Summary
Een sialoglycan microarray test kan gebruikt worden om anti-Neu5Gc antilichamen in humane sera te evalueren, waardoor het een potentiële diagnostische test voor kanker en andere chronische ontstekingsgemedieerde menselijke ziekten is.
Abstract
Cellen zijn bedekt met een mantel koolhydratenketens (glycanen) die gewoonlijk veranderd zijn in kanker en die variaties in siaalzuur (Sia) expressie omvatten. Dit zijn zure suikers die een 9-carbon ruggengraat hebben en die vertebraten glycanen op de celoppervlakken dichten. Twee van de belangrijkste Sia-vormen in zoogdieren zijn N- acetylneuraminezuur (Neu5Ac) en zijn gehydroxyleerde vorm, N- glycolylneuraminezuur (Neu5Gc). Mensen kunnen geen endogene Neu5Gc produceren door de inactivatie van het gen dat codeert voor cytidine 5'monofosfaat-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) hydroxylase (CMAH). Buitenlandse Neu5Gc wordt verkregen door menselijke cellen door het dieetverbruik van rood vlees en zuivel en verschijnt vervolgens op diverse glycanen op het celoppervlak, die hoofdzakelijk op carcinomen accumuleren. Derhalve hebben mensen circulerende anti-Neu5Gc antilichamen die verschillende rollen spelen in kanker en andere chronische ontstekingsgemedieerde aandoeningen en die potentieel diagnostisch en therapeutisch worden.rgets. Hier beschrijven we een high-throughput sialoglycan microarray test om dergelijke anti-Neu5Gc antilichamen in de menselijke sera te beoordelen. Neu5Gc-bevattende glycanen en hun bijpassende paren controles (Neu5Ac-bevattende glycanen), elk met een kern primaire amine, zijn covalent gekoppeld aan epoxy-beklede glazen glijbanen. We illustreren het afdrukken van 56 glijbanen in een 16-bronsformaat met behulp van een specifieke nano-printer die maximaal 896 array's per print kan genereren. Elke dia kan worden gebruikt om 16 verschillende humane sera monsters te screenen voor de evaluatie van anti-Neu5Gc antilichaam specificiteit, intensiteit en diversiteit. Het protocol beschrijft de complexiteit van dit robuuste gereedschap en biedt een basis richtlijn voor degenen die het antwoord op Neu5Gc dieet koolhydraatantigen in diverse klinische monsters in een matrixformaat willen onderzoeken.
Introduction
Sias zijn zure suikers die glycan ketens op glycoproteïnen op glycoproteïnen en glycolipiden in vertebraten omvatten. Sia expressie is gemodificeerd in kankercellen 1 en correleert met progressie en / of metastase 2 , 3 . Twee van de belangrijkste Sia-vormen in zoogdieren zijn Neu5Ac en zijn gehydroxyleerde vorm, Neu5Gc 2 . Mensen kunnen Neu5Gc niet synthetiseren door een specifieke inactivatie van het gen dat codeert voor het CMAH-enzym. Deze niet-humane Sia bevat metabolisch in menselijke cellen als 'zelf', afkomstig van voedings Neu5Gc-rijke voedingsmiddelen ( bijv. Rood vlees) 4 , 5 . Neu5Gc is aanwezig op lage niveaus op de celoppervlakken van menselijke epithelia en endothelia, maar komt vooral bij carcinomen op. Neu5Gc wordt herkend als vreemd door het humane humoral immune system 2 , 6 .De antigeencomplexiteit van Neu5Gc-glycanen kan zich op meerdere niveaus voordoen, inclusief Neu5Gc-modificatie, koppeling, onderliggende glycanen en steigers, en hun dichtheid, die allemaal weerspiegeld worden door de complexiteit van anti-Neu5Gc antilichaamrespons bij mensen 6 . Sommige van deze antilichamen dienen als carcinombiomarkers en potentiële immunotherapeutica 7 . De komst van de chemo-zymatische synthese van verschillende sialoglycanen 8 heeft de weg geboden voor de diepgaande analyse van dergelijke antilichamen, gefaciliteerd door het gebruik van glycan microarray technologie 9 , 10 . Dus, met de gefaciliteerde voorbereiding en manipulatie van grote bibliotheken van natuurlijke en synthetische koolhydraten, zijn glycan microarrays een krachtige high-throughput technologie geworden voor het onderzoeken van de interacties van koolhydraten met een groot aantal biomoleculen 10 , 11 , 12 , 13 . In een matrixformaat worden minimale hoeveelheden materialen gebruikt, en dit multivalente display van biologisch relevante glycanen zorgt voor het onderzoek naar duizenden bindende interacties in een enkel experiment. Belangrijk is dat deze technologie ook kan worden toegepast op biomarker ontdekking en het controleren van immuunresponsen in diverse monsters 7 , 12 .
Succesvolle glycan microarray fabricage vereist het overwegen van drie belangrijke aspecten: het type printer robot, glycan conjugation chemistry en detectie optica. Met betrekking tot het afdrukinstrument zijn twee technieken beschikbaar: contact- en niet-contactprinters. In contactdruk worden 1-48 stalen pennen gedompeld in een multi-well bronplaat die glycanoplossing bevat en worden gespot op gefunctionaliseerde glijbanen door direct contact op te nemen met het glazen glijvlak. De oplossing bedraagt deLevering aan de dia is een functie van de langdurige duur op het dia oppervlak. Meestal worden de monsters eerst voorgespoten op een glasblok (om homogene plekken te bereiken) voordat ze op het dia-oppervlak worden gedrukt. Bij niet-contactprinters ( bijv. De piezo-elektronische printer) worden de glycanen gedrukt vanuit een glazen capillaire met behulp van gecontroleerde elektrische signalen. Het elektrische signaal kan fijn gekalibreerd worden om nauwkeuriger afdrukken te verkrijgen ten opzichte van het afdrukken van contacten. De grootte en morfologie van de vlekken zijn ook relatief meer homogeen. Een extra voordeel is het recyclen van het monster terug naar de bronplaat na het afdrukken. Niettemin is het grote nadeel van piëzo-elektronische printers de drukknopbeperking (4 of 8), wat resulteert in een zeer lange drukduur, waarbij speciale aandacht moet worden besteed aan de stabiliteit, de temperatuur, de vochtigheid en de verdamping van het monster. De non-contact inkjetprinter vereist grotere voorbeeldvolumes 14 .
10 , 11 , 12 , 13 . Voor zeer gedetailleerde informatie over gedrukte glycan microarray technologie voor de oninitiateD-onderzoeker, verwijzen naar deze uitstekende beoordelingen 13 , 15 . Belangrijk is dat de recente Minimale Informatie Verplicht voor een Glycomics Experiment (MIRAGE) initiatief omschrijft richtlijnen voor steekproefbereiding 16 en voor het rapporteren van gegevens uit glycan microarray analyses 17 om de normen in dit groeiende veld te verbeteren.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de fabricage van sialoglycan microarrays met behulp van een specifieke contact nano-printer in een 16-vel formaat. Elk van de glycanen heeft een primaire amine die hun covalente verbinding met epoxy geactiveerde glazen glijbanen bemiddelt. We beschrijven ook de ontwikkeling en analyse van een dia met behulp van diverse menselijke sera-monsters, antilichamen en Sia-bindende plantentectines. Sialoglycan microarray analyses betreffen meerdere belangrijke stappen die matrix fabricage, verwerking, ontwikkeling en analyse omvatten. Array fabricage vereist de planning van de arRay-lay-out, bereiding van de glycanen en bronplaat, het programmeren van de nano-printer en het afdrukken van de dia's. Vervolgens worden de dia's verwerkt, ontwikkeld en geanalyseerd ( Figuur 1 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Human Sera-monsters werden verkregen uit de Israëlische Bloedbank en werden gebruikt in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en Tel Aviv University Institutional Review Board.
1. Array Fabrication Planning en Layout
- Bepaal de dia-indeling.
OPMERKING: Elke dia bevat 16 sub-arrays verdeeld in 16 identieke blokken genummerd B1 tot B16 ( Figuur 1B , Aanvullend Figuur 1A ). - Bepaal de pin lay-out. Gebruik vier pinnen, elk afdrukken van vier sub-arrays (blokken) per dia:
Pin 1 afdrukken Blokken 1, 2, 9 en 10;
Pin 2 afdrukken Blokken 3, 4, 11 en 12;
Pin 3 afdrukken Blokken 5, 6, 13 en 14; en
Pin 4 afdrukken Blokken 7, 8, 15 en 16 ( Aanvullend Figuur 1A ). - Bepaal het blok en de 384-put plaatopmaak.
OPMERKING: De volgorde waarin de glycanen in elk blok verschijnen, vereist een zorgvuldige planning. In dit voorbeeld arrAy, druk elke steekproef op vier replicaten, ontwerpt fluorescerende markeringsvlekjes in de rechterbenedenhoek (ter plaatseanalyse te vergemakkelijken) en drukvlekpunten op standaardcurve IgG (STD) afdrukken op zes toenemende concentraties ( aanvullend figuur 1B ).- Voor elke afgedrukte plaats, verdeel eerst het materiaal in vier putten (één voor elke pen) in een 384-putje plaat.
OPMERKING: De volgorde van de materialen in de 384-putplaat is gebaseerd op de ontwerpblokopmaak ( aanvullend figuur 1B-C ).
- Voor elke afgedrukte plaats, verdeel eerst het materiaal in vier putten (één voor elke pen) in een 384-putje plaat.
2. Bereiding van glycanen en de bronplaat
- Bereid glycandrukbuffer op (50 ml 300 mM fosfaatbuffer, pH 8,4). Weeg 58,5 mg mononatriumfosfaat monohydraat (NaH 2PO 4 .1H 2 O) en 3,9 g dinatriumfosfaat heptahydraat (Na2 HPO 4 .7H 2 O) in 40 ml gedeïoniseerd water (DIW). Titreer naar pH 8,4 onder gebruikmaking van 4 M NaOH. Stel het volume in op 50 ml anD filter door een 0,2 μm membraan voor sterilisatie.
- Bereid de markerbuffer op (50 ml 187 mM fosfaatbuffer, pH 5). Weeg 289 mg mononatriumfosfaat monohydraat (NaH 2PO 4 .1H 2 O) en 1,94 g dinatriumfosfaat heptahydraat (Na2 HPO 4 .7H 2 O) in 40 ml DIW. Titreer naar pH 5 met 1 M HC1. Stel het volume in op 50 ml en filter door een 0,2 μm membraan voor sterilisatie.
- Bereid STD-curvebuffer (50 ml PBS-glycerol: fosfaatgebufferde zoutoplossing, pH 7,4, aangevuld met 10% glycerol uit een 100% glycerolvoorraad) en filter deze door een 0,2 μm membraan voor sterilisatie.
- Bereid elke glycan voorraadoplossing bij 10 mM in DIW op. Controleer de sialyleerde glycaneconcentraties door middel van fluorescentiedetectie bij hogedruk-vloeistofchromatografische analyse 18 .
- Verdun elke glycan naar 100 μM in een totaal volume van 100 μl glycandrukbufferIn microcentrifugebuizen.
- Bereid de primaire amine bevattende fluorescerende kleurstof op. Solubiliseer Alexa 555-hydrazide op 1 mg / ml met markeringsbuffer en verdun vervolgens tot 1 μg / ml in een totaal volume van 1 ml.
OPMERKING: Elke andere primaire aminehoudende kleurstof kan volgens de dia-scanner worden gebruikt met een geschikte golflengte.
OPMERKING: Markerpunten vergemakkelijken het roosteruitlijning in elk blok tijdens analyse. - Bereiding menselijke IgG STD-curveverdunningen: Bereid 0,5 ml van een voorraadoplossing van menselijk IgG op 160 ng / μl in STD-curvebuffer. Verdun de voorraad 1: 1 zesmaal serieel om 80, 40, 20, 10, 5 en 2,5 ng / μl te verkrijgen, alles in de STD-curvebuffer bij een totaal volume van 200 μl elk.
OPMERKING: Andere Ig-isotypes kunnen worden gebruikt indien geschikt voor het experiment ( bijvoorbeeld menselijk IgA, IgM, IgE, of een Ig van een ander organisme). - Plaats de 384-putjesplaat op ijs. Met behulp van een elektronische multi-pipette, aliquot 7 μL van elke glycan-, marker- en STD-curve IgG-vier replicerenS van elk - volgens de plaatuitleg ( aanvullend figuur 1C ). Voor betere nauwkeurigheid, bel 35 μl van elk monster en aliquot 7 μl in elk van de vier putten van het monster. Plaats de overige 7 μL van elke glycan in hun originele buis.
- Bedek de plaat met parafilm en draai deze gedurende 2 minuten bij 250g en 12 ° C. Plaats de plaat bij kamertemperatuur (RT), beschermd tegen licht. Ontdek de plaat niet voordat de vochtigheid in de kamer 60-70% bereikt.
3. De Nano-printer programmeren
- Open de software "Microarray Manager". Gebruik het venster 'Methode eigenschappen'.
- Stel de werktafellay-out op: kies de '56-diaconfiguratie'.
OPMERKING: dit is een vooraf gedefinieerde configuratie die het mogelijk maakt om 56 afbeeldingen te printen. Kalibreer voor elk type plaat-, pen- en afdrukformaat ( Aanvullend Figuur 2 , stap 1). - Selecteer "Pin configuratie"| "Pin Tool 1x4 9 mm."
OPMERKING: dit is een vooraf gedefinieerde configuratie voor het gebruik van vier pennen ( aanvullend figuur 2 , stap 2). - Definieer het 'Pin type'. Bereken en maak het pin type dat geschikt is voor het afdrukken.
OPMERKING: Deze stap bepaalt hoeveel plaatsen een pin zou afdrukken voordat het opnieuw in de steekproef 384-put wordt gedypen en moet worden geoptimaliseerd voor de verschillende pin typen en schuifoppervlakkenchemie.
OPMERKING: Bij het gebruik van 946MP3-pennen, beschouw twee belangrijke problemen: 1) elke pin kan tot 140 homogene plekken printen en 2) voorspotting is essentieel om overmatige vloeistof uit de punt van de pen te verwijderen voordat u op de dia's afdrukt. Daarom programmeert u elke pin om 20 voorvlekken af te drukken op een voordrukblok (geoptimaliseerd voor 946MP3-pennen op epoxycoated slides).- Bereken het totale aantal afgedrukte plekken per monster.
OPMERKING: hier printt elke pin 4 plekken per sub-array (blok); Totaal 4 sub-arrays per dia's = 16 spots / slide. Na 7 glijbanen printt elke pin 16 x 7 = 112 spots. Daarnaast geven 20 voorvlekken voor het afdrukken 132 plaatsen / dip. Daarom wordt het pin type gedefinieerd als "946MP3-132 spots" (4 plekken per monster per blok x 4 blokken x 7 glijbanen + 20 voorvlekken = 132). - Maak het "Pin type" ( Aanvullend Figuur 2 , stap 3). Druk op "Setup" (linker paneel van de software) | "Micro Spotting Pins" | "Nieuwe naam" (946MP3-132 spots). Bepaal het aantal vlekken per dip (132), de plaatsdiameter (100 μm), de opname (0,25 μL), de levering (0,7 nL) en de minimale plekafstand (100 μm). Druk op "OK" | "OK."
- Selecteer in het venster 'Methodeeigenschappen' het aangemaakte pin type: '946MP3-132 spots'.
- Bereken het totale aantal afgedrukte plekken per monster.
- Definieer de wasomstandigheden. Zet de "Was voor het starten" en "Was na afwerking" op "Normaal wassen" ( Aanvullend Figuur 2 , stap 4).
- Definieer de "Plate lijst."
OPMERKING: Dit is het steekproefpatroon van de plaat (de volgorde van dips van de 384-putplaat) volgens de plaatuitleg. Om de plaat in de plaatlijst te uploaden, plaatst u een plaatsteekproefpatroon.- Maak de plaat "Steekproefpatroon." Ga naar "Sjablonen" ( Aanvullend Figuur 3 ) | "Steekproefpatronen." Geef een nieuwe naam ( bv. JoVE array) en selecteer "Insert" | "Vul bovenaan" | "Pin Tool 1 x4 9 mm." Selecteer de volgorde van de pick-ups volgens de vooraf gedefinieerde plaatuitleg ( Aanvullend Figuur 1A ). Druk op "OK" | "OK."
- Laad het plaatsteekproefpatroon. Klik op de rechterkant van de cel 'Plate list' ( Aanvullende afbeelding 3 ) | "Voeg plaat toe" en selecteer het juiste plaatsteekproefpatroon (de "JoVE array", beschreven in stap 3.6.1.). Selecteer "Normal Wash". pers"OK" | "OK."
- Ga naar de "Sample Plates" en verander de positie offset naar 1 (die bepaalt waar de plaat zich bevindt op het array-deck).
OPMERKING: De offsetpositie van 0 ligt dichter bij het sonicatorbad. - Definieer het 'Microarray Print Design'. Bereken de afstanden tussen de blokkeuze en de afstanden.
- Overweeg de afmetingen van het ontwikkelingsgereedschap dat de glijbaan verdeelt in 16 putjes van 7 x 7 mm, met 2 mm ruimtes tussen subrails (totaal 9 mm tussen blokken; aanvullend figuur 4 ).
- Beschouw de dimensies van de sub-array.
OPMERKING: De afstand tussen plaatsen is 0,275 mm en er zijn 12 kolommen en 18 rijen in dit printontwerp; De totale afmetingen zijn: breedte (11 x 0.275 mm = 3.025 mm) en hoogte (17 x 0.275 mm = 4.675 mm). Bereken de horizontale afstand: 9 mm - (11 0.275) = 5.97 mm. Bereken de verticale afstand: 9 mm - (17 x 0.275) = 4.325 mm. Bereken dVan de linkerzijde van de glijbaan: 4,43 mm + 1,07 mm = 5,5 mm. Bereken de afstand van de bovenzijde van de glijbaan: 2.95 mm + 0.55 mm = 3.5 mm ( Aanvullend Figuur 4 ). - Definieer de "Print Designs" ( Aanvullend Figuur 5 ). Selecteer 'Sjablonen' | "Print Designs" | "Nieuwe."
- Selecteer "Pin Setup" | "Pin Tool 1 x 4 9 mm" | "Pin - 946MP3-132 spots." Verander in het tabblad 'Algemeen' de 'Naam van Microarray Print' ( dwz 'JoVE array'). Selecteer 'Spot Speed' | "Replicate Number" (4) | "Touch Point Height" (0 mm) | "Soft Touch Height" (3 mm) | "Afdrukken naar alle beschikbare posities" ( Aanvullend Figuur 5A ).
- Kies in het tabblad 'Microarray' de horizontale en verticale afstand (5,9 mm en 4,325 mm van stap 3.8.2) en het aantal horizontale en verticale microarrays (2). Selecteer 'Afdrukken'Microarray Horizontaal "|" Print Duplicate Microarray "( Aanvullend Figuur 5B ).
- Kies in het tabblad sub-array het maximum aantal kolommen (12), het maximale aantal rijen (18) en de afstand tussen de kolommen en rijen (275 μm) ( aanvullend figuur 5C ).
- Kies in de afmetingen tab de afstand van de linkerzijde van de dia (5.5 mm), de afstand vanaf de bovenkant van de dia (3,5 mm, berekend in stap 3.8.2), de breedte van de diafragma (25 mm) , En de hoogte van de afdrukglijbaan (75 mm) ( aanvullend figuur 5D ). Druk op "OK" | "OK."
- Klik op de rechterkant van de cel "Microarray Print Designs" en selecteer het gedefinieerde ontwerp (de "JoVE array" van stap 3.8.3; Aanvullend Figuur 6 ).
- Definieer de "Slide Count" (56) en verander de "Position Offset" (0). Dit bepaalt de poSitie van de eerste dia die op het arrayerdeck wordt gedrukt ( aanvullend figuur 6 ).
- Definieer het "Microarray Pre-Print Design" ( Aanvullend Figuur 6 ). Selecteer "Glasblok" | "Pre-Print 1 x 4 mm pin tool."
OPMERKING: Met deze spatieafstand kan 46.464 voorvlekken (voor alle 4 spelden) op het glasblok, dus 46.464 / 4 = 11.616 voorvlekken per pen. Als de ruimte op het pre-printblok was opgebruikt, zal de printer stoppen en het blok moet omgeslagen worden.
OPMERKING: Om te berekenen na hoeveel monsters het voordrukblok vol is, overwegen het volgende: elk monster wordt genomen met 8 pin-dips in de 384-putplaat om 56 dia's te maken (7 dia's per dip) en elke dip Heeft nog eens 20 pre-spots, waardoor in totaal 160 voorvlekken per monster worden verkregen. Daarom 11.616 / 160 = 72.6 monsters. Zo zou het voordrukglasblok moeten worden omgeslagen na 72 monsters (om de tijd voor het flipperen te evalueren, h te metenOw lang duurt het voor een monster om een volledige run te voltooien op 56 glijbanen en vermenigvuldigen dan met 72). - Selecteer "PrePrint Design gebruiken" | "Ja" | "Scannen Barcodes" (Nee) | "Afdrukken enkelvoudig repliceren" (nee) ( aanvullend figuur 6 ).
- Klik op 'Valideren' ( aanvullend figuur 6 ).
- Klik op "Opslaan" en sla de methode op als een arr-bestand ( bijv. "JoVE array.arr," Aanvullende afbeelding 6 ).
4. Afdrukken van ontworpen arrays
OPMERKING: Alle stappen moeten uitgevoerd worden in een schone kamer met vochtigheid van 60-70% en met geschikte handschoenen en kleding ter bescherming
- Zet de nano-printermachine en luchtbevochtiger aan.
- Voor de wasbuffer en bevochtiging, vul met DI water. Leeg de wasbottel (afvoer) en bevochtigingsvanger-carboy ( Aanvullend Figuur 7A ).
- Zet de luchtbevochtiger op70% vochtigheid en start bevochtiging.
- Maak alle pennen voor het afdrukken schoon. Bereid 50 ml hete (65 ° C) speldreinigingsoplossing (15 g speldreinigingsreagens en 50 ml 65 ° C water, vermengd grondig tot het vaste reagens volledig is opgelost).
- Breng de schoonmaakoplossing aan elke speldop door de speldrubbel (fijn) in de spuitoplossingsoplossing te dompelen en het oppervlak van elke speldop te poetsen.
OPMERKING: Pin-tip reinigingsoplossing is corrosief en giftig. Zorg ervoor dat u altijd handschoenen en veiligheidsbril draagt bij het gebruik van deze oplossing. Het doordringen van speldjes in de speldreinigingsoplossing gedurende meer dan een paar minuten kan leiden tot permanente spierschade. - Vul het ultrasone bad met 1 liter gedistilleerd water en plaats de pennen in een vlotterschoonmaakrek in het bad. Soniceer gedurende 5 minuten en verwijder de pennen. Laat droog en zachtjes met speciale doekjes schoonmaken.
- Breng de schoonmaakoplossing aan elke speldop door de speldrubbel (fijn) in de spuitoplossingsoplossing te dompelen en het oppervlak van elke speldop te poetsen.
- Open de "Microarray Manager" -afdrukEr software; Bij aansluitingsset gaat het printerlicht aan (rood / groen). Druk op 'Stop' | "Clear" | "Init" ( Aanvullend Figuur 7B , stappen 1-3); De printkop arm zal dan de X, Y, Z-uitlijningen opnieuw instellen.
- Om de pennen in de printkop te laden, druk op "Load" ( Aanvullend Figuur 7B , stap 4) en plaats de pennen in de printkop volgens de gedefinieerde configuratie van de print / pin tool layout ( Aanvullend Figuur 7C ); Deze lay-out maakt gebruik van 4 pennen, elke afdruk van 4 sub-arrays op elke dia om in totaal 16 sub-arrays per dia te krijgen ( aanvullend figuur 1A ). Nadat u de pennen hebt geplaatst, drukt u nogmaals op "Init".
- Monteer de dia's op het array-dek. Open de glijbaan en reinig elke glijbaan door ultra-hoge zuiverheid stikstofgas te blazen. Plaats het gewenste aantal glijbanen op het platform. Houd de glijbanen met twee vingers in de onderste hoeken vast en plaats de glijbaan erinpositie. Houd de twee rechter hoeken vast en druk de linker hoeken zachtjes tot de dia stevig in zijn positie past. Duw voorzichtig naar de linkerhoek om een strakke pasvorm te garanderen ( aanvullend figuur 7D ).
- Maak het pre-blockglas schoon met gedestilleerd water, 70% ethanol en 100% ethanol en laat het drogen met lucht (gebruik alleen speciale doekjes). Plaats het voorblokglas op zijn plaats op het dek.
- Vul een sonicatorbad ( aanvullend figuur 7B ). Druk op "Vul" gedurende 55 s en druk op "OK". Dreineer de sonicator door 20 seconden op "Drain" te drukken en druk dan op "OK". Herhaal de vulling en afvoer nog een keer en vul dan nog eens 55 seconden in.
- Vul het wasbad ( Aanvullend Figuur 7B ): druk op "Prime" gedurende 40 seconden en druk dan op "OK".
- Plaats de 384-putjesplaat met gelijke monsters in de plaats op het array-dek en verwijder de parafilmafdekking.
- Wanneer het afdrukken is voltooid, moet u het sonicatorbad afvoeren ( aanvullend figuur 7B ) en de luchtbevochtiger uitzetten.
- Laat de glijbanen gedurende 16-24 uur zonder bevochtiging op het array-dek drogen.
- Nummer de dia's met een alcohol- / oplosmiddelbestendige merkpen en sla ze in een stofdichte doos in het donker.
5. Verwerking en ontwikkeling van de arrays
- Breng een glijbaan uit de vacuüm-verzegelde doos en plaats deze 5 minuten in een chemische afzuigkap, de array naar boven om de overmaat vloeistof te verdampen.
- Scan de dia bij de hoogste winst (950 PMT) om ervoor te zorgen dat alle vlekken zijn afgedrukt.
- Ga door met de chemische blokkering van epoxygroepen op de glijbaan
- Bereid 50 ml ethanolamine blokkerende oplossing (0,1 M Tris-HCl, pH 8 en 0,05 M ethanolamine). Meng 140 ml DIW met 8,8 ml Tris-HCl (1,7 M, pH 8) en 0,45 ml ethanolamine (16,6 M). Overboeken naar een 50-mL kleurbuis ( Aanvullend Figuur 8A ) en warm tot 50 ° C.
- Hydreer de dia. Plaats de glijbaan in een vlekbuis gevuld met DIW, bedek het met folie en incubeer gedurende 5 minuten met langzame en zachte schudden bij RT.
- Blok de reactieve epoxygroepen op de glijbaan. Dip de glijbaan in de 50 ml kleurslang gevuld met voorverwarmde ethanolamine blokkerende oplossing, deksel met folie, en incubeer gedurende 30 minuten met langzaam en zacht schudden bij RT.
- Gooi de ethanolamine-blokkeringsoplossing in de juiste houder van de biobrandstofafval en plaats de glijbaan in een nieuwe, schone vlekbuis die is gevuld met 50 ° C DIW. Bedek met folie en incubeer gedurende 10 minuten met langzame en zachte schudden bij RT.
- Gooi het water weg en breng de glijbanen over op een glasvlekhouder ( Aanvullend Figuur 8B ). Plaats de glasvlekhouder in een schommelhouder en centrifugeer de dia gedurende 5 minuten bij 200 xg en RT.
- Plaats de glijbaan op een 16-verdeler ( aanvullend figuur 8C ).
- Bereid PBST-wasoplossing op: 50 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4 + 0,1% Tween-20.
- Bereid biologische blokkerende oplossing (PBS-OVA): 5 ml PBS, pH 7,4 + 1% kip-ovalbumine (10 mg / ml).
OPMERKING: De keuze van het blokkerende reagens is cruciaal voor het succes van de detectie van anti-Neu5Gc antilichamen. Ovaalbumine is gemaakt in kippen die, zoals de mens, Neu5Gc niet kunnen synthetiseren, waardoor deze Sia ontbreekt. Voor de detectie van Neu5Gc kunnen zelfs kleine verontreinigingen de gevoeligheid van de test dramatisch verminderen, soms zelfs geen anti-Neu5Gc reactiviteit detecteren. Bijvoorbeeld, het meest gebruikte blokkerende reagens, boviene serumalbumine (BSA), hoewel niet zelf ge glycosyleerd, bevat boviene IgG-verontreinigingen die Neu5Gc-delen dragen en daarom competitie wMet gedrukte glycanen wanneer ze bindend zijn tegen anti-Neu5Gc antilichamen 19 , 20 . - Prewell de putjes. Gebruik een multipipette, alikot 200 μL PBST in de glijbronnen, plaats ze in een overdekte vochtige kamer en schud 5 minuten.
OPMERKING: De vochtigheidskamer is een glazen lade met een nat handdoekpapier, bedekt met nylonfolie en folie om de monsters tegen licht te beschermen. - Verwijder de PBST door te flikkeren en tachtjes op een schone handdoek te tikken en 200 μL PBS-OVA-blokkeringsbuffer in elke put op te nemen. Plaats in een vochtige kamer en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met zacht schudden.
- Bereid de primaire detectie verdund in PBS-OVA-blokkeringsbuffer op, zoals vermeld in tabel 2 .
OPMERKING: Voor de kwaliteitscontrole (QC) beoordeling van deze sialoglycan microarray, gebruik verschillende Sia bindende eiwitten: Sambucus nigra lectine (SNA), geïsoleerd uit elderberry bark, wordt verwacht dat Sia &# 945; 26; Maackia Amurensis Lectin II (MALII) zal naar verwachting Siaa23 herkennen; En kip anti-Neu5Gc IgY wordt verwacht, herken alle Neu5Gc-bevattende sialoglycanen. Gebruik bovendien diverse menselijke sera-monsters om profiel anti-Neu5Gc IgG-respons te profileren. De concentratie van lectines / antilichamen / sera moet experimenteel worden gekalibreerd. - Flip droge PBS-OVA blokkeringsbuffer en voeg 200 μL primair antilichaam per putje toe (minimaal volume per putje: 70 μL), incubeer in een vochtige kamer gedurende 2 uur.
- Flick droog de primaire detectie en was 4 keer met PBST (tussen de 3de en 4de wassen, incubeer de slede in PBST gedurende 5 min in vochtige kamer). Was eens met PBS.
- Bereid het secundaire antilichaam in PBS, zoals vermeld in Tabel 2 .
- Flick droog de PBS en voeg 200 μL secundair antilichaam toe. Incubeer gedurende 1 uur bij RT met schudden.
- Flick droog het secundaire antilichaam en was vier keer met PBST (tussen de 3Rd en 4 de was, incubeer de dia in PBST gedurende 5 min in de vochtige kamer).
- Verwijder het frame voorzichtig en plaats de glijbanen in een 50 ml glijbuis die met PBS wordt gevuld en schud 5 minuten.
- Vul twee glijbaden ( aanvullend figuur 8D ) met DIW, plaats de glijbaan in de glijhouder en doei het in het bad. Dompel 10 keer snel en verplaats vervolgens naar het tweede bad en doei 10 keer meer. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur bij schudden.
- Verwijder het water en breng de glijbaan naar een glazen vlekhouder ( Aanvullende afbeelding 8B , laat de dia luchtdrogen). Plaats de glasvlekhouder in een schommelhouder en centrifugeer de dia gedurende 5 minuten bij 200 g en RT.
- Scan de dia en geef het dan in een stofdichte doos in het donker.
6. Array Scanning en Data Analysis
- Open de fluorescerende dia-scanner en laat het gedurende 5 minuten verwarmen. Open deScannen en analyseren van software.
- Stel de scanparameters in ( aanvullende afbeelding 9A ): scan op 532 nm en 100% power met een winst van 350 PMT, met een lijn tot gemiddeld en een 0 μm focuspositie. Gebruik een resolutie van 10,0 μm pixelformaat.
OPMERKING: Scanparameters kunnen worden aangepast aan verschillende dia types, fluorescentie en resolutie. - Scan de ontwikkelde dia. Open de scannerdeur en plaats de dia binnen, array naar beneden gericht. Start scannen (groene "Play" knop in het menu van het navigatiepaneel van het softwarepaneel, aanvullend figuur 9B ).
- Sla de gescande dia's op als een tiff-bestand.
- Bereid glijbaan voor analyse. Selecteer 'Load array list' en upload het juiste GAL-bestand dat de arrays in elk blok op de dia plaatst ( aanvullend figuur 9C ).
OPMERKING: Het GAL-bestand bevat informatie over zowel de identiteit en de locatie (X, Y) van elke plaats op de dia. Dit bestand kan worden aangemaaktDoor de printersoftware een tab-afgestemd tekstbestand exporteren op basis van monstersidentiteiten in de 384-bronplaat en het gedefinieerde printontwerp. - Stel de uitlijning en analyse parameters in. Druk op de knop "Optie" in het menu van het navigatiepaneel van de software ( Aanvullende afbeelding 10 ).
- Definieer de uitlijnparameters. Zoek circulaire functies, resize functies tijdens de uitlijning met 50 - 350%, beperk de functie beweging tot een maximale vertaling van 40 μm, unflag functies die falen achtergronddrempel (CPI drempel 0), schat de wrapping en rotatie bij het vinden van blokken en automatiseer beeldregistratie (10 pixels) ( aanvullend figuur 10 ).
- Definieer de analyseparameters: W1 / 532 ratio, normale standaardafwijking, ontbrekende eigenschappen analyseren en achtergrond aftrekken. Klik op "selecteer" en dan "Local media background median" en stel 2 pixels uit om te sluiten en een 3-pixel breedte achtergrond. Druk op OK." SeT het verzadigingsniveau van de scanner naar de standaard ( aanvullend figuur 10 ).
OPMERKING: De achtergrondaftrekkingsmethode is afhankelijk van het experimentele ontwerp en kan volgens specifieke behoeften worden aangepast. - Breng de eigenschappen van de kaarten af. Zet het programma in de blokmodus (druk op "B"), selecteer alle blokken (Ctrl + A), plaats de matrixkaarten en stel alle blokken (Alt + Shift + F7) in ( Aanvullende afbeelding 11 ).
- Verfijn de functie-uitlijning in elk blok. Zoom (druk op "Z" om in de zoommodus te komen) in het linkerbovenste blok, druk nogmaals op "B" (blokstand) en druk op het raster van dit blok. Verplaats alleen het rooster van dit blok totdat het perfect uitkomt met de blokkeuzes en druk op F5 om de functies in dit geselecteerde blok uit te lijnen. Herhaal de roosterbeweging en F5-uitlijning tot de plekken perfect rond zijn. Doe hetzelfde voor elk van de 16 blokken totdat alle roosters op zijn plaats zijn.
- Ontleed en sla de gegevens op. Selecteer alle blokken (Crtl +A) en analyseer dan de data (Alt + A). Sla de analyseresultaten op (Ctrl + U) als een .gpr-bestand.
- Open het opgeslagen .gpr-bestand in een spreadsheetprogramma en analyseer de intensiteit van elke plek op basis van fluorescentie na lokale achtergrondaftrekking (F532-B532).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Array Printing, Development en Analysis:
Het afdrukken van een sialoglycan microarray met meerdere glycanmonsters en menselijke IgG STD-curven in 16 verschillende blokken vereist een grondige kalibratie om ervoor te zorgen dat alle monsters zo uniform mogelijk in alle 16 blokken per dia en op alle dia's in dezelfde afdrukcyclus worden gedrukt. Daarom zijn meerdere kalibreringsexperimenten nodig voordat de specifieke drukparameters worden bepaald, inclusief buffersamenstelling voor elk type monster, type slide en fabricage, type 384-putplaat, vochtigheidsniveaus, monstervolume in de 384-putplaat, hoeveelheid pre -printing voor elk type monster, menselijke IgG STD-curveconcentraties en marker type. De duurzaamheid van dergelijke gedrukte sialoglycan array slides werd gevalideerd tot 10 maanden lang in een vacuüm-verzegelde doos in het donker bij kamertemperatuur. Bij elke drukproef is uniformiteitVerder gecontroleerd en gevalideerd door kwaliteitscontrole experimenten met behulp van Sia bindende lectines en antilichamen. De ontwikkelings- en scanprotocollen werden geoptimaliseerd om uniformiteit en nauwkeurigheid te bereiken door monsters in en tussen dia's van dezelfde afdrukloop te vergelijken. De glijbanen worden ontwikkeld met de 16-verdeler, die zorgt voor een goede scheiding tussen blokken, met behulp van geoptimaliseerde blokkeringsomstandigheden (chemische en biologische), was- en incubatietijden. De primaire en secundaire detectie was uitgebreid gekalibreerd om maximale detectie te waarborgen met minimale achtergrond- en niet-specifieke binding. Bij het scannen en analyseren van dia's werden de uitvoerresultaten overgebracht naar een spreadsheetbestand en geanalyseerd om de detectie op elke plaats te bepalen. Iedere plek werd onderworpen aan een outliercontrole en weggelaten als het niet aan QC voldoet (als de% CV> 20 is en de plaats buiten het bereik van één standaardafwijking ligt weg van het gemiddelde van de vier replicaten). Dan is de gemiddelde signaalintensiteit afteR werd de aftrekking van de lokale achtergrond gemiddeld voor replicatiepunten per monster om het relatieve fluorescentie-eenheid (RFU) data punt per gedrukt monster te genereren. Zodra de uniformiteit van de IgG STD-curven in alle geteste blokken werd gevalideerd, werden de RFU-waarden genormaliseerd in ng / μL IgG, waardoor de kans is om de monsters beter te vergelijken binnen en tussen experimenten.
Sia-binding High-throughput Assay:
Sialoglycan arrays kunnen worden gebruikt om determinanten te detecteren ( bijvoorbeeld eiwitten, lectines, antilichamen, virussen, enz. ) Die Sia-bevattende glycanen binden. Voor QC na afdrukken worden Sia-bindende plantelectines en anti-Neu5Gc IgY gebruikt 19 . SNA bindt a2-6-gekoppelde Sia, MALII bindt a2-3-gekoppelde Sia, en anti-Neu5Gc IgY bindt Neu5Gc-bevattende sialoglycanen, maar bindt Neu5A nietC-bevattende sialoglycanen 19 , zoals getoond in figuur 2A . Het QC-experiment heeft tot doel validatie van spotprints en identiteit en het gebrek aan variabiliteit tussen de gedrukte blokken met behulp van de vier verschillende pennen. De variabele blokkeren wordt gecontroleerd door vier blokken te ontwikkelen voor elke primaire detectie per dia en door blokken te vergelijken die werden afgedrukt met elk van de vier pinnen met dezelfde primaire detectie-eenheid. Er wordt dan een vergelijking gedaan om ervoor te zorgen dat er geen grote verschillen zijn.
Humane sera bevatten diverse anti-Neu5Gc antilichamen 6 met implicatie voor diverse humane ziekten 2 , 21 , 22 , 23 . Om sialoglycan herkenning in humane sera IgG te evalueren, werden 12 sera van gezonde menselijke donoren geanalyseerd op de gedrukte sialoglycan micrOarray en ontwikkeld met behulp van fluorescent gelabelde anti-menselijke IgG ( Figuur 2B ). Elk gedrukt blok bevat een menselijke IgG STD-curve die in alle blokken vergelijkbaar en homogeen is ( Figuur 2C ). Pas na het valideren van de kwaliteit van de STD-krommen in elk blok ( Figuur 2C ) worden de resultaten van de glykanen genormaliseerd volgens de helling in het blok en vervolgens vermenigvuldigd met de verdunningsfactor. Zoals getoond in Figuur 2B bevatten alle geteste humane sera verschillende niveaus van anti-Neu5Gc IgG, met bijna geen herkenning van de gelijke paren Neu5Ac-bevattende sialoglycanen. Bovendien zijn anti-Neu5Gc IgG herkenningspatronen zeer uiteenlopend tussen deze 12 verschillende sera, zowel in intensiteitsniveau als diversiteit.
Figuur 1: OverzichtVan Array Printing, Development en Image Analysis. ( A ) Neu5Gc9Acα2-6GalNAcαProNH2 wordt weergegeven als een representatieve Neu5Gc-contaerende Sia-glycan, met een primaire amine die op epoxy-beklede glazen glijbanen wordt gedrukt. ( B ) Gedrukte arrays worden ontwikkeld met verschillende Sia-bindende eiwitten, gevolgd door detectie met een geschikt fluorescent gemerkt secundair antilichaam. Elk sub-array kan individueel worden ontwikkeld. ( C ) Het scannen van de probed slide in een fluorescentie scanner genereert een afbeelding die verder wordt geanalyseerd met behulp van de scanner beeldsoftware. De sub-arrays zijn overlaid met een rasterkaart van elke plek op de array's en de fluorescentie gedetecteerd voor elke plek. De resultaten worden dan overgebracht naar een spreadsheet bestand. Een enkele array in een enkele put is schematisch weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Profielen van Sialoglycan Microarrays met behulp van verschillende Sia-bindende Proteïnen.
Slides werden ontwikkeld met 16 verschillende primaire detectie-delen, één in elk blok. ( A ) Vertegenwoordiger 3 blokken van een QC-dia die de bindingspatronen van de Sia-specifieke plantelectines SNA en MALII en polyclonale monospecifieke kip anti-Neu5Gc IgY toont. De resultaten zijn weergegeven als de RFU in heatmap indeling voor elk individueel blok (rood, wit en blauw, die de 100 ste, 50 ste, en 0-de percentielen, respectievelijk). ( B ) 12 verschillende gezonde mensensera werden getest bij een verdunning van 1: 100 en gedetecteerd met anti-huamn IgG om anti-Neu5Gc IgG-reactiviteit te profileren. RFU-gegevens werden genormaliseerd naar ng / μL door elke waarde te verdelen met de IgG STD-curvehelling in elke specifieke blOck en vervolgens vermenigvuldigd met de verdunningsfactor. De gegevens worden weergegeven in heatmap formaat voor alle blokken in combinatie (rood, wit en blauw, die te 100ste, 50e en 0-de percentielen, respectievelijk). ( C ) Menselijke IgG STD-curven van de 12 blokken ontwikkeld met menselijke sera die gebruikt werden om de data te normaliseren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Glycan ID | Structuur | |||
| 1 | Neu5,9Ac 2 α3Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 2 | Neu5Gc9Acα3Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2CH 2 </ Sub> NH 2 | |||
| 3 | Neu5,9Ac 2 α6Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 4 | Neu5Gc9Acα6Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 5 | Neu5Acα6GalNAcαO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 6 | Neu5Gcα6GalNAcαO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 7 | Neu5,9Ac 2 α3Galβ3GlcNAcβO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 8 | Neu5Gc9Acα3Galβ3GlcNAcβO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 9 | Neu5,9Ac 2 α3Galβ3GalNAcαO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 10 | Neu5Gc9Acα3Galβ3GalNAcαO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 11 | Neu5Acα3Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 12 | Neu5Gcα3Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 13 | Neu5Acα3Galβ3GlcNAcβO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 14 | Neu5Gcα3Galβ3GlcNAcβO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 15 | Neu5Acα3Galβ3GalNAcαO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 16 | (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 17 | Neu5Acα6Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 18 | Neu5Gcα6Galβ4GlcNAcβO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 19 | Neu5Acα6Galβ4GlcβO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 20 | Neu5Gcα6Galβ4GlcβO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 21 | Neu5Acα3Galβ4GlcβO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 22 | Neu5Gcα3Galβ4GlcβO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 23 | Neu5,9Ac 2 α6GalNAcαO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 24 | Neu5Gc9Acα6GalNAcαO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 25 | Neu5Acα3GalβO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 26 | Neu5Gcα3GalβO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 27 | Neu5Acα6GalβO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 28 | Neu5Gcα6GalβO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 29 | Neu5,9Ac 2 α3GalβO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 30 | (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 31 | Neu5,9Ac 2 α6GalβO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 32 | Neu5Gc9Acα6GalβO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 33 | Neu5Acα3Galβ3GalNAcβO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 34 | Neu5Gcα3Galβ3GalNAcβO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 35 | Neu5,9Ac 2 α3Galβ3GalNAcβO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 36 | Neu5Gc9Acα3Galβ3GalNAcβO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| Neu5,9Ac 2 α6Galβ4GlcβO (CH2) 2 CH2-NH2 | ||||
| 38 | Neu5Gc9Ac6Galβ4GlcβO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 39 | Neu5,9Ac 2 α3Galβ4GlcβO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
| 40 | Neu5Gc9Ac3Galβ4GlcβO (CH2) 2 CH2-NH2 | |||
Tabel 1: Lijst van Gedrukte Glycans.
| Primaire / Secondary | Antilichaam / Lectine | Voorraadconcentratie | specificiteit | Werkend verdunning / concentratie |
| Primaire detectie | Gebiotinyleerd-MalII | 1 mg / ml | Sialinezuur in a2-3-koppeling | 1:50, 20 μg / ml |
| Gebiotinyleerd-SNA | 2 mg / ml | Sialinezuur in a2-6-koppeling | 1: 100, 20 ug / ml | |
| Kip anti-Neu5Gc IgY | ND | Neu5Gc Sialic zuur | 1: 7.000 | |
| Menselijk Serum | 100% | Talrijke epitopen | 1: 100 | |
| Secundaire Detectie | Cy3-Streptavidine | 0,75 mg / ml | biotine | 1: 500, 1,5 μg / ml |
| Cy3-anti Kip IgY | 0,75 mg / ml | Kip IgY | 1: 2000, 0,375 μg / ml | |
| Cy3-anti Menselijk IgG H + L | 0,6 mg / ml | HumaN IgG | 1: 1.500, 0.4 μg / ml |
Tabel 2: Lijst van primaire en secundaire detectieproteïnen.
Aanvullende cijfers: Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een succesvolle glycan microarray fabricage vereist een zorgvuldige planning en bevat diverse belangrijke stappen in het protocol. Deze omvatten: (1) het plannen van de blok- en plaatlayouts die alle volgende parameters bepalen ( bijv. Afstanden, afstand, hoeveelheid monsters en afdrukken); (2) het schoonmaken van de pennen en het waarborgen van de pin integriteit, die van cruciaal belang is voor het controleren van spot homogeniteit; (3) het handhaven van hoge vochtigheid tijdens het printen, kritisch om vermijding van het monster tijdens lange afdruktrajecten te vermijden, waardoor de spot homogeniteit kan worden gecompenseerd; (4) het selecteren van de juiste uitlijn- en analyseparameters, die de resultaten kunnen beïnvloeden ( bijv. Achtergrondtrekkingsmethode, drempelwaarde en flexibiliteit van de spotgrootte).
De methode kan verder worden aangepast om specifieke experimentele ontwerpen en doelen te voldoen. Bijvoorbeeld, het pre-spotting nummer kan worden aangepast om beter te passen aan elk type materiaal dat op de array moet worden afgedrukt. De speldwasstap tijdens deAfdrukken kan worden geoptimaliseerd om verschillende afdrukmaterialen aan te passen, met kortere of langere wascycli. Bovendien kan het aantal vlekken dat een pin afdrukken per dip aangepast worden om meer of minder plekken te bevatten, maar vereist aparte kalibratie voor elk type materiaal dat op de array wordt gebruikt. Het type fluorescentiemarkaat en de concentratie ervan kunnen worden aangepast, zolang het de juiste chemische groep voor vervoeging bevat (dat wil zeggen primaire amine voor epoxycoated glijbanen). De concentraties en typen STD-curven kunnen worden verlengd ( bijv. Menselijk / muis / ander organisme IgG, IgM, IgA, enz. ). Buffervoorwaarden kunnen worden geoptimaliseerd om verschillende materialen aan te passen, waarbij materialen bij voorkeur met primaire amine ontbreken om niet-specifieke binding aan de matrix te vermijden, wat een verhoogde achtergrond zou veroorzaken. Belangrijk, voor het optimale detecteren van Neu5Gc, moet het biologische blokkerende reagens vrij zijn van Neu5Gc ( bijv. Vermijd BSA amd melk), omdat dit Neu5Gc-sialoglycan detectie kan verminderen en ikNcrease achtergrond 19 , 20 . Primaire en secundaire detectieconcentraties moeten worden geoptimaliseerd om hoge achtergrond- en niet-specifieke binding te vermijden. Daarnaast kunnen scanparameters ( bijv. Vermogen, winst en resolutie) worden aangepast om de achtergrond te verminderen of lage signalen te verbeteren. Tenslotte kunnen uitlijning en analyse parameters worden aangepast aan hoge achtergrond of anders gevormde eigenschappen. Verdere informatie en richtlijnen met betrekking tot de aanbevolen normen voor het rapporteren van glycan microarray data is recentelijk beschreven door het MIRAGE-initiatief 17 , dat uiteindelijk de uitwisseling en interpretatie van gegevens kan vergemakkelijken.
Samengevat geven glycan microarrays een robuust hulpmiddel voor het onderzoeken van glycan-biomolecule interacties en kunnen worden aangepast aan verschillende biologische monsters. Anti-Neu5Gc antilichamen spelen verschillende rollen bij de ziekte van de mens 23 . Bijvoorbeeld in kankerAnti-Neu5Gc antilichamen spelen dubbele rollen: enerzijds dienen zij als potentiële biomarkers, maar daarentegen dienen zij als potentiële therapeutica 7 , 21 , 24 . Deze antilichamen dragen ook bij aan de exacerbatie van atherosclerose 25 , de werkzaamheid van xenotransplantatie 20 , 26 en het effect van glycosyleerde biotherapeutica 27 . Aldus is het profileren van anti-Neu5Gc antilichamen in verschillende menselijke monsters van toenemende belang, en door middel van hoge doorlaat analyses, zoals hier beschreven, kunnen bijdragen leveren tot het vergroten van ons inzicht in hun rol in de gezondheid van de mens en de ziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een Research Career Development Award van het Israël Cancer Research Fund, een subsidie van het Israëlische National Nanotechnology Initiative en het Helmsley Charitable Trust voor een focal technologiegebied op Nanomedicines for Personalized Theranostics (VP-K) en National Instituten van Gezondheidstoelaag R01GM076360 (naar XC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary-amine containing sialoglycans | Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services) | Contact info@glycohubusa.com for compound requests | Printed glycans |
| Monosodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | Printing buffer component |
| Disodium phosphate heptahydrate | Sigma | S9390 | Printing buffer component |
| Phosphate buffered saline | Hy-Labs | BP-507/500D | Printing buffer/ incubation/washing buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Slide blocking reagent |
| Glycerol | Sigma | G-7893 | Printing buffer component |
| Ethanolamine | Thermo-Fisher Scientific | 0700/08 | Slide blocking reagent |
| Ovalbumin (Grade V) | Sigma | A5503 | Slide Blocking protein |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | Slide washing detergent |
| Alexa 555-Hydrazide | Thermo-Fisher Scientific | A20501MP | Marker on array |
| ChromPure Human IgG, whole molecule | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Printing component |
| Biotinylated- SNA | Vector Laboratories | B-1305 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–6-linked |
| Biotinylated-MALII | Vector Laboratories | B-1265 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–3-linked |
| Chicken-anti Neu5Gc IgY | BioLegend | 146903 | Primary detection |
| Cy3-Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-0848 | Biotin binding |
| Cy3-anti Human IgG | Jackson Immunoresearch | 109-165-088 | Secondary detection against human IgG |
| Cy3-anti Chicken IgY | Jackson Immunoresearch | 703-165-155 | Secondary detection against chicken IgY |
| Human sera samples | Israeli Blood Bank | Primary detection | |
| Compressed Nitrogen (Grade 5) | General dusting/drying tool | ||
| Epoxy-coated slides | Corning | 40044 | Slides |
| Epoxy-coated slides | PolyAn | 2D 104-00-221 | Slides. In this type of slides the surface is more hydrophobic (compared to Coring slides) therefore the glycans Print Buffer would need to be supplemented with 0.005% Tween-20 to obtain 100 µm size spots. |
| 384-well microtiter plate | Genetix | 2070 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-310 | Slide labeling |
| Staining Tube | ArrayIt | MST | Slide developing tool |
| Staining bath | VWR | 25608-904 | Slide developing tool |
| Slides glass holders | VWR | 631-9321 | Slide developing tool |
| GenePix Scanner | Molecular devices | 4000B | Slide scanner |
| LM-60 NanoPrinter | ArrayIt | LM-60 | Array printer |
| Pins | ArrayIt | 946MP3 | Printing pins |
| ProPlate Module | Grace Bio-Labs | P37004 | Slide developing module |
| Distilled water | Bio-Lab | 2321020500 | Required for arrayer and humidifier |
| Electronic Multi Pippete, 8 Channel , volume range 2-125 μL | Thermo-Fisher Scientific (Matrix) | MA-2131 Impact2 Equalizer 384 | Multi pippete for sample dispansing into 384-well plate |
References
- Padler-Karavani, V. Aiming at the sweet side of cancer: Aberrant glycosylation as possible target for personalized-medicine. Cancer Lett. 352 (1), 102-112 (2014).
- Amon, R., Reuven, E. M., Leviatan Ben-Arye,, Padler-Karavani, S., V, Glycans in immune recognition and response. Carbohydr Res. 389, 115-122 (2014).
- Häuselmann, I., Borsig, L. Altered tumor-cell glycosylation promotes metastasis. Front Oncol. 4, (2014).
- Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (21), 12045-12050 (2003).
- Bardor, M., Nguyen, D. H., Diaz, S., Varki, A. Mechanism of uptake and incorporation of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells. J Biol Chem. 280 (6), 4228-4237 (2005).
- Padler-Karavani, V., et al. Diversity in specificity, abundance, and composition of anti-Neu5Gc antibodies in normal humans: potential implications for disease. Glycobiology. 18 (10), 818-830 (2008).
- Padler-Karavani, V., et al. Human xeno-autoantibodies against a non-human sialic acid serve as novel serum biomarkers and immunotherapeutics in cancer. Cancer Res. 71 (9), 3352-3363 (2011).
- Cao, H., Chen, X. General consideration on sialic acid chemistry. Methods Mol Biol. 808, 31-56 (2012).
- Deng, L., Chen, X., Varki, A. Exploration of sialic Acid diversity and biology using sialoglycan microarrays. Biopolymers. 99 (10), 650-665 (2013).
- Liang, C. H., Hsu, C. H., Wu, C. Y. Sialoside Arrays: New Synthetic Strategies and Applications. Top Curr Chem. 367, 125-149 (2015).
- Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Smith, D. F., Cummings, R. D. Glycan microarrays of fluorescently-tagged natural glycans. Glycoconj J. 32 (7), 465-473 (2015).
- Muthana, S. M., Gildersleeve, J. C. Glycan microarrays: powerful tools for biomarker discovery. Cancer Biomark. 14 (1), 29-41 (2014).
- Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
- Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F., Cummings, R. D. Preparation and analysis of glycan microarrays. Curr Protoc Protein Sci. 12 (10), (2011).
- Park, S., Gildersleeve, J. C., Blixt, O., Shin, I. Carbohydrate microarrays. Chem Soc Rev. 42 (10), 4310-4326 (2013).
- Struwe, W. B., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: sample preparation guidelines for reliable reporting of glycomics datasets. Glycobiology. 26 (9), 907-910 (2016).
- Liu, Y., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data. Glycobiology. , (2016).
- Hara, S., Yamaguchi, M., Takemori, Y., Furuhata, K., Ogura, H., Nakamura, M. Determination of mono-O-acetylated N-acetylneuraminic acids in human and rat sera by fluorometric high-performance liquid chromatography. Anal Biochem. 179 (1), 162-166 (1989).
- Padler-Karavani, V., et al. Cross-comparison of protein recognition of sialic acid diversity on two novel sialoglycan microarrays. J Biol Chem. 287 (27), 22593-22608 (2012).
- Padler-Karavani, V., Varki, A. Potential impact of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid on transplant rejection risk. Xenotransplantation. 18 (1), 1-5 (2011).
- Samraj, A. N., et al. A red meat-derived glycan promotes inflammation and cancer progression. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (2), 542-547 (2015).
- Pearce, O. M., Läubli, H. Sialic acids in cancer biology and immunity. Glycobiology. 26 (2), 111-128 (2016).
- Alisson-Silva, F., Kawanishi, K., Varki, A. Human risk of diseases associated with red meat intake: Analysis of current theories and proposed role for metabolic incorporation of a non-human sialic acid. Mol Aspects Med. 51, 16-30 (2016).
- Pearce, O. M., et al. Inverse hormesis of cancer growth mediated by narrow ranges of tumor-directed antibodies. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (16), 5998-6003 (2014).
- Pham, T., et al. Evidence for a novel human-specific xeno-auto-antibody response against vascular endothelium. Blood. 114 (25), 5225-5235 (2009).
- Reuven, E. M., et al. Characterization of immunogenic Neu5Gc in bioprosthetic heart valves. Xenotransplantation. 23 (5), 381-392 (2016).
- Ghaderi, D., Taylor, R. E., Padler-Karavani, V., Diaz, S., Varki, A. Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins. Nat Biotechnol. 28 (8), 863-867 (2010).
