeenfosforylase, glycogeenafbrekende enzymen, a-glucanotransferase en malto-dextrinefosforylase in gefosforyleerde glucose en vrije glucose. Deze feed intO catabolische wegen, inclusief de oxidatieve pentosefosfaatweg, de Embden-Meyerhof-Parnas-route (glycolyse) en de Entner-Doudoroff-weg 1 , 2 , 3 , 4 .
Glycogeen metabolisme in cyanobacteriën heeft de afgelopen jaren steeds meer belangstelling gekregen vanwege het potentieel dat cyanobacteriën zich ontwikkelen tot microbiële celfabrieken die door zonlicht worden aangedreven om chemicaliën en brandstoffen te produceren. Glycogeenmetabolisme kan worden aangepast om de opbrengst van de producten te verhogen, omdat glycogeen het grootste flexibele koolstofbad in deze bacteriën is. Een voorbeeld is de cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002, die genetisch gemanipuleerd is om mannitol te produceren; De genetische verstoring van glycogensynthese verhoogt de mannitolopbrengst 3 keer 5 . Een ander voorbeeld is de productie van bioethanol uit glycogeenbelaste wildtYpe Synechococcus sp. PCC 7002 6 . Het glycogeengehalte van het wildtype cel kan tot 60% van het droge gewicht van de cel zijn tijdens stikstofhongersnij 6 .
Ons begrip van glycogeen metabolisme en regulering is ook in de afgelopen jaren uitgebreid. Terwijl glycogeen bekend is om in het licht op te accumuleren en in het donker te worden gekatalyseerd, werd de gedetailleerde kinetiek van glycogeenmetabolisme gedurende de dielcyclus pas onlangs geopenbaard in Synechocystis sp. PCC 6803 7 . Bovendien zijn verschillende genen die de accumulatie van glycogeen beïnvloeden geïdentificeerd. Een opvallend voorbeeld is de ontdekking dat de vermeende histidinkinase PmgA en het niet-coderende RNA PmgR1 een regulerende cascade vormen en de accumulatie van glycogeen controleren. Interessant genoeg accumuleren de pmgA en pmgR1 deletiemutanten tweemaal zo veel glycogeen als de wildtypestam van Synechocystis sp. PCC 68038 , 9 . Andere regulerende elementen zijn ook bekend om de accumulatie van glycogeen te beïnvloeden, met inbegrip van de alternatieve sigma factor E en de transcriptieve factor CyAbrB2 10 , 11 .
Aangezien belangstelling voor glycogeenregulatie en metabolisme groeit, is een gedetailleerd protocol dat de bepaling van het glycogeengehalte omschrijft, gerechtvaardigd. In de literatuur worden verschillende methoden gebruikt. Zure hydrolyse, gevolgd door de bepaling van het monosaccharidegehalte door middel van hoge druk anionuitwisselingsvloeistofchromatografie gekoppeld met een gepulseerde amperometrische detector of spectrometrische bepaling na behandelingen met zuur en fenol, zijn veel gebruikte methoden om het glycogeengehalte 9 , 10 , 12 , 13 te benaderen. Echter, een hoge druk anionuitwisseling vloeistofchromatografieC-instrument is zeer duur en onderscheidt geen glucose afgeleid van glycogeen van die afgeleid van andere glucose-bevattende glycoconjugaten, zoals sucrose 14 , glucosylglycerol 15 en cellulose 16 , 17 , 18 , die bekend zijn om te accumuleren in sommige cyanobacteriële species. De methode van zuur-fenol kan worden uitgevoerd met behulp van standaard laboratoriumapparatuur. Het maakt echter gebruik van zeer giftige reagentia en onderscheidt geen glucose afgeleid van verschillende glycoconjugaten, noch onderscheidt het glucose uit andere monosacchariden die cellulaire materialen, zoals glycolipiden, lipopolysacchariden en extracellulaire matrices 12 vormen . Met name wordt de hete zuur-fenol-analyse vaak gebruikt voor het bepalen van het totale koolhydraatgehalte in plaats van voor de specifieke bepaling van glucose-gehalte 12 . Enzymatische hyDrolyse van glycogeen naar glucose door a-amyloglucosidase gevolgd door de detectie van glucose door middel van een enzymgekoppelde assay, produceert een colorimetrische aflezing die zeer gevoelig en specifiek is voor glucose afgeleid van glycogeen. De specificiteit kan verder worden versterkt met de preferentiële precipitatie van glycogeen uit cellysaten door ethanol 5 , 8 , 19 .
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor een enzym gebaseerde assay van het glycogeengehalte in twee van de meest geteste cyanobacteria, Synechocystis sp. PCC 6803 en Synechococcus sp. PCC 7002, in de wildtype en mutantstammen. Om een efficiënte hydrolyse te waarborgen wordt een cocktail van a-amylase en a-amyloglucosidase gebruikt 8 . Het endo-werkende a-amylase hydrolyseert de a-1,4-bindingen in verschillende glucanen in dextrinen, die verder worden gehydrolyseerd tO glucose door exo-werkende a-amyloglucosidase 20 . De synergistische effecten van deze enzymen zijn bekend, en deze enzymen worden routinematig gebruikt voor de selectieve hydrolyse van zetmeel, dat een a-gebonden glucan achtig glycogeen is, zonder andere glycoconjuganten, zoals cellulose, in de plantbiomassa 21 te beïnvloeden. De uitgebrachte glucose wordt kwantitatief gedetecteerd na een enzymgekoppelde assay bestaande uit glucoseoxidase, dat de reductie van zuurstof naar waterstofperoxide en de oxidatie van glucose naar een lacton- en peroxidase katalyseert, die een roze gekleurde quinoneimine kleurstof uit waterstofperoxide produceert, Een fenolische verbinding en 4-aminoantipyrine 22 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding
- Cyanobacteriële culturen
- Grow Synechocystis sp. PCC 6803 bij 30 ° C in vloeibaar BG11 medium 8 , met een constante toevoer van lucht aangevuld met 1% (v / v) CO 2 . Verlichten het kweken continu met licht bij een fotosynthetische foton flux dichtheid van 50 umol fotonen / m2 / s.
- Grow Synechococcus sp. PCC 7002 in vloeibaar A + medium 23 (BG11 medium kan ook gebruikt worden), met een constante toevoer van lucht aangevuld met 1% (v / v) CO 2 . De temperatuur moet 37 ° C zijn. Verlichten het kweken continu met licht bij een fotosynthetische foton flux dichtheid van 150 umol fotonen / m2 / s.
- Meet de optische dichtheid (OD) van de cultuur bij 730 nm met behulp van een cuvette met een lichtpad van 1 cm. Als de OD-waarde hoger is dan 0,8, maak dan de juiste verdunningen om OD-metingen te verkrijgen die evenredig zijn met dieE cel concentratie.
OPMERKING: De onderstaande protocollen zijn geschikt voor vloeibare culturen, met een celdichtheid die overeenkomt met een OD 730nm- waarde van 2 of hoger. Wanneer culturen in de exponentiële groeifase gewenst zijn, welke typisch een OD 730nm- waarde hebben onder 1, concentreer de celdichtheid door centrifugeren en resuspensioneren in een buffer of medium om een OD 730nm- waarde van 2 of hoger te bereiken.
- Buffers en reagentia
- Maak 50 mM Tris-HCl buffer bij pH 8.
- Maak 50 mM natriumacetaatbuffer bij pH 5.
- Maak een voorraadoplossing van 8 U / ml amyloglucosidase in 50 mM natriumacetaatbuffer, pH 5.
- Maak een voorraadoplossing van 2 U / ml a-amylase in 50 mM natriumacetaatbuffer, pH 5.
- Met gedestilleerd water, makeglucose standaardoplossingen bij concentraties tussen 0 en 100 μg / ml.
- Bereid GOD-POD reagens uit de D-Glucose Assay Kit (GODPOD Format), fDe instructies van de fabrikant volgen.
2. Bepaling van het Cell Dry Weight (Optioneel)
- Vervoer 2 ml van een cultuur of een celresuspensie (zie stap 1.1) naar een 2,0 ml buis en centrifugeer bij 6000 xg en 4 ° C gedurende 5 minuten. Gooi de supernatant weg.
- Resulteer de pellet in 1 ml water en centrifugeer bij 6000 xg en 4 ° C gedurende 5 minuten. Gooi de supernatant weg en verwijder de celpelletje in 0,5 ml water.
- Zet de vering over op een voorgewogen aluminium lade. Breng de lade naar een droogoven bij 105 ° C voor het drogen van de nacht (ongeveer 18 uur).
CRITICAL: Het is belangrijk dat de lade met tangjes wordt behandeld om de overdracht van materiaal uit de vingers te voorkomen. Droog een lege, voorafgewogen aluminium lade onder dezelfde omstandigheden om elk gewichtsverlies uit de bakken te bepalen tijdens het drogen. - Na het drogen, verwijder de bak uit de oven en laat het evenwicht bij omgevingstemperatuurOns voor 5 minuten voordat we het met een nauwkeurigheid van 0,0001 g weegt.
OPMERKING: De waarde kan gebruikt worden om het glycogeengehalte op een cel-droge basis te normaliseren.
3. Lysis van cyanobacteriële cellen
- Vervoer 1 ml van een cultuur of een celresuspensie (zie stap 1.1) naar een 1,5 ml buis en centrifugeer bij 6000 xg en 4 ° C gedurende 10 minuten. Gooi de supernatant weg.
- Resuspendeer de pellet in 1 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8, en centrifugeer bij 6000 xg en 4 ° C gedurende 10 minuten. Gooi de supernatant weg en verwijder de celpellet in 1 ml van de Tris-HCl-buffer. Herhaal het proces.
- Resulteer de pellet grondig in 500 μl 50 mM Tris-HCl buffer, pH 8.
CRITICAL: Resuspendeer de pellet goed voor een efficiënte cellysis. Houd de resuspensie in ijs. - Lyse de geresuspendeerde cellen bij 4 ° C door 30 cycli van ultrasonicatie uit te voeren, elke cyclus bestaande uit 30 s bij een frequentie van 20 kHz met de maximale amplitude,Gevolgd door 90 s zonder.
OPMERKING: Met deze methode kan Synechococcus sp. PCC 7002.- Als alternatief, overdracht van de celresuspension naar een schroefdopbuis en voeg zirkoniumoxide-kralen aan de buis toe volgens de instructies van de fabrikant. Zet de buis in een weefselhomogenisator en belicht de cellen bij 4 ° C door 2 cycli te kloppen, elke cyclus bestaat uit 5 minuten bij de frequentie-instelling van 5.
OPMERKING: Met deze methode kan Synechocystis sp. PCC 6803 en Synechococcus sp. PCC 7002.
- Als alternatief, overdracht van de celresuspension naar een schroefdopbuis en voeg zirkoniumoxide-kralen aan de buis toe volgens de instructies van de fabrikant. Zet de buis in een weefselhomogenisator en belicht de cellen bij 4 ° C door 2 cycli te kloppen, elke cyclus bestaat uit 5 minuten bij de frequentie-instelling van 5.
- Centrifugeer de buis die het lysaat bevat gedurende 10 minuten bij 6000 xg en 4 ° C.
OPMERKING: De pellet dient voornamelijk uit grote celresten te bestaan. Als er een significant aantal ongebroken cellen is, herhaal stap 3.4. Houd de supernatant op ijs. - Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van een commerciële BCA Protein assay kit.
OPMERKING: De waarde kan gebruikt worden om het glycogeengehalte te normaliserenOp basis van eiwitgehalte.
4. Glycogeen Precipitatie
- Verwijder chlorofyl a uit het cellysaat door 900 μl 96% (v / v) ethanol en 100 μl van de supernatant van stap 3.5 in een 1,5 ml schroefdopbuis te mengen. Na het afsluiten van de dop, verwarm de buis bij 90 ° C gedurende 10 minuten met behulp van een standaard laboratorium verwarmingsblok.
- Incubeer de buis 30 minuten op ijs.
- Centrifugeer de buis bij 20.000 xg en 4 ° C gedurende 30 minuten en verwijder de supernatant zorgvuldig; De pellet bevat glycogeen. Droog de pellet lichtjes in de lucht om overmaat ethanol te verwijderen.
CRITISCH: Overmatig drogen van de pellet moet vermeden worden, anders wordt het moeilijk om in stap 5.1 moeilijk te oplossen. - OPSIONEEL: Meet de absorptie van het supernatant verkregen in stap 4.3 bij 664 nm om de chlorofyl a- inhoud te bepalen. Gebruik een absorptiecoëfficiënt van 84,6 L / g / cm 24 .
OPMERKING: De waarde kan worden gebruikt om te normaliserenE het glycogeengehalte
5. Enzymatische hydrolyse en glycogeenbepaling
- Solubiliseer de pellet verkregen in stap 4.3 in 100 μl 50 mM natriumacetaat, pH 5, en voeg 50 μl 8 U / ml amyloglucosidase en 50 μl 2 U / ml α-amylase toe. Meng deze materialen goed met een draaikolk.
OPMERKING: Mengen door pipettering wordt niet aangeraden omdat de glycogeenpelletje viscerend is. - Incubeer het mengsel bij 60 ° C op een verwarmingsblok gedurende 2 uur om de vertering van glycogeen in glucose moleculen mogelijk te maken.
- Centrifugeer het monster bij 10.000 xg gedurende 5 minuten en draag de supernatant over naar een nieuwe 1,5 ml buis.
6. Bepaling van het totale glucosegehalte door het GOD-POD-reagens te gebruiken
- Meet de concentratie van glucose in het supernatant verkregen in stap 5.3 onder gebruikmaking van het GOD-POD reagens. Plaats 100 μl van de supernatant van stap 5.3 naar een put in een 96-putjesplaat. Als negatieve controle,Gebruik 100 μl 50 mM natriumacetaat, pH 5. Voor het genereren van een kalibratiekromme meet ook de glucose standaard oplossingen.
- Voeg 150 μL GOD-POD reagens toe aan elk monster en meng snel door pipettering.
- Incubeer de plaat statisch bij 25 ° C gedurende 30 minuten. Noteer de absorptiewaarde bij 510 nm met behulp van een plaatlezer.
- Bereken de concentratie van glucose met behulp van een kalibratiecurve die is verkregen uit de glucosestandaarden.
OPMERKING: De glycogeenconcentratie in het cellysaat wordt uitgedrukt als de glucoseconcentratie (μg / mL).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
10 ml wildtype Synechocystis sp. PCC 6803 werden gegroeid onder fotoautotrofe condities totdat de OD 730nm waarde ongeveer 0,8 was bereikt. De cellen werden geoogst en geresuspendeerd in 50 mM Tris-HCl, pH 8. De OD 730nm waarde werd ingesteld op 2-3. Het glycogeengehalte werd geanalyseerd volgens het hierboven beschreven protocol. Het glycogeengehalte per OD 730 nm was 13 ± 1,8 μg / ml / OD 730 nm ( N = 12). Het glycogeengehalte opzichte van het eiwitgehalte was 0,24 ± 0,03 ug / g (N = 12), en het glycogeengehalte opzichte van het chlorofyl a gehalte was 5,7 ± 0,6 ng / g (n = 12). Vanwege de beschikbare hoeveelheid materiaal werd de meting van het droge gewicht van de cel weggelaten. Gezien het eiwitgehalte in cyanobacteriën onder vergelijkbare omstandigheden gekweekt is ongeveer 50% van het droge gewicht van de cel 25 </ Sup> wordt het glycogeengehalte geschat op 12% van het droge gewicht van de cel, die consistent is met vorige studies 26 .
De detectiegrenzen van de GOD-POD-analyse lieten een lineaire correlatie zien tussen de glucoseconcentratie en de absorptie bij 510 nm in het glucoseconcentratiegebied tussen 10 en 100 μg / ml, overeenkomend met absorptiewaarden van 0,08 en 0,7 bij 510 nm. De minimumlimiet is waarschijnlijk te wijten aan de instrumentale detectiegrens. Wanneer glucoseconcentraties hoger dan 150 μg / ml werden gebruikt, vormden donkere groene precipitaten, waardoor een grote variatie in de absorptie-uitlezing ontstaat. Met betrekking tot de hoeveelheid gebruikte celmaterialen verkregen we regelmatig reproduceerbare glycogeeninhoud wanneer de OD 730nm- waarde van celresuspensie voorafgaand aan cellysis tussen 2 en 10 was. Cellresuspensies met een OD 730nm- waarde van 1 of minder gaf aanleiding tot signalen dicht bij de Minimum detectie limiT, wat leidt tot zeer variabele resultaten. Celresuspensie met een OD 730nm- waarde hoger dan 20 was niet geschikt omdat cellysis onvolledig was en of verlengde lysis of verdunningen nodig waren.
Figuur 1 toont representatieve resultaten van de glycogeeninhoud in Synechocystis sp. PCC 6803 wildtype en twee mutantstammen ( ΔpmgA en ΔpmgR1 ). De cellen die werden gegroeid bij de exponentiële groeifase werden gebruikt. De glycogeeninhoud werd eerst genormaliseerd door de totale eiwitgehalten en werden vervolgens uitgedrukt ten opzichte van de waarde voor de wildtype. De resultaten tonen aan dat de mutantstammen glycogeeninhoud hebben die minstens twee keer hoger zijn dan de wildtypestamme.
Vervolgens werd het glycogeengehalte geanalyseerd in stammen van Synechococcus sp. PCC 7002 ontworpen om mannitol 5 te produceren . De eerste stam (Glg +) bevat het wildtype glgA1 en glgA2 genen die coderen voor twee functionele glycogeensynthasen, terwijl de tweede stam (Glg -) functionele kopieën van deze genen 5 mist. De glycogeen- en mannitolgehaltes werden vervolgens gemeten in beide stammen ( Figuur 2 ). De resultaten tonen aan dat de Glg - een detecteerbaar niveau van glycogeen ontbrak, terwijl het meer mannitol produceerde dan de Glg + -stam. Dit suggereert dat de koolhydraat die wordt gesynthetiseerd door fotosynthese wordt omgezet naar mannitol in de mutante stam die het vermogen heeft om glycogeen te synthetiseren. De OD 730nm waarden van de culturen waren ongeveer 10, het verschaffen van voldoende celmaterialen voor celdrogergewichtsanalyse . De glycogeeninhoud werd genormaliseerd onder toepassing van het droge gewicht van de cel.
8 / 56068fig1.jpg "/>
Figuur 1: De glycogeeninhoud gemeten in verschillende lijnen van Synechocystis sp . PCC 6803. Relative inhoud glycogeen in de WT en twee mutanten (ΔpmgA 9 en ΔpmgR1 8) getoond. De glycogeenwaarden werden genormaliseerd door de totale eiwitgehaltes. Middelen van drie biologische replicaten worden getoond, met foutbalkjes die standaardafwijkingen vertegenwoordigen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Glycogeen en mannitolproductie in genetisch gemanipuleerde Synechococcus sp. PCC 7002 5 . Glg <Sup> +, de stam die mannitol en glycogeen synthetiseert. Glg - , de stam die mannitol synthetiseert, maar geen glycogeen. De getoonde waarden zijn het gemiddelde van drie biologische replicaten, met foutbalken die de standaardafwijkingen vertegenwoordigen. CDW: cel droog gewicht, ND: niet gedetecteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritieke stappen binnen het protocol zijn glycogeen neerslag en resuspensie. Na centrifugeren volgend ethanol neerslag vormt glycogeen een doorschijnende korrel die losjes vasthoudt aan de muren van de microcentrifugebuizen. Bij het verwijderen van de supernatant dient daarom speciale aandacht te worden gegeven om de pellet niet te verwijderen. De glycogeenpellet is kleverig, en oplosbaarheid kan moeilijk zijn als het uitdroogt. Merk op dat de volledige solubilisatie van de glycogeenpelletje belangrijk is omdat onvolledige solubilisatie tot inefficiënte enzymatische spijsvertering zal leiden en derhalve aanleiding geeft tot grote variaties tussen technische replicaten. De toepassing van sonicatie voorafgaand aan solubilisatie door vortexing kan het proces vergemakkelijken.
Wat de keuze van de normalisatiemethode betreft, is het droge gewicht van de cel een veelgebruikte referentie. Het is meer moeizaam en vereist meer celbiomassa dan bepalingen van eiwit en chlorofylA. Het totale eiwitgehalte verschaft een alternatieve verwijzing naar de celbiomassa en kan op kleine schaal worden bepaald, zoals beschreven in het onderhavige protocol. Het totale eiwitgehalte per droge celbiomassa ligt typisch in het gebied tussen 40% en 50%, hoewel de exacte waarde afhankelijk is van groeivoorwaarden 25 , 28 . De chlorofyl a- inhoud kan gemakkelijk worden bepaald en kan als proxy gebruikt worden voor de celhoeveelheid die in het monster aanwezig is. Het is echter welbekend dat de hoeveelheid chlorofyl a per cel sterk verschilt afhankelijk van de groeivoorwaarden, in het bijzonder als gevolg van veranderende nutriëntenconcentraties en lichtintensiteiten 29 .
Een van de belangrijke voordelen van de gepresenteerde techniek ten opzichte van andere methoden is dat het zeer selectief is. Het hotzuur- en fenolprotocol en de monosaccharide samenstelling analyse volgtZure hydrolyse zijn relatief eenvoudige methoden en zijn gebruikt in eerdere studies 9 , 10 , 12 , 13 . Deze methoden kunnen echter het glycogeengehalte overschatten, omdat niet-glycogeen glucose en extra suikers kunnen bijdragen aan de meting, afhankelijk van de koolhydratiedetectietechniek 12 . De beschreven techniek detecteert glucose in glycogeen selectief. Het kan ook glucose uit cellulose discrimineren, omdat a-amylase en a-amyloglucosidase de p-gelaste glucosylbindingen die in cellulose aanwezig zijn niet hydrolyseert. In eerdere studies werd de enzymatische hydrolyse van glycogeen alleen uitgevoerd door a-amyloglucosidase 7 , 27 . Inclusie van het endo-werkende a-amylase samen met het exo-activerende a-amyloglucosidase, zoals in dit protocol wordt voorgesteld, kan tHij efficiënte hydrolyse van glycogeen. Een soortgelijke selectieve hydrolyse wordt routinematig toegepast op behandelingen van plantenbiomassa, waarbij de combinatie van a-amylase-a-amyloglucosidase wordt gebruikt om zetmeel te hydrolyseren zonder dat andere glucose bevattende polysacchariden, zoals cellulose 21 , te beïnvloeden zijn.
De belangrijkste beperking van de techniek is dat de procedure weinig doorvoert, omdat afzonderlijke monsters afzonderlijk worden verwerkt met behulp van microcentrifugebuizen. De glycogeen precipitatiestap is de primaire factor die hogere doorvoer voorkomt. Implementatie als een high-throughput procedure vereist het gebruik van deep-well platen en het vermogen om deze te centrifugeren met een hoge snelheid (20.000 x g ). Terwijl centrifuges die 96-platen kunnen centrifugeren bij de nodige snelheid beschikbaar zijn, kunnen de meeste diepe platen geen kracht meer dan 6000 x g tolereren. Vandaar dat de zorgvuldige keuze van materialen nodig is om het protocol voor hig aan te passenH-doorvoer analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen Nordic Energy Research (AquaFEED, project nr. 24), Innovationfonden Denemarken (Pant Power, project nr. 12-131844) en Villum Fonden (projectnummer 13363)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QSonica Sonicators Q700 | Qsonica, LLC | NA | QSonica |
| SpectraMax 190 Microplate Reader | Molecular Devices | NA | Eliza plate reader |
| Bullet Blender Storm | Next Advance | BBY24M-CE | Beads beater |
| Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spectrophotometer | Amersham Biosciences | NA | Spectrophotometer |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | Buffer |
| HCl | Merck | 1-00317 | pH adjutment |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | 32319 | Buffer |
| Amyloglycosidase (Rhizopus sp.) | Megazyme | E-AMGPU | Enzyme for glycogen depolymerization |
| α-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis) | Sigma-Aldrich | A3176 | Enzyme for glycogen depolymerization |
| D-Glucose | Merch | 8337 | Standard for the glucose assay |
| Pierce BCA Protein assay kit | Thermo Fisher scientific | 23225 | For determination of protein concentrations |
| Aluminum drying trays, disposable | VWR | 611-1362 | For determination of cell dry weights |
| D-Glucose assay kit (GODPOD format) | Megazyme | K-GLUC | For determination of glucose concentrations |
| Zirconium oxide breads, 0.15 mm | Next Advance | ZrOB015 | Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm |
| RINO tubes | Next Advance | NA | Tubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm |
References
- Chen, X., et al. The Entner-Doudoroff pathway is an overlooked glycolytic route in cyanobacteria and plants. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (19), 5441-5446 (2016).
- Yang, C., Hua, Q., Shimizu, K. Metabolic flux analysis in Synechocystis using isotope distribution from C-13-labeled glucose. Metab Eng. 4 (3), 202-216 (2002).
- Pelroy, R. A., Levine, G. A., Bassham, J. A. Kinetics of light-dark CO2 fixation and glucose assimilation by Aphanocapsa 6714. J Bacteriol. 128, 633-643 (1976).
- You, L., Berla, B., He, L., Pakrasi, H. B., Tang, Y. J. 13C-MFA delineates the photomixotrophic metabolism of Synechocystis. sp. PCC 6803 under light- and carbon-sufficient conditions. Biotechnol J. 9, 684-692 (2014).
- Jacobsen, J. H., Frigaard, N. U. Engineering of photosynthetic mannitol biosynthesis from CO2 in a cyanobacterium. Metab Eng. 21, 60-70 (2014).
- Möllers, K. B., Cannella, D., Jørgensen, H., Frigaard, N. -U. Cyanobacterial biomass as carbohydrate and nutrient feedstock for bioethanol production by yeast fermentation. Biotechnol Biofuels. 7, 64 (2014).
- Angermayr, S. A., et al. Culturing Synechocystis. sp. strain PCC 6803 with N2 and CO 2 in a diel regime reveals multiphase glycogen dynamics with low maintenance costs. Appl Environ Microbiol. 82, 4180-4189 (2016).
- de Porcellinis, A. J., et al. The Non-coding RNA Ncr0700/PmgR1 is required for photomixotrophic growth and the regulation of glycogen accumulation in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Plant Cell Physiol. 57 (10), 2091-2103 (2016).
- Sakuragi, Y. alpha-Tocopherol plays a role in photosynthesis and macronutrient homeostasis of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 that is independent of its antioxidant function. Plant Physiol. 141, 508-521 (2006).
- Osanai, T., et al. Positive regulation of sugar catabolic pathways in the cyanobacterium Synechocystis. sp. PCC 6803 by the group 2 sigma factor sigE. J Biol Chem. 280, 30653-30659 (2005).
- Yamauchi, Y., Kaniya, Y., Kaneko, Y., Hihara, Y. Physiological roles of the cyAbrB transcriptional regulator pair Sll0822 and Sll0359 in Synechocystis sp. strain PCC 6803. J Bacteriol. 193, 3702-3709 (2011).
- Dubois, M., Gilles, K., Hamilton, J., Rebers, P., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal Chem. 28, 350-356 (1956).
- Osanai, T., et al. Genetic engineering of group 2 {sigma} factor SigE widely activates expressions of sugar catabolic genes in Synechocystis species PCC 6803. J Biol Chem. 286, 30962-30971 (2011).
- Miao, X., Wu, Q., Wu, G., Zhao, N. Sucrose accumulation in salt-stressed cells of agp gene deletion-mutant in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. FEMS Microbiol Letters. 218, 71-77 (2003).
- Hagemann, M., Erdmann, N. Activation and pathway of glucosylglycerol synthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Microbiology. 140, 1427-1431 (1994).
- Nobles, D. R., Romanovicz, D. K., Brown, R. M. Cellulose in cyanobacteria. Origin of vascular plant cellulose synthase. Plant Physiol. 127, 529-542 (2001).
- Zhao, C., et al. High-yield production of extracellular type-I cellulose by the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002. Cell Discovery. 1, 15004 (2015).
- Kawano, Y., et al. Cellulose accumulation and a cellulose synthase gene are responsible for cell aggregation in the cyanobacterium Thermosynechococcus vulcanus RKN. Plant Cell Physiol. 52, 957-966 (2011).
- Angermayr, S. A., Gorchs Rovira, A., Hellingwerf, K. J. Metabolic engineering of cyanobacteria for the synthesis of commodity products. Trends Biotechnol. 33, 352-361 (2015).
- Zhang, B., Dhital, S., Gidley, M. J. Synergistic and antagonistic effects of α-amylase and amyloglucosidase on starch digestion. Biomacromolecules. 14, 1945-1954 (2013).
- Harholt, J., et al. ARABINAN DEFICIENT 1 is a putative arabinosyltransferase involved in biosynthesis of pectic arabinan in Arabidopsis. Plant Physiol. 140, 49-58 (2006).
- Fernando, C. D., Soysa, P. Optimized enzymatic colorimetric assay for determination of hydrogen peroxide (H2O2) scavenging activity of plant extracts. MethodsX. 2, 283-291 (2015).
- Jacobsen, J. H., Rosgaard, L., Sakuragi, Y., Frigaard, N. U. One-step plasmid construction for generation of knock-out mutants in cyanobacteria: studies of glycogen metabolism in Synechococcus sp PCC 7002. Photosynth Res. 107 (2), 215-221 (2011).
- Lichtenthaler, H. K. Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes. Methods Enzymol. 148, 350-382 (1987).
- López, C. V. G., del Carmen Cerón García, M., Fernández, F. G. A., Bustos, C. S., Chisti, Y., Sevilla, J. M. F. Protein measurements of microalgal and cyanobacterial biomass. Bioresource Technol. 101, 7587-7591 (2010).
- Hasunuma, T., et al. Dynamic metabolic profiling of cyanobacterial glycogen biosynthesis under conditions of nitrate depletion. J Exp Bot. 64, 2943-2954 (2013).
- Díaz-Troya, S., López-Maury, L., Sánchez-Riego, A. M., Roldán, M., Florencio, F. J. Redox regulation of glycogen biosynthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803: Analysis of the AGP and glycogen synthases. Molecular Plant. 7, 87-100 (2014).
- Parrott, L. M., Slater, J. H. The DNA, RNA and protein composition of the cyanobacterium Anacystis nidulans grown in light- and carbon dioxide-limited chemostats. Arch Microbiol. 127, 53-58 (1980).
- Hihara, Y., Kamei, A., Kanehisa, M., Kaplan, A., Ikeuchi, M. DNA microarray analysis of cyanobacterial gene expression during acclimation to high light. Plant Cell. 13, 793-806 (2001).
