Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Aorta Ring samtidig kultur analysen: Ett bekvämt verktyg för att bedöma angiogena Potential mesenkymala stromaceller In Vitro

Published: September 18, 2017 doi: 10.3791/56083
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2,3,4,5
1Create Fertility Centre, 2Department of Physiology, University of Toronto, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 4Department of Medical Sciences, University of Toronto, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Women's College Hospital

Summary

Här presenterar vi en ny tillämpning av aorta ring analysen där prelabelled mesenkymala celler är samtidig odlade med råtta aorta-derived endothelial nätverk. Denna nya metod kan visualisering av mesenkymala stromaceller (MSCs) homing och integration med endothelial nätverk, kvantifiering av Nätverksegenskaper, och utvärdering av MSC immunophenotypes och gen uttryck.

Abstract

Angiogenes är en komplex och starkt reglerad process som är ansvarig för att tillhandahålla och upprätthålla adekvat vävnadsperfusion. Otillräcklig vaskulatur underhåll och patologiska missbildningar kan resultera i svår ischemisk sjukdomar, medan alltför riklig kärlbildningsprocessen är associerad med cancer och inflammatoriska sjukdomar. En lovande form av proangiogena terapi är användningen av angiogena cell källor, som kan ge reglerande faktorer samt fysisk stöd för nyligen utveckla kärlsystemet.

Mesenkymala stromaceller (MSCs) är i stor utsträckning undersökta kandidater för vaskulär regenerering på grund av deras parakrin effekter och deras förmåga att upptäcka och hem till ischemisk eller inflammerade vävnader. Särskilt första trimestern mänskliga perivaskulär navelsträngsblod (FTM HUCPVCs) är en mycket lovande kandidat på grund av deras pericyt-liknande egenskaper, hög proliferativ och Multilinjärt potential, immun-privilegierade boenden och robust parakrin profilen. Effektivt utvärdera potentiellt angiogena regenerativa celler, är det en förutsättning att testa dem i tillförlitliga och ”översättas” pre-kliniska analyser. Aorta ring analysen är en ex vivo angiogenes modell som möjliggör enkel kvantifiering av tubulär endothelial strukturer, ger tillbehör stödjande celler och extracellulär matrix (ECM) från värden, utesluts inflammatoriska komponenter och är snabb och billig att ställa in. Detta är fördelaktigt jämfört med i vivo modeller (t.ex., korneal assay, Matrigel plug assay); aorta ring analysen kan spåra administrerade cellerna och observera intercellulära interaktioner samtidigt undvika xeno-immun avvisande.

Vi presenterar ett protokoll för en ny tillämpning av aorta ring analysen, vilket inkluderar mänskliga MSCs i samtidig kulturer med utveckla råtta aorta endothelial nätverk. Denna analys möjliggör analys av MSC bidrag till tube bildning och utveckling genom fysisk pericyt-liknande interaktioner och deras styrka för aktivt migrerar till platser av angiogenes, och för att bedöma deras förmåga att utföra och medla ECM-bearbetning. Detta protokoll ger ytterligare information om förändringar i MSC fenotyp och gen uttryck efter samtidig kultur.

Introduction

Den komplexa processen av angiogenes förbättrar och upprätthåller vävnadsperfusion genom att främja nytt blod fartyg från redan existerande kärl1. Det är en hårt reglerad, balanserad process av proangiogena och anti-angiogena faktorer. Eventuella brister i detta system kan leda till otillräcklig fartyg underhåll eller tillväxt, orsakar svår ischemisk sjukdomar inklusive hjärtinfarkt sjukdom, stroke och neurodegenerativa sjukdomar. Överdrivna kärlbildningsprocessen är emellertid karakteristiskt för villkor inklusive cancer och inflammatoriska sjukdomar2.

Utveckla terapier som syftar till att styra angiogenes för att uppnå gynnsam vävnadsregeneration är av avgörande betydelse. Trots omfattande prekliniska och kliniska undersökningar, har försök att stimulera angiogenes med hjälp av proangiogena faktorer och mikroRNA misslyckats med att uppnå önskat resultat3,4,5. Möjliga orsaker till övergående effekterna inkluderar: begränsad livslängd av angiogena proteiner och nukleinsyror och ändliga antalet riktade tillväxtfaktorer6,7. Även om lösliga angiogena faktorer är väsentliga för att initiera angiogenes, beroende underhåll och funktionalitet av kärlsystemet stödja celltyper inklusive pericyter och smidig muskel celler8. Fältet av proangiogena behandlingar nu undersöker potentiella stamceller och stamceller cell-källor som kan ge angiogena lokalt, medan fysiskt stödja nyligen utvecklat kärlsystemet, själv förnya eller ens skilja i endothelial-liknande celler9,10. Att hitta den optimala angiogena celltyper med kapacitet att uppfylla dessa funktionskrav rymmer ett stort löfte för ischemisk vävnadsregeneration.

För att framgångsrikt översätta potentiella cellbaserade terapier till kliniska prövningar, måste prekliniska studier Visa sin effekt och belysa de underliggande angiogena mekanismerna. Trots det höga antalet etablerade angiogenes analyser, fältet saknar en ”guld-standard” in vitro- test som på ett tillförlitligt sätt kan utvärdera effekten av potentiella kandidat cell typer11,12, 13. de flesta in vitro- angiogenes analyser (inklusive endothelial spridning, migration och tube bildandet analyserna) vanligtvis bedöma effekterna av celler eller föreningar på endotelceller fenotypiska förändringar eller differentiering i tubulär och nätverk strukturer14,15. Även dessa funktioner är avgörande för angiogenes, en ”översättas” assay bör också utvärdera: 1) den bröstförstoring eller utbyte av de stödjande celltyper inklusive pericyter eller glatta muskelceller, 2) behandling av ECM eller basalmembranet, och 3). effektiviteten för att främja bildandet av funktionella mikrocirkulation. In vivo angiogenes modeller, inklusive korneal assay och Matrigel plug assay, recapitulate det unika i vivo mikromiljö men utmanas av svårigheten att spåra administreras celler att iaktta fysiska interaktioner. Dessutom i i vivo modeller, kan xeno-immun avslag uppstå när du testar potentiella allogena cell terapi kandidater16. Ex vivo angiogenes modeller, särskilt aortastenos ring analysen kan ge: 1) enkel observation och kvantifiering av tubulära strukturer, (2) tillbehör stödjande celler, 3) ECM från värd och konstgjorda förnödenheter, 4) uteslutning av inflammatoriska komponenter, och 5) snabb och billig installation17,18. Typiskt, aorta ring analysen kan testa angiogena potential små sekretoriska proteiner, farmakologiska agenter och transgena djurmodeller19,20,21.

MSCs är lovande kandidater för vaskulär regenerering främst genom deras parakrin-medierade effekter22,23,24. MSCs har visat att utsöndra nyckel angiogena faktorer inklusive Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), Hepatocyte Growth Factor (HGF), Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1) basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) och angiopoeitin-1 (Ang-1)25 ,26. MSCs kan också upptäcka och hem till ischemisk eller inflammerade vävnader, men de exakta mekanismerna är fortfarande under utredning. Alltmer, stöder litteraturen hypotesen att de flesta MSCs uppkommer perivaskulär celler, Co express pericyt markörer och kan bete sig som pericyter27. HUCPVCs är en ung källa av MSCs härrör från regionen perivaskulär av mänskliga navelsträngen. De representerar en befolkning av MSCs med pericyt-liknande egenskaper och har karaktäriserats från både FTM och sikt navelsträngar. FTM HUCPVCs visar ett högt uttryck av pericyt markörer inklusive CD146 och NG2, hög proliferativ och Multilinjärt potential, immun-privilegierade egenskaper, och visa en robust parakrin profil28. FTM HUCPVCs är en idealisk kandidat celltyp att främja regenerering av skadad vävnad genom främjande av nya vaskulatur via deras pericyt-liknande egenskaper.

För att testa den angiogena potential och pericyt-liknande egenskaper av mänskliga MSCs, är ett mycket begränsat antal angiogenes analyser tillgänglig där positiva angiotropic migration (hädanefter benämnd ”homing”), ECM bearbetning och utveckling av fysiska interaktioner mellan celltyper kan undersökas, medan få kvantitativa uppgifter om mikrocirkulation utveckling.

Härmed presenterar vi ett protokoll som beskriver en ny tillämpning av aorta ring analysen. Mänskliga MSCs var samtidig odlade med utveckla råtta-derived aorta endothelial nätverk för att bedöma deras bidrag som rör bildande, mognad och homeostas. Denna version av aorta ring analysen bedömer förmågan och styrkan av cell terapi kandidater till hem till platser av angiogenes, utföra medla ECM bearbetning och bidra till endotel tubulär utveckling genom att etablera pericyt-liknande fysiska interaktioner. Förutom att kvantifiera nettoeffekten av MSCs på in vitro- endothelial nätverk bildas och observera intercellulära interaktioner, optimerad vi också ett protokoll för att isolera MSCs från samtidig kulturer. Genom att utföra flödescytometri och qPCR, är det möjligt att karaktärisera förändringar i MSC fenotyp och gen uttryck efter samtidig kultur. Som modell celltyper, Vi jämförde ontogenetically tidigt (prenatal) och sena (vuxen) källor till mänskliga MSCs: FTM HUCPVCs och mänsklig benmärg-derived MSCs (BMSC), respektive i aorta ring-analysen. Vi föreslår att aorta ring analysen kan användas till studerar angiogena potential någon fysiskt stödjande celltyp när under utredning för angiogena regenerativ applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

alla studier på djur var utföras och rapporteras enligt ankomst riktlinjer 29. Alla studier utfördes med institutionella forskning etik styrelsens godkännande (REB nummer 4276). Alla djur förfaranden godkändes av Animal Care Committee of the University Health Network (Toronto, Kanada), och alla djur fick Human vård i enlighet med Guide för skötsel och användning av försöksdjur, 8 : e upplagan ( Nationella institut för hälsa 2011).

1. aorta Ring Assay Setup

  1. isolatet råtta aorta.
    1. Euthanize 8 - 10 veckor gamla Sprague-Dawley-råttor med hjälp av CO 2 kvävning: Set CO 2 kammare till 20% gas utbyte (flöde = 0,2 x kammare volym/min). Bekräfta genom avsaknad av nypa reflex och hjärtat slår av palperas bröstet.
    2. Blöt pälsen på bröstet med steriliserad gasväv med 70% etanol. Använd steriliserad pincett och sax att göra ett snitt i bröstet mittlinjen och skär genom hud och muskel lager.
    3. När bröstkorgen utsätts, skär revbenen på varje sida och vik uppåt ca 5 mm från bröstbenet på varje sida. Viss blödning förväntas från interkostal artärer i färska kadaver.
    4. Tryck lungvävnad och hjärtat till anatomiska höger att exponera aorta. Aorta är vitan färgade fartyget ligger intill ryggraden.
    5. Använd pincett att nypa aorta (efter aortabågen) och Använd kirurgisk sax för att göra första snittet medan du håller aorta med pincett. Vid styckning aorta, brösthålan kommer snabbt fylls med blod, därför är det viktigt att arbeta snabbt för att få aorta före blodkoagulation.
    6. Använd pincett att hålla aorta och dra försiktigt aorta nedåt, bort från ryggraden. Dra kommer sever interkostal artärer utan ytterligare snitt. Innan aorta delas i två grenar i bukhålan och skär aorta ur slaktkroppen kan du få cirka 10 cm av vävnad och/eller. Driva membranet om behövde kaudala riktning för att få tillgång till lägre delar av aorta.
      Anmärkning: Dra aorta försiktigt eftersom intensiv kraft kan orsaka att riva. Om aorta tårarna, tillåta koagulation i några sekunder och använda hushållspapper för att ta bort koagulerat blod, så att synligheten av återstående aorta.
    7. Placera aorta i en 15 mL tub med 10 mL iskallt Hank ' s balanserad Salt lösning (HBSS) kompletteras med 1% penicillin/streptomycin (P/S). Hålla rören på ice.
      Obs: Aorta vävnaden kan pågå i 1-2 h på is men det är bäst att behandla den så snabbt som möjligt.
  2. Förbereda aorta ring assay kultur media i en steril biosäkerhet skåp (BSC).
    1. Förbered Endothelial odlingsmedium (EGM) genom att använda en filtrering enhet för att filtrera 500 mL Endothelial Basal Medium (EBM) kompletteras med 2% fetalt bovint Serum (FBS), 1% gentamicin och tillväxtfaktorer (se Tabell för material). Häll 50 mL av filtrerade media i en pärla eller vattenbad vid 37 ° C.
    2. Använder en annan filtrering enhet för att filtrera 100 mL av EBM kompletteras med 2% FBS och 1% P/S till beredd att EBM 2% FBS (EBM-FBS) och förvaras vid 4 ° C.
  3. Coat 12-väl vävnadsodling plattor med Basal membran extrahera (BME) medan du arbetar på is.
    1. Plats en 12-well platta på en kall yta (stor kylklamp eller facket). Tillsätt 200 µL per brunn av nymalen tinade BME med kyld pipettspetsar och snurra BME för att säkerställa jämn beläggning. Arbeta snabbt för att undvika ojämn polymerisation av BME.
      Obs: En typisk aorta excision ger 20 aorta ringar. För att beakta variabiliteten mellan aorta ring analyserna, setup minst tre aorta ring analyser per behandlingsgrupp och inkluderar en kontroll. Om källan medger, 6 ringar per behandlingsgrupp rekommenderas.
    2. Placera belagda plattorna i befuktade inkubatorer (95% relativ luftfuktighet, 37 ° C, 5% CO 2; dessa villkor gäller för alla befuktade inkubator steg nedan) för 30 min. plats 1000 µL pipettspetsar tillbaka till-20 ° C för steg 1.5.3.
      Obs: Medan basal membran extraktet används i lager koncentration, dess enhetlighet och stelhet är strikt kontrollerad av polymerisation tiden. Se till att hålla exakt samma polymerisation tider för alla paralleller och oberoende experiment.
  4. Avsnitt aorta i enhetlig ringar.
    1. Ta aorta från 15 mL röret och placera det i en 10 cm skålen med 10 mL färsk HBSS kompletteras med 1% P/S.
    2. Använda två uppsättningar pincett att noga skilja den överflödig bindväv, fettvävnad och använda en skalpell för de återstående grenarna av interkostal artärer ansluten till aorta. Detta minskar variabiliteten mellan ring enheter baserat på olika nivåer av den återstående vävnaden. Ta bort eventuella kvarvarande koagulerat blod från insidan aorta.
    3. Placera en linjal eller rutnät under 10 cm skålen exakt skära 1-2 mm breda sektioner av aorta med steril skalpell och pincett. Skär avsnitten så exakt som möjligt för att minska variationen mellan enheter.
  5. Bädda in aorta ringarna i BME.
    Anmärkning: Om snittning av aorta ringar inte är avslutad innan BME polymerisation inkubation, ta belagda plattorna från befuktade inkubatorer och tillsätt 100 µL av EBM till varje brunn för att avsluta polymerisation. Exakt tidpunkt är avgörande eftersom alltför polymerisation av BME kan störa den endothelial nätverk utveckling och cell migrationen. När aorta ringarna är beredda att ta bort EBM från brunnarna och fortsätt från steg 1.5.2.
    1. Ta bort BME belagda brunnarna från de befuktade inkubatorerna och återgå till BSC.
    2. Försiktigt plocka upp enskilda aorta ringar med pincett och placera en i mitten av varje BME-belagd brunn. Upprepa för de återstående aorta ringarna.
      Obs: Media överförs tillsammans med aorta ringen bör hållas minimal för att undvika polymerisation oegentligheter.
    3. Använd kyld (-20 ° C) 1000 µL pipettspetsar lägga till 300 µL av BME ovanpå varje aorta ring och jämnt fördela BME runt brunnen.
    4. Returnera de inbäddade aorta ringarna till de befuktade inkubatorerna för 30 min.
    5. Ta bort plattorna med inbäddade aorta ringen från de befuktade inkubatorerna och sakta lägga 1000 µL av EGM (beredd och värmde på steg 1.2.1) genom att placera pipetten spets mot väggen av kulturen väl.
      Obs: Direkt pipettering media på BME kan störa den polymeriserat BME och hindra kontinuerlig endothelial nätverksutveckling. Använd en lämplig flerkanalspipett om.
    6. Efter 24 h, bort 1000 µL av extra bolagsstämma och ersätta med 1000 µL av EBM-FBS bereddes i steg 1.2.2 igen av långsamt pipettering mot sida kulturen väl.
  6. Upprätthålla aorta ring analysen genom att ersätta 500 µL av EBM-FBS med 500 µL av färska EBM-FBS (37 ° C) varje 48 h.
    Obs: Se SEKning 2 startar MSC kultur expansion på samma dag som aorta ring assay etablering. Detta kommer att säkerställa att MSCs är redo för samtidig kultur när de endothelial näten färdigställs.
  7. Använda ljusa fält microscopyen följa aorta ring assay endothelial nätverksutveckling (se figur 1 som referens för optimal utveckling). När den endothelial nätverk aspekten är som visas i figur 2, fortsätta med att ställa in aorta ring assay-MSC samtidig kulturerna (avsnitt 3). Se steg 4.1 för ytterligare information om imaging endothelial nätverken.

2. Vävnadsodling

  1. Förbered stamlösningar av vävnadsodling media.
    1. Kultur FTM HUCPVCs (tidigare etablerade, n ≥ 3 oberoende linjer för varje) 30 och kommersiellt tillgängliga BMSCs i alpha-MEM kompletteras med 10% FBS och 1% P/S.
    2. Sterilisera media med 0,2 µm porstorlek storlek filter flaskor.
    3. Lagra de förberedda media lösningarna vid 4 ° C i upp till 3 veckor.
  2. Upprätthålla FTM HUCPVC och BMSC kulturer i befuktade inkubatorer och passagen på 70-80% konfluens bestäms av fas kontrast mikroskopi. Använd lämpliga volymer av media för storleken på vävnadsodling skålen används (dvs. 10 mL i en 10 cm skål). Använda dessa odlingsbetingelser för att upprätthålla och passaging MSCs.
  3. Separera de MSC enskiktslager för passaging eller aorta ring assay-MSC Co kulturer med en dissociation enzym lösning (4 mL/10 cm skålen) och inkubera i de befuktade inkubatorerna för 3 min. se till avlossning av cellerna med ljusa fält mikroskopi; Inkubera för en ytterligare 1-2 min om krävs.
  4. Överföra de dissocierade cellerna in i en 15 mL rör och centrifugera vid 400 x g i 5 min.
  5. Aspirera supernatanten utan att störa cellpelleten och resuspendera cellerna i 1 mL av en lämplig kultur media (alpha-MEM komplett media för passaging celler eller EBM-FBS för aorta ring assay/MSC samtidig kulturer) för att räkna med en cell räknare.

3. Beredning av aorta Ring Assay/MSC samtidig kulturer

  1. frö 10 4 MSCs på varje inbäddad aorta ring (9 000 celler/cm 2 / 12-väl plåt). Baserat på antalet aorta ring analyser, pre fläcken MSCs med livskraftiga, icke-överförbar fluorescerande färgämne. Behålla minst tre brunnar av aorta ringar utan MSCs för en kontrollgrupp.
    1. Att fläcken 10 5 MSCs/mL EBM-FBS media, tillsätt 2,5 µL av livskraftiga, icke-överförbar fluorescerande färgämne/mL media (5 µM) in i en 15 mL tub och plats i den befuktade inkubatorn för 30 min. Blanda försiktigt röret halvvägs genom inkubering.
    2. Följande 30 minuters inkubation, Lägg till 1 volymdel färska EBM-FBS till färgade celler och snurra vid 400 x g för 5 min.
    3. Avlägsna supernatanten och slamma cellpelleten i 1 mL av EBM-FBS media. Bekräfta lyckad färgning av de MSCs använder fluorescensmikroskopi.
  2. Ta bort aorta ring-innehållande plattorna från befuktade inkubatorn och 500 µL av EBM-FBS från varje brunn.
  3. Utsäde noggrant 10 4 MSCs i 500 µL av EBM-FBS på varje inbäddade aorta ring av jämnt pipettering runt de endothelial nätverk. Garantera jämn fördelning genom att försiktigt skaka kultur plattan.
    1. Lägg till ytterligare EBM-FBS för att säkerställa att den totala volymen av media på aorta ring assay/MSC samtidig kulturerna 1000 µL.
  4. Använda fluorescensmikroskopi för att visualisera de fluorescently märkta MSCs i aorta ring analysen.

4. mikroskopi

  1. Använd ljusa fält mikroskopi till bild råtta endothelial nätverken före aorta ring assay/MSC Co kulturer för baslinje (dag 0) mätningar av endothelial Nätverksegenskaper (t.ex., det nätverk längd, nätverk loopar). Bild 4 kvadranter per brunn från aorta ringen till den mest bortersta delen av endothelial nätverket inom denna kvadrant.
    1. Bild av aorta ring-nätverk efter aorta ringen kulturer assay/MSC tillsammans på dag 3, 5 och 7. Använda dessa bilder för att kvantifiera MSC effekten på den endothelial nätverksutveckling.
  2. Använda fluorescensmikroskopi till bild pre märkta MSCs i aorta ring-analysen.
    1. Följande 24 h av aorta ring assay/MSC samtidig kulturer, Använd fluorescensmikroskopi för att visualisera MSC homing, töjning och integration med de endothelial nätverk. Överlappar de fluorescerande bilderna av MSCs med ljusa fält bilder av endotelceller att iaktta colocalization båda celltyper.
    2. Bild av MSCs lokaliserade inom de utveckla endothelial näten proximala aorta ring vävnaden, och de MSCs lokaliserade inom nyligen utveckla nätverk distala aorta ring vävnaden ( figur 2).

5. Flöda flödescytometri och qPCR

  1. en dag före separera de endothelial aorta ring-nätverk, Tina frysta dispase vid 4 ° C O/N. avsnitt 5.3 är identiska för både flödescytometri och qPCR.
  2. Värma 50 mL dispase och 50 mL 0,5% trypsin i 37 ° C pärla eller vattenbad.
  3. Hämta cellerna för analys från aorta ring assay/MSC samtidig kulturerna.
    1. Efter 1 vecka av aorta ring assay/MSC samtidig kultur, ta bort kultur media och tillsätt 1 mL av Phosphate-Buffered saltlösning (PBS) långsamt till varje brunn för 3 min och ta bort. Upprepa detta två gånger mer tvätt.
    2. Lägga till 800 µL före värmde dispase till varje brunn och inkubera i de befuktade inkubatorerna för 15 min.
    3. Ta bort plattorna från de befuktade inkubatorerna och avbryta dispase av pipettering (5-10 x) för att bryta upp BME och överför innehållet i varje brunn i separat 15 mL rör.
    4. Upprepa steg 5.3.3 igen med färska pre värmde dispase tills inga kända restrisker BME observeras i kulturen väl. Lägg till 1 volymdel PBS kompletteras med 3% FBS till dispase-cellsuspensionen att inaktivera dispase. Ta bort den aorta ringar flytande i cellsuspensionen använder pipettspetsar.
    5. Spinn cellsuspensioner vid 400 x g för 5 min. avlägsna supernatanten noga, lämnar 3 mL cellsuspension i 15 mL röret.
      Obs: En tydlig, fast pellet syns inte men finns celler och BME.
    6. Tillsätts 3 mL av förvärmd 0,5% trypsin cellsuspension och kraftfullt Omsuspendera (5-10 x genom pipettering) celler. Inkubera trypsinized cell lösningarna i de befuktade inkubatorerna för 10 min.
    7. Bort de trypsinized cellsuspensioner från befuktade inkubatorer och lägga till 6 mL PBS kompletteras med 3% FBS och resuspendera några timES. Spinn cellsuspensioner vid 400 x g för 5 min.
    8. Försiktigt bort alla supernatanten, lämnar cellpelleten i röret och resuspendera cellerna i 1 mL PBS kompletteras med 3% FBS i varje rör.
    9. Filtrera 1 mL cellsuspension med hjälp av en 70 µm cell sil för att avlägsna aggregerade celler och kvarstående BME från cellsuspension. Räkna cellerna i 1 mL cellsuspension med en cell räknare.
  4. Förbereda cellerna för flödescytometri.
    1. Inkubera cellen suspensioner (10 5 celler i 200 µL PBS kompletteras med 3% FBS) med fluorophore-konjugerad (FITC eller APC) primära antikroppar (TRA-1 - 85-, CD146, CD31) koncentration = 1:40) vid 4 ° C i 30 min, skyddas från ljus.
      Obs: Flödescytometri för MSCs optimerades av Hong et al., 2013 28. Minst 10.000 celler krävs för noggranna avläsningar.
    2. Efter 30 min ruvning, Omsuspendera cellerna i 2 mL PBS kompletteras med 3% FBS och centrifugera (400 x g, 5 min).
    3. Behåll celler vid 4 ° C skyddas från ljus tills analysera av flödescytometri (minst 1 x 10 4 händelser) inom 1 h. För Usenets strategi, se kompletterande Figur1. Sortera mänskliga MSCs använder anti-TRA-1-85 (APC) (koncentration: 1:40 och i 0,5% FBS/PBS) och sortera celler i 350 μl lyseringsbuffert cell för qPCR analys.
      Obs: Lyserat celler kan lagras vid-80 ° C i upp till 3 månader för framtida qPCR analys.
  5. Förbereda cellerna för qPCR-analys.
    1. Isolera RNA från lyserat celler använder kolumnbaserade RNA isolering kit och fastställa RNA-koncentrationen och kvalitet.
    2. Förbered cDNA från upp till 5 µg RNA per 100 µL omvänt transkriptas reaktion. Utföra en före förstärkning steg om RNA avkastningen är låg (< 10 ng/µL). Användning av mindre än 100 ng av RNA kommer att resultera i en hög grad av falska negativa.
      Obs: CDNA mallarna kan förvaras vid-20 ° C för vidare analys för upp till 4 månader.
    3. Utför de qPCR med angiogenes uttrycket profiler matriser för att upptäcka förändringar i genuttryck. Använd 5 ng av cDNA per reaktion (40 cykler, 60 ° C glödgning/utvidga temperatur). Express faldig förändring av uttryck jämfört med odifferentierad MSC härrör cDNA prover. Kör på motsvarande negativa kontroller (aorta ring utan mänskliga MSCs).

6. Nätverk kvantifiering följande aorta Ring Assay/MSC samtidig kulturer

  1. Hämta bildprogram såsom ImageJ tillsammans med angiogenes Analyzer plugin 31.
  2. Importera endothelial nätverk bilder tagna och öppna med hjälp av programvara.
  3. Konvertera bilden skalor baserat på specifikationerna för mikroskopet används.
  4. Använda en linjär verktyg för att mäta radiella nätverk tillväxten.
  5. Räkna endothelial nätverk slingor med verktyget cell counter (loopar med minst 4 sidor bör kvantifieras).
  6. För ytterligare kvantifiering av Nätverksegenskaper, använda insticksmodulen angiogenes Analyzer eller andra liknande plugins för att analysera master segment, totallängd segment, totalt nätverksområden och antal korsningar. Använd verktyget oskarp mask för att sudda aorta ring vävnad och tomma utrymmen att undvika falska positiva beräkningar.
  7. Överföra värdena till en statistik program och Graf endothelial Nätverksegenskaper efter aorta ring assay/MSC samtidig kulturerna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den schematiska arbets-flöden för att fastställa aorta ring/MSC samtidig kultur analysen framgår i figur 1. De viktigaste stegen inkluderar: råtta aorta isolering, snittning och inbäddning av aorta ringarna, övervakning av endothelial groning och nätverksutveckling, och slutligen märkning och administrera MSCs. Tidslinjen i den endothelial nätverksanalys beskriver fönstret för analyserna som möjligt för varje period av samtidig odling: dag 1, 5 & 7. Ytterligare anmärkningar markeras av prickade rutorna.

Identifiering av strukturellt distinkta regioner i aorta ring endotelceller kulturer utförs av ljusa fält mikroskopi, 3-5 d efter aorta ringarna är inbäddade i ECM (figur 2). Ostrukturerade området (figur 2A) karaktäriseras som en region av hög cellproliferation men låg strukturella organisationen i direkt närhet av aorta vävnaden. De utveckla endothelial nätverk (figur 2B) hänvisar till regioner med hög strukturell organisation, där nätverk är fullt etablerat och huvudsakligen består av slutna, även före tillsats av MSCs. Utveckla nätverken (figur 2 c) är belägna på de distala delarna av endothelial kulturerna. Dessa är platserna av endotelial cellmigration och töjning som formuläret strukturer av nya nätverk. De ovan nämnda 3 regionerna är lätt identifierbara i hela experimenten och används när du refererar till där MSCs hem till i samtidig kulturer. De prelabelled MSCs bör samtidig odlade med aorta ring analys när alla tre nätverkssegment har utvecklat. Kvantifiering av endothelial nätverk efter MSC samtidig kulturer omfatta regioner i industriländer och utvecklingsländer nätverk (figur 2, vit ram).

Fluorescensmikroskopi tillåter för kvalitativa mätningar av MSC migration, integration och morfologi i samband med utveckling av endothelial nät i aorta ring-MSC samtidig kultur-analysen (figur 3). De MSCs märkt med livskraftiga, cytoplasmiska fluorophore var avbildade 24 h efter administrering till samtidig kulturer. FTM HUCPVCs hittades i utkanten av de framkallande endothelial nätverk, visas avlång cell morfologier och bidrog till ytterligare utveckling av endothelial nätverk (figur 3A, B). För jämförelse homed BMSCs till utveckla näten medan du visar mindre interaktion med endotelceller (figur 3 c, D). Hög förstoring bilder på 72 h visade att FTM HUCPVCs bibehållas hög täckning och stabilisering av endothelial nätverk medan BMSCs i samtidig kulturer presenteras med sfäriska morfologier med begränsad integrering i endotel nätverk (figur 3E , F). De observerade skillnaderna tydligt visa de kvalitativa, funktionella skillnaderna mellan människors MSC typer. En terapeutisk kandidat celltyp som har betydande homing och egenskaper endothelial integration (figur 3A, B & E) sticker ut jämfört med en celltyp med begränsad endothelial nätverksintegrering och bröstförstoring kapacitet (figur 3 c, D & F).

Hög förstoring fluorescence mikroskopi bilder förvärvades för att ytterligare dissekera fysiska interaktioner mellan endotelceller och FTM HUCPVCs i tubulär nätverk. Den pre märkta FTM-HUCPVCs (figur 4A, grön) visas följa med ofärgade endotelceller (figur 4A, vita pilar). FTM HUCPVCs konstaterades för att ge strukturellt stöd till endotelceller genom att tjäna som en axel och fastsättning yta mellan noder. De endothelial aorta ring-nätverk kan också vara pre märkta med en livskraftig fluorophore på samma sätt som MSC färgning (figur 4B, röd). I dubbel färgade samtidig kulturer visade fluorescensmikroskopi långsträckt sammanväxningar mellan de två celltyper, stärkande observationen av samarbete och stödjande cell beteende.

Kvantifiering av endothelial strukturella Nätverksegenskaper utfördes på dag 5 av MSC samtidig kulturer (figur 5). Enhetlig kvadranter definierades för mätning i hela aorta ring endothelial nätverket (figur 2, vit ram). Genomsnittliga nätverk tillväxten beräknades som avståndet från de första proximala stängt nätverk looparna genom aorta ring till de mest bortersta distala slutna (RADIUS-storlek) (figur 5A). Genomsnittliga nätverk tillväxten av aorta ring-MSC samtidig kulturer var följande: FTM HUCPVCs (2,98 ±0.3 mm) och BMSCs (1,5 0.15 mm). De obehandlade endothelial nätverk utvecklat en genomsnittlig radie av 1,9 ±0, 1 mm. Den statistiska jämförelsen mellan behandlingsgrupperna MSC visat att FTM HUCPVCs bidragit till betydligt större nätverk tillväxt jämfört med BMSCs och obehandlad nätverk (p ≤0.001). Den obehandlade endothelial nätverk utvecklats avsevärt mer än BMSC som innehåller Co kulturer (p ≤0.01) (figur 5B).

Det totala antalet slingor var beräknas i varje kvadrant och uttryckt som genomsnittlig total loop bildandet (figur 5 c). Det genomsnittliga antalet totala slutna var följande: FTM HUCPVC behandlade samtidig kulturer (81 ±7), BMSCs (26 ±3) och obehandlade ringar (55 ±7). FTM HUCPVCs bidragit till betydligt större endothelial loop bildandet jämfört med BMSCs (p ≤0.01) och obehandlade nätverk (p ≤0.01). BMSC kulturer tillsammans resulterade i färre endothelial nätverk slingor jämfört med obehandlade nätverk (p ≤0.01). Denna kvantifiering identifierar en celltyp som har en signifikant positiv effekt på endotelceller nätverksutveckling (FTM HUCPVC) och en celltyp som även kan försämra endothelial nätverk. Det ska noteras att väsentligt ökade nätverksutveckling observerades för att korrelera väl med MSC täckningen på endotelceller nätverk. Det antyder att de direkta interaktionerna är avgörande för MSCs att utföra deras stödjande funktion.

Möjliga fallgropar av aorta ring samtidig kultur etableringarna är representerade i figur 6. Otillräcklig eller ojämn polymerisation av BME är ett problem som kan störa framgångsrika endothelial nätverksutveckling. Timing BME polymerisation i exakt 30 minuter och överföra media utan att störa polymeren garanterar en intakt, funktionella BME fas (figur 6A). Färgning av MSCs för långvarig inkubationstider och låta MSCs till pellet under längre perioder kan störa cellmorfologi och fenotyp på samtidig kulturer. Figur 5B visar FTM HUCPVCs målat för 1 h och tillåtnaför att pellets för 1 h före samtidig kultur, som båda är suboptimal timings. FTM HUCPVCs visar inte företräde till platser av endothelial nätverk och är utspridda över hela nätverket. Jämföra korrekt behandlade celler (figur 3) till misskött FTM HUCPVCs, misskött cellerna rundade cellmorfologi och begränsad cell-till-cell interaktioner med endotelceller (figur 6B). Slutligen, om aorta ring analysen inte kan fastställas på dagen för dissektion, artärer kan lagras vid-80 ° C i extra bolagsstämma-C media kompletteras med 10% dimetyl sulfoxid (DMSO) och 10% FBS. Endothelial nätverk utvecklingen kan ta 1-3 d längre vid applicering tinade aorta ringar jämfört med färsk vävnad, men endothelial nätverken kommer att räcka för MSC samtidig kultur etablering (figur 6 c).

Som ett alternativt förfarande av aorta ring samtidig kultur bedömningen, kan den cellulära delen av BME inbäddade aorta ringar ska extraheras och analyseras med flödescytometri (kompletterande Figur1). Den mänskliga specifik markören TRA-1-85 (kompletterande figur 1A, B, y-axeln) positiv cell befolkningen från FTM HUCPVC innehållande Co kulturer identifierades som mänskliga MSCs. Co märkning visade lågt uttryck av endotelceller marker CD31 (kompletterande figur 1A) och hög uttryck för pericyt markören CD146 (kompletterande figur 1B) inom den mänskliga specifika markör positiv cell befolkningen. Sådan utvärdering kan dechiffrera eventuell immunophenotypic och härstamning engagemang förändringar av de näringsidkaravgifter som induceras av interaktionen med endotelceller och ge värdefull information om den testade celltypen. För att erhålla ett tillräckligt antal celler för FC analys, kan de celler som utvinns från parallella brunnar i samma experimentella gruppen kombineras. Det är viktigt att överväga att använda icke-pre-färgade MSC innehållande aorta ringarna för flödescytometri Flödesanalys så att den påminna fluorescensen av livskraftiga färgämnet inte stör signalen från den antikropp-relaterade fluorophores. Annars bör den negativa gating ta pre färgade cellen fluorescensen i beaktande.

Vi sorterade mänskliga MSCs extraherad form aorta ring samtidig kulturer (dag 7 av samtidig kultur) med den mänskliga cell ytbehandlar markör specifika antikroppen (TRA-1-85). FTM HUCPVCs och BMSCs återhämtat sig från aorta ring analysen bearbetades för qPCR-analys för att testa uttrycket av angiogena gener. Med en kommersiellt tillgänglig qPCR-matris, tre aorta ring samtidig kulturer som tillhandahålls tillräckliga mängder genetiskt material att kvantifiera uttrycket av 84 mänskliga tillväxtfaktor gener (kompletterande figur 2A). De preliminära resultaten visar att FTM HUCPVCs och BMSCs uttrycka nyckel utsöndrade angiogena på jämförbara nivåer (kompletterande figur 2B). Förutom att jämföra uttrycksnivåerna för olika celltyper i analysen, baserat effekten av överföra celler till EBM assay media från deras expansion kultur media bör övervägas. När du använder celler av högre fenotypiska eller genetiska plasticitet, bör en jämförande kontrollgrupp av mänskliga MSCs i EBM media - utan aorta vävnad - ingå i utvärderingen.

Likheter i angiogena faktorn uttryck av MSCs antyder att den betydande skillnaden i deras nätverk augmentation inte är ett resultat av olika parakrin aktiviteter. Detta är i överensstämmelse med tidigare observationen att ökad direkta intercellulära interaktion tycks främja endothelial nätverksutveckling.

Figure 1
Figur 1: Schematisk bild av en ny tillämpning av aorta Ring Assay Setup.
De viktigaste stegen i installationen och analys av MSC samtidig kulturer med aorta ring analys beskrivs i solid lådor och kompletterande anmärkningar beskrivs i prickade rutorna. Skalstapeln = 1000 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Representativ bild av aorta Ring nätverk analysen.
Endothelial nätverk är indelad i tre koncentriska regioner baserat på strukturella skillnader: ostrukturerade område i närheten av aorta ring vävnad (A), utvecklat/strukturerade endothelial nätverk (B) och utveckla nätverk Beläget i peripheryen av den ex vivo vävnadsodling (C). Radiella nätverket tillväxt och enhetlig quadrant för antalet loop definieras inom det utvecklade endothelial nätverket (B). x: endothelial slutna räknas i enhetlig kvadranten. Skalstapeln = 250 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Fluorescerande Imaging av regionen nätberoende Integration av mänskliga MSCs i aorta Ring analysen efter 24 & 72 h.
Prestained (grön) FTM-HUCPVCs och BMSCs har lagts till de framkallande aorta ring endothelial tube-nätverk. Fluorescence mikroskopi bilder tagna 24 h efter att MSC samtidig kulturer Visa FTM HUCPVCs som migrerar genom ECM och hem till perifera utveckla endothelial nätverk (A). Bilder med högre förstoring visar långsträckt morfologier av FTM HUCPVCs medan i nära kontakt med de endothelial nätverk (B). Färre BMSCs processen ECM och hem till endotel nätverk med inga observerbara preferenser till perifera utveckla nätverk (C). BMSCs Visa sfäriska cell morfologier (D).
Hög förstoring fluorescence mikroskopi bilder av prestained MSCs i råtta aorta ring analys efter 72 h av samtidig kultur (E, F). FTM HUCPVCS presentera långsträckt morfologier medan du visar endothelial täckning genom direct cell-till-cell interaktioner med endotelceller (fast vita pilar) både i nätverksnoder och tubuli (E). BMSCs upprätthålla sfäriska cell morfologier klustrade i de endothelial nätverksnoder (F). Broken arrow representerar riktningen av endothelial nätverk tillväxten från aorta ring vävnaden. En, C: Skalstapeln = 1.000 µm B, D: skalabar = 400 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Hög förstoring Fluorescence mikroskopi bilder av pericyt-endotelceller fysiska interaktioner.
Ofärgade endotelceller som är associerade till kontinuerlig utskjutande delar ansluta pre färgade FTM HUCPVCs i tubulär nätverket (A) påträffades. Fluorescerande bilder av pre färgade endothelial nätverk (EG, röd) med pre färgade FTM HUCPVCs (FTM, grön) påvisa interaktioner går igenom endotelceller, pericyt interaktioner (B). A: skalstapeln = 100 µm B: skalstapeln = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Kvantifiering av nätverket tillväxt för MSC-behandling för 5 D efter samtidig kultur etablering.
Låg förstoring fas kontrast mikroskopi bilder är tagna från aorta ring behandlingsgrupperna åtgärd nätverk tillväxt och utveckling (A). Spridda pilen visar riktningen av nätverket tillväxt. Skalstapeln = 250 µm. mikroskopi bilder har använts för att kvantifiera Nätverksegenskaper, inklusive menar nätverket tillväxt och menar nätverket loop bildning i en assay kvadrant. FTM HUCPVCs bidrog till större nätverk jämfört med BMSC samtidig kulturer och obehandlad nätverk (p ≤0.001) (B). P värde beräknades med en envägs ANOVA vara p <0,0001 använder Tukey's Post test (N = 3). Nätverk-loopar med minst fyra stängda sidor kvantifierades (C). FTM HUCPVC kulturer tillsammans utvecklade större nätverk slingor jämfört med BMSC samtidig kulturer (p ≤0.001) och obehandlade nätverk (p ≤0.01). P värde beräknades med en envägs ANOVA vara p < 0.0001 med Tukey's Post-testet (N = 3). Medelvärdet av 4 fält av endothelial nätverk kvantifierades. Skalstapeln = 250 µm. För parvis jämförelse, * = p ≤0.05, ** = p ≤0.01, *** = p ≤0.001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Möjliga fel i aorta Ring Assay etableringen.
Aorta ringar inbäddade i ofullständig BME polymerisation kan leda till inkonsekvent och trasiga endotelceller nätverk (A). FTM HUCPVCs målat för långa perioder med stor tid luckor mellan färgning och inrättande av samtidig kulturer, avkastning minimal homing och endotelceller interaktioner (B). Endothelial nätverket från råtta aorta lagras i-80 ° C och tinade för aorta ring assay (C). A: skalstapeln = 250 µm B, C: skalstapeln = 400 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Kompletterande bild 1: Flow flödescytometri analys av mänskliga FTM HUCPVCs extraheras från aorta Ring samtidig kulturer.
Cellulära fraktioner av aorta ring kulturer var isolerade och behandlas för flödescytometri Flödesanalys. Fluorophore konjugerad antikropp mot mänsklig särskilda cell surface markör (TRA-1-85, APC) användes i kombination med endothelial markör (CD31, FITC, (A)) eller pericyt markör (CD146, FITC, (B)) specifika antikroppar. Cell befolkningen positivt för den mänskliga markören (y-axeln) testade låg positivitet för endothelial markör CD31 (A, Q2) och hög positiv för pericyt markör CD146 (B, F6). Detta tyder på att FTM HUCPVCs underhålls deras perivaskulär Cellegenskaper i aorta ring samtidig kulturer och inte utveckla en endothelial fenotyp. I kvadranter på tomter definierades med hjälp av isotypen kontroller på tillämpad primära antikropparna. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Kompletterande bild 2: Kvantitativ PCR-analys av viktiga angiogena gener.
Liknande genuttrycket av viktiga angiogena gener av FTM HUCPVCs och BMSCs efter 1 veckas samtidig kultur i aorta ring-analysen (A). Representativa CT-värden visas i tabell (B). Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det finns flera kritiska skeden i ställa in en framgångsrik aorta ring assay MSC samtidig kultur experiment. Först, de viktigaste stegen när isolera och snittning aorta är: 1) erhålla uteslutande bröstkorg segmentet av aorta; (2) noggrant bort förgrenade blodkärl, bindväv och fettväv och; (3) skära även sektioner av aorta (~ 1 mm) att begränsa variabiliteten mellan varje försök. Andra, den framgångsrika inbäddning av aorta ringar i BME är kritiska för denna analys. Om BME är inte fullständigt polymeriserat eller polymeriseras ojämnt, aorta ringarna inbäddad i BME kommer inte att kunna inleda endothelial groning eller de kan utveckla diskontinuerligt endothelial nätverk. Om BME polymerisation är otillräcklig, är analyser inte tillförlitliga för kvantifiering. Tredje, komplett faktor-berikad endothelial media är nödvändigt att ge näring för aorta ringarna att inleda groning. När aorta ring ringar har inlett fartyget groning, involvera nästa kritiska kommande steg celltypen som ska testas. I detta syfte måste MSCs framgångsrikt pre färgas och administreras till de spirande aorta ringarna. Det finns två kritiska förfaranden för detta avsnitt. (1) att välja lämpliga dagen för sådd: nätverken bör vara i utvecklingsstadiet och inte att nå hög täckning av kulturen väl. Om MSCs inte administreras i tid, blir det svårt att kvantifiera MSCs netto effekter på nätverksutveckling. (2) prestaining MSCs före tillägg: om MSCs är alltför färgade eller förbli i pellets för en lång tidsperiod, klumpar sker som försämrar homing och integration inom endothelial nätverk. Slutligen, kvantifiera nätverken kan lätt uppnås om lämpliga kontroller är beredda. Aorta ringar utan MSCs kommer utveckla endothelial nätverk eftersom aorta själv stöder groning, men MSCs kan främja större nätverksutveckling med olika nätverksstrukturer som beskrivs i detta manuskript. Kvantifiering av endothelial nätverk bör utföras minst 5 d följande upprättande av samtidig kulturer. På grund av det slutna systemet, angiogena svar är övergående och endotel nätverk börjar urarta efter cirka 7 d. Om syftet med observationen är att utvärdera testade cell typ effekt på utvecklingen av endothelial nät, bör bilderna förvärvas inom den första veckan av samtidig odling.

En möjlig ändring av aktuella analysen kan vara tillämpningen av primär mänsklig vävnad. En 1 mm sektion av råtta aorta gör en enhet för samtidig kultur, kan mänskliga artärer ge ett stort antal sektioner av konsekvent mätningar. Trots mycket begränsad tillgång till livskraftiga mänskliga primära vävnad föreslår den höga effekten potentiella genomförbarhet. När man utvecklar ett test för storskaliga utvärderingar, kan före formning analysen och lagra dess komponenter tills celler för testning blir tillgängliga betraktas. BME beläggningen kan förberedas på vävnadsodling tallrikar och lagras i en fryst, torkad form för längre tidsperioder. Också, som vi testade i vårt laboratorium, råtta aorta vävnad kan vara fryst och lagras för senare tillämpning, således att arbete med den mest avgörande delen av analysen mer praktiskt.

Trots de många fördelarna av aorta ring analysens finns det några begränsningar anges. Första kan etableringen av assay kulturer vara utmanande. I sin nuvarande form kräver rutinmässiga tillämpningen tillräcklig manuella färdigheter. Operatören fel kan införa variabilitet. Det kan speglas i nätverket tillväxt och kan göra det svårt att på ett tillförlitligt sätt utvärdera effekten av administrerade celler och följaktligen viktigt angiogena egenskaper. Men dessa utmaningar är liknande om inte mindre jämfört med de andra metoder som är tillgängliga och erforderlig utbildningsperioden kan vara bekvämt kort och ekonomiska i motsats till i vivo experiment. Andra behöver en eftersläpning period mellan inbäddning av ex vivo aorta vävnaden och inledande nätverksutveckling som markerar tidpunkten för cell administration redovisas av användaren. Tredje, kvantifiering av endothelial Nätverksegenskaper kan vara tidskrävande men kan lösas genom att tilldela hallmark parametrar, inklusive radiella tillväxt, tube längd och nätverk mesh dimensioner. Detta kan utföras genom att använda datorstödd analys av bilder bild J, som avsevärt kan minska den tid som krävs för konsekvent och tillförlitlig kvantifiering. Det fjärde kan variabiliteten mellan varje test uppstå till följd av smärre inkonsekvenser i animalisk vävnad källa och hantering av operatören. Vi fann att denna utmaning kan lösas effektivt och kvantifiering blir statistiskt säkerställd genom inrättandet av exemplar för varje behandlingsgrupp. Slutligen, extrahera och sortering för celler av människa och råtta efter analysens analys kan vara utmanande. Dock kan särskilda proteinaser, inklusive dispase och cell återhämtning lösning användas för att återställa celler för immunophenotypic eller gen uttryck analys.

Jämfört med befintliga metoder som antingen kultur en enda endotelceller typ eller levande djur system, presenterade detta analysen använder kombinationen av ex vivo aorta vävnad och BME. Denna inställning gör att användaren kan få både kvalitativa och kvantitativa data belysa angiogena egenskaper cell terapi kandidater. Att kombinera BME och flercelliga ex vivo vävnad ger boenden nära härma den närmiljön som den terapeutiska celltypen kan uppstå efter lokal administrering. På grund av möjligheten av ett stort antal paralleller och nära kontrollen över odlingsbetingelser, är operatören försedd med ett system som innehåller nödvändiga element för tillförlitlig utvärdering, medan eliminera variabler och inkonsekvenser finns i djurmodeller. Bedömningar är dessutom mer genomförbart eftersom det minskar kostnaderna och behovet av upprepade djur förfaranden. Enstaka cell analyser och mest djurmodeller saknar faktorer och variabler som införts av immunsvar som annars skulle uppstå i den kliniska tillämpningen av cell terapi kandidater. Den inflammatoriska reaktionen förändrar angiogenes och därför den terapeutiska effekten av implanterade ämnen eller celler inte kan kvantifieras korrekt. Aorta ring analysen utesluter många inflammatoriska komponenter som skulle störa test mätningar. Det innehåller emellertid bosatta makrofager som viktiga aktörer i den mikrocirkulation utveckling32. Med lätt identifiering av både endothelial nät och prestained mänskliga celler, effekten av de MSC utsöndras inflammatoriska cytokiner och även cellulära element av immunsystemet, kan enkelt observerats med hjälp av denna analys.

Hög kontroll av användaren under villkor som analysen och reproducerbara arten av den experimentella setup tillåter införandet av ytterligare element i systemet. För det första, aorta ring analysen kan användas som en modell för skada. Efter för inbäddning av aorta ringar och endotel groning, analyser kan införas till ischemisk skada, inflammatoriska faktorer (TNF-α) eller bakteriell lipopolysackarid (LPS), följt av MSC tillägg att avgöra möjliga räddning av angiogena svar efter skada. För det andra för att belysa möjliga mekanismer för hur MSCs bidra till angiogena svaret, neutraliZing antikroppar kan användas för att tysta potentiella receptorer kritiska för cell-till-cell interaktioner. Slutligen, för att undersöka egenskaperna parakrin av MSCs, aorta ring analysen kan ställas in i ett transwell system att utesluta effekten av cell-till-cell interaktioner av angiogena svar men fokus på parakrin boenden.

Sammanfattningsvis, aorta ring analysen kan bedöma förmågan och styrkan av cell terapi kandidater att medla ECM bearbetning, migrera till områden av angiogenes och bidra till fartygets utveckling genom fysisk kontakt. Aorta ring ex vivo angiogenes analysen skulle kunna utvecklas som en värdefull, kvantitativa pre screening verktyg för kandidat cellinjer för regenerativ behandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Clifford L. Librach är medinnehavare av patentet: metoder för isolering och användning av celler som härrör från första trimestern navelsträngen vävnaden. Beviljas i Kanada och Australien.

Acknowledgments

Författarna tackar följande anställda och forskning personal: Andrée Gauthier-Fisher, Matthew Librach, Tanya Barretto, Tharsan Velauthapillai och Sarah Laronde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alpha-MEM Gibco 12571071 For FTM HUCPVC and BMSC culture media.
APC-conjugated anti human TRA-1-85 R&D Systems FAB3195A Human-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting
Basal membrane extract (BME) (Matrigel) Corning 354234 For aorta embedding
Bullet-kit Lonza CC-3162 Includes: Gentamicin/Amphotericin-B
(GA)human Epidermal
Growth Factor (hEGF); Vascular
Endothelial Growth Factor (VEGF); R3-
Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1);
Ascorbic Acid; Hydrocortisone;
human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum
(FBS). Required to prepare EGM
CellTracker Green CMFDA Dye Thermo-fisher C2925 For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs
CKX53 Culture Microscope Olympus For bright-field imaging of endothelial network development
Countess automated cell counter Invitrogen C10227 Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR
Dispase StemCell technologies 7923 For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C)
Disposable sterile scalpels VWR 21909-654 For sectioning aorta
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma-Aldrich D8537 PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride
Endothelial basal media (EBM) Lonza CC-3156 Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS
Ethanol, 70%, Biotechnology Grade VWR 97064-768 To sterilize surfaces
EVOS Life Technologies In-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration
Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone) GE Healthcare SH3039603 Serum component of cell culture medium
FITC-conjugated anti-CD31 antibody BD 558068 Human endothelial marker for flow cytometry
FITC-conjugated anti-CD146antibody BD 560846 Human pericyte marker for flow cytometry
Forceps Almedic 7727-A10-704 For handing rat tissue. Can use any similar forceps
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Life Technologies 14175-094 1X Without calcium chloride and magnesium chloride
HERAcell 150i CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific 51026410 For incubating cells
Human Angiogenesis RT2 profiler PCR array Qiagen PAHS-024Z Human specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction
ImageJ Open source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin
LSR II BD UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.
MoFlo Astrios Beckman Coulter UHN SickKids FC Facility. For cell sorting.
Penicillin/streptomycin Gibco 15140122 Antibiotic component to buffers and cell culture medium
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 For RNA purification. Includes cell lysis buffer
RT2Easy First Strand Kit Qiagen 330421 For preparation of cDNA for qPCR
RT2PreAMP cDNA Synthesis Kit Qiagen 330451 Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA
Surgical scissors Fine Science Tools 14059-11 For cutting skin, muscle and aorta
Sterile gauze VWR 3084 To dampen and sterilize chest fur
TrypleE Thermo Fisher Scientific 12605036 MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C
0.2 μm pore filtration unit Thermo Fisher Scientific 566-0020 To sterilize tissue culture media
0.25% Trypsin/EDTA Gibco 25200056 For cell dissociation, pre-warm at 37 °C
10 cm tissue culture dishes Corning 25382-428 For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture
12 well-cell culture plates Corning-Sigma Aldrich CLS3513 For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures
15 mL tube BD Falcon 352096 For general tissue culture procedures
70 μm cell strainer Fisherbrand 22363548 To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  2. Hoeben, A., Landuyt, B., Highley, M. S., Wildiers, H., Van Oosterom, A. T., De Bruijn, E. A. Vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacol Rev. 56 (4), 549-580 (2004).
  3. Khan, T. A., Sellke, F. W., Laham, R. J. Gene therapy progress and prospects: therapeutic angiogenesis for limb and myocardial ischemia. Gene Ther. 10 (4), 285-291 (2003).
  4. Gupta, R., Tongers, J., Losordo, D. W. Human studies of angiogenic gene therapy. Circ Res. 105 (8), 724-736 (2009).
  5. Chu, H., Wang, Y. Therapeutic angiogenesis: controlled delivery of angiogenic factors. Ther Deliv. 3 (6), 693-714 (2012).
  6. Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits? Discov Med. 9 (46), 179-184 (2010).
  7. Said, S. S., Pickering, J. G., Mequanint, K. Advances in growth factor delivery for therapeutic angiogenesis. J Vasc Res. 50 (1), 35-35 (2013).
  8. Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro Oncol. 7 (4), 452-464 (2005).
  9. Leeper, N. J., Hunter, A. L., Cooke, J. P. Stem cell therapy for vascular regeneration: adult, embryonic, and induced pluripotent stem cells. Circulation. 122 (5), 517-526 (2010).
  10. Sieveking, D. P., Ng, M. K. Cell therapies for therapeutic angiogenesis: back to the bench. Vasc Med. 14 (2), 153-166 (2009).
  11. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90 (3), 195-221 (2009).
  12. Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49 (1), 32-40 (2003).
  13. Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
  14. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).
  15. Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).
  16. Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
  17. Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. J Cell Mol Med. 13 (10), 4113-4136 (2009).
  18. Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat Protoc. 7 (1), 89-104 (2011).
  19. Guo, J., et al. A secreted protein (Canopy 2, CNPY2) enhances angiogenesis and promotes smooth muscle cell migration and proliferation. Cardiovasc Res. 105 (3), 383-393 (2015).
  20. Wittig, C., Scheuer, C., Parakenings, J., Menger, M. D., Laschke, M. W. Geraniol Suppresses Angiogenesis by Downregulating Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)/VEGFR-2 Signaling. PLoS One. 10 (7), e0131946 (2015).
  21. Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biol Proced Online. 4, 24-31 (2002).
  22. Caplan, A. I. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine. J Cell Physiol. 213 (2), 341-347 (2007).
  23. Caplan, A. I., Dennis, J. E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J Cell Biochem. 98 (5), 1076-1084 (2006).
  24. Keating, A. Mesenchymal stromal cells: new directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
  25. Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212 (3), 702-709 (2007).
  26. Tang, Y. L., et al. Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction. Ann Thorac Surg. 80 (1), 229-236 (2005).
  27. Caplan, A. I. All MSCs are pericytes? Cell Stem Cell. 3 (3), 229-230 (2008).
  28. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
  29. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
  30. Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
  31. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  32. Gelati, M., Aplin, A. C., Fogel, E., Smith, K. D., Nicosia, R. F. The angiogenic response of the aorta to injury and inflammatory cytokines requires macrophages. J Immunol. 181 (8), 5711-5719 (2008).

Tags

Utvecklingsbiologi problemet 127 angiogenes aorta ring assay cellmigration endothelial nätverk mesenkymala stromaceller fysiska interaktioner parakrin faktorer perivaskulär celler navelsträngen
Aorta Ring samtidig kultur analysen: Ett bekvämt verktyg för att bedöma angiogena Potential mesenkymala stromaceller <em>In Vitro</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iqbal, F., Gratch, Y. S., Szaraz,… More

Iqbal, F., Gratch, Y. S., Szaraz, P., Librach, C. L. The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (127), e56083, doi:10.3791/56083 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter