Summary
Her presenterer vi en ny anvendelse av aorta ring analysen der prelabelled mesenchymal celler er co kulturperler med rotte aorta-avledet endothelial nettverk. Denne romanen metoden tillater visualisering av Mesenchymal Stromal celler (MSCs) homing og integrasjon med endotelial nettverk, kvantifisering av Nettverksegenskaper og evaluering av MSC immunophenotypes og gene uttrykk.
Abstract
Angiogenese er en kompleks, sterkt regulerte prosess som er ansvarlig for å gi og opprettholde tilstrekkelig vevsperfusjon. Utilstrekkelig blodkar vedlikehold og patologisk misdannelser kan resultere i alvorlig iskemiske sykdommer, mens altfor rikelig vaskulær utvikling er assosiert med kreft og inflammatoriske lidelser. En lovende form for pro-angiogenic terapi er bruken av angiogenic celle kilder, som kan gi regulatoriske forhold, samt fysiske støtte for nylig utvikle blodkar.
Mesenchymal Stromal celler (MSCs) er grundig undersøkt kandidater for vaskulær gjenfødelse deres paracrine effekter og deres evne til å oppdage og hjem iskemiske eller betent vev. Spesielt første trimester menneskelige navlestreng perivascular celler (FTM HUCPVCs) er en meget lovende kandidat på grunn av deres pericyte-lignende egenskaper, høy proliferativ og multilineage potensialet, immun rettigheter egenskaper og robust paracrine profil. For å effektivt vurdere potensielt angiogenic regenerativ celler, er det en forutsetning å teste dem i pålitelig og "oversettbare" pre-klinisk analyser. Aorta ring analysen er en ex vivo angiogenese modell som tillater enkel kvantifisering av rørformede endothelial strukturer, gir tilbehør støttende celler og ekstracellulær matrix (EFM) fra verten, utelukker inflammatorisk komponenter og er rask og billig å definere. Dette er en fordel i forhold til i vivo modeller (f.eks, hornhinnen analysen, Matrigel plug analysen); aorta ring analysen kan spore administrert cellene og observere intercellulære interaksjoner og unngå xeno-uimottakelig avvisning.
Vi presenterer en protokoll for en ny anvendelse av aorta ring analysen, som inkluderer menneskelige MSCs i co kulturer med utvikle rotte aorta endothelial nettverk. Denne analysen kan for analyse av MSC bidrag til rør formasjon og utvikling gjennom fysisk pericyte som interaksjoner og deres styrke aktivt migrering til områder av angiogenese og vurdere deres evne til å utføre og megle ECM behandling. Denne protokollen gir ytterligere informasjon om endringer i MSC fenotypen og gene uttrykk etter co kultur.
Introduction
Den komplekse prosessen med angiogenese forbedrer og opprettholder vevsperfusjon ved å fremme nytt blod fartøy utvikling fra eksisterende blodkar1. Det er en strengt regulert, balansert prosess av pro-angiogenic og anti-angiogenic faktorer. Noen mangel på dette systemet kan føre til utilstrekkelig fartøyet vedlikehold eller vekst, forårsaker alvorlig iskemiske sykdommer som hjerteinfarkt sykdom, slag og nevrodegenerative lidelser. Men er overdrevet vaskulær utvikling karakteristisk for forhold som kreft og inflammatoriske lidelser2.
Utvikle terapier som mål å kontrollere angiogenese for å oppnå gode vev gjenfødelse er viktig. Til tross for omfattende prekliniske og kliniske undersøkelser kunne forsøk på å stimulere angiogenese pro-angiogenic faktorer og microRNAs oppnå ønskede resultatene3,4,5. Mulige årsaker for forbigående effekter inkluderer: begrenset levetid angiogenic proteiner og nukleinsyrer og begrenset antall målrettet vekstfaktorer6,7. Selv om løselig angiogenic faktorer er avgjørende for å starte angiogenese, avhenger vedlikehold og funksjonalitet i blodkar støtte celletyper inkludert pericytes og glatt muskel celler8. Feltet av pro-angiogenic terapier er nå Utforsker mulige stilk cellen og stamfar celle kilder som kan gi angiogenic faktorer lokalt, mens fysisk støtter nylig utviklet blodkar, selvtillit fornyelse eller selv skille i endothelial-lignende celler9,10. Finne den optimale angiogenic celletyper med evne til å oppfylle disse funksjonelle krav har en store løftet for iskemiske vev gjenfødelse.
For å kunne oversette potensielle cellen-basert behandling til kliniske studier, må pre kliniske studier demonstrere deres effekt og markere underliggende angiogenic mekanismer. Til tross for det høye antallet etablerte angiogenese analyser, feltet mangler en "gull-standard" i vitro analysen som pålitelig kunne evaluere effekten av potensielle kandidat cellen typer11,12, 13. de fleste i vitro angiogenese analyser (inkludert endothelial spredning, migrasjon og rør formasjon analyser) vanligvis vurdere effekten av celler eller forbindelser på endotelceller phenotypical endringer eller differensiering inn rørformet og nettverk strukturer14,15. Mens disse funksjonene er kritiske for angiogenese, en "oversettbare" analysen bør også vurdere: 1) i augmentation eller utskifting av de støtte celletyper inkludert pericytes eller glatt muskelceller, 2) behandling av ECM og/eller kjelleren membran, og 3). effektiviteten til fremme dannelsen av funksjonelle microvasculature. I vivo angiogenese modeller, inkludert hornhinnen analysen og Matrigel plug analysen, recapitulate unike i vivo -microenvironment men er utfordret av problemer med sporing administrert celler å observere fysisk interaksjon. Videre kan i vivo modeller, xeno-uimottakelig avvisning oppstå mens testing potensielle allogene cellen terapi kandidater16. Ex vivo angiogenese modeller, spesielt aorta ring analysen kan gi: 1) lett observasjon og måling av rørformede strukturer, 2) tilbehør støttende celler, 3) ECM fra verten og kunstig forsyninger, 4) Utelatelse av inflammatoriske komponenter og 5) rask og billig17,18. Vanligvis kan aorta ring analysen teste angiogenic potensialet i små sekretoriske proteiner, farmakologiske agenter og transgene gnager modeller19,20,21.
MSCs er lovende kandidater for vaskulær gjenfødelse primært gjennom deres paracrine-mediert effekter22,23,24. MSCs har vist seg å skille ut viktige angiogenic faktorer inkludert vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), Hepatocyte vekstfaktor (HGF), Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1), grunnleggende Fibroblast vekstfaktor (bFGF) og angiopoeitin-1 (Ang-1)25 ,26. MSCs kan også detektere hjem iskemiske eller betent vev, men nøyaktig mekanismene er fremdeles under etterforskning. Økende grad støtter litteraturen hypotesen at de fleste MSCs oppstå fra perivascular cellene, co express pericyte indikatorer og kan oppføre seg som pericytes27. HUCPVCs er en ung MSCs avledet fra perivascular regionen navlestrengen menneskelig. De representerer en befolkning på MSCs med pericyte-lignende egenskaper og har vært preget fra både FTM og begrepet kontrollkabler. FTM HUCPVCs viser en høy uttrykk for pericyte inkludert CD146 og NG2, høy proliferativ og multilineage potensial, immun rettigheter egenskaper og vise en robust paracrine profil28. FTM HUCPVCs er en ideell kandidat celle type å fremme regenerering av skadde vevet gjennom bruk av nye blodkar via pericyte-lignende egenskaper.
For å teste angiogenic potensialet og pericyte-lignende egenskaper av menneskelig MSCs, er et svært begrenset antall angiogenese analyser tilgjengelig der positive angiotropic overføring (heretter referert til som "homing"), ECM behandling og utvikling av fysisk interaksjoner mellom celletyper kan undersøkes, mens skaffe kvantitative data på microvasculature utvikling.
Dette vil vi presentere en protokoll som beskriver en ny anvendelse av aorta ring analysen. Menneskelige MSCs var co kulturperler med utvikle rotte-avledet aorta endothelial nettverk for å vurdere deres bidrag til rør formasjon, modning og homeostase. Denne versjonen av aorta ring analysen vurderer evne og styrken på cellen terapi kandidater til hjem til nettsteder av angiogenese, utføre megle ECM behandling og bidra til endotelial rørformede utvikling gjennom etablering av pericyte-lignende fysiske interaksjoner. Kvantifisere virkningen MSCs på i vitro endothelial nettverk dannelse og observere intercellulære interaksjoner, optimalisert vi også en protokoll for å isolere MSCs fra co kulturer. Ved å utføre flowcytometri og qPCR, er det mulig å karakterisere endringer i MSC fenotypen og gene uttrykk etter co kultur. Som modell celletyper, vi sammenlignet ontogenetically tidlig (prenatal) og slutten (voksen) kilder for menneskelige MSCs: FTM HUCPVCs og menneskelige Ben margtransplantasjon-avledet MSCs (BMSC), henholdsvis i aorta ring analysen. Vi foreslår at aorta ring analysen kan brukes å studere angiogenic potensialet i en fysisk støtte celle type når under etterforskning for angiogenic regenerativ programmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle studier som involverer dyr ble gjennomført og rapportert etter ANKOMME retningslinjer 29. Alle studier ble utført med institusjonelle forskning etikk styret godkjenning (REB nummer 4276). Alle dyr prosedyrer ble godkjent av dyr omsorg University helse Network (Toronto, Canada), og alle dyr mottatt Human omsorg i samsvar med Guide og bruk av forsøksdyr, 8 th utgave ( Nasjonale institutter for helse 2011).
1. aorta Ring analysen Setup
- isolere rotte aorta.
- Euthanize 8 - 10-uke-gamle Sprague-Dawley rotter ved hjelp av CO 2 kvelning: angi 2 kammer til 20% gass erstatning (strømningshastighet = 0,2 x kammer volum/min). Bekreft ved fravær av knipe refleks og hjerte slår av palpating brystet.
- Våt pelsen på brystkassen sterilisert gasbind med 70% etanol. Bruke steriliserte tang og saks å gjøre et snitt i brystet midtlinjen og skjære gjennom hud og muskel lag.
- Når ribbe buret er utsatt, klipp ribbe buret på hver side og brett oppover cirka 5 mm fra sternum på hver side. Noe blødning er forventet fra interkostalrom arteries i frisk levningene.
- Skyve lungevev og hjertet til anatomiske høyre å avsløre aorta. Aorta er hvit farget fartøyet ligger ved siden av ryggraden.
- Bruk tang knip aorta (etter aortabuen) og bruke kirurgisk saks til å gjøre den første snittet mens du holder aorta med tang. Ved skjæring aorta, brystet hulrom raskt fyller med blod, derfor er det avgjørende å jobbe raskt for å få aorta før blodpropp.
- Bruk tang til å holde aorta og forsiktig skrelle aorta nedover, fra ryggraden. Trekk vil skille interkostalrom arteriene uten ytterligere snitt. Få ca 10 cm av vev og/eller før aorta deler inn i to grener i bukhulen og kuttet aorta av carcass. Presse membranen om nødvendig caudal retning til å få tilgang til lavere deler av aorta.
Merk: Skrell aorta forsiktig fordi intense kraft kan føre til rive. Hvis aorta tårer, la blodpropp i noen sekunder og bruker papirhåndkle fjerne koagulert blod, slik at synligheten av gjenværende aorta. - Plasserer aorta i en 15 mL tube med 10 mL iskald Hank ' s balansert Salt løsning (HBSS) supplert med 1% penicillin/streptomycin (P/S). Holde rørene på ice.
Merk: Aorta vevet kan vare i 1-2 h på is, men det er best å behandle den så raskt som mulig.
- Forberede aorta ring analysen kultur media i et sterilt biosikkerhet kabinett (BSC).
- Forberede Endothelial vekstmediet (EGF) ved hjelp av en filtrering enhet for å filtrere 500 mL Endothelial basale Medium (EBM) med 2% fosterets Bovine Serum (FBS), 1% gentamicin og vekst faktorer (se Tabell for materiale). Plasser 50 mL av filtrerte media i en perle eller vann bad på 37 ° C.
- Bruker en annen filtrering enhet for å filtrere 100 mL av EBM supplert med 2% FBS og 1% P/S til forberedt EBM 2% FBS (EBM-FBS) og lagre på 4 ° C.
- Coat 12-vel vev kultur plater med Basal membran ekstrakt (BME) mens du arbeider på is.
- Sted en 12-vel plate på en kald overflate (store isen pack eller brett). Legge til 200 µL/godt av fersk tinte BME bruker kjøling pipette-spisser og virvel BME slik aften belegging. Arbeider raskt for å unngå ujevn polymerisering av BME.
Merk: En typisk aorta excision gir 20 aorta ringer. Kontoen for variasjon mellom aorta ring analyser, setup minst tre aorta ring analyser per behandlingsgruppe og inkluderer en kontroll. Hvis kilden tillater, 6 rings per behandlingsgruppe anbefales. - Plasser belagt plater i fuktet inkubatorer (95% relativ fuktighet, 37 ° C, 5% CO 2, disse betingelsene gjelder alle fuktet inkubator trinnene heretter) for 30 min. sted 1000 µL pipette-spisser tilbake i 20 ° C for trinn 1.5.3.
Merk: Mens de basale membranen brukes i lager konsentrasjon, dens konsistens og stivhet strengt kontrollert av polymerisasjon tiden. Hold nøyaktig samme polymerisasjon tidspunktene for alle parallels og uavhengige eksperimenter.
- Sted en 12-vel plate på en kald overflate (store isen pack eller brett). Legge til 200 µL/godt av fersk tinte BME bruker kjøling pipette-spisser og virvel BME slik aften belegging. Arbeider raskt for å unngå ujevn polymerisering av BME.
- Delen aorta i uniform ringer.
- Ta aorta fra 15-mL røret og legg den i en 10 cm parabolen med 10 mL av ferske HBSS med 1% P/S.
- Bruke to sett med tang til å nøye skille overflødig bindevev, fettvev og bruk skalpell for gjenværende grenene av interkostalrom arteriene koblet til aorta. Dette reduserer variasjon mellom ring enheter basert på ulike nivåer av gjenværende vev. Fjern alle gjenværende koagulert blod fra innsiden av aorta.
- Plasser en linjal eller rutenett under 10 cm parabolen med presist kutt 1-2 mm bredt deler av aorta sterilt skalpell og tang. Kutte delene så nøyaktig som mulig å redusere variasjonen mellom enheter.
- Bygge aorta ringene i BME.
Merk: Hvis inndeling av aorta ringer ikke er fullført før BME polymerisasjon inkubering, fjerne belagt plater fra fuktet inkubatorer og tilsett 100 µL av EBM hver brønn å avslutte polymerisasjon. Nøyaktig tidspunkt er kritisk over polymerisering av BME kan forstyrre endothelial nettverk utvikling og celle migrasjon. Når aorta ringene er forberedt, fjerne EBM fra brønnene og fortsette fra trinn 1.5.2.- Fjerne BME belagt brønnene fra fuktet inkubatorer og gå tilbake til BSC.
- Nøye hente personlige aorta ringer med tang og Plasser en i hver BME-belagt brønn. Gjenta for gjenværende aorta ringene.
Merk: Media overført sammen med aorta ringen bør holdes minimal for å unngå polymerisasjon uregelmessigheter. - Bruk avkjølt (20 ° C) 1000 µL pipette-spisser legger 300 µL av BME på hver aorta ring og jevnt distribuere BME rundt brønnen.
- Returnerer de innebygde aorta ringene fuktet inkubatorer for 30 min.
- Fjerner platene med innebygd aorta ringen fra fuktet inkubatorer og sakte legger 1000 µL av EGM (forberedt og oppvarmet på trinn 1.2.1) ved å plassere pipette tips mot veggen av kulturen godt.
Merk: Direkte pipettering medier på BME kan forstyrre polymerized BME og hindre kontinuerlig endothelial utbygging. Bruk et passende flerkanals pipette hvis tilgjengelig. - Etter 24 h, fjerne 1000 µL av EGM og erstatte med 1000 µL av EBM-FBS utarbeidet i trinn 1.2.2, igjen av sakte pipettering mot siden av kulturen godt.
- Opprettholde aorta ring analysen ved å erstatte 500 µL av EBM-FBS med 500 µL av fersk EBM-FBS (37 ° C) hver 48 h.
Merk: Se secsjon 2 starte MSC kultur ekspansjon på samme dag som aorta ring analysen etablering. Dette vil sikre at MSCs er klar for co kultur når endothelial nettverkene er klar. - Bruke lyse feltet mikroskopi for å følge aorta ring analysen endothelial utbygging (se figur 1 som referanse for optimal utbygging). Når endothelial nettverk aspekt er som vist i figur 2, fortsette med å sette opp aorta ring analysen-MSC co kulturer (del 3). Se trinn 4.1 forhør Imaging endothelial nettverkene.
2. Vev kultur
- forberede lager løsninger av vev kultur medier.
- Kultur FTM HUCPVCs (tidligere etablerte, n ≥ 3 uavhengige linjer for hver) 30 og kommersielt tilgjengelige BMSCs i alpha-MEM supplert med 10% FBS og 1% P/S.
- Sterilisere media med 0,2 µm pore størrelse filter flasker.
- Lagre forberedt media løsninger på 4 ° C 3 uker.
- Opprettholde FTM HUCPVC og BMSC kulturer i fuktet inkubatorer og ved 70-80% confluency etter fase kontrast mikroskopi. Bruk passende mengder media for størrelsen på vev kultur parabol brukes (i.e. 10 mL i 10 cm parabol). Bruke disse kultur betingelser for å opprettholde og passaging av MSCs.
- Dissociate MSC monolayers for passaging eller aorta ring analysen-MSC co kulturer bruker en dissosiasjon enzym løsning (4 mL/10 cm parabolen) og ruge i fuktet inkubatorer for 3 min. sikre avdeling av cellene med lyse feltet mikroskopi; ruge for en ytterligere 1-2 min eventuelt.
- Forflytning dissosiert cellene i en 15 mL tube og sentrifuger 400 x g i 5 min.
- Sug opp nedbryting uten å forstyrre det cellen pellet og resuspend cellene i 1 mL av en passende kultur medier (alpha-MEM komplett media for passaging celler eller EBM-FBS for aorta ring analysen/MSC co kulturer) for opptelling bruker en celle teller.
3. Utarbeidelse av aorta Ring analysen/MSC co kulturer
- frø 10 4 MSCs på hver innebygd aorta ring (9000 celler/cm 2 / 12-vel plate). Basert på antall aorta ring analyser, før flekken MSCs med levedyktig, overførbar fluorescerende farge. Opprettholde minst tre brønner aorta ringer uten MSCs for en kontrollgruppe.
- Flekken 10 5 MSCs/mL EBM-FBS media, legge til 2,5 µL av levedyktig, ikke-overførbar fluorescerende farge/mL media (5 µM) i en 15 mL og plasser i fuktet inkubator for 30 min. Bland forsiktig røret halvveis gjennom inkubasjon.
- Følgende de 30 min incubation, Legg 1 volumet av frisk EBM-FBS til farget cellene og spinne på 400 x g i 5 min.
- Fjern nedbryting og å suspendere celle pellet i 1 mL av EBM-FBS media. Bekrefte vellykket farging av MSCs bruker fluorescens mikroskopi.
- Fjern aorta ring inneholder platene settefiskanlegg fuktet og fjerne 500 µL av EBM-FBS fra hver brønn.
- Frø nøye 10 4 MSCs i 500 µL av EBM-FBS på hver innebygd aorta ring av jevnt pipettering rundt endothelial nettverkene. Sikre jevn fordeling ved forsiktig risting kultur plate.
- Legge til flere EBM-FBS for å sikre at det totale volumet av media på aorta ring analysen/MSC co kulturer 1000 µL.
- Bruk fluorescens mikroskopi for å visualisere fluorescently merket MSCs i aorta ring analysen.
4. mikroskopi
- Bruk lyse-feltet mikroskopi å image rotte endothelial nettverkene før aorta ring analysen/MSC co kulturer for opprinnelig plan (dag 0) måling av endothelial Nettverksegenskaper (f.eks, nettverk lengde, nettverk løkker). Bilde 4 quadrants per brønn fra aorta ringen til delen lengst endothelial Network i at kvadranten.
- Bilde av aorta ring-nettverk etter aorta ringen kulturer analysen/MSC co dager 3, 5 og 7. Bruke disse bildene for å kvantifisere MSC effekten på endothelial nettverksutvikling.
- Bruk fluorescens mikroskopi for å image pre merket MSCs i aorta ring analysen.
- Følgende 24 timer av aorta ring analysen/MSC co kulturer, bruke fluorescens mikroskopi visualisere MSC homing, forlengelse og integrering med endotelial nettverk. Overlappe fluorescerende bilder av MSCs med lyse feltet bilder av endotelceller å observere colocalization begge celletyper.
- Bilde av MSCs lokalisert innenfor utviklet endothelial nettverkene proksimale til aorta ring vev og MSCs lokalisert innenfor nylig utvikle nettverk distale til aorta ring vev ( figur 2).
5. Flow cytometri og qPCR
- dagen før dissociating aorta ring endothelial nettverk, tine frosne dispase på 4 ° C O/N. delen 5.3 er identiske for både flowcytometri og qPCR.
- Varme 50 mL av dispase og 50 mL av 0,5% trypsin i 37 ° C perle eller vann bath.
- Hente celler for analyse fra aorta ring analysen/MSC co kulturer.
- Etter 1 uke av aorta ring analysen/MSC co kultur, fjerner kultur media og legger 1 mL av Phosphate-Buffered saltvann (PBS) sakte å hver godt for 3 min og fjerne. Gjenta denne vask to ganger mer.
- Legge til 800 µL av pre varmet dispase i hver brønn og ruge i fuktet inkubatorer for 15 min.
- Fjern platene fra fuktet inkubatorer suspendere dispase av pipettering (5-10 x) å bryte opp BME og overføre innholdet i hver brønn i separate 15 mL rør.
- Gjenta trinn 5.3.3 igjen med fersk forvarmes dispase til ingen gjenværende BME er observert i kultur godt. Legge 1 volum på PBS med 3% FBS til dispase-cellen suspensjon å deaktivere i dispase. Fjerne aorta ringene flytende i cellen suspensjon med pipette-spisser.
- Spinne av cellen suspensjon 400 x g for 5 min. fjerner nedbryting nøye, forlater 3 mL celle suspensjon i 15 mL tube.
Merk: En tydelig, solid pellets kan ikke være synlig men celler og BME. - Legge 3 mL prewarmed 0,5% trypsin til celle suspensjon og kraftig resuspend (5-10 x av pipettering) celler. Inkuber trypsinized celle løsningene i de fuktet inkubatorer for 10 min.
- Fjerne av trypsinized celle suspensjon fra fuktet inkubatorer og legge 6 mL av PBS med 3% FBS og resuspend noen times. Spinn av cellen suspensjon 400 x g for 5 min.
- Nøye fjerne alle nedbryting, forlater cellen pellet i røret og resuspend celler i 1 mL PBS med 3% FBS i hver retning.
- Filtrerer 1 mL celle suspensjon med en 70 µm celle sil fjerne oppsamlet celler og gjenværende BME fra cellen suspensjon. Telle celler i 1 mL av cellen hjuloppheng med en celle teller.
- Forberede cellene for flowcytometri.
- Incubate cellen suspensjoner (10 5 celler i 200 µL PBS med 3% FBS) med fluorophore-konjugerte (FITC eller APC) primære antistoffer (TRA-1 - 85-, CD146, CD31) konsentrasjon = 1:40) 4 ° C i 30 min, beskyttet fra lys.
Merk: Flowcytometri for MSCs var optimalisert ved Hong et al., 2013 28. Minimum 10 000 celler kreves for nøyaktige målinger. - Etter den 30 min inkubering, resuspend cellene i 2 mL PBS med 3% FBS og sentrifuger (400 x g, 5 min).
- Holde cellene på 4 ° C beskyttet fra lys til analyse av flowcytometri (minst 1 x 10 4 hendelser) i 1 time. Hvis den gating strategien, kan du se utfyllende figur 1. Sortere menneskelige MSCs bruker anti-TRA-1-85 (APC) (konsentrasjon: 1:40 og i 0,5% FBS/PBS) og sortere celler i 350 µL av cellen lyseringsbuffer for qPCR analyse.
Merk: Lysed celler kan lagres på-80 ° C i opptil 3 måneder for fremtidige qPCR analyse.
- Incubate cellen suspensjoner (10 5 celler i 200 µL PBS med 3% FBS) med fluorophore-konjugerte (FITC eller APC) primære antistoffer (TRA-1 - 85-, CD146, CD31) konsentrasjon = 1:40) 4 ° C i 30 min, beskyttet fra lys.
- Forberede cellene qPCR analyse.
- Isolere RNA fra lysed celler med kolonne-baserte RNA isolasjon kits og bestemme RNA konsentrasjonen og kvaliteten.
- Forberede cDNA fra opptil 5 µg av per 100 µL revers transkriptase reaksjon. Utføre en pre forsterkning trinnet hvis RNA avkastningen er lav (< 10 ng/µL). Bruk av mindre enn 100 ng av vil resultere i en høy grad av feilaktige negativer.
Merk: CDNA malene kan lagres på 20 ° C for videre analyse for inntil 4 måneder. - Utføre qPCR ved hjelp av angiogenese uttrykket profiler matriser til å oppdage endringer i genuttrykk. Bruk 5 ng av cDNA per reaksjon (40 sykluser, 60 ° C annealing/utvide temperatur). Uttrykke fold endring av uttrykk i forhold til udifferensierte MSC avledet cDNA prøver. Kjøre riktige negative kontroller (aorta ring uten menneskelig MSCs).
6. Nettverk kvantifisering følgende aorta Ring analysen/MSC co kulturer
- nedlasting bildebehandlingsprogramvare som ImageJ sammen med angiogenese Analyzer plugin 31.
- Importere endothelial nettverk bildene tatt og åpne programmvre.
- Konvertere bildet skalaer basert på spesifikasjoner av mikroskopet brukes.
- Bruke lineær verktøy for å måle radial nettverk veksten.
- Teller endothelial nettverk looper med verktøyet celle counter (looper med minst 4 sider bør kvantifiseres).
- For ekstra kvantifisering av Nettverksegenskaper bruke angiogenese Analyzer plugin eller andre liknende plugins for å analysere master segmenter, total lengde, totalt nettverksområder og antall veikryss. Bruke Uskarp maske-verktøyet for å uskarphet aorta ring vev og tomme mellomrom for å unngå falske positive beregninger.
- Overføre verdiene til en statistikk program og graph endothelial Nettverksegenskaper etter aorta ring analysen/MSC co kulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Skjematisk arbeidsflyten for å etablere aorta ring/MSC co kultur analysen er demonstrert i figur 1. De viktigste trinnene inkluderer: rotte aorta isolasjon, skjæring og innebygging av aorta ringene, overvåking endothelial spirende og utbygging, og endelig merking og administrasjon av MSCs. Tidslinjen endothelial nettverk analysen skisserer vinduet for analysene mulig for hver periode av co dyrking: dag 1, 5 & 7. Tilleggsmerknader utheves stiplede boksene.
Identifikasjon av strukturelt atskilte områder i aorta ring endothelial cellekulturer utføres av lyse feltet mikroskopi, 3-5 d etter aorta ringene er innebygd i ECM (figur 2). Ustrukturert området (figur 2A) karakteriseres som et område av høy celle spredning men lav strukturelle organisasjon i nærheten av aorta vev. Utviklet endothelial nettverk (figur 2B) se regioner med høy strukturelle organisasjon, der nettverk er fullt etablert og hovedsakelig består av lukkede sløyfer, selv før tillegg av MSCs. Utvikle nettverk (figur 2C) ligger på distale områder av endothelial kulturer. Dette er nettstedene til endotelial celle migrasjon og forlengelse som det nye nettverk strukturer skjemaet. Ovennevnte 3 regioner er lett identifiserbare gjennom eksperimenter og brukes når refererer der MSCs hjem til i co kulturer. De prelabelled MSCs skal co kulturperler med aorta ring analysen når alle tre nettverkssegmenter har utviklet. Kvantifisering av endothelial nettverk etter MSC co kulturer inkluderer regioner i industriland og utviklingsland nettverk (figur 2, hvit ramme).
Fluorescens mikroskopi tillater kvalitativ måling av MSC migrasjon, integrasjon og morfologi sammen med utvikle endothelial nettverk i aorta ring-MSC co kultur analysen (Figur 3). MSCs merket med levedyktig, cytoplasmatiske fluorophore ble fotografert 24 timer etter administrasjon co kulturer. FTM HUCPVCs ble funnet i utkanten av utvikle endothelial nettverkene, vises langstrakt cellen morphologies og bidro til videre utvikling av endothelial nettverk (figur 3A, B). Til sammenligning homed BMSCs til utvikle nettverk mens mindre interaksjon med endotelceller (Figur 3 c, D). Forstørring bilder på 72 h viste at FTM HUCPVCs opprettholdt høy dekning og stabilisering av endothelial nettverk mens BMSCs i co kulturer presentert med sfærisk morphologies med begrenset integrering i endothelial nettverk (figur 3E , F). De observerte forskjeller tydelig vise de kvalitative, funksjonelle forskjellene mellom menneskelig MSC. En terapeutisk kandidat celle type som har betydelige homing og egenskaper endothelial integrasjon (figur 3A, B & E) skiller seg ut i forhold til en celle med begrenset endothelial nettverksintegrasjon og augmentation mulighetene (Figur 3 c, D & F).
Forstørring fluorescens mikroskopi bildene ble anskaffet å ytterligere analysere fysiske interaksjonene mellom endotelceller og FTM HUCPVCs i rørformede nettverk. Den pre merket FTM HUCPVCs (figur 4A, grønn) vises følge med unstained kvinne endotelceller (figur 4A, hvite piler). FTM HUCPVCs fant gir strukturell støtte til endotelceller ved som en akse og vedlegg overflate mellom noder. De endothelial aorta ring-nettverkene kan også være pre merket med en levedyktig fluorophore på samme måte som MSC flekker (figur 4B, rød). I dobbel farget co kulturer avslørte fluorescens mikroskopi langstrakt adhesjon mellom de to cellen, befeste observasjon av samarbeid og støttende celle atferd.
Kvantifisering av endothelial strukturelle Nettverksegenskaper ble utført på dag 5 av MSC co kulturer (figur 5). Uniform kvadranter ble definert for måling gjennom hele aorta ring endothelial nettverk (figur 2, hvit ramme). Mener nettverksvekst beregnet som avstanden fra første proksimale lukket nettverk løkkene av aorta ring til lengst distale lukket looper (radius størrelse) (figur 5A). Mener nettverk veksten av aorta ring-MSC co kulturer var som følger: FTM HUCPVCs (2,98 ±0.3 mm) og BMSCs (1,5 ±0.15 mm). Ubehandlet endothelial nettverkene utviklet en mener radius 1,9 ±0.1 mm. Statistisk sammenligningen mellom MSC behandling viste at FTM HUCPVCs bidro til betydelig større nettverksvekst i forhold til BMSCs og ubehandlet nettverk (p ≤0.001). Ubehandlet endothelial nettverk utviklet seg betydelig mer enn BMSC som inneholder co kulturer (p ≤0.01) (figur 5B).
Det totale antallet sløyfer var beregnet i hvert land og uttrykt som gjennomsnittlig totale loop dannelse (figur 5C). Gjennomsnittlig antall totale lukkede sløyfer var som følger: FTM HUCPVC behandlet co kulturer (81 ±7), BMSCs (26 ±3) og ubehandlet ringer (55 ±7). FTM HUCPVCs bidro betydelig større endothelial loop-formasjonen i forhold til BMSCs (p ≤0.01) og ubehandlet nettverk (p ≤0.01). BMSC co kulturer resulterte i færre endothelial nettverk looper sammenlignet med ubehandlet nettverk (p ≤0.01). Denne kvantifisering identifiserer en celle type som har en betydelig positiv effekt på endothelial utbygging (FTM HUCPVC) og en celle type som kan selv forringe endothelial nettverk. Det skal bemerkes at den betydelig økt utbyggingen ble observert for å korrelere med MSC dekning på endothelial nettverk. Det antyder at direkte samspillet er avgjørende for MSCs kjøre deres støttende funksjon.
Mulige fallgruvene av aorta ring co kultur bedriftene er representert i figur 6. Utilstrekkelig eller ujevn polymerisering av BME er et problem som kan påvirke vellykket endothelial utbygging. Timing BME polymerisasjon i nøyaktig 30 minutter og overføre media uten å forstyrre polymer sikrer en intakt, funksjonelle BME fase (figur 6A). Farging av MSCs for langvarig inkubasjon ganger og la MSCs til pellets for lengre perioder kan forstyrre av cellen morfologi og fenotypen på co kulturer. Figur 5B viser FTM HUCPVCs farget 1t og tillattfor å pellets for 1 h før co kultur, begge er sub-optimale tidsberegninger. FTM HUCPVCs viser ikke preferanse til områder av endothelial nettverk og er spredt over hele nettverket. Sammenligne riktig behandlet celler (Figur 3) til feilsendt FTM HUCPVCs, feilsendt cellene avrundet celle morfologi og begrenset celle til celle interaksjon med endotelceller (figur 6B). Til slutt, hvis aorta ring analysen ikke kan opprettes ved dissection, aortas kan lagres på-80 ° C i EGF-C medier med 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) og 10% FBS. Endothelial nettverksutvikling kan ta 1-3 d lengre når tinte aorta ringer sammenlignet ferskt vev, men endothelial nettverk vil være tilstrekkelig for MSC co kultur etablering (figur 6C).
Som et alternativ fortsetter av aorta ring co kultur vurdering, kan mobilnettet brøkdel av BME innebygd aorta ringer trekkes ut og analyseres av flowcytometri (supplerende figur 1). Den menneskelige spesifikke markøren TRA-1-85 (supplerende figur 1A, B, y-aksen) positive celle befolkningen fra FTM HUCPVC som inneholder co kulturer ble identifisert som menneskelige MSCs. Co merking viste lav uttrykk på endothelial celle står CD31 (supplerende figur 1A) og høy uttrykket på pericyte står CD146 (supplerende figur 1B) i menneskelig spesifikk markør positiv celle befolkningen. Slike vurderinger kan dechiffrere eventuell immunophenotypic og avstamning forpliktelse endringer av MSCs indusert av samhandlingen med endotelceller, og gi ytterligere verdifull informasjon om testet cellen. For å få et tilstrekkelig antall celler for FC analyse, kan cellene utvunnet fra parallell brønner i samme eksperimentelle gruppe kombineres. Det er viktig å vurdere å bruke ikke-pre-farget MSC som inneholder aorta ringene for flyt cytometri analyse slik at den minner fluorescensen av levedyktig fargestoffet ikke forstyrrer signalet av antistoff-relaterte fluorophores. Ellers bør den negative gating ta pre farget celle fluorescens hensyn.
Vi sortert menneskelige MSCs utdraget skjemaet aorta ring co kulturer (dag 7 av co kultur) bruker human celle overflaten markør spesifikt antistoff (TRA-1-85). FTM HUCPVCs og BMSCs fra aorta ring analysen ble behandlet for qPCR analyse å teste uttrykk for angiogenic gener. Bruker et kommersielt tilgjengelig qPCR utvalg, gitt tre aorta ring co kulturer tilstrekkelig mengder av genetisk materiale å kvantifisere uttrykket av 84 menneskelig vekst faktor gener (supplerende figur 2A). Foreløpige resultatene indikerer at FTM HUCPVCs og BMSCs express nøkkel utskilles angiogenic faktorer på sammenlignbare nivåer (supplerende figur 2B). I tillegg sammenligner uttrykket nivåer av ulike celletyper i analysen, basert effekten av overføre celler til EBM analysen media fra deres ekspansjon kultur media bør betraktes. Når du bruker celler av høyere fenotypiske eller genetiske plastisitet, må en komparator kontrollgruppe menneskelig MSCs i EBM media - uten aorta vev - være inkludert i evalueringen.
Likheter i angiogenic faktor uttrykk for MSCs antyder at den betydelig forskjellen i deres nettverk augmentation ikke er et resultat av ulike paracrine aktiviteter. Dette er i samsvar med tidligere observasjon som økt direkte intercellulære interaksjon synes å fremme endothelial utbygging.
Figur 1: Skjematisk Diagram av en ny søknad av aorta Ring analysen.
De viktigste trinnene av installasjonen og analyse av MSC co kulturer med aorta ring analysen er skissert i solid bokser og flere merknader er skissert i stiplede bokser. Skala bar = 1000 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representant bilde av aorta Ring nettverk analyse.
Endothelial nettverk er delt inn i tre konsentriske områder basert på strukturelle forskjeller: ustrukturert området i nærheten aorta ring vev (A), utviklet/strukturert endothelial nettverk (B) og utvikle nettverk Hotellet ligger i utkanten av ex vivo vev kultur (C). Radial nettverksvekst og uniform kvadranten for løkkeantall defineres i utviklede endothelial nettverket (B). x: lukket endothelial sløyfe telles i uniform kvadrant. Skala bar = 250 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Fluorescerende Imaging of Network regionen-avhengige integrering av menneskelig MSCs i aorta Ring analysen etter 24 & 72 h.
Prestained (grønn) FTM HUCPVCs og BMSCs ble lagt til utvikle aorta ring endothelial tube nettverk. Fluorescens mikroskopi bilder tatt 24 timer etter å etablere MSC co kulturer vise FTM HUCPVCs overføre gjennom ECM og hjem til eksterne utvikle endothelial nettverk (A). Høyere forstørrelse bilder viser langstrakt morphologies av FTM HUCPVCs i nær kontakt med endotelial nettverk (B). Færre BMSCs prosessen ECM og hjem til endotelial nettverk med ingen observerbare preferanse til eksterne utvikle nettverk (C). BMSCs vise sfærisk celle morphologies (D).
Forstørring fluorescens mikroskopi bilder av prestained MSCs i rotte aorta ring analysen etter 72 h co kultur (E, F). FTM HUCPVCS presenterer langstrakt morphologies mens endothelial dekning gjennom direkte celle til celle interaksjon med endotelceller (solid hvite piler) både nettverksnoder og tubules (E). BMSCs opprettholde sfærisk celle morphologies i de endothelial nettverksnodene (F). Broken arrow representerer retning endothelial nettverk vekst fra aorta ring vevet. En C: Skala bar = 1000 µm B D: skalaBar = 400 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Forstørring fluorescens mikroskopi bilder av Pericyte-endothelial celle fysisk interaksjon.
Unstained kvinne endotelceller fant knyttet til kontinuerlig utstikkende deler koble pre farget FTM HUCPVCs i rørformede nettverket (A). Fluorescerende bilder av pre farget endothelial nettverk (EC, rød) med pre farget FTM HUCPVCs (FTM, grønn) viser interaksjoner recapitulating endothelial celle, pericyte vekselsvirkningene (B). A: skala bar = 100 µm B: skala bar = 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Kvantifisering av nettverksvekst i MSC behandling grupper 5 D etter co kultur etablering.
Lav forstørrelse fase kontrast mikroskopi bilder ble tatt fra aorta ring behandlingsgrupper å måle nettverksvekst og utvikling (A). Spredte pilen viser nettverksvekst. Skala bar = 250 µm. mikroskopi bilder ble brukt for å kvantifisere Nettverksegenskaper inkludert mener nettverksvekst og mener nettverk loop formasjon i en analysen kvadrant. FTM HUCPVCs bidro til større nettverksvekst i forhold til BMSC co kulturer og ubehandlet nettverk (p ≤0.001) (B). P verdien ble beregnet med en enveis ANOVA skal p <0,0001 bruker Tukey's Post test (N = 3). Nettverk looper med minst fire lukkede sidene kvantifisert (C). FTM HUCPVC kulturer co utviklet større nettverk looper i forhold til BMSC co kulturer (p ≤0.001) og ubehandlet nettverk (p ≤0.01). P verdien ble beregnet med en enveis ANOVA skal p < 0.0001 bruker Tukeys innlegg test (N = 3). Gjennomsnittet av 4 endothelial nettverk kvantifisert. Skala bar = 250 µm. Til parvis sammenligning * = p ≤0.05, ** = p ≤0.01, *** = p ≤0.001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Mulige feil i aorta Ring analysen etableringen.
Aorta ringer i ufullstendige BME polymerisasjon kan føre til inkonsekvent og brutt endothelial nettverk (A). FTM HUCPVCs farget i lange perioder med stor tid hull mellom flekker og etablere co kulturer, gir minimal homing og endothelial celle interaksjon (B). Endothelial nettverket fra rotte aorta lagret i-80 ° C og tint for aorta ring analysen (C). A: skala bar = 250 µm B, C: skala bar = 400 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1: Flyt cytometri analyse av menneskelig FTM HUCPVCs utdraget fra aorta Ring co kulturer.
Mobilnettet fraksjoner av aorta ring kulturer ble isolert og behandlet for flyt cytometri analyse. Fluorophore konjugert antistoff mot menneskelig bestemt celle overflaten markør (TRA-1-85, APC) ble brukt i kombinasjon med endotelial markør (CD31, FITC, (A)) eller pericyte markør (CD146, FITC, (B)) spesifikke antistoffer. Celle befolkningen positivt for menneskelig markøren (y-aksen) testet lav positivitet for endothelial markør CD31 (A, Q2) og høy positivt for pericyte markør CD146 (B, spørsmål 6). Dette tyder på at FTM HUCPVCs vedlikeholdt perivascular celleegenskaper i aorta ring co kulturer og ikke utvikle en endothelial fenotypen. Kvadrantene på tomter ble definert isotype kontroller matchende anvendt primære antistoffer. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 2: Kvantitative PCR analyse av viktige Angiogenic gener.
Den lignende genuttrykk av viktige angiogenic gener av FTM HUCPVCs og BMSCs etter 1 ukes co kultur i aorta ring analysen (A). Representant CT verdiene vises i tabellen (B). Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er flere kritiske stadier i å sette opp en vellykket aorta ring analysen MSC co kultur eksperiment. Først, de viktigste trinnene når isolere og snitting aorta er: 1) å skaffe utelukkende thorax segmentet av aorta; 2) nøye fjerne forgrening blodkar, forbinde og fettvev og; 3) kutte selv deler av aorta (~ 1 mm) å begrense variasjon mellom hver analysen. Andre er vellykket innebygging av aorta ringer i BME avgjørende for denne analysen. Hvis BME er ikke helt polymerized eller polymerized ujevnt, aorta ringene innebygd i BME vil ikke kunne starte endothelial spirende eller de kan utvikle usammenhengende endothelial nettverk. Hvis BME polymerisasjon er utilstrekkelig er analyser ikke pålitelig for kvantifisering. Tredje er komplett faktor-beriket endothelial media nødvendig å gi næring til aorta ringene å starte spirende. Når aorta ring ringer har igangsatt fartøyet spirende, omfatter neste kritiske kommende trinnene celle type skal testes. Dette må MSCs vellykket pre farget og administreres til spirende aorta ringene. Det er to viktige prosedyrer for denne delen. 1) velge passende dag for såing: nettverkene skal utvikle Stadium og ikke nå høy dekning av kultur godt. Hvis MSCs ikke administreres i tide, blir det utfordrende å kvantifisere netto effekten av av MSCs på utbygging. 2) prestaining MSCs før tillegg: Hvis MSCs er over farget eller forbli i pellets for en omfattende periode, clumping oppstår som svekker homing og integrasjon innenfor endothelial nettverk. Til slutt, kvantifisere nettverkene kan enkelt oppnås hvis aktuelle kontroller er forberedt. Aorta ringer uten MSCs vil utvikle endothelial nettverk fordi aorta selv støtter spirende, men av MSCs kan fremme større utbygging med forskjellige strukturer som beskrevet i dette manuskriptet. Kvantifisering av endothelial nettverk skal utføres minst 5 d følgende etablering co kulturer. På grunn av det lukket systemet, angiogenic svar er forbigående og endothelial nettverk starte degenereres etter ca 7 d. Hvis formålet med observasjon er å evaluere testet celle typeeffekt på utvikling av endothelial nettverk, skal bildene være ervervet innen den første uken av co dyrking.
En mulig endring av gjeldende analysen kan være bruk av primære menneskelig vev. Som en 1 mm del av rotte aorta gjør én enhet for co kultur, kan menneskelige aortas gi mange deler av svært konsistente målinger. Til tross for at svært begrenset levedyktig menneskelig primære vev antyder den høye effekten potensielle gjennomførbarhet. Når du utvikler en analysen for storskala evalueringer, betraktes pre danner analysen og lagring komponentene til celler for testing blir tilgjengelig. BME belegget kan være forberedt på vev kultur plater og lagret i en frossen, dehydrert form for lengre perioder. Også, som vi testet i vårt laboratorium, rotte aorta vev kan frosset og lagres for senere bruk, dermed gjør arbeid med den mest avgjørende elementet i analysen enklere.
Til tross for de mange fordelene av aorta ring analysen er det noen begrensninger skal vises. Først kan etableringen av analysen kulturer være utfordrende. I sin nåværende form krever programmet rutinemessig tilstrekkelig manuelle ferdigheter. Operatørfeil kan introdusere variasjon. Det kan speiles i nettverksvekst og kan gjøre det vanskelig å vurdere pålitelig effekten av administrert celler og dermed egenskapene viktig angiogenic. Men disse utfordringene er like om ikke mindre i forhold til de andre metodene som er tilgjengelige og nødvendige opplæringen perioden kan enkelt kort og økonomiske i motsetning til i vivo eksperimenter. Andre må løpet lag mellom innebygging av ex vivo aorta vevet og første nettverksutvikling som markerer av cellen administrasjon forklares av brukeren. Tredje kvantifisering av endothelial Nettverksegenskaper kan være tidkrevende, men kan løses ved å tilordne hallmark parametere, inkludert radial vekst, tube lengde og nettverk maske dimensjoner. Dette kan utføres ved hjelp av datastyrt analyse av bilder (bilde J), som kan betydelig redusere tiden som kreves for konsekvent og pålitelig kvantifisering. Fjerde kan variasjon mellom hver analysen oppstå som følge av liten inkonsekvenser i dyr tissue kilde og håndtering av operatøren. Vi fant at denne utfordringen kan overvinnes effektivt og kvantifiseringen blir statistisk pålitelig ved å definere triplicates for hver behandling. Til slutt, trekke ut og sortere cellene av menneskelige og rotten opprinnelse for etter analysen analyse kan være utfordrende. Bestemt proteinases, inkludert dispase og celle gjenopprettingsløsning kan imidlertid brukes til å gjenopprette celler for immunophenotypic eller gene expression analyse.
Sammenlignet med eksisterende metoder som kultur en enkelt endothelial celle type eller live dyr systemer, presentert dette analysen bruker kombinasjonen av ex vivo aorta vev og BME. Dette oppsettet kan du få både kvalitative og kvantitative data Klargjørende angiogenic egenskapene for cellen terapi kandidater. Kombinere BME og multi-mobilnettet ex vivo vev inneholder egenskaper tett etterligne microenvironment terapeutiske celle type kan støte etter lokal administrasjon. På grunn av muligheten for mange paralleller og tett kontroll over oppdrettsforholdene leveres operatør med et system som inneholder nødvendige elementer for pålitelig evaluering, mens eliminere variabler og inkonsekvenser funnet i dyr modeller. Videre er vurderinger mer gjennomførbart fordi det reduserer kostnadene og behovet for gjentatt dyr prosedyrer. Enkelt celle analyser og de fleste dyr modeller mangler faktorer og variabler introdusert av immunreaksjoner som ellers ville oppstå i klinisk anvendelse av cellen terapi kandidater. Inflammatorisk respons endrer angiogenese og derfor den terapeutiske effekten av implantert stoffer eller cellene ikke kan kvantifiseres nøyaktig. Aorta ring analysen utelukker mange inflammatorisk komponenter som ville forstyrre analysen målinger. Det inneholder imidlertid bosatt makrofager som er viktige aktører i microvasculature utvikling32. Med enkel identifisering av både endothelial nettverk og prestained menneskeceller kan effekten av MSC utskilles inflammatoriske cytokiner, og selv Mobiltlf elementer av immunsystemet, lett observeres ved hjelp av denne analysen.
Høy kontroll av brukeren over analysen betingelsene og reproduserbar natur eksperimentelle oppsettet gir innføring av ytterligere elementer i systemet. Først kan aorta ring analysen brukes som en skade-modell. Etter innebygging av aorta ringer og endothelial spirende, analyser kan bli introdusert til iskemiske skader, inflammatorisk faktorer (TNF-α) eller bakteriell lipopolysakkarid (LPS), etterfulgt av MSC-tillegg for å avgjøre mulig redning av angiogenic svar etter skade. Dernest for å belyse mulig mekanismer for hvordan MSCs bidra til angiogenic svaret, neutralizing antistoffer kan utnyttes for å stoppe potensielle reseptorer kritisk for celle til celle interaksjoner. Til slutt, for å undersøke egenskapene paracrine MSCs, aorta ring analysen kan installeres i et transwell system å ekskludere effekten av celle-til-celle interaksjoner angiogenic svar men fokus på paracrine egenskaper.
Oppsummert aorta ring analysen kan vurdere muligheten og styrken på cellen terapi kandidater å megle ECM behandling, overføre til områder av angiogenese og bidra til fartøyet utvikling gjennom fysisk kontakt. Aorta ring ex vivo angiogenese analysen kunne utvikles som en verdifull, kvantitativ screenings verktøy for kandidaten linjer for regenerativ therapy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Clifford L. Librach er felles innehaver av patent: isolasjon og bruk av cellene stammer fra første trimester navlestreng vev. Gitt i Canada og Australia.
Acknowledgments
Forfatterne takker følgende stab medlemmer og forskning personell: Andrée Gauthier-Fisher, Matthew Librach, Tanya Barretto, Tharsan Velauthapillai og Sarah Laronde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alpha-MEM | Gibco | 12571071 | For FTM HUCPVC and BMSC culture media. |
| APC-conjugated anti human TRA-1-85 | R&D Systems | FAB3195A | Human-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting |
| Basal membrane extract (BME) (Matrigel) | Corning | 354234 | For aorta embedding |
| Bullet-kit | Lonza | CC-3162 | Includes: Gentamicin/Amphotericin-B (GA)human Epidermal Growth Factor (hEGF); Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF); R3- Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1); Ascorbic Acid; Hydrocortisone; human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum (FBS). Required to prepare EGM |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo-fisher | C2925 | For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs |
| CKX53 Culture Microscope | Olympus | For bright-field imaging of endothelial network development | |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 | Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR |
| Dispase | StemCell technologies | 7923 | For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C) |
| Disposable sterile scalpels | VWR | 21909-654 | For sectioning aorta |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride |
| Endothelial basal media (EBM) | Lonza | CC-3156 | Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS |
| Ethanol, 70%, Biotechnology Grade | VWR | 97064-768 | To sterilize surfaces |
| EVOS | Life Technologies | In-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration | |
| Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone) | GE Healthcare | SH3039603 | Serum component of cell culture medium |
| FITC-conjugated anti-CD31 antibody | BD | 558068 | Human endothelial marker for flow cytometry |
| FITC-conjugated anti-CD146antibody | BD | 560846 | Human pericyte marker for flow cytometry |
| Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | For handing rat tissue. Can use any similar forceps |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-094 | 1X Without calcium chloride and magnesium chloride |
| HERAcell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026410 | For incubating cells |
| Human Angiogenesis RT2 profiler PCR array | Qiagen | PAHS-024Z | Human specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction |
| ImageJ | Open source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin | ||
| LSR II | BD | UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry. | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | UHN SickKids FC Facility. For cell sorting. | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotic component to buffers and cell culture medium |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA purification. Includes cell lysis buffer |
| RT2Easy First Strand Kit | Qiagen | 330421 | For preparation of cDNA for qPCR |
| RT2PreAMP cDNA Synthesis Kit | Qiagen | 330451 | Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | For cutting skin, muscle and aorta |
| Sterile gauze | VWR | 3084 | To dampen and sterilize chest fur |
| TrypleE | Thermo Fisher Scientific | 12605036 | MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C |
| 0.2 μm pore filtration unit | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | To sterilize tissue culture media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200056 | For cell dissociation, pre-warm at 37 °C |
| 10 cm tissue culture dishes | Corning | 25382-428 | For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture |
| 12 well-cell culture plates | Corning-Sigma Aldrich | CLS3513 | For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures |
| 15 mL tube | BD Falcon | 352096 | For general tissue culture procedures |
| 70 μm cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting |
References
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
- Hoeben, A., Landuyt, B., Highley, M. S., Wildiers, H., Van Oosterom, A. T., De Bruijn, E. A. Vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacol Rev. 56 (4), 549-580 (2004).
- Khan, T. A., Sellke, F. W., Laham, R. J. Gene therapy progress and prospects: therapeutic angiogenesis for limb and myocardial ischemia. Gene Ther. 10 (4), 285-291 (2003).
- Gupta, R., Tongers, J., Losordo, D. W. Human studies of angiogenic gene therapy. Circ Res. 105 (8), 724-736 (2009).
- Chu, H., Wang, Y. Therapeutic angiogenesis: controlled delivery of angiogenic factors. Ther Deliv. 3 (6), 693-714 (2012).
- Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits? Discov Med. 9 (46), 179-184 (2010).
- Said, S. S., Pickering, J. G., Mequanint, K. Advances in growth factor delivery for therapeutic angiogenesis. J Vasc Res. 50 (1), 35-35 (2013).
- Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro Oncol. 7 (4), 452-464 (2005).
- Leeper, N. J., Hunter, A. L., Cooke, J. P. Stem cell therapy for vascular regeneration: adult, embryonic, and induced pluripotent stem cells. Circulation. 122 (5), 517-526 (2010).
- Sieveking, D. P., Ng, M. K. Cell therapies for therapeutic angiogenesis: back to the bench. Vasc Med. 14 (2), 153-166 (2009).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90 (3), 195-221 (2009).
- Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49 (1), 32-40 (2003).
- Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
- Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
- Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. J Cell Mol Med. 13 (10), 4113-4136 (2009).
- Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat Protoc. 7 (1), 89-104 (2011).
- Guo, J., et al. A secreted protein (Canopy 2, CNPY2) enhances angiogenesis and promotes smooth muscle cell migration and proliferation. Cardiovasc Res. 105 (3), 383-393 (2015).
- Wittig, C., Scheuer, C., Parakenings, J., Menger, M. D., Laschke, M. W. Geraniol Suppresses Angiogenesis by Downregulating Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)/VEGFR-2 Signaling. PLoS One. 10 (7), e0131946 (2015).
- Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biol Proced Online. 4, 24-31 (2002).
- Caplan, A. I. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine. J Cell Physiol. 213 (2), 341-347 (2007).
- Caplan, A. I., Dennis, J. E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J Cell Biochem. 98 (5), 1076-1084 (2006).
- Keating, A. Mesenchymal stromal cells: new directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
- Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212 (3), 702-709 (2007).
- Tang, Y. L., et al. Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction. Ann Thorac Surg. 80 (1), 229-236 (2005).
- Caplan, A. I. All MSCs are pericytes? Cell Stem Cell. 3 (3), 229-230 (2008).
- Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
- Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Gelati, M., Aplin, A. C., Fogel, E., Smith, K. D., Nicosia, R. F. The angiogenic response of the aorta to injury and inflammatory cytokines requires macrophages. J Immunol. 181 (8), 5711-5719 (2008).
