Summary
מאמר זה מתאר תהליך עבור כוונון הצפיפות crosslinking ובגודל של covalently תפור חלקיקים מן ליניארית אחרים-פולימרים וסופולימרים המכיל פונקציונליות תליון. על-ידי התאמת הפרמטרים סינתזה (משקל מולקולרי פולימר, תליון פונקציונליות התאגדות, ושווי crosslinker), צפיפות crosslinking ובגודל הרצויים ננו-חלקיק יכולה להיות מושגת ליישומים משלוח סמים.
Abstract
אנו מתארים פרוטוקול לסינתזה של פוליאסטר ליניארי המכיל תליון epoxide והפונקציונליות שלהם השתלבות nanosponge עם ממדים מבוקרת. גישה זו מתחילה סינתזה של לקטון functionalized אשר היא המפתח functionalization תליון של הפולימר וכתוצאה מכך. Valerolactone (VL) ו- allyl-valerolactone (AVL) הם ואז copolymerized באמצעות פתיחת הטבעת הפילמור. פלמור שלאחר השינוי משמש לאחר מכן להתקין את moiety epoxide על חלק או כל הקבוצות allyl תליון. כימיה אפוקסי-אמין מועסק על טופס חלקיקים פתרון שתדללו של פולימר והן מולקולה קטנה diamine ב crosslinker בהתבסס על צפיפות crosslinking ובגודל nanosponge הרצוי. הגדלים Nanosponge יכולים להיות מאופיינת הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) הדמיה כדי לקבוע את הממדים ואת ההפצה. שיטה זו מספקת נתיב שבו קבוצה מאוד tunable ניתן ליצור חלקיקים tunable, אשר יכול לשמש לצורך כימוס סמים מולקולה קטנה. בשל אופיו של עמוד השדרה, החלקיקים הם hydrolytically ו enzymatically מתכלה לשחרור מבוקר של מגוון רחב של מולקולות קטנות הידרופובי.
Introduction
דווקא כוונון הצפיפות crosslinking ובגודל של חלקיקים המבוססת על crosslinking הבין-מולקולרי הוא בעל חשיבות רבה לחזור ולהשפיע על מדריך לפרופיל שחרור הסמים של אלה nanosystems1. Designing nanosponge tunability, דהיינו, הכנת חלקיקים של צפיפויות רשת שונים, הוא מסתמך על הפונקציונליות תליון של הפולימר קודמן ושווי של crosslinker הידרופיליות שילב. בגישה זו, הריכוז של קודמן, crosslinker של הממס חשוב טופס חלקיקים בגודל דיסקרטית ולא ג'ל בצובר. ניצול ספקטרוסקופיה כמותיים תהודה מגנטית גרעינית (NMR) כמו טכניקה אפיון מאפשר הקביעה מדויקת של משקל מולקולרי פולימר ופונקציונליות של תליון incorporated. ברגע חלקיקים נוצרים, הם יכולים להיות מרוכז, solubilized ב אורגניקס ללא בעל האופי של nanogel.
עבודה במשלוח סמים nanoparticle התמקדה השימוש פוליפוני (לקטית-co-חומצה גליקולית) (PLGA) התאספו עצמית חלקיקים2,3,4,5,6. PLGA יש קישורים אסתר מתכלה שהופכות אותו מתאים ליישומי משלוח סמים והוא משולב לעתים קרובות עם poly(ethylene glycol) (PEG) עקב שלה מאפיינים התגנבות7. עם זאת, בשל אופיו עצמית שהורכב היווצרות חלקיקים PLGA, לא solubilized החלקיקים ב אורגניקס עבור עוד יותר functionalization. בניגוד PLGA חלקיקים, השיטה המוצעת מספק crosslinking קוולנטיות ויוצרים של ננו-חלקיק עם גדלים מוגדרים, מורפולוגיה, אשר יציבים ב אורגניקס ולבזות פתרונות מימית1. היתרונות של גישה זו היכולת עוד יותר מבחינה כימית functionalize את פני השטח של nanosponge8, יציבותו של ממיסים אורגניים יכול לשמש עבור טעינת פוסט של החלקיקים עם תרכובות פרמצבטיות1,9. בשיטה זו, ומגעים הידרופובי מולקולות קטנות יכולה להיות מושגת על ידי משקעים לתוך המדיה מימית. Hydrophobicity של עמוד השדרה פוליאסטר יחד עם crosslinker קצר הידרופילית נותן החלקיקים תו אמורפי בטמפרטורת הגוף. יתר על כן, לאחר סמים טעינה, החלקיק יכול יוצרות המתלים בסדר בתקשורת מימית להיות מוזרק בקלות בתוך vivo. זוהי מטרתנו בעבודה זו להעריך את הפרמטרים עבור הסינתזה של אלה nanosponges פוליאסטר ולקבוע את אלה אשר לתדרוך עיצוב, שליטה על גודל של מורפולוגיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להעריך את הקשר בין פרמטרים סינתזה של nanosponge גודלו תוצאות, חשוב ריכוז ותליון הפונקציונליות של כל קודמן פולימר. איור 1, ערכת successfulsynthetic של nanosponges מבוצעת בתנאים ריפלוקס לאחר שילוב שני קודמן פולימרים וחומרים diamine ב crosslinker ב- DCM במשך 12 שעות. הריכוז של epoxides בפתרון חיוני גם ויוצרים חלקיקים בדידים. ברגע nanosponges היו מסונתז, TEM הדמיה שימש לקבוע את מידות מדויקות של ערכה של חלקיקים. איור 2, אוסף של ניסויים שונים nanosponge נותחו בהתבסס על שלהם פולימר קודמן משקל מולקולרי ותליון פונקציונליות התאגדות כדי לקבוע אם מערכת יחסים בין השני יכולה להיות השפעה על גודל nanosponge. איור 2, מגמה של הגדלת גודל החלקיקים נתפסת כמו משקל מולקולרי הוא גדל על התאגדות EVL 6% והן 8% עם אחד diamine ב crosslinker לכל epoxide (2 אמינים לכל epoxide).
איור 3 מראה הגדלת אחוז epoxide והן crosslinker מקבילות שיש השפעה דומה תוך שמירה על משקל מולקולרי דומה בין קבוצות nanosponge. שוב, נראה מגמה להגדיל את גודל nanosponge תוך כדי לשנות פרמטרים אלה. חשוב להבין איך הסינתזה של פולימר מבשרי יכול לשחק תפקיד חיוני בגודל ננו-חלקיק הנובעת לכוון בדיוק nanosponges ליישומים שונים. חשוב גם לשמור על שיטה אמינה הדירים סינתזה nanosponge אשר יש סטיות קטנות בין גודל חלקיקים בודדים, כפי שמוצג באיור 4. על ידי ניצול פרמטרים אלה, במגוון של גדלים, נוסחה באופן אמין מתרבה nanosponge בגודל מסוים ניתן לפתח עבור יישום נתון או הרצוי המטרה, שמוכיחים זאת כימיה nanosponge צדדי ומעשי.
איור 1: התגובה שיטת סינתזה Nanosponge. קופולימר פוליאסטר ליניארי המכיל קבוצות פונקציונליות allyl ו- epoxide תליון הגיבו crosslinker diamine ב כדי ליצור חלקיקים דיסקרטית עם מידות גודל של-100 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: ניתוח של Nanosponge Tunability מבוסס על משקל מולקולרי ופונקציונליות תליון. על-ידי הערכת השינוי בגודל nanosponge מבוסס על משקל מולקולרי של הפולימר קודמן ולהשאיר את הפונקציונליות תליון יחסית זהה, עלייה גודל החלקיקים כמו עליות משקל מולקולרי ניתן להראות על פולימרים EVL 6% ו- 8%. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: ניתוח של Nanosponge Tunability Crosslinker, תליון פונקציונליות Equivalencies. על-ידי החזקת את crosslinker המקביל יציב, תליון פונקציונליות גבוהה יותר תגרום ההתאגדות crosslinker גבוהה יותר. באיור זה, נוספו ארבעה אמינים לכל epoxide (שני diamine ב crosslinker מקבילות לכל epoxide) פולימר EVL 6% והן 10%. ככל crosslinker יותר הוא שולב את nanosponge בגלל epoxides יותר לכל פולימר ושווי crosslinker גבוה יותר, מגדיל הגודל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: תמונת TEM של Nanosponges. תמונת TEM של חלקיקים covalently מקושר נוצר במהלך הסינתזה. ציין גודל 79 ± 12 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
קבלת nanosponge לשחזור גדלים חיוני ביישומים משלוח סמים. פרמטרים מרובים בסינתזה פלמור, nanosponge משפיעות על הצפיפות crosslink ובגודל של החלקיק וכתוצאה מכך. שלושה פרמטרים חשובים זוהו בניתוח שלנו: משקל מולקולרי פולימר, פונקציונליות תליון epoxide ו- crosslinker מקבילות. על מנת לייצר מגוון רחב של משקולות מולקולרית ופונקציונליות epoxide של סינתזה nanosponge, סטויכיומטריה של VL -co -AVL קופולימר חייב להשתנות. הריכוז של הקבוצה הפונקציונלית allyl במהלך epoxidation של קופולימר יכול להיות נהגה epoxidize אחוז הרצוי של allyls או כולם. אם נעשה שימוש עודף של חמצון הסוכן, השפלה של שרשרת הפולימר יכולה להתרחש; עם זאת, זה ניתן לתקן על ידי הפחתת כמות סוכן חמצון. כאשר allyls כל epoxidized, יש allyls תליון אין על פני nanosponge עבור עוד יותר functionalization. חשוב גם עבור סינתזה nanosponge הריכוז של epoxide ב פתרון nanosponge סינתזה היא 0.0054 M.
התגובה nanosponge יוערכו בעבר כדי לקבוע על ריכוז אופטימלי עבור טווחים בגודל הרצוי nanosponge13. ריכוז זה מחושב בהתבסס על ערך יחידה חוזרת עבור הפונקציונליות epoxide ב הפולימר. היחידה חוזרת היא המשקל של פולימר ליחידה תגובתי אחד, אשר נמצא בשימוש כדי לחשב את השומות של יחידות תגובתי פולימר אחד. לדוגמה, כפי שמוצג להלן, אם פולימר עם משקל מולקולרי של 2,000 גרם/מול מכיל 10 תגובתי יחידות מונומר (RMU) הנושאת תליון פונקציונליות, נקבע על ידי NMR כמותית, תגובתי היחידה של הפולימר היא 200 גרם/מול RMU. באמצעות ערך זה, השומות של יחידות תגובתי ניתן לחשב את המשקל פולימר כדי לקבוע crosslinker equivalencies של nanosponge סינתזה.
כמו מגמה כללית, הגדלת משקל מולקולרי פולימר והן פונקציונליות epoxide תרם לגודל nanosponge מוגברת באופן עצמאי. Polydispersity צר משיגה התפלגות גודל nanosponge צר (~ סטיית תקן של 10%) ומשפר את הפארמצבטית של סינתזה nanosponge.
הגישה הציג משיגה dispersity פולימר צרים על ידי שימוש פח זרז triflate14. Equivalencies crosslinking מחושבות על בסיס אמין לכל epoxide מקבילות, עלייה crosslinker מקבילות מוצג כדי להגדיל את גודל nanosponge. עם זאת, שימוש עודף של crosslinker חשוב בשל המטרה של צריכת כל epoxides זמין. הנותרים amine פונקציונליות על פני השטח nanosponge יכול לשמש עבור עוד יותר functionalization של פני השטח של חלקיקים.
לעומת שיטות קונבנציונליות להכנת ננו-חלקיק, היתרונות בגישה זו הם הפרמטרים מרובים לפי גודל מדויק שבו צפיפות שליטה יכולה להיות מושגת, היכולת עוד יותר functionalize פני השטח של nanosponge, המסיסות ב אורגניקס לצורך כימוס סמים הידרופובי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
LK הוא אסיר תודה על מימון הלאומית למדע קרן מחקר מלגת לימודים לתואר שני (DGE-1445197), מחלקת כימיה אוניברסיטת ונדרבילט. LK, EH רוצה להודות את המימון עבור כלי אוסיריס TEM (NSF EPS 1004083).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2'-(Ethylenedioxy)bis(ethylamine) | Sigma-Aldrich | 385506-100ML | |
| 3-methyl-1-butanol | Sigma-Aldrich | 309435-100ML | anhydrous, ≥99% |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124-4L | |
| Allyl bromide | Sigma-Aldrich | A29585-5G | ≥99% |
| Ammonium chloride | Fisher Scientific | A661-500 | saturated solution in DI water |
| Cell culture water | Sigma-Aldrich | W3500-500ML | Filtered through 0.45 μm syringe filter |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997-100ML | anhydrous, ≥99%, contains 40 - 150 ppm amylene as stabilizer |
| Ethyl Acetate | Fisher Scientific | E145SK-4 | |
| EZFlow 0.2 μm Syringe Filter | Foxx Life Sciences | 386-2116-OEM | Hydrophillic PTFE, 13 mm |
| EZFlow 0.45 μm Syringe Filter | Foxx Life Sciences | 386-3126-OEM | Hydrophillic PTFE, 25 mm |
| Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Test Tubes with Plain End | Fisher Scientific | 14-961-31 | |
| Fisherbrand Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-666-318 | 1.5 mL |
| Hamilton Microliter Syringe, 100 μL | Hamilton Company | 80600 | Model 710 N SYR, Cemented NDL, 22s ga, 2 in, point style 2 |
| Hexamethylphosphoramide | Sigma-Aldrich | H11602-100G | ≥99%, contains ≤1,000 ppm propylene oxide as stabilizer |
| Hexanes | Fisher Scientific | H292-4 | |
| Magnesium sulfate anhydrous | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Meta-chloroperoxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 273031-100G | Purified to ≥99% by buffer wash |
| Methanol (MeOH) | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | anhydrous, ≥99% |
| N-butyllithium solution | Sigma-Aldrich | 230707-100ML | 2.5 M in hexanes |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma-Aldrich | 550043-500ML | ≥99% |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| PELCO Pro Reverse (Self-Closing) Tweezers | Ted Pella, Inc. | 5375-NM | |
| Phosphotungstic acid hydrate | Alfa Aesar | 40116 | |
| Q55 Sonicator | Qsonica | Q55-110 | 55 Watts, 20 kHz |
| SiliaMetS Cysteine | Silicycle | R80530B-10g | |
| SnakeSkin Dialysis Clips | Thermo Scientific | 68011 | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCO | Thermo Scientific | 68100 | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | 5233-500 | saturated solution in DI water |
| TEM grid | Ted Pella, Inc. | 01822-F | Ultrathin Carbon Type-A, 400 mesh, Copper, approx. grid hole size: 42 µm |
| Tetrahydrofuran (THF) | Sigma-Aldrich | 401757-1L | Anhydrous, ≥99.9%, inhibitor-free |
| Tin(II) trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich | 388122-1G | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Whatman Filter Paper, Grade 1 | Fisher Scientific | 09-805H | Circles, 185 mm |
| δ-valerolactone | Sigma-Aldrich | 389579-100ML | Purified by vacuum distillation |
References
- van der Ende, A. E., Sathiyakumar, V., Diaz, R., Hallahan, D. E., Harth, E. Linear release nanoparticle devices for advanced targeted cancer therapies with increased efficacy. Polym Chem. 1 (1), 93 (2010).
- Sharma, S., Parmar, A., Kori, S., Sandhir, R. PLGA-based nanoparticles: A new paradigm in biomedical applications. Trends Anal Chem. 80, 30-40 (2016).
- Cao, L. B., Zeng, S., Zhao, W. Highly Stable PEGylated Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) Nanoparticles for the Effective Delivery of Docetaxel in Prostate Cancers. Nanoscale Res Lett. 11 (1), 305 (2016).
- Chelopo, M. P., Kalombo, L., Wesley-Smith, J., Grobler, A., Hayeshi, R. The fabrication and characterization of a PLGA nanoparticle-Pheroid® combined drug delivery system. J Mater Sci. 52 (6), 3133-3145 (2016).
- Guan, Q., et al. Preparation, in vitro and in vivo evaluation of mPEG-PLGA nanoparticles co-loaded with syringopicroside and hydroxytyrosol. J Mater Sci Mater Med. 27 (2), 24 (2016).
- Cannava, C., et al. Nanospheres based on PLGA/amphiphilic cyclodextrin assemblies as potential enhancers of Methylene Blue neuroprotective effect. RSC Adv. 6, 16720-16729 (2016).
- Locatelli, E., Franchini, M. C. Biodegradable PLGA-b-PEG polymeric nanoparticles: synthesis, properties, and nanomedical applications as drug delivery system. J Nanopart Res. 14 (12), (2012).
- van der Ende, A. E., Croce, T., Hamilton, S., Sathiyakumar, V., Harth, E. M. Tailored polyester nanoparticles: post-modification with dendritic transporter and targeting units via reductive amination and thiol-ene chemistry. Soft Matter. 5 (7), 1417 (2009).
- Lockhart, J. N., Stevens, D. M., Beezer, D. B., Kravitz, A., Harth, E. M. Dual drug delivery of tamoxifen and quercetin: Regulated metabolism for anticancer treatment with nanosponges. J Control Release. 220 (Pt. B), 751-757 (2015).
- Shriner, R. L., Hermann, C. K. F., Morrill, T. C., Curtin, D. Y., Fuson, R. C. The Systematic Identification of Organic Compounds. , 8th ed, Wiley. (2004).
- Derome, A. E. Modern NMR Techniques for Chemistry Research. , Pergamon Press. (1987).
- Williams, D. B., Barry Carter, C. Transmission Electron Microscopy: A Textbook for Materials Science. , 2nd ed, Springer. (2009).
- van der Ende, A. E., Kravitz, E. J., Harth, E. M. Approach to Formation of Multifunctional Polyester Particles in Controlled Nanoscopic Dimensions. J Am Chem. Soc. 130 (27), 8706-8713 (2008).
- Stevens, D. M., Watson, H. A., LeBlanc, M. A., Wang, R. Y., Chou, J., Bauer, W. S., Harth, E. M. Practical polymerization of functionalized lactones and carbonates with Sn(OTf)2 in metal catalysed ring- opening polymerization methods. Polym Chem. 4, 2470-2474 (2013).
