Summary
Здесь мы представляем надежный и простой анализ для измерения содержания гликогена в клетках цианобактерий. Процедура влечет за собой осаждение, селективную деполимеризацию и обнаружение остатков глюкозы. Этот метод подходит как для дикого типа, так и для генетически модифицированных штаммов и может способствовать метаболической инженерии цианобактерий.
Abstract
Цианобактерии накапливают гликоген в качестве основного внутриклеточного углерода и энергии при фотосинтезе. Недавние разработки в области исследований выявили сложные механизмы метаболизма гликогена, в том числе цикл циклов биосинтеза и катаболизма, окислительно-восстановительную регуляцию и участие некодирующей РНК. В то же время предпринимаются усилия по перенаправлению углерода из гликогена в желаемые продукты в генно-инженерных цианобактериях для повышения выхода продукта. Для определения содержания гликогена в цианобактериях используются несколько методов с переменной точностью и техническими сложностями. Здесь мы приводим подробный протокол для надежного определения содержания гликогена в цианобактериях, который может быть выполнен в стандартной лабораторной лаборатории. Протокол влечет за собой селективное осаждение гликогена из клеточного лизата и ферментативную деполимеризацию гликогена с образованием глюкозных мономеров, которые обнаруживаются у глюкозыIdase-peroxidase (GOD-POD), связанный с ферментом. Этот метод применяется к Synechocystis sp. PCC 6803 и Synechococcus sp. PCC 7002, две модели цианобактериальных видов, которые широко используются в метаболической инженерии. Кроме того, метод успешно показал различия в содержании гликогена между диким типом и мутантами, дефектными в регуляторных элементах или генах биосинтеза гликогена.
Introduction
Цианобактерии накапливают гликоген в качестве основного углеводного хранилища углерода из СО 2, закрепленного в свете путем фотосинтеза. Гликоген представляет собой гликан, состоящий из линейного α-1,4-связанного глюкана с ответвлениями, образованными α-1,6-связанными глюкозильными связями. Биосинтез гликогена в цианобактериях начинается с превращения глюкозо-6-фосфата в ADP-глюкозу посредством последовательного действия фосфоглюкомутазы и АДФ-глюкозо-пирофосфорилазы. Глюкозную часть в ADP-глюкозе переносят на невосстанавливающий конец α-1,4-глюкан-скелета гликогена одной или несколькими гликогенсинтазами (GlgA). Впоследствии разветвляющиеся ферменты вводят α-1,6-связанное глюкозильное звено, которое далее расширяется, чтобы генерировать гликогенную частицу. В темноте гликоген разрушается гликогенфосфорилазой, гликогенными дебранирующими ферментами, α-глюканотрансферазой и мальтодекстринфосфорилазой в фосфорилированную глюкозу и свободную глюкозу. Эти фиды intO катаболические пути, включая окислительный пентозофосфатный путь, путь Эмбдена-Мейерхофа-Парнаса (гликолиз) и путь Энтерна-Дудорова 1 , 2 , 3 , 4 .
В последние годы метаболизм гликогена в цианобактериях вызвал повышенный интерес из-за возможности развития цианобактерий в заводы микробиологических клеток, вызванных солнечным светом, для производства химических веществ и топлива. Метаболизм гликогена можно модифицировать, чтобы увеличить выход продуктов, поскольку гликоген является самым большим гибким углеродным пулом в этих бактериях. Примером может служить cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002, который был генетически разработан для производства маннита; Генетический разрыв синтеза гликогена увеличивает выход маннита в 3 раза 5 . Другим примером является производство биоэтанола из загруженного гликогенами дикогоYpe Synechococcus sp. PCC 7002 6 . Содержание гликогена в клеточном слое дикого типа может составлять до 60% от сухой массы клетки во время голодания азота 6 .
Наше понимание метаболизма и регуляции гликогена также расширилось за последние годы. Хотя известно, что гликоген накапливается в свете и катаболизируется в темноте, детальная кинетика метаболизма гликогена во время цикла диэлей была недавно обнаружена только в Synechocystis sp. PCC 6803 7 . Кроме того, было выявлено несколько генов, влияющих на накопление гликогена. Примечательным примером является открытие, что предполагаемая гистидинкиназа PmgA и некодирующая РНК PmgR1 образуют регуляторный каскад и контролируют накопление гликогена. Интересно, что мутанты делеции pmgA и pmgR1 накапливают в два раза больше гликогена, чем штамм дикого типа Synechocystis sp. PCC 68038 , 9 . Известно, что другие регуляторные элементы влияют на накопление гликогена, включая альтернативный сигма-фактор E и транскрипционный фактор CyAbrB2 10 , 11 .
По мере роста интереса к регуляции гликогена и метаболизма необходим подробный протокол, описывающий определение содержания гликогена. В литературе используются несколько методов. Кислотный гидролиз с последующим определением содержания моносахарида посредством анионообменной жидкостной хроматографии под высоким давлением в сочетании с импульсным амперометрическим детектором или спектрометрическим определением после обработки кислотой и фенолом являются широко используемыми методами для аппроксимации содержания гликогена 9 , 10 , 12 , 13 . Однако анион-обменный жидкостной хроматограф высокого давленияC является очень дорогостоящим и не выделяет глюкозу, полученную из гликогена, по сравнению с другими глюкозосодержащими гликоконъюгатами, такими как сахароза 14 , глюкозилглицерин 15 и целлюлоза 16 , 17 , 18 , которые, как известно, накапливаются у некоторых видов цианобактерий. Кислотно-фенольный метод может быть выполнен с использованием стандартного лабораторного оборудования. Тем не менее, он использует высоко токсичные реагенты и не различает глюкозу , полученную из различных гликоконъюгатов, а также не различают глюкозы из других моносахаридов , которые представляют собой клеточные материалы, такие как гликолипиды, липополисахариды и внеклеточные матрицы 12. В частности, анализ горячей кислоты-фенола часто используется для определения общего содержания углеводов, а не для конкретного определения содержания глюкозы 12 . ФерментативныйДролиз гликогена до глюкозы посредством α-амилоглюкозидазы с последующим детектированием глюкозы через фермент-связанный анализ генерирует колориметрическое считывание, которое является высокочувствительным и специфичным для глюкозы, полученной из гликогена. Специфичность может быть дополнительно улучшена с предпочтительным осаждением гликогена из клеточных лизатов с помощью этанола 5 , 8 , 19 .
Здесь мы опишем подробный протокол для анализа содержания гликогена на основе фермента на двух наиболее широко изученных цианобактериальных видах Synechocystis sp. PCC 6803 и Synechococcus sp. PCC 7002, в штаммах дикого типа и мутантов. Для обеспечения эффективного гидролиза используется коктейль α-амилазы и α-амилоглюкозидазы 8 . Эндо-действующая α-амилаза гидролизует α-1,4-связи в различных глюканах в декстрины, которые далее гидролизуются tO глюкозой экзо-действующей α-амилоглюкозидазой 20 . Синергические эффекты этих ферментов хорошо известны, и эти ферменты обычно используются для селективного гидролиза крахмала, который является α-связанным глюканоподобным гликогеном, не влияя на другие гликоконъюганты, такие как целлюлоза, в биомассе растений 21 . Выделенная глюкоза количественно обнаруживается после анализа, связанного с ферментом, состоящего из глюкозооксидазы, которая катализирует восстановление кислорода до перекиси водорода и окисление глюкозы до лактона и пероксидазы, которая продуцирует хинонимин-краситель розового цвета из перекиси водорода, Фенольное соединение и 4-аминоантипирин 22 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка
- Цианобактериальные культуры
- Grow Synechocystis sp. PCC 6803 при 30 ° C в жидкой среде BG11 8 с постоянной подачей воздуха, дополненной 1% (об. / Об.) CO 2 . Освещать культуры непрерывно светом при плотности фотосинтетического фотона 50 мкмоль фотон / м 2 / с.
- Grow Synechococcus sp. PCC 7002 в жидкой среде A + 23 (среда BG11 также может использоваться) с постоянной подачей воздуха, дополненной 1% (об. / Об.) CO 2 . Температура должна составлять 37 ° C. Освещать культуры непрерывно светом при плотности фотосинтетического потока фотонов 150 мкмоль фотон / м 2 / с.
- Измерьте оптическую плотность (OD) культуры при 730 нм, используя кювету с световым пучком 1 см. Если значение OD выше 0,8, сделайте соответствующие разведения для получения измерений OD, которые пропорциональны thКонцентрация клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ. Представленные ниже протоколы пригодны для жидких культур с плотностью ячейки, соответствующей значению OD 730 нм, равному 2 или выше. Когда желательны культуры в фазе экспоненциального роста, которые обычно имеют значение OD 730 нм ниже 1, концентрируют плотность клеток путем центрифугирования и ресуспендирования в буфере или среде для достижения значения OD 730 нм 2 или выше.
- Буферы и реактивы
- Сделайте 50 мМ буфера Tris-HCl при рН 8.
- Получают 50 мМ ацетатный буфер натрия при рН 5.
- Сделайте исходный раствор 8 ед / мл амилоглюкозидазы в 50 мМ буфере для ацетата натрия, pH 5.
- Сделайте исходный раствор 2 U / мл α-амилазы в 50 мМ буфере для ацетата натрия, pH 5.
- Используя дистиллированную воду, стандартные растворы стандартной глюкозы в концентрациях от 0 до 100 мкг / мл.
- Подготовьте реагент GOD-POD из набора для анализа D-глюкозы (формат GODPOD), fВ соответствии с инструкцией производителя.
2. Определение сухой массы ячейки (необязательно)
- Перенесите 2 мл культуры или ресуспензию клеток (см. Этап 1.1) в пробирку объемом 2,0 мл и центрифугируют при 6000 × g и 4 ° C в течение 5 минут. Отбросьте супернатант.
- Ресуспендируют гранулу в 1 мл воды и центрифугируют при 6000 × g и 4 ° C в течение 5 минут. Удалите супернатант и ресуспендируйте клеточный осадок в 0,5 мл воды.
- Перенесите суспензию в предварительно взвешенный алюминиевый лоток. Переместите лоток в сушильную печь при температуре 105 ° C для сушки в течение ночи (приблизительно 18 часов).
КРИТИЧЕСКИЙ: Важно, чтобы лоток обрабатывался пинцетом, чтобы избежать переноса материала с пальцев. Высушите пустой предварительно взвешенный алюминиевый лоток в тех же условиях, чтобы определить потерю веса из лотков во время сушки. - После высыхания выньте лоток из духовки и дайте ему уравновешиваться при комнатной температуреВ течение 5 мин до взвешивания с точностью 0,0001 г.
ПРИМЕЧАНИЕ. Значение может быть использовано для нормализации содержания гликогена на основе сухого веса клеток.
3. Лизис цианобактериальных клеток
- Перенесите 1 мл культуры или ресуспендирования клеток (см. Этап 1.1) в 1,5 мл пробирку и центрифугируют при 6000 × g и 4 ° C в течение 10 мин. Отбросьте супернатант.
- Ресуспендируют гранулу в 1 мл 50 мМ Трис-HCl, pH 8 и центрифугируют при 6000 × g и 4 ° C в течение 10 мин. Удалите супернатант и ресуспендируйте клеточный осадок в 1 мл буфера Tris-HCl. Повторите этот процесс.
- Тщательно ресуспендируют гранулу в 500 мкл 50 мМ буфера Tris-HCl, pH 8.
КРИТИЧЕСКИЙ: Повторно суспендируйте гранулу для эффективного клеточного лизиса. Держите ресуспензию на льду. - Lyse ресуспендированные клетки при 4 ° C путем выполнения 30 циклов ультразвука, каждый цикл, состоящий из 30 с на частоте 20 кГц с максимальной амплитудой,А затем 90 с без.
ПРИМЕЧАНИЕ. Этот метод может эффективно лизировать Synechococcus sp. PCC 7002.- В качестве альтернативы переносите ресуспензию клеток на трубку с винтовой крышкой и добавьте шарики из оксида циркония в трубку, следуя инструкциям производителя. Установите трубку в тканевый гомогенизатор и лизируйте клетки при 4 ° С, выполняя 2 цикла избиения, каждый цикл, состоящий из 5 мин при установке частоты 5.
ПРИМЕЧАНИЕ. Этот метод может эффективно лизировать Synechocystis sp. PCC 6803 и Synechococcus sp. PCC 7002.
- В качестве альтернативы переносите ресуспензию клеток на трубку с винтовой крышкой и добавьте шарики из оксида циркония в трубку, следуя инструкциям производителя. Установите трубку в тканевый гомогенизатор и лизируйте клетки при 4 ° С, выполняя 2 цикла избиения, каждый цикл, состоящий из 5 мин при установке частоты 5.
- Центрифугируйте пробирку, содержащую лизат, в течение 10 минут при 6000 xg и 4 ° C.
ПРИМЕЧАНИЕ. Осадок должен состоять в основном из крупного клеточного мусора. Если существует значительное количество непрерывных ячеек, повторите шаг 3.4. Держите супернатант на льду. - Определите концентрацию белка, используя коммерческий набор для анализа белка BCA.
ПРИМЕЧАНИЕ. Значение можно использовать для нормализации содержания гликогенаНа основе содержания белка.
4. Осаждение гликогена
- Удалите хлорофилл a из клеточного лизата путем смешивания 900 мкл 96% (об. / Об.) Этанола и 100 мкл супернатанта со стадии 3.5 в 1,5-миллилитровой трубке с крышкой. После закрытия колпачка нагрейте трубку при 90 ° C в течение 10 минут, используя стандартный лабораторный нагревательный блок.
- Инкубируйте трубку на льду в течение 30 мин.
- Центрифугируйте пробирку при 20 000 xg и 4 ° C в течение 30 минут и осторожно удалите супернатант; Гранула содержит гликоген. Слегка высушите осадок на воздухе, чтобы удалить избыток этанола.
КРИТИЧЕСКИЙ: Следует избегать чрезмерной сушки гранулы, в противном случае на стадии 5.1 солюбилизировать становится сложно. - ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Измерьте поглощение супернатанта, полученного на этапе 4.3, на уровне 664 нм, чтобы определить содержание хлорофилла а . Используйте коэффициент поглощения 84,6 л / г / см 24 .
ПРИМЕЧАНИЕ. Значение может быть использовано для нормализацииЕ гликогена.
5. Определение ферментативного гидролиза и гликогена
- Солюбилизируют гранулу, полученную на стадии 4.3, в 100 мкл 50 мМ ацетата натрия, pH 5, и добавляют 50 мкл 8U / мл амилоглюкозидазы и 50 мкл 2 U / мл α-амилазы. Хорошо перемешайте эти материалы, используя вихрь.
ПРИМЕЧАНИЕ. Смешивание путем пипетирования не рекомендуется, поскольку гликогенный гранулятор является вязким. - Инкубируйте смесь при 60 ° C на нагревательном блоке в течение 2 часов, чтобы обеспечить переваривание гликогена в молекулы глюкозы.
- Центрифугируют образец при 10000 мкг в течение 5 мин и переносят супернатант в новую 1,5 мл пробирку.
6. Определение общего содержания глюкозы с использованием реагента GOD-POD
- Измерьте концентрацию глюкозы в супернатанте, полученном на этапе 5.3, с использованием реагента GOD-POD. Перенесите 100 мкл супернатанта из стадии 5.3 в лунку в 96-луночный планшет. Как отрицательный контроль,Используйте 100 мкл 50 мМ ацетата натрия, рН 5. Для получения калибровочной кривой также измерьте стандартные растворы глюкозы.
- Добавьте 150 мкл реагента GOD-POD к каждому образцу и быстро перемешайте пипетированием.
- Инкубируйте пластину статически при 25 ° C в течение 30 мин. Запишите значение поглощения при 510 нм с помощью планшетного ридера.
- Вычислите концентрацию глюкозы с использованием калибровочной кривой, полученной из стандартов глюкозы.
ПРИМЕЧАНИЕ. Концентрация гликогена в клеточном лизате выражается как концентрация глюкозы (мкг / мл).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
10 мл дикого типа Synechocystis sp. PCC 6803 выращивали в фотоавтотрофных условиях до достижения значения OD 730 нм около 0,8. Клетки собирали и ресуспендировали в 50 мМ Трис-HCl, pH 8. Значение OD 730 нм было доведено до 2-3. Содержание гликогена анализировали в соответствии с описанным выше протоколом. Содержание гликогена на OD 730 нм составляло 13 ± 1,8 мкг / мл / OD 730 нм ( N = 12). Содержание гликогена по отношению к содержанию белка составляло 0,24 ± 0,03 мкг / мкг ( N = 12), а содержание гликогена относительно содержания хлорофилла а составляло 5,7 ± 0,6 мкг / мкг ( N = 12). Из-за небольшого количества доступного материала измерение сухого веса ячейки было опущено. Учитывая, что содержание белка в цианобактериях, культивируемых в сопоставимых условиях, составляет около 50% сухого веса клеток 25 </ Sup>, содержание гликогена оценивается в 12% от сухого веса клетки, что согласуется с предыдущими исследованиями 26 .
Пределы обнаружения анализа GOD-POD показали линейную корреляцию между концентрацией глюкозы и поглощением при 510 нм в диапазоне концентраций глюкозы от 10 до 100 мкг / мл, что соответствует значениям поглощения 0,08 и 0,7 при 510 нм. Минимальный предел, вероятно, связан с пределом инструментального обнаружения. Когда были использованы концентрации глюкозы более 150 мкг / мл, образовывались темно-зеленые осадки, что приводило к большому изменению показаний поглощения. Что касается количества используемых материалов ячеек, мы регулярно получали воспроизводимое содержание гликогена, когда значение OD 730nm ресуспензии клеток до лизиса клеток составляло от 2 до 10. Ресуспензии клеток с величиной OD 730nm 1 или ниже приводили к появлению сигналов, близких к Минимальное обнаружение limiT, что приводит к очень переменным результатам. Повторная суспензия клеток с величиной OD 730nm выше 20 не была подходящей, поскольку лизис клеток был неполным и требовался либо расширенный лизис, либо разбавления.
На рисунке 1 показаны репрезентативные результаты содержания гликогена в Synechocystis sp. PCC 6803 и два мутантных штамма ( ΔpmgA и ΔpmgR1 ). Использовали клетки, выращенные на стадии экспоненциального роста. Содержание гликогена сначала нормализовалось общим содержимым белка, а затем было выражено относительно значения для дикого типа. Результаты показывают, что мутантные штаммы имеют содержание гликогена, которые по меньшей мере в два раза выше, чем штамм дикого типа.
Затем содержание гликогена анализировали в штаммах Synechococcus sp. PCC 7002, спроектированный для производства маннита 5 , Первый штамм (Glg + ) содержит гены glgA1 и glgA2 дикого типа, кодирующие две функциональные гликогенсинтазы, тогда как второй штамм (Glg - ) не имеет функциональных копий этих генов 5 . Затем содержание гликогена и маннита измеряли в обоих штаммах ( рисунок 2 ). Результаты показывают, что Glg - не обнаружил обнаруживаемого уровня гликогена, тогда как он продуцировал больше маннита, чем штамм Glg + . Это говорит о том, что углевод, синтезируемый фотосинтезом, перенаправляется на маннит в мутантном штамме, который не обладает способностью синтезировать гликоген. Значения OD 730 нм для культур составляли приблизительно 10, обеспечивая достаточные клеточные материалы для анализа сухого веса клеток. Содержание гликогена нормализовалось с использованием сухого веса клетки.
8 / 56068fig1.jpg "/>
Рисунок 1: Содержание гликогена, измеренное в разных строках Synechocystis sp . PCC 6803. Относительное содержание гликогена в WT и у двух мутантов ( ΔpmgA 9 и ΔpmgR1 8 ). Уровни гликогена были нормализованы общим содержанием белка. Показаны три биологических репликации с ошибками, представляющими стандартные отклонения. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Производство гликогена и маннита в генетически модифицированном Synechococcus sp. PCC 7002 5 . Glg <Sup> +, синтезирующий штамм маннит и гликоген. Glg - штамм, синтезирующий маннит, но не гликоген. Показанные значения представляют собой среднее значение трех биологических повторов, с ошибками, представляющими стандартные отклонения. CDW: сухой вес клетки, ND: не обнаружен. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические шаги в протоколе - это осаждение гликогена и ресуспензия. После центрифугирования после осаждения этанолом гликоген образует полупрозрачную таблетку, которая свободно прилипает к стенкам микроцентрифужных пробирок. Поэтому при удалении надосадочной жидкости необходимо уделять особое внимание, чтобы не удалить осадок. Гликогенная таблетка является липкой, и солюбилизация может быть затруднена, если она высыхает. Обратите внимание, что полная солюбилизация гликогенного гранулята важна, поскольку неполная солюбилизация приведет к неэффективному ферментативному расщеплению и, следовательно, приведет к большим изменениям между техническими повторами. Применение ультразвука до солюбилизации путем встряхивания может облегчить процесс.
Что касается выбора метода нормализации, сухой вес клетки является широко используемой ссылкой. Он более трудоемкий и требует больше клеточной биомассы, чем определения белка и хлорофиллаA. Общее содержание белка дает альтернативную ссылку на клеточную биомассу и может быть определено в небольшом масштабе, как описано в настоящем протоколе. Общее содержание белка на биомассу сухой клетки обычно находится в диапазоне от 40% до 50%, хотя точное значение зависит от условий роста 25 , 28 . Содержание хлорофилла а может быть легко определено и может быть использовано в качестве прокси к количеству клеток, присутствующим в образце. Однако хорошо известно, что количество хлорофилла a на клетку значительно изменяется в зависимости от условий роста, особенно в ответ на изменение концентраций питательных веществ и интенсивности света 29 .
Одним из существенных преимуществ представленной техники в отношении других методов является то, что она является высокоселективной. Протокол горячей кислоты и фенола и анализ композиции моносахаридов послеКислотный гидролиз являются относительно простыми методами и были использованы в предыдущих исследованиях 9 , 10 , 12 , 13 . Однако эти способы могут переоценить содержание гликогена, поскольку глюкоза глюкозы и дополнительные сахара могут способствовать измерению в зависимости от метода обнаружения углеводов 12 . Описанный метод избирательно обнаруживает глюкозу в гликогене. Он также может отличать глюкозу от целлюлозы, потому что α-амилаза и α-амилоглюкозидаза не гидролизуют β-связанные глюкозильные связи, присутствующие в целлюлозе. В предыдущих исследованиях ферментативный гидролиз гликогена выполнялся исключительно α-амилоглюкозидазой 7 , 27 . Включение эндо-действующей α-амилазы вместе с экзо-действующей α-амилоглюкозидазой, представленной в этом протоколе, может обеспечить tЭффективный гидролиз гликогена. Подобный избирательный гидролиз обычно применяется для обработки растительной биомассы, где комбинация α-амилазы -амилоглюкозидазы используется для гидролиза крахмала, не затрагивая другие глюкозосодержащие полисахариды, такие как целлюлоза 21 .
Основное ограничение техники заключается в том, что процедура является низкой пропускной способностью, поскольку отдельные образцы обрабатываются отдельно с использованием микроцентрифужных пробирок. Стадия осаждения гликогена является основным фактором, препятствующим более высокой пропускной способности. Реализация в качестве процедуры с высокой пропускной способностью потребует использования пластин с глубокими лунками и способности центрифугировать их с высокой скоростью (20 000 x g ). В то время как центрифуги, которые могут центрифугировать 96-луночные планшеты с необходимой скоростью, доступны, большинство пластин глубокой скважины не выдерживают силу более 6000 x g . Следовательно, тщательный выбор материалов необходим для адаптации протокола дляH-пропускной анализ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы признают, что Nordic Energy Research (AquaFEED, проект № 24), Innovationfonden Denmark (Pant Power, проект № 12-131844) и Villum Fonden (проект № 13363)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QSonica Sonicators Q700 | Qsonica, LLC | NA | QSonica |
| SpectraMax 190 Microplate Reader | Molecular Devices | NA | Eliza plate reader |
| Bullet Blender Storm | Next Advance | BBY24M-CE | Beads beater |
| Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spectrophotometer | Amersham Biosciences | NA | Spectrophotometer |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | Buffer |
| HCl | Merck | 1-00317 | pH adjutment |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | 32319 | Buffer |
| Amyloglycosidase (Rhizopus sp.) | Megazyme | E-AMGPU | Enzyme for glycogen depolymerization |
| α-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis) | Sigma-Aldrich | A3176 | Enzyme for glycogen depolymerization |
| D-Glucose | Merch | 8337 | Standard for the glucose assay |
| Pierce BCA Protein assay kit | Thermo Fisher scientific | 23225 | For determination of protein concentrations |
| Aluminum drying trays, disposable | VWR | 611-1362 | For determination of cell dry weights |
| D-Glucose assay kit (GODPOD format) | Megazyme | K-GLUC | For determination of glucose concentrations |
| Zirconium oxide breads, 0.15 mm | Next Advance | ZrOB015 | Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm |
| RINO tubes | Next Advance | NA | Tubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm |
References
- Chen, X., et al. The Entner-Doudoroff pathway is an overlooked glycolytic route in cyanobacteria and plants. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (19), 5441-5446 (2016).
- Yang, C., Hua, Q., Shimizu, K. Metabolic flux analysis in Synechocystis using isotope distribution from C-13-labeled glucose. Metab Eng. 4 (3), 202-216 (2002).
- Pelroy, R. A., Levine, G. A., Bassham, J. A. Kinetics of light-dark CO2 fixation and glucose assimilation by Aphanocapsa 6714. J Bacteriol. 128, 633-643 (1976).
- You, L., Berla, B., He, L., Pakrasi, H. B., Tang, Y. J. 13C-MFA delineates the photomixotrophic metabolism of Synechocystis. sp. PCC 6803 under light- and carbon-sufficient conditions. Biotechnol J. 9, 684-692 (2014).
- Jacobsen, J. H., Frigaard, N. U. Engineering of photosynthetic mannitol biosynthesis from CO2 in a cyanobacterium. Metab Eng. 21, 60-70 (2014).
- Möllers, K. B., Cannella, D., Jørgensen, H., Frigaard, N. -U. Cyanobacterial biomass as carbohydrate and nutrient feedstock for bioethanol production by yeast fermentation. Biotechnol Biofuels. 7, 64 (2014).
- Angermayr, S. A., et al. Culturing Synechocystis. sp. strain PCC 6803 with N2 and CO 2 in a diel regime reveals multiphase glycogen dynamics with low maintenance costs. Appl Environ Microbiol. 82, 4180-4189 (2016).
- de Porcellinis, A. J., et al. The Non-coding RNA Ncr0700/PmgR1 is required for photomixotrophic growth and the regulation of glycogen accumulation in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Plant Cell Physiol. 57 (10), 2091-2103 (2016).
- Sakuragi, Y. alpha-Tocopherol plays a role in photosynthesis and macronutrient homeostasis of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 that is independent of its antioxidant function. Plant Physiol. 141, 508-521 (2006).
- Osanai, T., et al. Positive regulation of sugar catabolic pathways in the cyanobacterium Synechocystis. sp. PCC 6803 by the group 2 sigma factor sigE. J Biol Chem. 280, 30653-30659 (2005).
- Yamauchi, Y., Kaniya, Y., Kaneko, Y., Hihara, Y. Physiological roles of the cyAbrB transcriptional regulator pair Sll0822 and Sll0359 in Synechocystis sp. strain PCC 6803. J Bacteriol. 193, 3702-3709 (2011).
- Dubois, M., Gilles, K., Hamilton, J., Rebers, P., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal Chem. 28, 350-356 (1956).
- Osanai, T., et al. Genetic engineering of group 2 {sigma} factor SigE widely activates expressions of sugar catabolic genes in Synechocystis species PCC 6803. J Biol Chem. 286, 30962-30971 (2011).
- Miao, X., Wu, Q., Wu, G., Zhao, N. Sucrose accumulation in salt-stressed cells of agp gene deletion-mutant in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. FEMS Microbiol Letters. 218, 71-77 (2003).
- Hagemann, M., Erdmann, N. Activation and pathway of glucosylglycerol synthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Microbiology. 140, 1427-1431 (1994).
- Nobles, D. R., Romanovicz, D. K., Brown, R. M. Cellulose in cyanobacteria. Origin of vascular plant cellulose synthase. Plant Physiol. 127, 529-542 (2001).
- Zhao, C., et al. High-yield production of extracellular type-I cellulose by the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002. Cell Discovery. 1, 15004 (2015).
- Kawano, Y., et al. Cellulose accumulation and a cellulose synthase gene are responsible for cell aggregation in the cyanobacterium Thermosynechococcus vulcanus RKN. Plant Cell Physiol. 52, 957-966 (2011).
- Angermayr, S. A., Gorchs Rovira, A., Hellingwerf, K. J. Metabolic engineering of cyanobacteria for the synthesis of commodity products. Trends Biotechnol. 33, 352-361 (2015).
- Zhang, B., Dhital, S., Gidley, M. J. Synergistic and antagonistic effects of α-amylase and amyloglucosidase on starch digestion. Biomacromolecules. 14, 1945-1954 (2013).
- Harholt, J., et al. ARABINAN DEFICIENT 1 is a putative arabinosyltransferase involved in biosynthesis of pectic arabinan in Arabidopsis. Plant Physiol. 140, 49-58 (2006).
- Fernando, C. D., Soysa, P. Optimized enzymatic colorimetric assay for determination of hydrogen peroxide (H2O2) scavenging activity of plant extracts. MethodsX. 2, 283-291 (2015).
- Jacobsen, J. H., Rosgaard, L., Sakuragi, Y., Frigaard, N. U. One-step plasmid construction for generation of knock-out mutants in cyanobacteria: studies of glycogen metabolism in Synechococcus sp PCC 7002. Photosynth Res. 107 (2), 215-221 (2011).
- Lichtenthaler, H. K. Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes. Methods Enzymol. 148, 350-382 (1987).
- López, C. V. G., del Carmen Cerón García, M., Fernández, F. G. A., Bustos, C. S., Chisti, Y., Sevilla, J. M. F. Protein measurements of microalgal and cyanobacterial biomass. Bioresource Technol. 101, 7587-7591 (2010).
- Hasunuma, T., et al. Dynamic metabolic profiling of cyanobacterial glycogen biosynthesis under conditions of nitrate depletion. J Exp Bot. 64, 2943-2954 (2013).
- Díaz-Troya, S., López-Maury, L., Sánchez-Riego, A. M., Roldán, M., Florencio, F. J. Redox regulation of glycogen biosynthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803: Analysis of the AGP and glycogen synthases. Molecular Plant. 7, 87-100 (2014).
- Parrott, L. M., Slater, J. H. The DNA, RNA and protein composition of the cyanobacterium Anacystis nidulans grown in light- and carbon dioxide-limited chemostats. Arch Microbiol. 127, 53-58 (1980).
- Hihara, Y., Kamei, A., Kanehisa, M., Kaplan, A., Ikeuchi, M. DNA microarray analysis of cyanobacterial gene expression during acclimation to high light. Plant Cell. 13, 793-806 (2001).
