Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

De aorta Ring mede cultuur Assay: Een handig hulpmiddel om te beoordelen van het potentieel van de Angiogenic van mesenchymale stromale cellen In Vitro

Published: September 18, 2017 doi: 10.3791/56083
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2,3,4,5
1Create Fertility Centre, 2Department of Physiology, University of Toronto, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 4Department of Medical Sciences, University of Toronto, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Women's College Hospital

Summary

Hier presenteren we een nieuwe toepassing van de bepaling van de aorta ring waar prelabelled mesenchymale cellen zijn mede gekweekte met rat aorta afkomstige endothelial netwerken. Deze nieuwe methode kunt visualisatie van mesenchymale stromale cellen (MSCs) homing en integratie met endothelial netwerken, kwantificering van netwerkeigenschappen en evaluatie van MSC immunophenotypes en gen-expressie.

Abstract

Angiogenese is een complexe, sterk gereguleerde proces dat verantwoordelijk is voor de verlening en de handhaving van adequate weefsel perfusie. Onvoldoende therapieën onderhoud en pathologische misvormingen kunnen leiden tot ernstige ischemische ziekten, terwijl al te overvloedige vasculaire ontwikkeling geassocieerd met kanker en inflammatoire aandoeningen wordt. Een veelbelovende vorm van pro-angiogenic therapie is het gebruik van angiogenic cel broncodes, welke regelgevende factoren evenals fysieke ondersteuning bieden kan voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën.

Mesenchymale stromale cellen (MSCs) zijn uitgebreid onderzochte kandidaten voor vasculaire regeneratie als gevolg van de effecten van hun paracrine en hun vermogen op te sporen en de thuisbasis van ischemische of ontstoken weefsels. In het bijzonder, eerste trimester menselijke navelstreng gerelateerde cellen (FTM HUCPVCs) zijn een zeer veelbelovende kandidaat als gevolg van hun pericyte-achtige eigenschappen, hoge proliferatieve en multilineage potentieel immuun-bevoorrechte eigenschappen en robuuste paracrine Profiel. Om te kunnen beoordelen effectief angiogenic regeneratieve cellen, is het een vereiste om hen in betrouwbare en 'vertaalbare ' redactionele preklinische testen te testen. De bepaling van de aorta ring is een ex vivo angiogenese model dat zorgt voor gemakkelijk kwantificeren van de tubulaire endothelial structuren, biedt accessoire ondersteunende cellen en extracellulaire matrix (ECM) van de host, uitsluit van inflammatoire componenten en is snel en goedkoop op te zetten. Dit is voordelig in vergelijking met in vivo modellen (bijvoorbeeld, hoornvlies assay, Matrigel plug assay); de aorta ring test kan volgen van de door de overheid gereguleerde cellen en intercellulaire interacties observeren terwijl het vermijden van xeno-immuun afwijzing.

Presenteren we een protocol voor een nieuwe toepassing van de bepaling van de aorta ring, waarin menselijke MSCs in co culturen met ontwikkelingslanden rat aorta endothelial netwerken. Deze bepaling voorziet in de analyse van de bijdrage van de MSC aan tube vorming en ontwikkeling door middel van fysieke pericyte-achtige interacties en van hun potentie voor het actief migreren naar sites van angiogenese, en voor de evaluatie van hun vermogen uit te voeren en bemiddelen ECM verwerking. Dit protocol bevat verdere informatie over wijzigingen in MSC fenotype en gen-expressie na co cultuur.

Introduction

Het complexe proces van angiogenese verbetert en onderhoudt perfusie van het weefsel door het stimuleren van nieuw bloed vaartuig ontwikkeling van reeds bestaande therapieën1. Het is een stevig gereglementeerde, evenwichtige proces door pro-angiogenic en anti-angiogenic factoren. Elke tekortkoming in dit systeem kan leiden tot onvoldoende schip onderhoud of groei, waardoor ernstige ischemische ziekten met inbegrip van het myocard en vaatziekten, beroerte en neurodegeneratieve aandoeningen. Echter is overdreven vasculaire ontwikkeling kenmerkend voor aandoeningen zoals kanker en inflammatoire aandoeningen,2.

Het ontwikkelen van therapieën die gericht zijn op het bepalen van de angiogenese om gunstige weefselregeneratie is van cruciaal belang. Ondanks uitgebreide preklinische en klinische onderzoeken, zijn pogingen ter stimulering van de angiogenese met behulp van pro-angiogenic factoren en microRNAs mislukt om de gewenste resultaten3,4,5. Mogelijke redenen voor de tijdelijke effecten omvatten: beperkte levensduur van angiogenic proteïnen en nucleïnezuren, en het eindige aantal gerichte groeifactoren6,7. Hoewel oplosbaar angiogenic factoren essentieel zijn voor het initiëren van angiogenese, afhankelijk het onderhoud en de functionaliteit van therapieën van ondersteuning van celtypen, met inbegrip van pericytes en gladde spier cellen8. Het gebied van pro-angiogenic therapieën onderzoekt nu potentiële stamcellen en progenitor cel bronnen waarmee angiogenic factoren lokaal, terwijl het fysiek ondersteunen van nieuw ontwikkelde therapieën, zelf vernieuwen of zelfs differentiëren in Endotheel-achtige cellen9,10. Het vinden van de optimale angiogenic celtypes met het vermogen om te voldoen aan deze functionele eisen houdt een grote belofte voor ischemische weefselregeneratie.

Om met succes vertalen potentiële cel-gebaseerde therapieën in de klinische proeven, moeten pre-klinische studies hun doelmatigheid aan te tonen en markeer de onderliggende mechanismen van de angiogenic. Ondanks het grote aantal gevestigde angiogenese testen, ontbreekt het veld een "gouden standaard" in vitro -assay die betrouwbaar kunt het evalueren van de werkzaamheid van potentiële kandidaat-cel typen11,12, 13. meeste in vitro angiogenese testen (met inbegrip van het endotheel proliferatie, migratie en buis vorming testen) meestal beoordelen de effecten van cellen of verbindingen op de endotheliale cellen phenotypical wijzigingen of differentiatie in buisvormige en netwerk structuren14,15. Terwijl deze functies essentieel voor angiogenese zijn, een 'vertaalbare ' redactionele assay ook moet evalueren: 1) de vergroting of de vervanging van de ondersteunende celtypen, met inbegrip van pericytes of zachte spiercellen, 2) de verwerking van ECM en/of kelder membraan, en 3). de efficiëntie ter bevordering van de vorming van functionele microvasculature. In vivo angiogenese-modellen, met inbegrip van de cornea assay en Matrigel plug assay, de unieke in-vivo -communicatie recapituleren maar worden uitgedaagd door de moeilijkheid van tracking toegediend cellen te observeren van de fysieke interacties. Bovendien, in in-vivo modellen, xeno-immuun afwijzing kan optreden tijdens het testen van potentiële allogene cel therapie kandidaten16. Ex vivo angiogenese-modellen, met name de bepaling van de aorta ring kan bieden: 1) gemakkelijk observatie en kwantificering van buisvormige structuren, 2) accessoire ondersteunende cellen, 3) ECM van host en kunstmatige leveringen, 4) uitsluiting van inflammatoire onderdelen en 5) snelle en goedkope setup17,18. Typisch, de aorta ring test kunt testen het angiogenic potentieel van kleine secretoire eiwitten, farmacologische agenten en transgene knaagdieren modellen19,20,21.

MSCs zijn veelbelovende kandidaten voor vasculaire regeneratie voornamelijk via hun paracrine-gemedieerde effecten22,23,24. MSCs is aangetoond dat ze afscheiden van belangrijke angiogenic factoren, met inbegrip van vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), Hepatocyte Growth Factor (HGF), insuline-like Growth Factor-1 (IGF-1), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) en angiopoeitin-1 (Ang-1)25 ,26. MSCs kunnen ook detecteren en thuisbasis van ischemische of ontstoken weefsels, echter, de precieze mechanismen zijn nog onderzocht. In toenemende mate ondersteunt de literatuur de hypothese dat de meeste MSCs uit gerelateerde cellen voortvloeien, mede express pericyte markeringen en zich zoals pericytes27 gedragen kunnen. HUCPVCs zijn een jonge bron van MSCs afgeleid van de gerelateerde regio van de menselijke navelstreng. Zij vertegenwoordigen een bevolking van MSCs met pericyte-achtige eigenschappen en van FTM zowel term umbilical koorden gekenmerkt. FTM HUCPVCs tonen een hoge expressie van pericyte markers, met inbegrip van CD146 en NG2, hoge proliferatieve en multilineage potentieel, immuun-bevoorrechte eigenschappen, en een robuuste paracrine profiel28weer te geven. FTM HUCPVCs zijn een ideale kandidaat celtype ter bevordering van de regeneratie van de gewonde weefsel door het bevorderen van nieuwe therapieën via hun pericyte-achtige eigenschappen.

Om te testen het angiogenic potentieel en de pericyte-achtige eigenschappen van menselijke MSCs, zijn een zeer beperkt aantal angiogenese testen beschikbaar wanneer positieve angiotropic migratie (hierna te noemen "homing"), ECM, verwerking en ontwikkeling van fysieke interacties tussen celtypes kunnen worden onderzocht, terwijl het verkrijgen van kwantitatieve gegevens over de ontwikkeling van de microvasculature.

Hierbij presenteren wij een protocol dat wordt een nieuwe toepassing van de aorta ring test beschreven. Menselijke MSCs waren mede gekweekte met ontwikkelingslanden rat afkomstige aorta endothelial netwerken te beoordelen op hun bijdrage aan de vorming, rijping en homeostase buis. Deze versie van de aorta ring assay beoordeelt het vermogen en de potentie van cel therapie kandidaten home naar sites van angiogenese, voeren en bemiddelen van ECM verwerking, en bijdragen aan endothelial buisvormige ontwikkeling door middel van vaststelling van pericyte-achtige lichamelijke interacties. Naast het kwantificeren van het netto-effect van MSCs op in vitro endothelial netwerk vorming en observeren intercellulaire interacties, wij ook geoptimaliseerd een protocol om te isoleren MSCs uit co culturen. Door het uitvoeren van cytometry van de stroom- en qPCR, is het mogelijk om te karakteriseren wijzigingen in MSC fenotype en gen-expressie na co cultuur. Als model celtypes, vergeleken we ontogenetisch vroeg (prenatale) en eind (volwassen) bronnen van menselijke MSCs: FTM HUCPVCs en menselijke beenmerg-afgeleide MSCs (BMSC), respectievelijk in de aorta ring test. Wij stellen voor dat de bepaling van de aorta ring kan worden gebruikt om te studeren het angiogenic potentieel van elk fysiek ondersteunende celtype wanneer onderzochte voor regeneratieve toepassingen van de angiogenic.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

alle studies waarbij dieren werden uitgevoerd en gerapporteerd overeenkomstig ARRIVE richtsnoeren 29. Alle studies werden uitgevoerd met institutioneel onderzoek ethiek bestuur goedkeuring (REB nummer 4276). Alle dier procedures werden goedgekeurd door het Comité zorg dier van het University Health Network (Toronto, Canada), en alle dieren ontvangen humane zorg met inachtneming van de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, 8 th edition) Nationale instituten van gezondheid 2011).

1. aorta Ring Assay Setup

  1. isolaat de rat aorta.
    1. Euthanaseren 8 - 10 weken oude Sprague-Dawley ratten met behulp van CO 2 stikken: Set CO 2 kamers tot 20% gas vervanging (debiet = 0,2 x kamer volume/min). Bevestigen door de afwezigheid van snuifje reflex en hart beats door de Palperende borst.
    2. Natte vacht op de borst gebied met gesteriliseerd gaas met 70% ethanol. Gesteriliseerde pincet en schaar gebruik te maken van een sneetje in de borst middellijn en dwars door lagen van de huid en spier.
    3. Zodra de ribbenkast is blootgesteld, knip de ribbenkast aan weerskanten en vouw naar boven ongeveer 5 mm van het borstbeen aan elke kant. Sommige bloeden wordt verwacht van intercostale slagaders in verse kadavers.
    4. Duwen het longweefsel en het hart naar de anatomische rechterzijde naar de aorta bloot. De aorta is de witte gekleurde vaartuig gelegen grenzend aan de wervelkolom.
    5. Gebruik pincet te knijpen van de aorta (na de aortaboog) en chirurgische schaar gebruik te maken van de eerste snede terwijl de aorta met een tang. Bij het snijden van de aorta, de borstholte zal snel vullen met bloed, daarom is het essentieel om snel om te verkrijgen van de aorta vóór de bloedstolling.
    6. Gebruik pincet te houden van de aorta en schil voorzichtig de aorta naar beneden, weg van de wervelkolom. De trek zal de intercostale slagaders zonder verdere insnijdingen verbreken. Ongeveer 10 cm van weefsel en/of verkrijgen voordat de aorta verdeeld in twee takken in de buikholte en snijd de aorta uit het karkas. Druk op het middenrif als nodig om de caudal richting te krijgen toegang tot de lagere delen van de aorta.
      Opmerking: Schil de aorta voorzichtig omdat intens kracht kan daardoor te scheuren. Als de tranen van de aorta, toestaan bloedstolling voor een paar seconden en gebruik van een papieren handdoek te verwijderen van het gestold bloed, waardoor de zichtbaarheid van de resterende aorta.
    7. Plaatst de aorta in een tube van 15 mL met 10 mL ijskoud Hank ' s evenwichtig zout oplossing (HBSS) aangevuld met 1% penicilline/streptomycine (P/S). Houd de buizen op ice.
      Opmerking: De aorta weefsel kan duren 1-2 h op ijs maar het is best om het zo snel mogelijk verwerken.
  2. Bereiden de aorta ring assay voedingsbodems in een steriele bioveiligheid kabinet (BSC).
    1. Voorbereiden het endotheel groeimedium (BAVA) met behulp van een filtratie-eenheid voor het filteren van 500 mL Endothelial basaal Medium (EBM) aangevuld met 2% foetale boviene Serum (FBS), 1% gentamicine en groeifactoren (Zie Tabel van materialen). Breng 50 mL van de gefilterde media in een kraal of water bad op 37 ° C.
    2. Gebruiken een andere filtratie eenheid voor het filteren van 100 mL van EBM aangevuld met 2% FBS en 1% P/S tot bereid de EBM 2% FBS (EBM-FBS) en bewaren bij 4 ° C.
  3. 12-well weefselkweek platen met basale membraan Extract (BMT) jas tijdens het werken op het ijs.
    1. Plaats een 12-well-plaat op een koud oppervlak (grote zak ijs of lade). Voeg 200 µL per putje van het gebruik van vers ontdooid BME gekoeld Pipetteer tips en swirl de BMT om ervoor te zorgen zelfs coating. Werk snel om te voorkomen dat ongelijke polymerisatie van de BMT.
      Opmerking: Een typische aorta excisie levert 20 aorta ringen. Ter verantwoording voor de variabiliteit tussen de aorta ring testen, ten minste drie aorta ring testen per behandeling groep instellen en een besturingselement bevatten. Als de bron toelaat, 6 ringen per groep van de behandeling is het raadzaam.
    2. Plaatst de gecoate platen in bevochtigde incubators (37 ° C, relatieve vochtigheid van 95%, 5% CO 2; deze voorwaarden van toepassing op alle bevochtigde incubator stappen hierna) voor 30 min. plaats 1.000 µL Pipetteer tips terug in-20 ° C voor stap 1.5.3.
      Opmerking: Terwijl het basale membraan extract in voorraad concentratie wordt gebruikt, de samenhang en de stijfheid wordt strikt gecontroleerd door de polymerisatie-tijd. Zorg ervoor om te houden van de exacte dezelfde polymerisatie tijden voor alle parallellen en onafhankelijke experimenten.
  4. Sectie van de aorta in uniforme ringen.
    1. Neem de aorta uit de buis 15 mL en plaats het in een 10 cm schotel met 10 mL verse HBSS aangevuld met 1% P/S.
    2. Gebruiken twee sets van de verlostang om te scheiden zorgvuldig de overtollige bindweefsel, vetweefsel en gebruik een scalpel voor de resterende takken van de intercostale slagaders op de aorta aangesloten. Dit vermindert de variabiliteit tussen de ring projectoren op basis van verschillende niveaus van het resterende weefsel. Verwijder eventuele resterende gecoaguleerd bloed van binnenkant van de aorta.
    3. Plaats een liniaal of een raster onder de 10 cm schotel precies snijden 1-2 mm brede lagen van de aorta met steriel scalpel en pincet. Snijd de secties zo nauwkeurig mogelijk reduceren van variabiliteit tussen eenheden.
  5. De aorta ringen insluiten in BME.
    Opmerking: Als het segmenteren van aorta ringen is niet voltooid vóór BME polymerisatie incubatie, verwijder de gecoate platen uit bevochtigde starterscentra en voeg 100 µL van EBM aan elk putje te beëindigen van de polymerisatie. Exacte timing is van cruciaal belang als overmatige polymerisatie van BME met de endothelial netwerk ontwikkeling en cel migratie interfereren kan. Zodra de aorta ringen zijn voorbereid, verwijdert u de EBM de putjes en verder vanaf stap 1.5.2.
    1. De BME gecoat putten uit de bevochtigde incubators verwijderen en terugkeren naar het Comité voor Bankentoezicht.
    2. Zorgvuldig halen individuele aorta ringen met een tang en plaats een in het midden van elk putje BME-gecoat. Herhaal dit voor de resterende aorta ringen.
      Opmerking: Media overgedragen samen met de aorta ring moet worden bewaard teneinde polymerisatie onregelmatigheden minimale.
    3. Gebruik gekoeld (-20 ° C) 1.000 µL Pipetteer tips om Voeg 300 µL van BMT bovenop elke aorta ring en verdeel de BMT naast de waterput.
    4. De ingesloten aorta ringen tot de bevochtigde incubators voor 30 min. terug
    5. Verwijderen van de platen met de ingesloten aorta ring uit de bevochtigde incubators en voeg langzaam 1.000 µL van BAVA (bereid en verwarmde op stap 1.2.1) door het plaatsen van de pipet tip tegen de muur van de cultuur goed.
      Opmerking: Direct pipetteren de media op de BMT kan verstoren de gepolymeriseerde BMT en continu endothelial netwerk ontwikkeling belemmeren. Gebruik een passende meerkanaalspipet indien beschikbaar.
    6. Na 24 h, 1.000 µL van BAVA verwijderen en te vervangen met 1.000 µL van EBM-FBS bereid in stap 1.2.2, opnieuw door langzaam pipetteren tegen de zijkant van de cultuur goed.
  6. De aorta ring bepaling handhaven door te vervangen door 500 µL van EBM-FBS 500 µL van verse EBM-FBS (37 ° C) elke 48 h.
    Opmerking: Zie section 2 om te beginnen met de uitbreiding van de cultuur MSC op dezelfde dag als de aorta ring assay vestiging. Dit zal ervoor zorgen dat MSCs klaar voor co cultuur wanneer het endotheel netwerken klaar zijn.
  7. Gebruiken de heldere veld microscopie te volgen van de ontwikkeling van het endotheel netwerk van de assay van aorta ring (Zie Figuur 1 als referentie voor de ontwikkeling van optimale netwerk). Zodra het endotheel netwerken aspect zoals afgebeeld in Figuur 2 is, gaat u verder met het opzetten van de aorta ring assay-MSC co culturen (sectie 3). Verwijzen naar stap 4.1 voor meer informatie van het endotheel netwerken imaging.

2. Weefselkweek

  1. voorraadoplossingen van het voorbereiden van weefselkweek media.
    1. Cultuur FTM HUCPVCs (eerder gevestigde, n ≥ 3 onafhankelijke lijnen voor elk) 30 en verkrijgbare BMSCs in alpha-MEM aangevuld met 10% FBS en 1% P/S.
    2. De media met behulp van 0,2 µm porie-grootte filter flessen steriliseren.
    3. Slaan de bereid mediaoplossingen bij 4 ° C voor maximaal 3 weken.
  2. Handhaven FTM HUCPVC en BMSC culturen in bevochtigde voorbroeders en doorsnede(n) ter 70-80% confluentie bepaald door de fase contrast microscopie. Gebruik geschikte volumes van media voor de grootte van weefselkweek schotel gebruikt (dat wil zeggen 10 mL in een 10 cm schotel). Gebruiksvoorwaarden van deze cultuur voor het behoud en de MSCs passaging.
  3. Distantiëren de MSC monolayers voor passaging of aorta ring assay-MSC mede culturen met behulp van een dissociatie enzym oplossing (4 mL/10 cm schotel) en broeden in de bevochtigde incubators voor 3 min. Zorg ervoor detachement van de cellen met behulp van lichte veld microscopie; broeden voor een extra 1-2 min desgewenst.
  4. Transfer van de gedissocieerde cellen in een tube van 15 mL en centrifuge bij 400 x g gedurende 5 min.
  5. Gecombineerd de bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de cel pellet en resuspendeer de cellen in 1 mL van een geschikte kweekmedia (alpha-MEM volledige media voor passaging van cellen of EBM-FBS voor aorta ring assay/MSC co culturen) voor het tellen van de met behulp van een cel counter.

3. Voorbereiding van de aorta Ring Assay/MSC co culturen

  1. zaad 10 4 MSCs op elk ingesloten aorta ring (9.000 cellen/cm 2 / 12-well-plate). Op basis van het aantal aorta ring testen, vlek vooraf de MSCs met levensvatbare, niet-overdraagbaar fluorescente kleurstof. Ten minste drie putten van aorta ringen zonder MSCs voor een groep besturingselementen handhaven.
    1. 10 5 MSCs/mL EBM-FBS media vlek, voeg 2.5 µL van levensvatbare, niet-overdraagbaar fluorescerende kleurstof/mL media (5 µM) in een tube van 15 mL en de plaats in de bevochtigde incubator voor 30 min. zachtjes Meng de buis halverwege de incubatie.
    2. Volgende de 30 min incubatie, 1 deel vers EBM-FBS aan de gekleurde cellen toevoegen en bij 400 x g gedurende 5 min. draaien
    3. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cel pellet in 1 mL van EBM-FBS media. Bevestig succesvolle kleuring van de MSCs met behulp van fluorescentie microscopie.
  2. Verwijderen van de aorta ring-bevattende platen uit de bevochtigde incubator en 500 µL van EBM-FBS verwijderen uit elk putje.
  3. Zaad 10 4 MSCs in 500 µL van EBM-FBS op elk ingesloten aorta ring zorgvuldig door gelijkmatig pipetteren rond het endotheel netwerken. Zorgen voor gelijkmatige verdeling door zachtjes schudden de cultuur-plaat.
    1. Toevoegen extra EBM-FBS om ervoor te zorgen dat het totale volume van de media op de aorta ring assay/MSC co culturen 1.000 µL.
  4. Fluorescentie microscopie gebruiken om te visualiseren de fluorescently geëtiketteerde MSCs in de aorta ring assay.

4. microscopie

  1. gebruik helder-veld microscopie om het imago van de rat endothelial netwerken voorafgaand aan de aorta ring assay/MSC mede culturen voor basislijnmetingen (dag 0) van endothelial netwerkeigenschappen (b.v., netwerk lengte, netwerk loops). Afbeelding 4 kwadranten per putje van de aorta ring aan de verst sectie van het endotheel netwerk binnen het desbetreffende kwadrant.
    1. Afbeelding de aorta ring-netwerken na de aorta ring culturen assay/MSC samen op dag 3, 5 en 7. Gebruik van deze beelden te kwantificeren van het MSC-effect op de ontwikkeling van het endotheel netwerk.
  2. Fluorescentie microscopie gebruiken om het imago van vooraf gelabelde MSCs in de aorta ring test.
    1. Volgende 24 h van aorta ring assay/MSC co culturen, gebruiken fluorescentie microscopie te visualiseren MSC homing, rek en integratie met de endothelial netwerken. De fluorescerende beelden van MSCs met de beelden van de heldere veld van endotheliale cellen te observeren de colocalization van beide soorten cellen overlappen.
    2. Beeld van de MSCs gelokaliseerd in het proximale aan de aorta ring weefsel ontwikkelde endothelial vervoersnet en de MSCs gelokaliseerd binnen de nieuwe ontwikkeling van netwerken distale aan de aorta ring weefsel ( Figuur 2).

5. Stroom Cytometry en qPCR

  1. een dag voorafgaand aan distantiëren van de aorta ring endothelial netwerken, ontdooien bevroren dispase bij 4 ° C O/N. punt 5.3 is identiek voor zowel qPCR als stroom cytometry.
  2. 50 mL dispase en 50 mL 0,5% trypsine in de kraal of water bad 37 ° C warm.
  3. Halen de cellen voor de analyse van de aorta ring assay/MSC co culturen.
    1. Na 1 week van aorta ring assay/MSC co cultuur, verwijder het medium van de cultuur en voeg vervolgens 1 mL van Phosphate-Buffered zoutoplossing (PBS) langzaam aan elk goed voor 3 min en verwijderen. Herhaal dit twee keer meer wassen.
    2. Voeg 800 µL van vooraf opgewarmd dispase aan elk putje en broeden in de bevochtigde incubators gedurende 15 minuten
    3. Verwijderen van de platen uit de bevochtigde incubators en schorten dispase door (5-10 x) om te breken met de BMT pipetteren en breng de inhoud van elk putje in aparte 15 mL tubes.
    4. Herhaal stap 5.3.3 weer met frisse voorverwarmde dispase tot geen resterende BME wordt waargenomen in de cultuur goed. Voeg 1 deel van PBS aangevuld met 3% FBS tot de schorsing van de dispase-cel aan de inactivering van het dispase. Verwijderen van de aorta ringen drijvend in de celsuspensie met behulp van tips van de pipet.
    5. Draaien de cel schorsingen op 400 x g voor 5 min. verwijderen het supernatant zorgvuldig, 3 mL celsuspensie verlaten in de tube van 15 mL.
      Opmerking: Een duidelijke, solide pellet wellicht niet zichtbaar maar cellen en BMT aanwezig zijn.
      6. 3 mL trypsine van 0,5% voorverwarmde toevoegen
    6. aan de celsuspensie en krachtig resuspendeer (5-10 x door pipetteren) cellen. Incubeer de trypsinized cel-oplossingen in de bevochtigde incubators voor 10 min.
    7. Verwijderen van de trypsinized cel schorsingen van bevochtigde starterscentra en voeg 6 mL PBS aangevuld met 3% FBS en resuspendeer een paar times. De cel schorsingen bij 400 x g gedurende 5 min. draaien
    8. Zorgvuldig verwijderen van alle de bovendrijvende vloeistof, waardoor de cel pellet in de buis en resuspendeer de cellen in 1 mL PBS aangevuld met 3% FBS in elke buis.
    9. Filteren de 1 mL celsuspensie, met behulp van een 70 µm cel zeef samengevoegde cellen en resterende BME verwijderd met de celsuspensie. De cellen in 1 mL celsuspensie, met behulp van een cel counter tellen.
  4. De cellen voorbereiden stroom cytometry.
    1. Incubate de cel schorsingen (10 5 cellen in 200 µL PBS aangevuld met 3% FBS) met fluorophore-geconjugeerde (FITC of APC) primaire antilichamen (TRA-1 - 85-, CD146, CD31) concentratie = 1:40) bij 4 ° C gedurende 30 minuten, beschermd tegen licht.
      Opmerking: Stroom cytometry voor MSCs is geoptimaliseerd door Hong et al., 2013 28. Minimaal 10.000 cellen is vereist voor nauwkeurige lezingen.
    2. Na de 30 min incubatie, resuspendeer de cellen in 2 mL PBS aangevuld met 3% FBS en centrifuge (400 x g, 5 min).
    3. Houden cellen bij 4 ° C beschermd tegen licht tot analyseren door stroom cytometry (minstens 1 x 10 4 gebeurtenissen) binnen 1 uur. Zie voor de gating strategie, aanvullende figuur 1. Sorteren van menselijke MSCs met behulp van anti-TRA-1-85 (APC) (concentratie: 1:40 en 0,5% FBS/PBS) en sorteren van cellen in 350 µL van lysis van de cel buffer p.a. qPCR.
      Opmerking: Lysed cellen kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C voor maximaal 3 maanden voor de analyse van de toekomstige qPCR.
  5. QPCR analyse voorbereiden op de cellen.
    1. Isoleren van RNA van lysed cellen met behulp van kolom gebaseerde RNA isolatie kits en de concentratie van RNA en de kwaliteit bepalen.
    2. Voorbereiden cDNA van maximaal 5 µg RNA per 100 µL reverse-transcriptase reactie. Een versterking van de pre-stap uitvoeren wanneer het rendement van RNA laag is (< 10 ng/µL). Gebruik van minder dan 100 ng van RNA zal resulteren in een hoge mate van valse negatieven.
      Opmerking: De cDNA-sjablonen kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C voor verdere analyse voor maximaal 4 maanden.
    3. De qPCR met behulp van angiogenese expressie profiler arrays om de opsporing van wijzigingen in genexpressie uitvoeren Gebruik 5 ng van cDNA per reactie (40 cycli, 60 ° C gloeien/uitbreiding van de temperatuur). Uitdrukkelijke vouw verandering van meningsuiting t.o.v. ongedifferentieerde MSC afgeleid cDNA monsters. Voer de juiste negatieve controles (aorta ring zonder menselijke MSCs).

6. Netwerk van kwantificering volgende aorta Ring Assay/MSC co culturen

  1. imaging software downloaden zoals ImageJ samen met angiogenese Analyzer plugin 31.
  2. De opnamen van de endothelial netwerk importeren en het openen met behulp van de software.
  3. Converteren van de afbeelding schalen op basis van de specificaties van de Microscoop gebruikt.
  4. Gebruiken een lineaire instrument voor het meten van de groei van de radiale netwerk.
  5. Rekenen de lussen van de endothelial netwerk met behulp van de mobiele teller tool (lussen met ten minste 4 zijden moeten worden gekwantificeerd).
  6. Voor extra kwantificering van netwerkeigenschappen, gebruik de angiogenese Analyzer plugin of andere soortgelijke plugins voor het analyseren van meester segmenten, totale segment lengte, totale netwerkgebieden en aantal kruispunten. Gebruik het gereedschap wazig masker te vervagen aorta ring weefsel en lege ruimtes om te voorkomen dat valse positieve berekeningen.
  7. De waarden overbrengen in een statistieken programma en grafiek endothelial netwerkeigenschappen na de aorta ring assay/MSC co culturen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De schematische-workflow voor de vaststelling van de aorta ring/MSC co cultuur bepaling wordt geïllustreerd in Figuur 1. De belangrijkste stappen omvatten: rat aorta isolatie, afdelen en inbedding van de aorta ringen, toezicht op het endotheel kiemen en de ontwikkeling van het netwerk, en ten slotte etikettering en beheren van de MSCs. De tijdlijn van het endotheel netwerkanalyse schetst het venster voor de analyses die haalbaar is voor elke periode van co kweken: dag 1, 5 & 7. Aanvullende notities worden gemarkeerd door de gestippelde vakken.

De identificatie van de structureel verschillende regio's in de aorta ring endothelial cel-culturen wordt uitgevoerd door heldere veld microscopie, 3-5 d Nadat de aorta ringen zijn ingesloten in ECM (Figuur 2). De ongestructureerde gebied (figuur 2A) wordt gekenmerkt als een regio van hoge celproliferatie maar lage structurele organisatie in de directe nabijheid van de aorta weefsel. De ontwikkelde endothelial netwerken (figuur 2B) verwijzen naar regio's met hoge structurele organisatie, waar netwerken zijn ten volle gevestigd en hoofdzakelijk samengesteld uit gesloten lussen, zelfs voordat het prestatiemeteritembestand van MSCs. De ontwikkelende netwerken (figuur 2C) bevindt zich in de distale delen van het endotheel culturen. Dit zijn de sites van endothelial cel migratie, en de rek als de nieuwe netwerk structuren vorm. De hierboven genoemde 3 gewesten zijn herkenbaar in de experimenten en worden gebruikt wanneer wordt verwezen naar waar de MSCs huis aan in de co culturen. De prelabelled MSCs moet mede gekweekte met de aorta ring test bij alle drie netwerksegmenten hebben ontwikkeld. De kwantificering van endothelial netwerken na MSC co culturen zijn regio's van ontwikkelde en ontwikkelingslanden netwerk (Figuur 2, witte frame).

Fluorescentie microscopie zorgt voor kwalitatieve metingen van MSC migratie, integratie en morfologie in combinatie met de ontwikkeling van endothelial netwerken in de aorta ring-MSC co cultuur assay (Figuur 3). De MSCs levensvatbare, cytoplasmatische fluorophore voorzien werden 24 h beeld na toediening aan mede culturen. FTM HUCPVCs werden gevonden aan de rand van de ontwikkelingslanden endothelial netwerken weergegeven langwerpige cel morphologies en bijgedragen aan de verdere ontwikkeling van endothelial netwerken (figuur 3A, B). Ter vergelijking: BMSCs homed aan de ontwikkelende netwerken tijdens het weergeven van minder interactie met endotheliale cellen (Figuur 3 c, D). Hoge vergroting beelden bij 72 h bleek dat FTM HUCPVCs gehandhaafd hoge dekking en stabilisatie van de endothelial netwerken terwijl BMSCs in co culturen gepresenteerd met sferische morphologies met beperkte integratie in endotheel netwerken (figuur 3E , F). De waargenomen verschillen tonen duidelijk aan de kwalitatieve, functionele verschillen tussen menselijke MSC types. Een celtype van therapeutische kandidaat die aanzienlijke homing en endotheel integratie eigenschappen heeft (figuur 3A, B & E) opvalt in vergelijking met een celtype met beperkte endothelial netwerkintegratie en vergroting vermogens (Figuur 3 c, D & F).

Hoge vergroting fluorescentie microscopie beelden werden verworven om de fysieke interactie tussen endotheliale cellen en FTM HUCPVCs in buisvormige netwerken verder te ontleden. De vooraf gelabelde FTM HUCPVCs (figuur 4A, groen) staan vast te houden met onbevlekt endotheliale cellen (figuur 4A, Witte pijlen). FTM HUCPVCs bleken structurele steun bieden aan de endotheliale cellen door te dienen als een as en bijlage oppervlak tussen knooppunten. De aorta ring endotheel-netwerken kunnen ook vooraf gelabelde met behulp van een levensvatbare fluorophore op dezelfde manier naar de MSC kleuring (figuur 4B, rood). In dubbele gebeitst co culturen onthuld fluorescentie microscopie langwerpige verklevingen tussen de twee celtypes, vitaal het waarnemen van samenwerking en ondersteunende cel gedrag.

De kwantificering van endothelial structurele netwerkeigenschappen werd uitgevoerd op dag 5 van MSC co culturen (Figuur 5). Uniforme kwadranten werden vastgesteld voor de meting gedurende de gehele aorta endothelial ringnetwerk (Figuur 2, witte frame). De gemiddelde netwerk groei werd berekend door de afstand van de eerste proximale gesloten netwerk lussen aorta ring aan de verst distale gesloten lussen (RADIUS-grootte) (figuur 5A). De groei van de gemiddelde netwerk van aorta ring-MSC co culturen waren als volgt: FTM HUCPVCs (2.98 ±0.3 mm) en BMSCs (1.5 mm van de ±0.15). De onbehandelde endothelial netwerken ontwikkeld een gemiddelde straal van 1.9 ±0.1 mm. De statistische vergelijking tussen de MSC behandelgroepen aangetoond dat FTM HUCPVCs bijdraagt tot een significant groter netwerk groei in vergelijking met BMSCs en onbehandelde netwerken (p ≤0.001). De onbehandelde endothelial netwerken ontwikkeld aanzienlijk meer dan BMSC met mede culturen (p ≤0.01) (figuur 5B).

Het totale aantal lussen werden in elk kwadrant berekend en uitgedrukt als gemiddelde totale lus vorming (figuur 5C). Het gemiddelde aantal totale gesloten lussen waren als volgt: FTM HUCPVC behandeld co culturen (81 ±7), BMSCs (26 ±3) en onbehandelde ringen (55 ±7). FTM HUCPVCs bijgedragen tot aanzienlijk grotere endothelial lus vorming in vergelijking met BMSCs (p ≤0.01) en onbehandelde netwerken (p ≤0.01). De BMSC culturen mede heeft geleid tot minder endothelial netwerk lussen in vergelijking met onbehandelde netwerken (p ≤0.01). Deze kwantificering identificeert een celtype die een aanzienlijk positief effect op de ontwikkeling van het endotheel netwerk (FTM HUCPVC heeft) en een celtype die zelfs endothelial netwerken kan schaden. Het dient te worden opgemerkt dat de ontwikkeling van het aanzienlijk verhoogde netwerk te correleren goed met de MSC dekking op het endotheel netwerken werd waargenomen. Het suggereert dat de directe interacties zijn cruciaal voor de MSCs uit te voeren hun ondersteunende functie.

Mogelijke valkuilen van de aorta ring mede cultuur inrichtingen worden weergegeven in Figuur 6. Ontoereikende of onevenwichtige polymerisatie van BMT is een probleem dat met de ontwikkeling van succesvolle endothelial netwerk interfereren kan. Timing van de BME polymerisatie precies 30 minuten en de media over te dragen zonder het verstoren van het polymeer zorgt een intact, functionele BME fase (figuur 6A). Kleuring van de MSCs voor langdurige incubatie tijden en waardoor de MSCs naar pellet voor langere perioden kunnen interfereren met cel morfologie en fenotype op co culturen. Figuur 5B toont FTM HUCPVCs gekleurd voor 1 h en toegestaanom de pellet voor 1 h vóór co cultuur, wordt zowel sub-optimale tijdsinstellingen. FTM HUCPVCs vertonen geen voorkeur naar sites van endothelial netwerken en zijn verspreid over het netwerk. Cellen (Figuur 3) goed vergelijken getrakteerd op onjuist afgehandelde FTM HUCPVCs, de onjuist afgehandelde cellen weergegeven afgeronde cel morfologie en beperkte cel-naar-cel interactie met de endotheliale cellen (figuur 6B). Tot slot, als de aorta ring bepaling kan niet worden vastgesteld op de dag van de dissectie, de aortas kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C in de BAVA-C media aangevuld met 10% dimethylsulfoxide (DMSO) en 10% FBS. De ontwikkeling van het endotheel netwerk 1-3 d langer kan duren, bij de toepassing van de ontdooide aorta ringen ten opzichte van vers weefsel, maar de endothelial netwerken zullen volstaan voor MSC co cultuur vestiging (Figuur 6 c).

Als een alternatieve procedure voor de beoordeling van de aorta ring mede cultuur, kan de cellulaire fractie van BMT ingesloten aorta ringen worden geëxtraheerd en geanalyseerd door stroom cytometry (aanvullende figuur 1). De menselijke specifieke marker TRA-1-85 (aanvullende figuur 1A, B, y-as) positieve cel bevolking van FTM HUCPVC met mede culturen werd geïdentificeerd als menselijke MSCs. De co etikettering toonde lage expressie van de endothelial cel markering CD31 (aanvullende figuur 1A) en hoge expressie van de markering van de pericyte CD146 (aanvullende figuur 1B) binnen de menselijke specifieke marker positieve celpopulatie. Dergelijke evaluatie kan ontcijferen uiteindelijke immunophenotypic en bloedlijn inzet wijzigingen van de MSCs geïnduceerd door de interacties met endotheliale cellen, en verdere waardevolle informatie over de geteste celtype verstrekken. Met het oog op een voldoende aantal cellen voor FC analyse, kunnen de cellen parallel putjes van de dezelfde experimentele groep is onttrokken worden gecombineerd. Het is belangrijk om te overwegen met behulp van niet-pre-gekleurd MSC waarin de aorta ringen stroom cytometry p.a. zodat de denken fluorescentie van de levensvatbare kleurstof niet met het signaal van de antilichaam-gerelateerde fluorophores interfereert. Anders moet de negatieve gating de vooraf gekleurde cel fluorescentie in aanmerking nemen.

We gesorteerd op menselijke MSCs uitgepakte formulier aorta ring mede culturen (dag 7 van co cultuur) met behulp van het specifieke antilichaam voor menselijke cel oppervlakte marker (TRA-1-85). FTM HUCPVCs en BMSCs de aorta ring assay verhaald werden verwerkt voor qPCR analyse voor het testen van de expressie van genen die angiogenic. Met behulp van een commercieel verkrijgbare qPCR array, drie aorta ring mede culturen geboden voldoende hoeveelheden van genetisch materiaal te kwantificeren van de expressie van genen die 84 menselijke groeifactor (aanvullende figuur 2A). De voorlopige resultaten wijzen erop dat FTM HUCPVCs en BMSCs express belangrijke secreted angiogenic factoren op vergelijkbare niveaus (aanvullende figuur 2B). Naast het vergelijken van expressie niveaus van verschillende celtypes in de analyse, het effect van de overdracht van cellen aan EBM gebaseerd assay media van hun expansie voedingsbodems moet worden beschouwd. Wanneer u cellen van hogere fenotypische of genetische plasticiteit, moet een controlegroep van de Comparateur van menselijke MSCs in EBM media - zonder aorta weefsel - worden opgenomen in de evaluatie.

De gelijkenissen in angiogenic factor expressie van MSCs suggereert dat de significant verschil in de vergroting van hun netwerk is niet een gevolg van de activiteiten van de verschillende paracrine. Dit is in overeenstemming met de eerdere opmerking dat verhoogde directe intercellulaire interactie verschijnt ter bevordering van de ontwikkeling van het endotheel netwerk.

Figure 1
Figuur 1: Schematisch Diagram van een nieuwe toepassing van de aorta Ring Assay Setup.
De belangrijkste stappen van setup en analyse van MSC co culturen met de aorta ring test zijn beschreven in stevige dozen en aanvullende notities worden uiteengezet in gestippelde vakken. Schaal bar = 1.000 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Representatief beeld van de aorta Ring netwerkanalyse.
Endotheel netwerken zijn onderverdeeld in drie concentrische regio's gebaseerd op structurele verschillen: ongestructureerde gebied dicht bij de aorta ring weefsel (A), ontwikkelde/gestructureerd endothelial netwerken (B) en ontwikkelende netwerken gelegen in de periferie van de weefselkweek ex vivo (C). Radiaal netwerk groei en uniforme Kwadrant voor de telling van de lus zijn binnen het ontwikkelde endothelial netwerk (B) gedefinieerd. x: endothelial kringloop geteld in uniforme Kwadrant. Schaal bar = 250 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: TL Imaging of Network regio-afhankelijke integratie van menselijke MSCs in de aorta Ring Assay na 24 & 72 h.
Prestained (groen) FTM-HUCPVCs en BMSCs werden toegevoegd aan de ontwikkelende aorta ring endothelial buis-netwerken. Fluorescentie microscopie opnamen 24u na de oprichting van MSC co culturen weergeven FTM HUCPVCs die door de ECM en de thuisbasis van perifere ontwikkelende endothelial netwerken (A migreren). Beelden met een hogere vergroting weergegeven verlengde morphologies van FTM HUCPVCs terwijl in nauw contact met de endothelial netwerken (B). Minder BMSCs verwerken de ECM en de thuisbasis van endothelial netwerken met geen waarneembare voorkeur aan perifere ontwikkelende netwerken (C). BMSCs weergeven sferische cel morphologies (D).
Hoge vergroting fluorescentie microscopie beelden van prestained MSCs in rat aorta ring assay na 72 h van co cultuur (E, F). FTM HUCPVCS presenteren een verlengde morphologies terwijl endothelial dekking door middel van directe cel-naar-cel interactie met endotheliale cellen (effen witte pijlen) wordt zowel in netwerkknooppunten en tubuli (E) weergegeven. BMSCs onderhouden sferische cel morphologies geclusterd in het endotheel netwerkknooppunten (F). Broken arrow Hiermee geeft u de richting van de groei van het endotheel netwerk van de aorta ring weefsel. A, C: Schaal bar = 1.000 µm B, D: schaalBar = 400 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Hoge vergroting fluorescentie microscopie beelden van Pericyte-endothelial cel fysieke interactie.
Onbevlekt endotheliale cellen bleken gekoppeld aan continue uitsteeksels vooraf gebeitst FTM HUCPVCs in het tubulaire netwerk (A) aansluiten. Fluorescerende beelden van vooraf gebeitst endothelial netwerken (EG, rode) met vooraf gebeitst FTM HUCPVCs (FTM, groene) tonen interacties Recapitulerend endothelial cel, pericyte interacties (B). A: schaal bar = 100 µm B: schaal balk = 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: Kwantificeren van de groei van het netwerk in de MSC-behandeling groepen 5 D na co cultuur oprichting.
Lage vergroting fase contrast microscopie beelden werden genomen uit de aorta ring behandelgroepen voor maatregel netwerk groei en ontwikkeling (A). Verspreide pijl geeft de richting van de groei van het netwerk. Schaal bar = 250 µm. microscopie afbeeldingen werden gebruikt om te kwantificeren netwerkeigenschappen, met inbegrip van gemiddelde netwerk groei en betekenen netwerk lus vorming in één assay Kwadrant. FTM HUCPVCs bijdraagt tot een groter netwerk groei in vergelijking met BMSC co culturen en onbehandelde netwerken (p ≤0.001) (B). De p -waarde werd berekend aan de hand van een one-way ANOVA als p <0,0001 met behulp van Tukey Post test (N = 3). Netwerk lussen met ten minste vier gesloten zijden werden gekwantificeerd (C). FTM HUCPVC culturen samen ontwikkelde groter netwerk lussen in vergelijking met BMSC co culturen (p ≤0.001) en onbehandelde netwerken (p ≤0.01). De p -waarde werd berekend aan de hand van een one-way ANOVA om p < 0.0001 met behulp van Tukey Post test (N = 3). Het gemiddelde van 4 velden van endothelial netwerken werden gekwantificeerd. Schaal bar = 250 µm. Voor de paarsgewijze vergelijking, * = p ≤0.05, ** = p ≤0.01, *** = p ≤0.001. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: Mogelijke fouten in de aorta Ring Assay inrichting.
Aorta ringen ingebed in onvolledige BME polymerisatie kunnen leiden tot inconsistente en gebroken endothelial netwerken (A). FTM HUCPVCs gekleurd voor lange periodes met relatief lange kloof tussen kleuring en co culturen, opbrengst minimale homing en endothelial cel interacties (B). Het endotheel netwerk van rat aorta opgeslagen in-80 ° C en ontdooid voor aorta ring assay (C). A: schaal bar = 250 µm B, C: schaal bar = 400 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende figuur 1: Stroom Cytometry analyse van menselijke FTM HUCPVCs aorta Ring mede culturen is onttrokken.
Cellulaire breuken van aorta ring culturen werden geïsoleerd en verwerkt voor stroom cytometry analyse. Fluorophore geconjugeerd antilichaam tegen menselijke specifieke cel oppervlakte marker (TRA-1-85, APC) werd toegepast in combinatie met endothelial marker (FITC, CD31, (A)) of specifieke antilichamen van pericyte marker (FITC, CD146, (B)). De positieve voor de menselijke marker (y-as) celpopulatie lage positiviteit voor endothelial marker CD31 (A, Q2) en hoge positieve voor pericyte marker CD146 (B, V6) getest. Dit suggereert dat FTM HUCPVCs hun gerelateerde Celeigenschappen in de aorta ring mede culturen onderhouden en heb niet de ontwikkeling van een endothelial fenotype. De kwadranten op percelen werden gedefinieerd met behulp van isotype controles overeenkomen met de toegepaste primaire antilichamen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Kwantitatieve PCR analyse van belangrijke Angiogenic genen.
De vergelijkbare genexpressie van genen die belangrijke angiogenic door FTM HUCPVCs en BMSCs na 1 week co cultuur in de aorta ring assay (A). Representatieve CT-waarden worden weergegeven in tabel (B). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Er zijn verschillende kritieke fasen in het opzetten van een succesvolle aorta ring assay MSC co cultuur experiment. Ten eerste, de belangrijkste stappen bij het isoleren en segmenteren van de aorta zijn: 1) verkrijgen van uitsluitend het thoracale segment van aorta; 2) zorgvuldig verwijderen vertakkende bloedvaten, bindweefsel en vetweefsel en; 3) snijden zelfs secties van de aorta (~ 1 mm) te beperken van variabiliteit tussen elke bepaling. Ten tweede, de succesvolle inbedding van aorta ringen in BMT is essentieel voor deze test. Als de BMT is niet volledig polymeervorm of polymeervorm ongelijk, de aorta ringen ingebed in de BMT zal niet zitten kundig voor initiëren endothelial kiemen of deze discontinue endothelial netwerken kunnen ontwikkelen. Als de polymerisatie van BMT onvoldoende is, zijn testen niet betrouwbaar voor kwantificering. Ten derde, de volledige factor-verrijkt endothelial media is moet verstrekken voeding voor de aorta ringen om te starten met het kiemen. Zodra de aorta ring ringen hebben geïnitieerd vaartuig kiemen, omvatten de volgende kritische aankomende stappen het celtype te beproeven. Te dien einde moeten MSCs met succes worden vooraf gekleurd en toegediend aan de gekiemde aorta ringen. Er zijn twee belangrijke procedures voor deze sectie. 1) selecteren van de juiste dag voor het zaaien: de netwerken moeten in de derde fase en niet bereiken hoge dekking van de cultuur goed. Als de MSCs niet op een tijdige manier worden toegediend, wordt het uitdagend om te kwantificeren van de netto effecten van de MSCs op ontwikkeling van het netwerk. 2) prestaining van de MSCs vóór toevoeging: als de MSCs zijn overdreven gekleurd of een langere tijd in pellet gedurende, samendoen zal voorkomen dat belemmert de homing en integratie binnen endothelial netwerken. Ten slotte, kwantificeren van de netwerken kan gemakkelijk worden bereikt als de juiste besturingselementen zijn bereid. Aorta ringen zonder MSCs Nieuwengels endothelial netwerken omdat de aorta zelf ondersteunt kiemen, maar de MSCs de ontwikkeling van het grotere netwerk met verschillende netwerkstructuren bevorderen kunnen, zoals beschreven in dit manuscript. De kwantificering van endothelial netwerken moet worden uitgevoerd ten minste 5 d volgende vaststelling van co culturen. Als gevolg van het gesloten systeem, angiogenic reactie van voorbijgaande aard is en endotheel netwerken beginnen ontaarden na ongeveer 7 d. Als het doel van de observatie is het geteste cel type effect op de ontwikkeling van endothelial netwerken te beoordelen, moeten de beelden worden verworven binnen de eerste week van mede kweken.

Een eventuele wijziging van de huidige bepaling kunnen de toepassing van primaire menselijk weefsel. Zoals een 1 mm sectie van rat aorta één eenheid voor co cultuur maakt, kunnen menselijke aortas voorzien van een groot aantal secties van zeer consistente metingen. Ondanks de zeer beperkte beschikbaarheid van levensvatbare menselijke primaire weefsels suggereert de hoge output potentiële haalbaarheid. Bij het ontwikkelen van een assay voor grootschalige evaluaties, kunnen vooraf vormen de bepaling en de componenten ervan op te slaan totdat cellen voor testen beschikbaar komen worden beschouwd. De BMT-coating kan worden voorbereid op weefselkweek platen en opgeslagen in een bevroren, gedroogde vorm voor langere tijd. Ook, als we in ons laboratorium getest, rat aorta weefsel kan worden ingevroren en opgeslagen voor latere toepassing, dus maken werk met het meest cruciale element van de bepaling handiger.

Ondanks de vele voordelen van de aorta ring test zijn er een paar beperkingen te worden vermeld. Ten eerste kan de oprichting van de culturen van de bepaling worden uitdagende. In zijn huidige vorm vereist de routinematige toepassing voldoende manuele vaardigheden. Exploitant fouten kunnen introduceren variabiliteit. Het kan worden weerspiegeld in de groei van het netwerk en kan het moeilijk maken om op betrouwbare wijze evalueren van het effect van door de overheid gereguleerde cellen en dus ook de belangrijke angiogenic eigenschappen. Echter, deze uitdagingen zijn vergelijkbaar indien niet kleiner in vergelijking met die van andere methoden beschikbaar, en de vereiste opleidingsperiode kort en economische in plaats van in vivo experimenten gunstig kan zijn. Ten tweede, een periode van de vertraging tussen het insluiten van de ex vivo aorta weefsel en de ontwikkeling van het eerste netwerk dat de tijd van cel administratie markeert dient te worden verklaard door de gebruiker. Ten derde, de kwantificering van endothelial netwerkeigenschappen kan tijdrovend maar kan worden opgelost door het toewijzen van hallmark parameters, met inbegrip van radiale groei, buis lengte en netwerk mesh afmetingen. Dit kan worden uitgevoerd met behulp van computer aided analyse van beelden (afbeelding J), die kan leiden tot aanzienlijke afname van de tijd die nodig is voor de kwantificering van consistent en betrouwbaar. Ten vierde, de variabiliteit tussen elke bepaling kan optreden als gevolg van lichte inconsistenties in dierlijk weefsel bron en de behandeling door de exploitant. We vonden dat deze uitdaging effectief kan worden overwonnen en de kwantificering statistisch betrouwbare wordt door het opzetten van triplicates voor alle behandelde groepen. Tot slot kunnen uitpakken en sorteren van de cellen van mens en rat oorsprong na assay p.a. uitdagend. Specifieke proteinases, met inbegrip van dispase, en de oplossing van de gegevensterugwinning van de cel kunnen echter worden toegepast om te herstellen van cellen voor immunophenotypic of gen expressie analyse.

In vergelijking met bestaande methoden die cultuur een enkele endothelial celtype hetzij levende dieren systemen, dit gepresenteerd assay gebruik de combinatie van ex vivo aorta weefsel en BMT. Deze setup kan de gebruiker zowel kwalitatieve als kwantitatieve gegevens ophelderen van de angiogenic eigenschappen van cel therapie kandidaten krijgen. Het combineren van BMT en multi-cellulaire ex vivo weefsel biedt eigenschappen nauw het nabootsen van de communicatie die het therapeutische celtype na lokale toediening tegenkomen kunt. Vanwege de mogelijkheid van een groot aantal parallellen en de nauwe controle over kweekomstandigheden, is de exploitant voorzien van een systeem waarin de noodzakelijke elementen voor betrouwbare evaluatie, terwijl elimineren van variabelen en inconsistenties gevonden in dierlijke modellen. Evaluaties zijn bovendien meer haalbaar omdat het vermindert de kosten en de noodzaak van herhaalde dierlijke procedures. Eencellige testen en meest diermodellen missen de factoren en variabelen geïntroduceerd door immuunrespons die in de klinische toepassing van cel therapie kandidaten optreden zou. De ontstekingsreactie verandert angiogenese en daarom het therapeutische effect van geïmplanteerde stoffen of cellen kunnen niet nauwkeurig worden gekwantificeerd. De bepaling van de aorta ring sluit vele inflammatoire componenten die assay metingen zou verstoren. Het bevat echter resident macrofagen die belangrijke spelers in de microvasculature ontwikkeling32 zijn. Met de gemakkelijke identificatie van zowel het endotheel netwerk en de prestained menselijke cellen, kunnen het effect van de MSC uitgescheiden inflammatoire cytokines en zelfs cellulaire elementen van het immuunsysteem, worden gemakkelijk waargenomen met behulp van deze test.

Hoge controle door de gebruiker over de assay-voorwaarden en de reproduceerbare aard van de experimentele opzet voorziet in de invoering van verdere elementen op het systeem. Ten eerste, de aorta ring test kan worden gebruikt als een schade-model. Na de inbedding van de aorta ringen en endotheel kiemen, testen kunnen worden ingevoerd om de ischemische schade, inflammatoire factoren (TNF-α) of bacteriële lipopolysaccharide (LPS), gevolgd door MSC toevoeging aan het bepalen van mogelijke redding van angiogenic reactie na verwonding. Ten tweede het ophelderen van de mogelijke mechanismen van hoe de MSCs bijdragen aan de reactie van angiogenic, neutralizing antilichamen kunnen worden gebruikt om het zwijgen van de potentiële receptoren kritische voor cel-naar-cel interacties. Tot slot, om te onderzoeken de paracrine eigenschappen van MSCs, kan de bepaling van de aorta ring worden ingesteld in een systeem van de transwell uit te sluiten van het effect van cel naar cel interacties van de angiogenic reactie maar focus op paracrine eigenschappen.

Kortom, de aorta ring bepaling de mogelijkheid kan beoordelen en potentie van cel therapie kandidaten te bemiddelen ECM verwerking, migreren naar gebieden van angiogenese, en bijdragen aan schip ontwikkeling door middel van fysiek contact. De aorta ring ex vivo angiogenese bepaling zou kunnen worden ontwikkeld als een waardevolle, kwantitatieve pre-screening hulpmiddel voor kandidaat-cellijnen voor regeneratieve therapie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Clifford L. Librach is medehouder van het octrooi: methoden van isolatie en het gebruik van cellen die zijn afgeleid van de eerste trimester navelstreng weefsel. Verleend in Canada en Australië.

Acknowledgments

De auteurs danken de volgende personeelsleden en onderzoek personeel: Andrée Gauthier-Fisher, Matthew Librach, Tanya Barretto, Tharsan Velauthapillai en Sarah Laronde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alpha-MEM Gibco 12571071 For FTM HUCPVC and BMSC culture media.
APC-conjugated anti human TRA-1-85 R&D Systems FAB3195A Human-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting
Basal membrane extract (BME) (Matrigel) Corning 354234 For aorta embedding
Bullet-kit Lonza CC-3162 Includes: Gentamicin/Amphotericin-B
(GA)human Epidermal
Growth Factor (hEGF); Vascular
Endothelial Growth Factor (VEGF); R3-
Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1);
Ascorbic Acid; Hydrocortisone;
human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum
(FBS). Required to prepare EGM
CellTracker Green CMFDA Dye Thermo-fisher C2925 For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs
CKX53 Culture Microscope Olympus For bright-field imaging of endothelial network development
Countess automated cell counter Invitrogen C10227 Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR
Dispase StemCell technologies 7923 For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C)
Disposable sterile scalpels VWR 21909-654 For sectioning aorta
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma-Aldrich D8537 PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride
Endothelial basal media (EBM) Lonza CC-3156 Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS
Ethanol, 70%, Biotechnology Grade VWR 97064-768 To sterilize surfaces
EVOS Life Technologies In-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration
Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone) GE Healthcare SH3039603 Serum component of cell culture medium
FITC-conjugated anti-CD31 antibody BD 558068 Human endothelial marker for flow cytometry
FITC-conjugated anti-CD146antibody BD 560846 Human pericyte marker for flow cytometry
Forceps Almedic 7727-A10-704 For handing rat tissue. Can use any similar forceps
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Life Technologies 14175-094 1X Without calcium chloride and magnesium chloride
HERAcell 150i CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific 51026410 For incubating cells
Human Angiogenesis RT2 profiler PCR array Qiagen PAHS-024Z Human specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction
ImageJ Open source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin
LSR II BD UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.
MoFlo Astrios Beckman Coulter UHN SickKids FC Facility. For cell sorting.
Penicillin/streptomycin Gibco 15140122 Antibiotic component to buffers and cell culture medium
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 For RNA purification. Includes cell lysis buffer
RT2Easy First Strand Kit Qiagen 330421 For preparation of cDNA for qPCR
RT2PreAMP cDNA Synthesis Kit Qiagen 330451 Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA
Surgical scissors Fine Science Tools 14059-11 For cutting skin, muscle and aorta
Sterile gauze VWR 3084 To dampen and sterilize chest fur
TrypleE Thermo Fisher Scientific 12605036 MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C
0.2 μm pore filtration unit Thermo Fisher Scientific 566-0020 To sterilize tissue culture media
0.25% Trypsin/EDTA Gibco 25200056 For cell dissociation, pre-warm at 37 °C
10 cm tissue culture dishes Corning 25382-428 For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture
12 well-cell culture plates Corning-Sigma Aldrich CLS3513 For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures
15 mL tube BD Falcon 352096 For general tissue culture procedures
70 μm cell strainer Fisherbrand 22363548 To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  2. Hoeben, A., Landuyt, B., Highley, M. S., Wildiers, H., Van Oosterom, A. T., De Bruijn, E. A. Vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacol Rev. 56 (4), 549-580 (2004).
  3. Khan, T. A., Sellke, F. W., Laham, R. J. Gene therapy progress and prospects: therapeutic angiogenesis for limb and myocardial ischemia. Gene Ther. 10 (4), 285-291 (2003).
  4. Gupta, R., Tongers, J., Losordo, D. W. Human studies of angiogenic gene therapy. Circ Res. 105 (8), 724-736 (2009).
  5. Chu, H., Wang, Y. Therapeutic angiogenesis: controlled delivery of angiogenic factors. Ther Deliv. 3 (6), 693-714 (2012).
  6. Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits? Discov Med. 9 (46), 179-184 (2010).
  7. Said, S. S., Pickering, J. G., Mequanint, K. Advances in growth factor delivery for therapeutic angiogenesis. J Vasc Res. 50 (1), 35-35 (2013).
  8. Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro Oncol. 7 (4), 452-464 (2005).
  9. Leeper, N. J., Hunter, A. L., Cooke, J. P. Stem cell therapy for vascular regeneration: adult, embryonic, and induced pluripotent stem cells. Circulation. 122 (5), 517-526 (2010).
  10. Sieveking, D. P., Ng, M. K. Cell therapies for therapeutic angiogenesis: back to the bench. Vasc Med. 14 (2), 153-166 (2009).
  11. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90 (3), 195-221 (2009).
  12. Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49 (1), 32-40 (2003).
  13. Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
  14. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).
  15. Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).
  16. Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
  17. Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. J Cell Mol Med. 13 (10), 4113-4136 (2009).
  18. Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat Protoc. 7 (1), 89-104 (2011).
  19. Guo, J., et al. A secreted protein (Canopy 2, CNPY2) enhances angiogenesis and promotes smooth muscle cell migration and proliferation. Cardiovasc Res. 105 (3), 383-393 (2015).
  20. Wittig, C., Scheuer, C., Parakenings, J., Menger, M. D., Laschke, M. W. Geraniol Suppresses Angiogenesis by Downregulating Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)/VEGFR-2 Signaling. PLoS One. 10 (7), e0131946 (2015).
  21. Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biol Proced Online. 4, 24-31 (2002).
  22. Caplan, A. I. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine. J Cell Physiol. 213 (2), 341-347 (2007).
  23. Caplan, A. I., Dennis, J. E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J Cell Biochem. 98 (5), 1076-1084 (2006).
  24. Keating, A. Mesenchymal stromal cells: new directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
  25. Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212 (3), 702-709 (2007).
  26. Tang, Y. L., et al. Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction. Ann Thorac Surg. 80 (1), 229-236 (2005).
  27. Caplan, A. I. All MSCs are pericytes? Cell Stem Cell. 3 (3), 229-230 (2008).
  28. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
  29. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
  30. Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
  31. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  32. Gelati, M., Aplin, A. C., Fogel, E., Smith, K. D., Nicosia, R. F. The angiogenic response of the aorta to injury and inflammatory cytokines requires macrophages. J Immunol. 181 (8), 5711-5719 (2008).

Tags

Ontwikkelingsbiologie kwestie 127 angiogenese aorta ring assay cel migratie endotheel netwerken mesenchymale stromale cellen fysieke interacties paracrine factoren gerelateerde cellen navelstreng
De aorta Ring mede cultuur Assay: Een handig hulpmiddel om te beoordelen van het potentieel van de Angiogenic van mesenchymale stromale cellen <em>In Vitro</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iqbal, F., Gratch, Y. S., Szaraz,… More

Iqbal, F., Gratch, Y. S., Szaraz, P., Librach, C. L. The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (127), e56083, doi:10.3791/56083 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter