Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Aorta Ring Co kultur Assay: Et praktisk værktøj til at vurdere angiogene af mesenchymale stromale celler In Vitro

Published: September 18, 2017 doi: 10.3791/56083
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2,3,4,5
1Create Fertility Centre, 2Department of Physiology, University of Toronto, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 4Department of Medical Sciences, University of Toronto, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Women's College Hospital

Summary

Her præsenterer vi en roman anvendelse af aorta ring assay hvor prelabelled mesenchymale celler er co kulturperler med rotte aorta-afledte endotel netværk. Denne nye metode giver mulighed for visualisering af mesenchymale stromale celler (MSCs) målsøgende og integration med endotel netværk, kvantificering af Netværksegenskaber og evaluering af MSC immunophenotypes og gen udtryk.

Abstract

Angiogenese er en kompleks, stærkt reguleret proces, der er ansvarlig for at levere og vedligeholde passende væv perfusion. Utilstrækkelig Vaskulaturen vedligeholdelse og patologiske misdannelser kan resultere i alvorlige iskæmiske sygdomme, mens alt for rigelige vaskulære udvikling er forbundet med kræft og inflammatoriske lidelser. En lovende form af pro-angiogene terapi er brugen af angiogene celler kilder, der kan levere såvel regulerende faktorer som fysisk støtte for nyligt udvikle Vaskulaturen.

Mesenchymale stromale celler (MSCs) er udførligt undersøgte kandidater til vaskulær regeneration på grund af deres paracrine virkninger og deres evne til at opdage og hjemsted for iskæmisk eller betændt væv. Især første trimester menneskelige navlestrengen perivascular celler (FTM HUCPVCs) er en meget lovende kandidat på grund af deres pericyte-lignende egenskaber, høj proliferativ og multilineage potentiale, immun-privilegeret egenskaber og robust paracrine profil. Effektivt evaluering potentielt angiogene regenerativ celler, er det en forudsætning at teste dem i pålidelige og "oversættes" præ-klinisk assays. Aorta ring assay er en ex vivo angiogenese model, der giver mulighed for nem kvantificering af rørformede endotel strukturer, indeholder tilbehør støttende celler og ekstracellulære matrix (ECM) fra værten, udelukker inflammatoriske komponenter, og er hurtig og billig at etablere. Dette er fordelagtigt i forhold til i vivo modeller (fx, cornea assay, Matrigel plug assay); aorta ring assay kan spore de administrerede celler og observere intercellulære interaktioner samtidig undgå xeno-immune afvisning.

Vi præsenterer en protokol for en roman anvendelse af aorta ring assay, som omfatter menneskelige MSCs i co kulturer med udviklingslandene rotte aorta endotel netværk. Denne analyse giver mulighed for analyse af MSC bidrag til tube dannelse og udvikling gennem fysisk pericyte-lignende interaktioner og deres styrke til aktivt overflytning til websteder af angiogenese, og for at vurdere deres evne til at udføre og mægle ECM behandling. Denne protokol giver yderligere oplysninger om ændringer i MSC fænotype og gen udtryk efter fælles kultur.

Introduction

Den komplekse proces af angiogenese forbedrer og vedligeholder væv perfusion af nyt blod fartøj udvikling fra allerede eksisterende Vaskulaturen1. Det er en stramt reguleret, afbalanceret proces af pro-angiogene og anti-angiogene faktorer. Enhver mangel i dette system kan føre til utilstrækkelig fartøj vedligeholdelse eller vækst, forårsager alvorlige iskæmiske sygdomme herunder Myokardie sygdom, slagtilfælde og neurodegenerative lidelser. Overdrevet vaskulære udvikling er imidlertid karakteristisk for betingelser, herunder kræft og inflammatoriske lidelser2.

Udvikling af behandlinger, der har til formål at kontrollere angiogenese for at opnå gunstige vævsregeneration er af afgørende betydning. Trods omfattende prækliniske og kliniske undersøgelser, har forsøg på at stimulere angiogenese ved hjælp af pro-angiogene faktorer og MicroRNA undladt at opnå ønskede resultater3,4,5. Mulige årsager til forbigående virkninger omfatter: begrænsede levetiden af angiogene proteiner og nukleinsyrer og det begrænsede antal målrettet vækstfaktorer6,7. Selvom opløselige angiogene faktorer er afgørende for at indlede angiogenese, afhænger vedligeholdelse og funktionalitet af Vaskulaturen støtte celletyper, herunder pericytes og glat muskel celler8. Feltet af pro-angiogene behandlingsformer nu udforske potentielle stamceller og stamceller celle kilder, der kan give angiogene faktorer lokalt, mens fysisk støtte nyligt udviklet Vaskulaturen, selvstændig fornyelse eller endda differentiere i endotel-lignende celler9,10. At finde den optimale angiogene celletyper med kapacitet til at opfylde disse funktionelle krav holder en stor lovende for iskæmisk væv revitalisering.

For at med held oversætte potentielle cellebaserede behandlinger i kliniske forsøg, skal prækliniske undersøgelser vise deres effektivitet og fremhæve de underliggende angiogene mekanismer. Trods det høje antal etablerede angiogenese assays, feltet mangler en "guldstandard" i vitro assay, der pålideligt kunne evaluere effekten af potentiel kandidat celle typer11,12, 13. de fleste in vitro- angiogenese assays (herunder i endothelial spredning, migration og tube dannelse assays) typisk vurdere virkningerne af celler eller forbindelser i endothelial celler phenotypical ændringer eller differentiering af rørformede og netværk strukturer14,15. Mens disse funktioner er afgørende for angiogenese, en "oversættes" assay bør også evaluere: 1) brystforstørrelse eller udskiftning af de understøttende celletyper, herunder pericytes eller glatte muskelceller, 2) forarbejdningen af ECM og/eller basalmembranen, og 3). effektivitet til at fremme dannelsen af funktionelle microvasculature. In vivo angiogenese modeller, herunder hornhinde assay og Matrigel plug assay, sammenfatte unikke i vivo mikromiljø men bliver udfordret ved sværhedsgrad af tracking administreres celler til at observere fysiske interaktioner. Desuden, i vivo modeller, xeno-immune afvisning kan forekomme under test potentielle allogene celle terapi kandidater16. Ex vivo angiogenese modeller, især i aorta ring assay kan give: 1) let observation og kvantificering af rørformede strukturer, 2) tilbehør støttende celler, 3) ECM fra vært og kunstige forsyninger, 4) udelukkelsen af inflammatoriske komponenter, og 5) hurtig og billig installation17,18. Typisk, aorta ring assay kan teste lille sekretoriske proteiner og farmakologiske agenser og genetisk modificerede gnavere modeller19,20,21angiogene muligheder.

MSC'er er lovende kandidater til vaskulær regenerering primært gennem deres paracrine-medierede effekter22,23,24. MSC'er har vist sig at udskille centrale angiogene faktorer herunder vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF), hepatocyt vækstfaktor (HGF), Insulin-lignende vækstfaktor-1 (IGF-1), basic Fibroblast vækstfaktor (bFGF) og angiopoeitin-1 (Ang-1)25 ,26. MSC'er kan også opdage og hjemsted for iskæmisk eller betændt væv, men de præcise mekanismer er stadig under efterforskning. I stigende grad støtter litteraturen den hypotese, at de fleste MSCs opstår fra perivascular celler, co express pericyte markører og kan opføre sig som pericytes27. HUCPVCs er en ung kilde til MSCs stammer fra perivascular-regionen i den menneskelige navlestrengen. De repræsenterer en befolkning på MSCs med pericyte-lignende egenskaber og har været præget af både FTM og sigt umbilical snore. FTM HUCPVCs viser et højt udtryk af pericyte markører herunder CD146 og NG2, høj proliferativ og multilineage potentiale, immun-privilegeret egenskaber, og vise en robust paracrine profil28. FTM HUCPVCs er en ideel kandidat celletype skal fremme regenerering af tilskadekomne væv gennem fremme af nye Vaskulaturen via deres pericyte-lignende egenskaber.

For at teste angiogene potentiale og pericyte-lignende egenskaber af menneskelige MSC'er, er et meget begrænset antal angiogenese assays tilgængelige hvor positive angiotropic migration (i det følgende benævnt "homing"), ECM forarbejdning og udvikling af fysisk interaktioner mellem celletyper kan undersøges under hentning kvantitative data om microvasculature udvikling.

Vi præsenterer hermed en protokol, der beskriver en roman anvendelse af aorta ring assay. Menneskelige MSCs var Co kulturperler med udviklingslandene rotte-afledte aorta endotel netværk til at vurdere deres bidrag til tube dannelse, modning og homøostase. Denne version af aorta ring analysen vurderer evnen og styrken af celle terapi kandidater til hjem til websteder af angiogenese, udføre og mægle ECM behandling, og bidrage til endotel rørformede udvikling gennem oprettelse af pericyte-lignende fysiske interaktioner. Ud over at kvantificere nettoeffekten af MSCs på in vitro- endotel netværk dannelse og observere intercellulære interaktioner, optimeret vi også en protokol for at isolere MSCs fra Co kulturer. Ved at udføre flowcytometri og qPCR, er det muligt at karakterisere ændringer i MSC fænotype og gen udtryk efter fælles kultur. Som model celletyper, vi sammenlignet ontogenetically tidligt (prænatal) og slutningen (voksen) kilder til menneskelige MSCs: FTM HUCPVCs og menneskelige knoglemarv-afledte MSCs (BMSC), henholdsvis i aorta ring assay. Vi foreslår, at aorta ring analysen kan bruges til at studere angiogene potentiale for enhver fysisk støtte celletype når under efterforskning for angiogene regenerativ applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

alle undersøgelser, der involverer dyr blev gennemført og rapporteret efter ANKOMME retningslinjer 29. Alle undersøgelser blev udført med institutionelle forskning etik bestyrelsen godkendelse (REB antallet 4276). Alle dyr procedurer blev godkendt af Animal Care Committee of University Health Network (Toronto, Canada), og alle dyr modtages Human pleje i overensstemmelse med den vejledning for pleje og brugen af forsøgsdyr, 8 th edition ( National institutes of Health 2011).

1. aorta Ring Assay Setup

  1. isolat rotte aorta.
    1. Aflive 8 - 10 uger gamle Sprague-Dawley rotter ved hjælp af CO 2 kvælning: sæt CO 2 kamre til 20% gas udskiftning (strømningshastighed = 0,2 x kammer volumen/min). Bekræft ved fravær af knivspids refleks og hjertet slår ved føles brystet.
    2. Våd pels på brystet området ved hjælp af steriliseret gaze med 70% ethanol. Bruge steriliseret pincet og saks til at gøre et snit i brystet midterlinjen og skære igennem hud og muskel lag.
    3. Når brystkassen er udsat, skære brystkassen på hver side og fold opad ca 5 mm fra sternum på hver side. Nogle blødning forventes fra interkostale arterier i frisk kadavere.
    4. Skubbe lungevæv og hjerte til den anatomiske højre side til at eksponere aorta. Aorta er hvide farvet fartøj beliggende støder op til rygsøjlen.
    5. Brug pincet klemme aorta (efter aortabuen) og bruge kirurgisk saks til at gøre den første snit mens du holder aorta med pincet. Efter skæring aorta, brysthulen vil hurtigt fylde med blod, derfor er det kritisk at arbejde hurtigt for at opnå aorta før blodkoagulation.
    6. Brug pincet til at holde aorta og forsigtigt skræl aorta nedad, væk fra rygsøjlen. Træk vil bryde de interkostale arterier uden yderligere indsnit. Opnå ca 10 cm af væv og/eller før Hovedpulsåren deler sig i to grene i bughulen og skære aorta ud af slagtekroppen. Skubbe mellemgulvet, hvis det er nødvendigt at de caudale retning at få adgang til lavere dele af aorta.
      Bemærk: Skræl aorta forsigtigt fordi intens kraft kan forårsage at rive. Hvis aorta tårer, tillade blodets koagulation i et par sekunder og brug et stykke køkkenrulle til at fjerne koaguleret blod, giver synlighed af de resterende aorta.
    7. Placer aorta i en 15 mL tube med 10 mL iskold Hank ' s Balanced Salt løsning (HBSS) suppleret med 1% penicillin/streptomycin (P/S). Holder rørene på ice.
      Bemærk: Aorta væv kan vare i 1-2 h på is, men det er bedst at behandle det så hurtigt som muligt.
  2. Forberede aorta ring assay Kulturmedier i en steril biosikkerhed kabinet (BSC).
    1. Forbered i Endothelial vækstmediet (EGM) ved hjælp af en filtrering enhed til at filtrere 500 mL i Endothelial Basal Medium (EBM) suppleret med 2% føtal bovin Serum (FBS), 1% gentamicin og vækstfaktorer (Se Tabel af materialer). Placer 50 mL af den filtrerede medier ind i en perle eller vand bad på 37 ° C.
    2. Brug en anden filtrering enhed til at filtrere 100 mL af EBM suppleret med 2% FBS og 1% P/S til forberedt EBM 2% FBS (EBM-FBS) og opbevares ved 4 ° C.
  3. Frakke 12-godt vævskultur plader med basale membran ekstrakt (BME) mens du arbejder på is.
    1. Sted 12-godt plade på en kold overflade (store ice pack eller bakke). Tilføje 200 µL/brønd af frisk optøede BME bruger nedkølet pipette tips og slyng BME for at sikre endnu belægning. Arbejde hurtigt for at undgå ulige polymerisering af BME.
      NOTE: Et typisk aorta excision giver 20 aorta ringe. For at tage højde for variabiliteten mellem aorta ring assays, setup mindst tre aorta ring assays pr. behandling gruppe og omfatte en kontrol. Hvis kilden tillader, 6 ringe pr. behandling gruppe anbefales.
    2. Placer belagt pladerne i befugtet væksthuse (95% relativ luftfugtighed, 37 ° C, 5% CO 2, disse betingelser gælder for alle befugtet incubator trin herefter) for 30 min. sted 1.000 µL pipette tips tilbage i-20 ° C for trin 1.5.3.
      Bemærk: Mens den basale membran ekstrakt bruges i stock koncentration, dens sammenhæng og stivhed er strengt kontrolleret af polymerisering tid. Sørg for at holde de nøjagtige samme polymerisering tidspunkter for alle paralleller og uafhængige forsøg.
  4. Afdeling aorta i ensartet ringe.
    1. Tage aorta fra 15-mL-rør og læg det i en 10 cm parabol med 10 mL frisk HBSS suppleret med 1% P/S.
    2. Bruge to sæt af tang til at forsigtigt adskille overskydende bindevæv, fedtvæv og brug en skalpel for de resterende grene af de interkostale arterier tilsluttet aorta. Dette reducerer variabiliteten mellem ring enheder baseret på forskellige niveauer af de resterende væv. Fjern eventuelle resterende koaguleret blod fra indersiden af aorta.
    3. Placer en lineal eller gitter under 10 cm parabol til netop skær 1-2 mm brede sektioner af aorta ved hjælp af steril skalpel og pincet. Skær sektioner så nøjagtige som muligt at reducere variabiliteten mellem enheder.
  5. Integrere aorta ringene i BME.
    Bemærk: Hvis skæring af aorta ringe ikke er afsluttet før BME polymerisering inkubation, fjerne de overtrukne plader fra befugtet væksthuse og tilsæt 100 µL af EBM til hver brønd til at opsige polymerisering. Nøjagtige timing er kritisk, da overdreven polymerisering af BME kan forstyrre endotel netværk udvikling og celle migration. Når aorta ringene er forberedt, fjerne EBM fra brøndene og fortsætter fra trin 1.5.2.
    1. Fjerne BME coatede brønde fra de befugtet væksthuse og vende tilbage til BSC.
    2. Omhyggeligt afhente individuelle aorta ringe med pincet og placere en i hver BME-belagt brønd. Gentag for de resterende aorta ringe.
      Bemærk: Medier overføres sammen med aorta ringen holdes minimal for at undgå polymerisering uregelmæssigheder.
    3. Brug afkølet (-20 ° C) 1.000 µL pipette tips til at tilføje 300 µL af BME oven på hver aorta ring og jævnt distribuere BME omkring brønden.
    4. Returnere de integrerede aorta ringe til de befugtet inkubatorer til 30 min.
    5. Fjerne plader med den integrerede aorta ring fra de befugtet væksthuse og langsomt tilføje 1.000 µL af EGM (forberedt og varmede på trin 1.2.1) ved at placere pipetten tip mod væggen i kultur godt.
      Bemærk: Direkte pipettering medier på BME kan forstyrre den polymeriserede BME og hindrer udvikling af kontinuerlig endotel net. Brug en passende multikanalpipette, hvis tilgængelig.
    6. Efter 24 timer, fjerne 1.000 µL af EGM og erstatte med 1.000 µL af EBM-FBS udarbejdet i trin 1.2.2, igen af langsomt pipettering mod siden af kulturen og.
  6. Bevare aorta ring assay ved at erstatte 500 µL af EBM-FBS med 500 µL af frisk EBM-FBS (37 ° C) hver 48 h.
    Bemærk: Se sektion 2 for at starte MSC kultur udvidelse på samme dag som aorta ring assay etablering. Dette vil sikre, at MSC'er er klar til fælles kultur, når i endothelial netværk er klar.
  7. Bruge lysfelt mikroskopi til at følge aorta ring assay endotel netværk udvikling (Se figur 1 som reference for udvikling af optimale net). Når i endothelial netværk aspekt er som vist i figur 2, fortsætte med at konfigurere aorta ring assay-MSC Co kulturer (afsnit 3). Se trin 4.1 for yderligere detaljer om imaging i endothelial netværk.

2. Vævskultur

  1. Forbered stamopløsninger af vævskultur medier.
    1. Kultur FTM HUCPVCs (tidligere etablerede, n ≥ 3 uafhængige linjer for hver) 30 og kommercielt tilgængelige BMSCs i alpha-MEM suppleret med 10% FBS og 1% P/S.
    2. Sterilisere medierne bruger 0,2 µm pore størrelse filter flasker.
    3. Gemme de forberedte medieløsninger ved 4 ° C i op til 3 uger.
  2. Bevare FTM HUCPVC og BMSC kulturer i befugtet væksthuse og passage på 70-80% confluency bestemmes af fase kontrast mikroskopi. Brug relevante mængder af medier for størrelsen af vævskultur parabol anvendes (dvs. 10 mL i en 10 cm parabol). Brug disse dyrkningsbetingelserne for at bevare og passaging MSCs.
  3. Adskille MSC encellelag for passaging eller aorta ring assay-MSC Co kulturer ved hjælp af en dissociation enzym løsning (4 mL/10 cm parabol) og inkuberes i fugtig inkubatorer til 3 min. sikre udstationering af celler ved hjælp af lysfelt mikroskopi; Inkuber for en yderligere 1-2 min. Hvis det kræves.
  4. Overføre de dissocierede celler ind i en 15 mL rør og centrifugeres ved 400 x g i 5 min.
  5. Opsug supernatanten uden at forstyrre den celle pellet og resuspend celler i 1 mL af en passende dyrkningsmedier (alpha-MEM komplet media for passaging celler eller EBM-FBS for aorta ring assay/MSC Co kulturer) til optælling ved hjælp af en celle counter.

3. Forberedelse af aorta Ring Assay/MSC Co kulturer

  1. frø 10 4 MSCs på hver indlejret aorta ring (9.000 celler/cm 2 / 12-godt plade). Baseret på antallet af aorta ring assays, pre pletten MSCs med levedygtig, uoverdragelig fluorescerende farvestof. Vedligeholde mindst tre wells af aorta ringe uden MSC'er til en kontrolgruppe.
    1. At plette 10 5 MSCs/mL EBM-FBS medier, tilføje 2,5 µL af levedygtige, ikke-overdragelig fluorescerende farvestof/mL medier (5 µM) i en 15 mL tube og plads i den befugtet inkubator for 30 min. forsigtigt mix rør halvvejs gennem inkubation.
    2. Følgende de 30 min inkubation, tilføje 1 volumen af friske EBM-FBS til de farvede celler og spin på 400 x g i 5 min.
    3. Fjern supernatanten og genopslæmmes celle pellet i 1 mL af EBM-FBS medier. Bekræft vellykket farvning af MSCs ved hjælp af Fluorescens mikroskopi.
  2. Fjerne aorta ring-holdige pladerne fra befugtet rugemaskine og fjerne 500 µL af EBM-FBS fra hver brønd.
  3. Frø omhyggeligt 10 4 MSCs i 500 µL af EBM-FBS på hver integreret aorta ring af jævnt pipettering rundt i endothelial netværk. Sikre ligelig fordeling af forsigtigt ryste kultur plade.
    1. Tilføje yderligere EBM-FBS for at sikre, at den samlede mængde af medier på aorta ring assay/MSC Co kulturer er 1.000 µL.
  4. Bruge Fluorescens mikroskopi til at visualisere de fluorescently mærket MSCs i aorta ring assay.

4. mikroskopi

  1. Brug-lysfelt mikroskopi til billede rotte endotel netværk før aorta ring assay/MSC Co kulturer ved baseline (dag 0) målinger i endothelial Netværksegenskaber (fx, netværk længde, netværk sløjfer). Billede 4 kvadranter pr. brønd fra aorta ringen til afsnittet længst i endothelial netværket inden for denne kvadrant.
    1. Billede af aorta ring netværk efter aorta ringen kulturer assay/MSC Co på dage 3, 5 og 7. Brug disse billeder til at kvantificere MSC påvirkning i endothelial netudviklingsplan.
  2. Bruge Fluorescens mikroskopi til billede forud mærket MSCs i aorta ring assay.
    1. Følgende 24 timer af aorta ring assay/MSC Co kulturer, bruge Fluorescens mikroskopi til at visualisere MSC homing, strækforlængelse og integration med i endothelial netværk. Overlap MSC'er fluorescerende indskannede lysfelt billeder i endothelial celler til at observere colocalization af begge celletyper.
    2. Billede MSCs lokaliseret inden for de udviklede endotel netværk proksimale aorta ring væv og MSCs lokaliseret inden for nyligt udvikle netværk distalt for aorta ring væv ( figur 2).

5. Flow flowcytometri og qPCR

  1. en dag før miljøomkostningerne i endothelial aorta ring-netværk, optø frosne dispase ved 4 ° C O/N. afsnit 5.3 er identiske for både flowcytometri og qPCR.
  2. Varme 50 mL af dispase og 50 mL 0,5% trypsin i 37 ° C perle eller vand bad.
  3. Apportere celler til analyse af aorta ring assay/MSC Co kulturer.
    1. Efter 1 uge af aorta ring assay/MSC Co kultur, fjerne dyrkningsmedier og tilsættes 1 mL af Phosphate-Buffered saltvand (PBS) langsomt til hver godt for 3 min og fjern. Gentag denne to gange flere vask.
    2. Tilføje 800 µL af pre varmede dispase til hver brønd og Inkuber i de befugtet inkubatorer til 15 min.
    3. Fjerne pladerne fra de befugtet væksthuse og suspendere dispase af pipettering (5-10 x) for at bryde op BME og overføre indholdet af hver brønd i separate 15 mL rør.
    4. Gentag trin 5.3.3 igen med frisk pre varmede dispase indtil ingen resterende BME observeres i kultur godt. Tilføj 1 bind af PBS suppleret med 3% FBS til dispase-cellesuspension til at inaktivere dispase. Fjerne aorta ringene flyder i cellesuspension ved hjælp af pipette tips.
    5. Spinde celle suspensioner på 400 x g for 5 min. Fjern supernatanten omhyggeligt, forlader 3 mL cellesuspension i 15 mL tube.
      Bemærk: En indlysende, solid pellet kan ikke være synlige men celler og BME er til stede.
    6. Tilsættes 3 mL af forvarmet 0,5% trypsin cellesuspension og energisk resuspend (5-10 x af pipettering) celler. Inkubér trypsinized celle løsninger i de befugtet inkubatorer til 10 min.
    7. Fjerner trypsinized celle suspensioner fra befugtet væksthuse og tilføje 6 mL PBS suppleret med 3% FBS og resuspend et par times. Spin celle suspensioner på 400 x g i 5 min.
    8. Forsigtigt fjerne alle supernatanten, forlader cellen pellet i røret og resuspend celler i 1 mL PBS suppleret med 3% FBS i hver tube.
    9. Filter 1 mL cellesuspension ved hjælp af en 70 µm celle si for at fjerne aggregerede celler og resterende BME fra cellesuspension. Tælle celler i 1 mL cellesuspension ved hjælp af en celle counter.
  4. Forberede flowcytometri cellerne.
    1. Incubate cellen suspensioner (10 5 celler i 200 µL PBS suppleret med 3% FBS) med fluorophore-konjugeret (FITC eller APC) primære antistoffer (TRA-1 - 85-, CD146, CD31) koncentration = 1:40) ved 4 ° C i 30 min, beskyttet mod lys.
      Bemærk: Flowcytometri for MSCs var optimeret af Hong et al., 2013 28. Mindst 10.000 celler er påkrævet for nøjagtige målinger.
    2. Efter 30 min inkubation, resuspend celler i PBS suppleret med 3% FBS og centrifuge (400 x g, 5 min) sættes 2 mL.
    3. Hold celler ved 4 ° C beskyttet mod lys indtil analysere ved flowcytometri (mindst 1 x 10 4 begivenheder) inden for 1 h. Den gating strategi, se tillægs figur 1. Sortere menneskelige MSCs ved hjælp af anti-TRA-1-85 (APC) (koncentration: 1:40 og i 0,5% FBS/PBS) og sortere cellerne i 350 µL af celle lysisbuffer for qPCR analyse.
      Bemærk: Mængden celler kan opbevares ved-80 ° C i op til 3 måneder for fremtidige qPCR analyse.
  5. Forberede qPCR analyse cellerne.
    1. Isolere RNA fra mængden celler ved hjælp af kolonne-baserede RNA isolering kits og bestemme RNA koncentrationen og kvaliteten.
    2. Forbered cDNA fra op til 5 µg af RNA pr. 100 µL reverse transkriptase reaktion. Udføre en pre forstærkning skridt, hvis RNA udbyttet er lavt (< 10 ng/µL). Brug af mindre end 100 ng af RNA vil resultere i en høj hastighed på falske negativer.
      Bemærk: CDNA skabeloner kan opbevares ved-20 ° C til yderligere analyse for op til 4 måneder.
    3. Udføre qPCR ved hjælp af angiogenese udtryk profiler arrays til at opdage ændringer i genekspression. Brug 5 ng af cDNA pr. reaktion (40 cyklusser, 60 ° C udglødning/udvide temperatur). Express fold ændring af udtryk sammenlignet udifferentierede MSC afledt cDNA prøver. Kør de passende negative kontroller (aorta ring uden menneskelige MSCs).

6. Netværk kvantificering følgende aorta Ring Assay/MSC Co kulturer

  1. Download billedbehandlingsprogrammer f.eks ImageJ sammen med angiogenese Analyzer plugin 31.
  2. Importerer i endothelial netværk billeder taget og åbne ved hjælp af softwaren.
  3. Konvertere billedet skalaer baseret på specifikationerne af mikroskop bruges.
  4. Bruge en lineær værktøj til at måle den radiale netværk vækst.
  5. Tæller endotel netværk loops ved hjælp af værktøjet celle counter (sløjfer med mindst 4 sider skal kvantificeres).
  6. For yderligere kvantificering af Netværksegenskaber, bruge angiogenese Analyzer plugin eller andre lignende plugins til at analysere master segmenter, totallængde segment, samlede netværksområder og antallet af knudepunkter. Brug værktøjet sløret maske til at sløre aorta ring væv og tomme rum for at undgå falske positive beregninger.
  7. Overføre værdierne til en statistik program og graf endotel Netværksegenskaber efter aorta ring assay/MSC Co kulturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den skematiske arbejdsgang for oprettelse af aorta ring/MSC Co kultur assay er vist i figur 1. De vigtigste skridt omfatter: rotte aorta isolation, skæring og indlejring af aorta ringene, overvågning af endotel spiring og udvikling af net, og endelig mærkning og administration af MSCs. Tidslinjen i endothelial netværksanalyse skitserer vinduet for de analyser, der er muligt for hver periode på Co dyrkning: dag 1, 5 & 7. Yderligere noter er fremhævet af stiplede bokse.

Identifikation af strukturelt forskellige regioner i aorta ring endotel cellekulturer udføres af lysfelt mikroskopi, 3-5 d efter aorta ringene er indlejret i ECM (figur 2). Den ustrukturerede område (figur 2A) er karakteriseret som en region med høj celleproliferation, men lav strukturel organisation i direkte nærhed af aorta væv. De udviklede endotel net (figur 2B) henviser til regioner med høje strukturelle organisation, hvor netværk er fuldt etableret og overvejende består af lukkede kredsløb, selv før tilsætning af MSC'er. De udviklende netværk (figur 2 c) er placeret på de distale områder i endothelial kulturer. Disse er steder i endothelial celle migration og brudforlængelse som formen nye netværk strukturer. De ovennævnte 3 regioner er let identificerbare i hele eksperimenterne og bruges, når der refereres til, hvor MSCs hjemsted for Co kulturer. De prelabelled MSC'er skal være co kulturperler aorta ring assay, når alle tre netværkssegmenter har udviklet. Kvantificering i endothelial netværk efter MSC Co kulturer omfatter regioner i udviklede og udviklingslande netværk (figur 2, hvid ramme).

Fluorescens mikroskopi tillader kvalitative målinger af MSC migration, integration og morfologi i forbindelse med udviklingen af endotel netværk i aorta ring-MSC Co kultur assay (figur 3). MSC'er mærket med levedygtig, cytoplasmatisk fluorophore var afbildet 24 timer efter administration til co kulturer. FTM HUCPVCs blev fundet i periferien af de udvikle endotel netværk, vises aflange celle morfologier og bidraget til den videre udvikling i endothelial netværk (figur 3A, B). Til sammenligning homed BMSCs til at udvikle netværk samtidig viser mindre interaktion med endotelceller (figur 3 c, D). Høj forstørrelse billeder på 72 h viste at FTM HUCPVCs vedligeholdes høj dækning og stabilisering i endothelial netværk mens BMSCs i co kulturer præsenteret med sfæriske morfologier med begrænsede integration i endothelial netværk (figur 3E , F). Den observerede forskelle klart viser de kvalitative, funktionelle forskelle mellem menneskelige MSC typer. En terapeutisk kandidat celletype, der har betydelige målsøgende og endotel integration egenskaber (figur 3A, B & E) skiller sig ud i forhold til en celletype med begrænset endotel netværksintegration og brystforstørrelse kapaciteter (figur 3 c, D & F).

Høj forstørrelse Fluorescens mikroskopi billeder blev erhvervet for at yderligere dissekere fysiske vekselvirkninger mellem endotelceller og FTM HUCPVCs i rørformede netværk. Den forud mærket FTM HUCPVCs (figur 4A, grøn) er vist vedhængende med unstained endothelial celler (figur 4A, hvide pile). FTM HUCPVCs fandtes for at yde strukturel støtte til i endothelial celler ved at fungere som en akse og vedhæftet fil overflade mellem noder. I endothelial aorta ring-netværk kan også være forud mærket ved hjælp af en levedygtig fluorophore ligeledes til cand.merc. farvning (figur 4B, red). I dobbelt farvede Co kulturer afslørede Fluorescens mikroskopi aflange sammenvoksninger mellem de to celletyper, styrkende observation af samarbejde og støttende celle adfærd.

Kvantificering af strukturelle egenskaber i endothelial netværk blev udført på dag 5 af MSC Co kulturer (figur 5). Ensartet kvadranter blev defineret for måling gennem hele aorta ring endotel nettet (figur 2, hvid ramme). Den gennemsnitlige netværk vækst blev beregnet som afstanden fra de første proksimale lukket netværk sløjfer af aorta ring til de længst distale lukkede kredsløb (radius størrelse) (figur 5A). Den gennemsnitlige netværk vækst af aorta ring-MSC Co kulturer var som følger: FTM HUCPVCs (2,98 ±0.3 mm) og BMSCs (1,5 ±0.15 mm). De ubehandlede endotel netværk udviklet en gennemsnitlig radius af 1,9 ±0.1 mm. Den statistisk sammenligning mellem MSC behandlingsgrupper viste, at FTM HUCPVCs bidraget til betydeligt større netværk vækst i forhold til BMSCs og ubehandlet netværk (p ≤0.001). Ubehandlet endotel netværk udviklet betydeligt mere end BMSC indeholdende Co kulturer (p ≤0.01) (figur 5B).

Det samlede antal sløjfer blev beregnet i hver kvadrant og udtrykt som gennemsnitlige samlede loop dannelse (figur 5 c). Det gennemsnitlige antal samlede lukkede kredsløb var som følger: FTM HUCPVC behandlet Co kulturer (81 ±7), BMSCs (26 ±3) og ubehandlet ringe (55 ±7). FTM HUCPVCs bidraget til betydeligt større endotel loop formation i forhold til BMSCs (p ≤0.01) og ubehandlet netværk (p ≤0.01). BMSC Co kulturer resulterede i færre endotel netværk sløjfer sammenlignet med ubehandlet netværk (p ≤0.01). Denne kvantificering identificerer en celletype, der har en markant positiv effekt på endotel netværk udvikling (FTM HUCPVC) og en celletype, der endda kan forringe endotel netværk. Det er værd at bemærke at den markant forøgede netudviklingsplan blev observeret for at korrelere godt med MSC dækning på i endothelial netværk. Det tyder på, at det direkte samspil er afgørende for MSCs til at udføre deres støttende funktion.

Mulige faldgruber af aorta ring Co kultur virksomheder er repræsenteret i figur 6. Utilstrækkelig eller ujævn polymerisering af BME er et problem, der kan forstyrre succesfulde endotel netværk udvikling. Timing BME polymerisering for præcis 30 minutter og overføre medier uden at forstyrre polymeren vil sikre en intakt, funktionelle BME fase (figur 6A). Farvning af MSCs for langvarig inkuberingstider og tillader MSC'er til pellet i længere perioder kan interferere med celle morfologi og fænotype på Co kulturer. Figur 5B viser FTM HUCPVCs farvet for 1t og tilladtfor at pille for 1 h før Co kultur, begge er sub-optimale tidsindstillinger. FTM HUCPVCs viser ikke præference til steder i endothelial netværk og er spredt over hele netværket. Sammenligne korrekt behandlede celler (figur 3) til fejlhåndtering FTM HUCPVCs, mishandled cellerne afrundede celle morfologi og begrænset celle-til-celle interaktioner med i endothelial celler (fig. 6B). Endelig, hvis aorta ring assay ikke kan oprettes på dagen for dissektion, aortas kan opbevares ved-80 ° C i EGM-C media suppleret med 10% dimethylsulfoxid (DMSO) og 10% FBS. I endothelial netudviklingsplan kan tage 1-3 d længere, når du anvender optøede aorta ringe i forhold til frisk væv, men i endothelial netværk vil være tilstrækkeligt for MSC Co kultur etablering (figur 6 c).

Som en alternativ procedure for aorta ring Co kultur vurdering, kan den cellulære brøkdel af BME indlejret aorta ringe ekstraheret og analyseret ved flowcytometri (tillægs figur 1). Den menneskelige specifikke markør TRA-1-85 (supplerende figur 1A, B, y-aksen) positive celle befolkning fra FTM HUCPVC indeholdende Co kulturer blev identificeret som menneskelige MSCs. Co mærkning viste lave udtryk i endothelial celle markør CD31 (supplerende figur 1A) og høj udtryk for pericyte markøren CD146 (supplerende figur 1B) inden for den menneskelige specifikke markør positive celle befolkning. Sådan vurdering kan dechifrere eventuel immunophenotypic og afstamning engagement ændringer af MSCs induceret af interaktioner med endotelceller, og give yderligere værdifulde oplysninger om testede celletype. For at opnå et tilstrækkeligt antal celler for FC analyse, kan celler udvundet af parallelle wells af samme eksperimentelle gruppe kombineres. Det er vigtigt at overveje at bruge ikke-pre-farvede MSC indeholdende aorta ringene for flow flowcytometri analyse, således at den minder fluorescens af levedygtige farvestoffet ikke forstyrrer signalet fra den antistof-relaterede fluorophores. Ellers bør den negative gating tage pre farves celle fluorescens i betragtning.

Vi sorteret menneskelige MSCs udpakkede form aorta ring Co kulturer (dag 7 i fælles kultur) ved hjælp af den menneskelige celle overflade markør specifikke antistof (TRA-1-85). FTM HUCPVCs og BMSCs inddrives fra aorta ring analysen blev behandlet for qPCR analyse at teste udtryk af angiogene gener. Ved hjælp af en kommercielt tilgængelig qPCR vifte, fastsat tre aorta ring Co kulturer tilstrækkelige mængder af genetisk materiale til at kvantificere udtryk for 84 menneskelige vækstfaktor gener (supplerende figur 2A). De foreløbige resultater viser, at FTM HUCPVCs og BMSCs express centrale udskilles angiogene faktorer på sammenlignelige niveauer (supplerende figur 2B). Udover sammenligne udtryk niveauer af forskellige celletyper i analysen, baseret effekten af overføre celler til EBM assay medier fra deres ekspansion kultur medier bør overvejes. Når du bruger celler af højere fænotypiske eller genetiske plasticitet, bør en Komparator kontrolgruppe af menneskelige MSCs i EBM media - uden aorta væv - indgå i evalueringen.

Ligheder i angiogene faktor udtryk for MSCs tyder på, at den store forskel i deres netværk brystforstørrelse ikke er et resultat af forskellige paracrine aktiviteter. Dette er i overensstemmelse med den tidligere bemærkning om, at øget direkte intercellulær samspil synes at fremme udvikling af endotel net.

Figure 1
Figur 1: Skematisk Diagram af en roman anvendelse af aorta Ring Assay Setup.
De vigtigste trin i installationsprogrammet og analyse af MSC Co kulturer aorta ring assay er skitseret i faste kasser og yderligere noter er skitseret i stiplede bokse. Skalalinjen = 1.000 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Repræsentant billede af aorta Ring netværksanalyse.
Endotel netværk er opdelt i tre koncentriske regioner baseret på strukturelle forskelle: ustrukturerede område i umiddelbar nærhed af aorta ring væv (A), udviklet/struktureret endotel netværk (B) og udvikle netværk beliggende i periferien af ex vivo væv kultur (C). Radial netværk vækst og ensartet kvadrant loop Greve er defineret inden for det udviklede endotel netværk (B). x: lukkede endotel loop tælles i ensartet kvadrant. Skalalinjen = 250 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Fluorescerende Imaging af netværk Region-afhængige Integration af menneskelige MSCs i aorta Ring analysen efter 24 & 72 h.
Prestained (grøn) FTM HUCPVCs og BMSCs blev tilføjet til udviklingslandene aorta ring endotel tube netværk. Fluorescens mikroskopi billeder taget 24 timer efter oprettelse af MSC Co kulturer vise FTM HUCPVCs, der vandrer gennem den ECM og hjem til perifere udvikle endotel netværk (A). Højere forstørrelse billeder vise aflange morfologier af FTM HUCPVCs i tæt kontakt med i endothelial netværk (B). Færre BMSCs proces ECM og hjem til endotel netværk med ingen observerbare præference til perifere udvikle netværk (C). BMSCs vise sfæriske celle morfologier (D).
Høj forstørrelse Fluorescens mikroskopi billeder af prestained MSCs i rotte aorta ring assay efter 72 h Co kultur (E, F). FTM HUCPVCS præsentere aflange morfologier mens endotel dækning gennem direkte celle-til-celle interaktioner med endotelceller (solid hvide pile) både i netværk knudepunkter og tubuli (E). BMSCs vedligehold sfæriske celle morfologier grupperet i endothelial netværk knudepunkter (F). Broken arrow repræsenterer retningen i endothelial netværk vækst fra aorta ring væv. En, C: Skalalinjen = 1.000 µm B, D: skalabar = 400 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Høj forstørrelse Fluorescens mikroskopi billeder af Pericyte-endotel celle fysiske interaktioner.
Unstained endothelial celler blev fundet er knyttet til kontinuerlig fremspring forbinder pre farves FTM HUCPVCs i den rørformede netværk (A). Fluorescerende billeder af pre farves endotel netværk (EF, rød) med pre farves FTM HUCPVCs (FTM, grønne) påvise interaktioner recapitulating endotel celle, pericyte interaktioner (B). A: skalalinjen = 100 µm B: skalalinjen = 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Kvantificering af netværk vækst i MSC behandling grupper 5 D efter fælles kultur etablering.
Lav forstørrelse fase kontrast mikroskopi billeder blev taget fra behandlingsgrupper aorta ring foranstaltningen netværk vækst og udvikling (A). Spredte pilen viser retningen af netværk vækst. Skalalinjen = 250 µm. mikroskopi billeder blev brugt til at kvantificere Netværksegenskaber, herunder gennemsnitlig netværk vækst og betyde netværk loop dannelse i en assay kvadrant. FTM HUCPVCs bidraget til større netværk vækst i forhold til BMSC Co kulturer og ubehandlet netværk (p ≤0.001) (B). P -værdi blev beregnet ved hjælp af en en-vejs ANOVA skal p <0,0001 bruger Tukey's Post test (N = 3). Netværk sløjfer med mindst fire lukkede sider var kvantificeret (C). FTM HUCPVC kulturer Co udviklede større netværk sløjfer i forhold til BMSC Co kulturer (p ≤0.001) og ubehandlet netværk (p ≤0.01). P -værdi blev beregnet ved hjælp af en en-vejs ANOVA skal p < 0.0001 ved hjælp af Tukeys post-test (N = 3). Gennemsnittet af 4 felter i endothelial netværk var kvantificeret. Skalalinjen = 250 µm. For parvise sammenligning, * = p ≤0.05, ** = p ≤0.01, *** = p ≤0.001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Mulige fejl i aorta Ring Assay etablering.
Aorta ringe indlejret i ufuldstændig BME polymerisering kan føre til usammenhængende og brudt endotel netværk (A). FTM HUCPVCs farves i lange perioder med store tid huller mellem farvning og oprettelse af fælles kulturer, udbytte minimal målsøgende og endotel celle interaktioner (B). I endothelial netværk fra rotte aorta gemt i-80 ° C og optøet for aorta ring assay (C). A: skalalinjen = 250 µm B, C: skalalinjen = 400 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: Flow flowcytometri analyse af menneskers FTM HUCPVCs udvundet af aorta Ring Co kulturer.
Cellulære brøkdele af aorta ring kulturer blev isoleret og forarbejdet til flow flowcytometri analyse. Fluorophore konjugeret antistof mod human bestemt celle overflade markør (TRA-1-85, APC) blev anvendt i kombination med endotel markør (CD31, FITC, (A)) eller pericyte markør (CD146, FITC, (B)) specifikke antistoffer. Cellen befolkningen positivt for den menneskelige markør (y-akse) testet lav positivitet i endothelial markør CD31 (A, Q2) og høje positive for pericyte markør CD146 (B, SP6). Dette tyder på, at FTM HUCPVCs fastholdt deres perivascular celleegenskaber i aorta ring Co kulturer og ikke udvikler en endotel fænotype. Kvadranter på parceller blev defineret ved hjælp af isotype kontrol matchende anvendt primære antistoffer. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Kvantitativ PCR analyse af centrale angiogene gener.
Den lignende genekspression af centrale angiogene gener af FTM HUCPVCs og BMSCs efter 1-uges fælles kultur i aorta ring assay (A). Repræsentative CT værdier er vist i tabel (B). Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Der er flere kritiske faser i oprettelse af en vellykket aorta ring assay MSC Co kultur eksperiment. Første, de mest vigtige skridt når isolere og skæring aorta er: 1) at opnå udelukkende thorax segmentet af aorta; 2) omhyggeligt at fjerne forgrening blodkar, bindevæv og fedtvæv og; 3) skære selv dele af aorta (~ 1 mm) til at begrænse variabiliteten mellem hvert assay. Andet, vellykket integrering af aorta ringe på BME er kritisk for denne analyse. Hvis BME er ikke helt polymeriserede eller polymeriserede ujævnt, aorta ringene indlejret i BME vil ikke kunne indlede endotel spiring eller de kan udvikle diskontinuert endotel netværk. Hvis BME polymerisering er utilstrækkelig, er assays ikke pålidelige for kvantificering. Tredje, komplet faktor-beriget endotel medierne er nødvendigt at give næring til aorta ringene til at starte spiring. Når aorta ring ringe har indledte fartoejet spiring, involverer de næste kritiske kommende skridt celletype skal testes. Med henblik herpå skal MSCs held pre farves og gives til de spirende aorta ringe. Der er to kritiske procedurer for denne sektion. 1) at vælge den relevante dag for såning: nettene skal være i den tredje fase og være ikke at nå høje dækning af kultur godt. Hvis MSCs ikke administreres i tide, bliver det udfordrende at kvantificere MSCs netto indvirkning på udvikling af net. 2) prestaining MSCs inden de tilsættes: Hvis MSCs over farves eller forblive i pellet i en lang periode, Jokke opstår der forringer målsøgende og integration i endothelial netværk. Endelig kan kvantificere netværkene nemt opnås hvis passende kontrol er parat. Aorta ringe uden MSCs vil udvikle endotel netværk, fordi aorta, sig understøtter spiring, men MSCs kan fremme større udvikling af net med forskellige netværksstrukturer som beskrevet i dette håndskrift. Kvantificering i endothelial netværk bør udføres mindst 5 d følgende etablering af fælles kulturer. På grund af det lukkede system, angiogene svar er forbigående og endotel netværk begynde udarter efter ca 7 d. Hvis formålet med observation er at evaluere den testede celle type effekt på udviklingen i endothelial netværk, skal billederne erhverves inden for den første uge af co dyrkning.

En eventuel ændring af den nuværende assay kan være anvendelsen af primære humant væv. Som en 1 mm sektion af rotte aorta gør én enhed for fælles kultur, kan menneskelige aortas give et stort antal sektioner af meget sammenhængende målinger. Trods meget begrænset tilgængeligheden af levedygtige menneskelige primære væv foreslår den højkapacitet potentielle gennemførlighed. Udarbejdelsen af en analyse for storstilet evalueringer, kan pre danner analysen og gemme sine komponenter indtil celler til test bliver tilgængelige betragtes. BME belægning kan tilberedes på vævskultur plader og oplagres i frossen form, dehydreret i længere perioder. Også, som vi testede i vores laboratorium, rotte aorta væv kan være frosset og gemt til senere anvendelse, således at arbejde med det mest afgørende element af analysen mere bekvem.

Trods de mange fordele ved aorta ring assay er der et par begrænsninger skal anføres. For det første kan oprettelsen af assay kulturer være udfordrende. I sin nuværende form kræver rutinemæssig anvendelse tilstrækkelige manuelle færdigheder. Operatør fejl kan indføre variabilitet. Det kan spejles i netværket vækst og kan gøre det vanskeligt at pålideligt evaluere virkningen af administrerede celler og dermed vigtige angiogene egenskaber. Men disse udfordringer er lignende hvis ikke mindre i forhold til de af andre metoder til rådighed, og den krævede uddannelsesperiode kan være bekvemt kort og økonomisk i modsætning til i vivo forsøg. For det andet, et lag periode mellem integrering af ex vivo aorta væv og den indledende netudviklingsplan, der markerer tidspunktet for celle administration skal regnskabsføres af brugeren. For det tredje kvantificering i endothelial Netværksegenskaber kan være tidskrævende, men kan løses ved at tildele hallmark parametre, herunder radial vækst, tube længde og netværk mesh dimensioner. Dette kan udføres ved hjælp af computer aided analyse af billeder (billede Jørgensen), som væsentligt kan reducere den nødvendige tid til konsekvent og pålidelig kvantificering. For det fjerde kan variabiliteten mellem hvert assay opstå som følge af mindre uoverensstemmelser i animalsk væv kilde og håndtering af operatøren. Vi fandt, at denne udfordring kan løses effektivt og kvantificering ved opsætning af tre for hver behandling bliver statistisk pålidelig. Endelig, udvinding og sortering celler af human og rotte oprindelse for efter analysen analyse kan være udfordrende. Imidlertid kan specifikke proteinases, herunder dispase, og celle genoprettelsesløsning anvendes til at inddrive celler til immunophenotypic eller gene expression analyse.

I forhold til eksisterende metoder, der enten kultur en enkelt endotel celletype eller live animalsk systemer, præsenteres dette analysen bruger kombination af ex vivo aorta væv og BME. Denne opsætning gør det muligt for brugeren at få både kvalitative og kvantitative data belyse angiogene egenskaber for celle terapi kandidater. Kombinere BME og multi-cellulære ex vivo væv giver egenskaber nøje efterligne den mikromiljø, som terapeutisk celletype kan opstå efter lokal administration. På grund af muligheden for et stort antal paralleller og tæt kontrol over kultur betingelser er operatør forsynet med et system, der indeholder nødvendige elementer for pålidelig evaluering, mens fjerne variabler og uoverensstemmelser fundet i dyremodeller. Vurderinger er desuden mere realistisk, fordi det reducerer omkostningerne og behovet for gentagne animalske procedurer. Enkelt celle assays og mest dyremodeller mangler faktorer og variabler indført af immunrespons, der ville ellers opstå i den kliniske anvendelse af celle terapi kandidater. Det inflammatoriske respons ændrer angiogenese og derfor den terapeutiske effekt af implanterede stoffer eller celler kan ikke kvantificeres præcist. Aorta ring assay udelukker mange inflammatoriske komponenter, der ville forstyrre assay målinger. Det indeholder dog bosiddende makrofager, der er vigtige aktører i microvasculature udvikling32. Med den let identifikation af både endotel netværk og prestained menneskelige celler, kan effekten af MSC udskilles inflammatoriske cytokiner, og endda cellulære elementer af immunforsvaret, let observeres ved hjælp af denne analyse.

Høj kontrol af brugeren over assay betingelser og opsætningen af eksperimenterende reproducerbare karakter giver mulighed for indførelsen af yderligere elementer til systemet. For det første, aorta ring assay kan bruges som en skade model. Efter indlejring af aorta ringe og endotel spiring assays kan blive introduceret til iskæmisk skade, provokerende faktorer (TNF-α) eller bakteriel LPS (LPS), efterfulgt af MSC tilføjelse til at bestemme mulige redning af angiogene svar efter skade. For det andet, for at belyse de mulige mekanismer af hvordan MSCs bidrage til angiogene svar, neutralipift antistoffer kan udnyttes til at lukke munden på potentielle receptorer afgørende for celle-til-celle interaktioner. Endelig, for at undersøge paracrine egenskaberne af MSC'er, aorta ring analysen kan være setup i et transwell system til at udelukke virkningerne af celle-til-celle interaktioner af angiogene svar, men fokus på paracrine egenskaber.

Sammenfattende aorta ring assay kan vurdere evnen og styrken af celle terapi kandidater at mægle ECM forarbejdning, migrere til områder af angiogenese, og bidrage til fartøj udvikling gennem fysisk kontakt. Aorta ring ex vivo angiogenese assay kan udvikles som et værdifuldt og kvantitative pre-screening værktøj til kandidat cellelinjer til regenerativ terapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Clifford L. Librach er fælles indehaveren af patentet: metoder til isolering og brug af celler, der stammer fra første trimester navlestrengen væv. Ydes i Canada og Australien.

Acknowledgments

Forfatterne takke de følgende medarbejdere og forskning personale: Andrée Gauthier-Fisher, Matthew Librach, Tanya Barretto, Tharsan Velauthapillai og Sarah Laronde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alpha-MEM Gibco 12571071 For FTM HUCPVC and BMSC culture media.
APC-conjugated anti human TRA-1-85 R&D Systems FAB3195A Human-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting
Basal membrane extract (BME) (Matrigel) Corning 354234 For aorta embedding
Bullet-kit Lonza CC-3162 Includes: Gentamicin/Amphotericin-B
(GA)human Epidermal
Growth Factor (hEGF); Vascular
Endothelial Growth Factor (VEGF); R3-
Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1);
Ascorbic Acid; Hydrocortisone;
human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum
(FBS). Required to prepare EGM
CellTracker Green CMFDA Dye Thermo-fisher C2925 For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs
CKX53 Culture Microscope Olympus For bright-field imaging of endothelial network development
Countess automated cell counter Invitrogen C10227 Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR
Dispase StemCell technologies 7923 For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C)
Disposable sterile scalpels VWR 21909-654 For sectioning aorta
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma-Aldrich D8537 PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride
Endothelial basal media (EBM) Lonza CC-3156 Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS
Ethanol, 70%, Biotechnology Grade VWR 97064-768 To sterilize surfaces
EVOS Life Technologies In-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration
Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone) GE Healthcare SH3039603 Serum component of cell culture medium
FITC-conjugated anti-CD31 antibody BD 558068 Human endothelial marker for flow cytometry
FITC-conjugated anti-CD146antibody BD 560846 Human pericyte marker for flow cytometry
Forceps Almedic 7727-A10-704 For handing rat tissue. Can use any similar forceps
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Life Technologies 14175-094 1X Without calcium chloride and magnesium chloride
HERAcell 150i CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific 51026410 For incubating cells
Human Angiogenesis RT2 profiler PCR array Qiagen PAHS-024Z Human specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction
ImageJ Open source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin
LSR II BD UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.
MoFlo Astrios Beckman Coulter UHN SickKids FC Facility. For cell sorting.
Penicillin/streptomycin Gibco 15140122 Antibiotic component to buffers and cell culture medium
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 For RNA purification. Includes cell lysis buffer
RT2Easy First Strand Kit Qiagen 330421 For preparation of cDNA for qPCR
RT2PreAMP cDNA Synthesis Kit Qiagen 330451 Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA
Surgical scissors Fine Science Tools 14059-11 For cutting skin, muscle and aorta
Sterile gauze VWR 3084 To dampen and sterilize chest fur
TrypleE Thermo Fisher Scientific 12605036 MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C
0.2 μm pore filtration unit Thermo Fisher Scientific 566-0020 To sterilize tissue culture media
0.25% Trypsin/EDTA Gibco 25200056 For cell dissociation, pre-warm at 37 °C
10 cm tissue culture dishes Corning 25382-428 For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture
12 well-cell culture plates Corning-Sigma Aldrich CLS3513 For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures
15 mL tube BD Falcon 352096 For general tissue culture procedures
70 μm cell strainer Fisherbrand 22363548 To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  2. Hoeben, A., Landuyt, B., Highley, M. S., Wildiers, H., Van Oosterom, A. T., De Bruijn, E. A. Vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacol Rev. 56 (4), 549-580 (2004).
  3. Khan, T. A., Sellke, F. W., Laham, R. J. Gene therapy progress and prospects: therapeutic angiogenesis for limb and myocardial ischemia. Gene Ther. 10 (4), 285-291 (2003).
  4. Gupta, R., Tongers, J., Losordo, D. W. Human studies of angiogenic gene therapy. Circ Res. 105 (8), 724-736 (2009).
  5. Chu, H., Wang, Y. Therapeutic angiogenesis: controlled delivery of angiogenic factors. Ther Deliv. 3 (6), 693-714 (2012).
  6. Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits? Discov Med. 9 (46), 179-184 (2010).
  7. Said, S. S., Pickering, J. G., Mequanint, K. Advances in growth factor delivery for therapeutic angiogenesis. J Vasc Res. 50 (1), 35-35 (2013).
  8. Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro Oncol. 7 (4), 452-464 (2005).
  9. Leeper, N. J., Hunter, A. L., Cooke, J. P. Stem cell therapy for vascular regeneration: adult, embryonic, and induced pluripotent stem cells. Circulation. 122 (5), 517-526 (2010).
  10. Sieveking, D. P., Ng, M. K. Cell therapies for therapeutic angiogenesis: back to the bench. Vasc Med. 14 (2), 153-166 (2009).
  11. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90 (3), 195-221 (2009).
  12. Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49 (1), 32-40 (2003).
  13. Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
  14. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).
  15. Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).
  16. Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
  17. Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. J Cell Mol Med. 13 (10), 4113-4136 (2009).
  18. Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat Protoc. 7 (1), 89-104 (2011).
  19. Guo, J., et al. A secreted protein (Canopy 2, CNPY2) enhances angiogenesis and promotes smooth muscle cell migration and proliferation. Cardiovasc Res. 105 (3), 383-393 (2015).
  20. Wittig, C., Scheuer, C., Parakenings, J., Menger, M. D., Laschke, M. W. Geraniol Suppresses Angiogenesis by Downregulating Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)/VEGFR-2 Signaling. PLoS One. 10 (7), e0131946 (2015).
  21. Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biol Proced Online. 4, 24-31 (2002).
  22. Caplan, A. I. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine. J Cell Physiol. 213 (2), 341-347 (2007).
  23. Caplan, A. I., Dennis, J. E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J Cell Biochem. 98 (5), 1076-1084 (2006).
  24. Keating, A. Mesenchymal stromal cells: new directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
  25. Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212 (3), 702-709 (2007).
  26. Tang, Y. L., et al. Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction. Ann Thorac Surg. 80 (1), 229-236 (2005).
  27. Caplan, A. I. All MSCs are pericytes? Cell Stem Cell. 3 (3), 229-230 (2008).
  28. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
  29. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
  30. Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
  31. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  32. Gelati, M., Aplin, A. C., Fogel, E., Smith, K. D., Nicosia, R. F. The angiogenic response of the aorta to injury and inflammatory cytokines requires macrophages. J Immunol. 181 (8), 5711-5719 (2008).

Tags

Udviklingsmæssige biologi sag 127 angiogenese aorta ring assay celle migration endotel netværk mesenkymale stromale celler fysiske interaktioner paracrine faktorer perivascular celler navlestrengen
Aorta Ring Co kultur Assay: Et praktisk værktøj til at vurdere angiogene af mesenchymale stromale celler <em>In Vitro</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iqbal, F., Gratch, Y. S., Szaraz,… More

Iqbal, F., Gratch, Y. S., Szaraz, P., Librach, C. L. The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (127), e56083, doi:10.3791/56083 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter