Summary
En sialoglykan-mikroarrayanalys kan användas för att utvärdera anti-Neu5Gc-antikroppar i humansera, vilket gör den till en potentiell diagnostisk analys av höga genomströmningar för cancer och andra kroniska inflammationsmedierade humana sjukdomar.
Abstract
Cellerna är täckta med en kappa av kolhydratkedjor (glykaner) som vanligtvis förändras i cancer och som inkluderar variationer i sialinsyra (Sia) -uttryck. Dessa är syra sockerarter som har en 9-kol ryggraden och det häckar ryggradsglykaner på cellytor. Två av de stora Sia-formerna i däggdjur är N- acetylneuraminsyra (Neu5Ac) och dess hydroxylerade form, N- glykylylururinsyra (Neu5Gc). Människor kan inte producera endogen Neu5Gc på grund av inaktiveringen av genen som kodar för cytidin 5'monofosfat-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) hydroxylas (CMAH). Utländska Neu5Gc förvärvas av mänskliga celler genom kostförbrukningen av rött kött och mejeri och visas sedan på olika glykaner på cellytan, som huvudsakligen ackumuleras på karcinom. Följaktligen har människor cirkulerande anti-Neu5Gc antikroppar som spelar olika roller i cancer och andra kroniska inflammationsmedierade sjukdomar och som blir potentiella diagnostiska och terapeutiska targets. Här beskriver vi en sialoglycan-mikroarrayanalys med hög genomströmning för att utvärdera sådana anti-Neu5Gc-antikroppar i humansera. Neu5Gc-innehållande glykaner och deras matchade kontrollpar (Neu5Ac-innehållande glykaner), var och en med en primär aminkärna, är kovalent kopplade till epoxi-belagda glasskivor. Vi exemplifierar utskrift av 56 bilder i ett 16-brunnsformat med en specifik nanoprinter som kan generera upp till 896 arrayer per utskrift. Varje bild kan användas för att screena 16 olika humana serumprover för utvärdering av anti-Neu5Gc-antikroppsspecificitet, intensitet och mångfald. Protokollet beskriver komplexiteten i detta robusta verktyg och ger en grundläggande riktlinje för dem som syftar till att undersöka svaret på Neu5Gc dietary carbohydrate antigen i olika kliniska prov i ett array format.
Introduction
Sias är sura sockerarter som täcker glykankedjor på cellytglykoproteiner och glykolipider hos ryggradsdjur. Sia-uttryck är modifierat i cancerceller 1 och korrelerar med progression och / eller metastasering 2 , 3 . Två av de stora Sia former i däggdjur är Neu5Ac och dess hydroxylerad form Neu5Gc 2. Människor kan inte syntetisera Neu5Gc på grund av en specifik inaktivering av genen som kodar för CMAH-enzymet. Denna icke-mänskliga Sia inkorporerar metaboliskt i humana celler som "själv", som härrör från dietiska Neu5Gc-rika livsmedel ( t.ex. rött kött) 4 , 5 . Neu5Gc är närvarande i låga halter på cellytorna av mänsklig epitel och endotel, men ackumuleras speciellt i karcinom. Neu5Gc är erkänt som främmande av humant humoral immunsystem 2 , 6 .Den antigena komplexiteten hos Neu5Gc-glykaner kan uppstå vid flera nivåer, innefattande Neu5Gc modifiering, koppling, underliggande glykaner och byggnadsställningar, och deras densitet, som alla reflekteras av komplexiteten av anti-Neu5Gc-antikroppssvar hos människor 6 . Några av dessa antikroppar tjänar som karcinombiomarkörer och potentiella immunoterapeutika 7 . Tillkomsten av den kemoenzymatiska syntesen av olika sialoglykaner 8 banade vägen för en djupare analys av sådana antikroppar, underlättad genom användningen av glykanmikroskopteknik 9 , 10 . Således har glykanmikroarrayer med hjälp av den underlättade förberedelsen och manipuleringen av stora bibliotek av naturliga och syntetiska kolhydrater blivit en kraftfull hög genomströmningsteknik för att undersöka växelverkan av kolhydrater med en myriad av biomolekyler 10 , 11 , 12 , 13 . I ett arrayformat används minimala mängder material och denna multivalenta visning av biologiskt relevanta glykaner möjliggör undersökning av tusentals bindande interaktioner i ett enda experiment. Viktigt är att denna teknik också kan tillämpas på biomarknadsfunn och att övervaka immunsvar i olika prover 7 , 12 .
Framgångsrik tillverkning av glykan mikroarray kräver att man beaktar tre viktiga aspekter: skrivrobotstypen, glykan-konjugationskemi och detektionsoptik. När det gäller skrivarinstrumentets överväganden finns två tekniker tillgängliga: kontakt- och kontaktfria skrivare. Vid kontaktutskrift doppas 1-48 stiftstiften i en multi-well-källplatta innehållande glykanlösning och spottas på funktionaliserade glasskivor genom att direkt kontakta glasskivans yta. Lösningen mängder deLevererad till glidbanan är en funktion av den långvariga varaktigheten på glidytan. Vanligtvis är proverna först förspotted på ett glasblock (för att nå homogena fläckar) innan de skrivs ut på glidytan. I icke-kontaktskrivare ( t.ex. den piezo-elektroniska skrivaren) skrivs glykanerna ut från en glaskapillär med hjälp av kontrollerade elektriska signaler. Den elektriska signalen kan finskalibreras för att uppnå mer exakt tryckning i förhållande till kontaktutskrift. Plattornas storlek och morfologi är också relativt homogena. En ytterligare fördel är återvinningen av provet tillbaka till källplattan efter utskrift. Ändå är den stora nackdelen med piezoelektroniska skrivare tryckbegränsningen (4 eller 8), vilket resulterar i en mycket lång utskriftstid, vilket kräver särskild uppmärksamhet åt glidstabilitet, temperatur, fuktighet och provavdunstning. Inkjet-skrivaren utan kontakt kräver större provvolymer 14 .
10 , 11 , 12 , 13 . För mycket detaljerad information om tryckt glykan mikroarray teknik för oinitiatD-utredare, hänvisa till dessa utmärkta recensioner 13 , 15 . Viktigt är att den senaste minsta informationen som krävs för ett Glycomics Experiment-initiativ (MIRAGE) beskriver riktlinjer för provberedning 16 och för rapportering av data från glykanmikroarrayanalyser 17 för att förbättra normerna i detta odlingsområde.
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för tillverkning av sialoglykan-mikroarrayer med en specifik kontaktnano-skrivare i ett 16-brunnsformat. Var och en av glykanerna har en primär amin som förmedlar sin kovalenta länk till epoxidaktiverade glasskivor. Vi beskriver också utvecklingen och analysen av en slida med användning av olika humana seraprover, antikroppar och Sia-bindande växtelektiner. Sialoglykan-mikroarrayanalyser involverar flera viktiga steg som innefattar grupptillverkning, bearbetning, utveckling och analys. Array tillverkning kräver planering av arRay-layout, förbereda glykanerna och källplattan, programmera nano-skrivaren och skriva ut bilderna. Därefter bearbetas, utvecklas och analyseras objektglasen ( Figur 1 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Humana seraprover erhölls från den israeliska blodbanken och användes i enlighet med Helsingforsdeklarationen och institutionen för institutionella granskningar av Tel Aviv.
1. Array Fabrication Planering och Layout
- Bestäm bildskärmens layout.
OBS! Varje bild innehåller 16 delrader uppdelade i 16 identiska block som numreras B1 till B16 ( Figur 1B , Kompletterande Figur 1A ). - Bestäm pininställningen. Använd fyra stift, var och en skriver ut fyra delrader (block) per bildruta:
Stift 1 skriver ut block 1, 2, 9 och 10;
Pin 2 skriver ut block 3, 4, 11 och 12;
Pin 3 skriver ut Block 5, 6, 13 och 14; och
Stift 4 skriver ut block 7, 8, 15 och 16 ( kompletterande figur 1A ). - Bestäm block och layout med 384 brunnar.
OBS: Den ordning i vilken glykanerna visas i varje block kräver noggrann planering. I detta exempel arr arrAy, skriv ut varje prov på fyra replikat, designa fluorescerande markörfläckar som ska placeras längst ner till höger (för att underlätta punktanalys) och skriva ut standardkurva IgG (STD) fläckar vid sex ökande koncentrationer ( Tilläggs Figur 1B ).- För varje tryckt fläck ska du först fördela materialet i fyra brunnar (en för varje stift) i en 384 brunnsplatta.
OBS! Beställa materialet i 384-brunnsplattan beror på den konstruerade blocklayouten ( Tilläggs Figur 1B-C ).
- För varje tryckt fläck ska du först fördela materialet i fyra brunnar (en för varje stift) i en 384 brunnsplatta.
2. Framställning av glykaner och källplattan
- Förbered glykanutskriftsbuffert (50 ml 300 mM fosfatbuffert, pH 8,4). Väg upp 58,5 mg av mononatriumfosfat monohydrat (NaH 2 PO 4 .1H 2 O) och 3,9 g dinatriumfosfat-heptahydrat (Na 2 HPO 4 • 7 H2O) i 40 ml avjoniserat vatten (DIW). Titrera till pH 8,4 med användning av 4 M NaOH. Justera volymen till 50 ml anD filtrera genom ett 0,2 μm membran för sterilisering.
- Förbered markörbuffert (50 ml 187 mM fosfatbuffert, pH 5). Väg upp 289 mg av mononatriumfosfat monohydrat (NaH 2 PO 4 .1H 2 O) och 1,94 g dinatriumfosfat-heptahydrat (Na 2 HPO 4 • 7 H2O) i 40 ml DIW. Titrera till pH 5 med användning av 1 M HCl. Justera volymen till 50 ml och filtrera genom ett 0,2 μm membran för sterilisering.
- Förbered STD-kurvbuffert (50 ml PBS-glycerol: fosfatbuffrad saltlösning, pH 7,4, kompletterad med 10% glycerol från ett 100% glycerollager) och filtrera det genom ett 0,2 μm membran för sterilisering.
- Förbered varje glykan stamlösning vid 10 mM i DIW. Verifiera de sialylerade glykankoncentrationerna genom fluorescensdetektering vid revers-fas högtrycksvätskekromatografianalys 18 .
- Späd varje glykan till 100 | iM i en total volym av 100 | j, l glykandryckningsbuffertI mikrocentrifugrör.
- Förbered primära amininnehållande fluorescerande färgämne. Solubilisera Alexa 555-hydrazid till 1 mg / ml med markörbuffert och späd sedan till 1 μg / mL i en 1 ml total volym.
OBS! Alla andra primära amininnehållande färgämnen kan användas med lämplig våglängd i enlighet med bildskannern.
OBS! Markeringspunkter möjliggör nätjustering i varje block under analysen. - Förbered mänsklig IgG STD-kurvutspädningar: förbered 0,5 ml av en stamlösning av humant IgG vid 160 ng / μl i STD-kurvbuffert. Tillsätt stammen 1: 1 sex gånger för att erhålla 80, 40, 20, 10, 5 och 2,5 ng / μl, allt i STD-kurvbuffert vid en total volym av 200 | jL vardera.
OBS: Andra Ig-isotyper kan användas om de är lämpliga för experimentet ( t.ex. humant IgA, IgM, IgE eller ett Ig av en annan organism). - Placera 384-brunnsplattan på is. Med hjälp av en elektronisk multipipett replikeras alikvot 7 μl av varje glykan, markör och STD-kurva IgG-fyraS av vardera - enligt plattformen ( tilläggs figur 1C ). För bättre noggrannhet, ladda 35 μl av varje prov och alikvot 7 μL i var och en av de fyra brunnarna i provet. Placera de resterande 7 μL av varje glykan tillbaka i sitt ursprungliga rör.
- Täck tallriken med parafilm och snurra ner i 2 minuter vid 250g och 12 ° C. Placera plattan vid rumstemperatur (RT), skyddad mot ljus. Avlägsna inte plattan innan luftfuktigheten i rummet når 60-70%.
3. Programmera Nano-skrivaren
- Öppna "Microarray Manager" -programvaran. Använd fönstret "Metodegenskaper".
- Ställ in arbetsbordslayouten: välj "56 bildskärmskonfiguration."
OBS! Det här är en fördefinierad konfiguration som möjliggör utskrift av 56 bilder. Kalibrera för varje typ av platta, stift och utskriftsformat ( Kompletterande figur 2 , steg 1). - Välj "Pin-konfiguration"| "Pin Tool 1x4 9 mm."
OBS! Det här är en fördefinierad konfiguration för att använda fyra pinnar ( tilläggs bild 2 , steg 2). - Definiera "Pin-typ". Beräkna och skapa den typ av pin som passar för utskrift.
OBS! I det här steget definieras hur många fläckar en stift skulle skriva ut före omdypning i provet 384-brunn och bör optimeras för de olika stifttyperna och glidytans kemi.
OBS! När du använder 946MP3-stift, överväga två viktiga problem: 1) varje stift kan skriva upp till 140 homogena fläckar och 2) förspottning är avgörande för att tömma överskottsvätska från spetsen på stiftet innan du trycker på glidarna. Därför programmerar du varje stift för att skriva ut 20 pre-spots i ett förtryckningsblock (optimerat för 946MP3 stift på epoxibelagda bilder).- Beräkna det totala antalet tryckta fläckar per prov.
OBS: Här trycker varje stift 4 punkter per underuppsättning (block); Totalt 4 delrader per dias = 16 fläckar / slid. Efter 7 bilder trycker varje stift ut 16 x 7 = 112 fläckar. Dessutom ger 20 förfläckar före tryckning 132 fläckar / dip. Därför definieras stifttypen som "946MP3-132 fläckar" (4 fläckar per prov per block x 4 block x 7 slides + 20 pre-spots = 132). - Skapa "Pin-typ" ( Tilläggs Figur 2 , Steg 3). Tryck på "Setup" (vänster panel på programvaran) | "Micro Spotting Pins" | "Nytt namn" (946MP3-132 fläckar). Definiera antalet fläckar per dip (132), punktdiametern (100 μm), upptaget (0,25 μL), leveransen (0,7 nL) och den minsta punktavståndet (100 μm). Tryck på "OK" | "OK."
- I fönstret "Metodegenskaper" väljer du den skapade stifttypen: "946MP3-132 fläckar."
- Beräkna det totala antalet tryckta fläckar per prov.
- Definiera tvättförhållandena. Ställ in "Tvätta före start" och "Tvätta efter efterbehandling" till "Normal tvätt" ( Tilläggs bild 2 , steg 4).
- Definiera "Plate lista."
OBS! Det här är provtagningsmönstret från plattan (ordningsföljden från 384-brunnsplattan) enligt plattformen. För att ladda upp plattan i plåtslistan, ställ in ett plåtprovtagningsmönster.- Skapa plattan "Provtagningsmönster". Gå till "Mallar" ( Tilläggs Figur 3 ) | "Provtagningsmönster". Ange ett nytt namn ( t.ex. JoVE array) och välj "Insert" | "Fyll överst på botten" | "Pin Tool 1 x4 9 mm." Välj ordningen för brunnsupptagningar enligt den fördefinierade plattformen ( Tilläggs Figur 1A ). Tryck på "OK" | "OK."
- Ladda plåtsamplingsmönstret. Klicka på höger sida av "Plate list" -cellen ( tilläggs figur 3 ) | "Lägg till tallrik" och välj rätt plåtprovtagningsmönster ("JoVE array" beskrivet i steg 3.6.1.). Välj "Normal tvätt". Tryck"OK" | "OK."
- Gå till "Sample Plates" och ändra positionsförskjutningen till 1 (som bestämmer var plattan är placerad på arraydäcket).
OBS: Offsetpositionen 0 är närmare sonikatorns bad. - Definiera "Microarray Print Design." Beräkna block-to-block avstånd och avstånd.
- Tänk på dimensionerna av utvecklingsverktyget som delar glidbanan i 16 brunnar på 7 x 7 mm, med 2 mm mellanrum mellan delrader (totalt 9 mm mellan blocken, tilläggsbild 4 ).
- Tänk på sub-array-dimensionerna.
OBS: Avståndet mellan fläckarna är 0,275 mm och det finns 12 kolumner och 18 rader i denna tryckdesign. De totala dimensionerna är: bredd (11 x 0,275 mm = 3,025 mm) och höjd (17 x 0,275 mm = 4,675 mm). Beräkna det horisontella avståndet: 9 mm - (11 0,275) = 5,97 mm. Beräkna det vertikala avståndet: 9 mm - (17 x 0,275) = 4,325 mm. Beräkna dIständ från glidens vänstra sida: 4,43 mm + 1,07 mm = 5,5 mm. Beräkna avståndet från glidens övre sida: 2.95 mm + 0.55 mm = 3.5 mm ( Tilläggsbild 4 ). - Definiera "Print Designs" ( tilläggs figur 5 ). Välj "Mallar" | "Print Designs" | "Ny."
- Välj "Pin Setup" | "Pin Tool 1 x 4 9 mm" | "Pin - 946MP3-132 fläckar." På fliken "Allmänt" ändrar du "Namnet på Microarray Print" ( dvs. "JoVE array"). Välj "Spot Speed" | "Repliceringsnummer" (4) | "Touch Point Height" (0 mm) | "Soft Touch Height" (3 mm) | "Skriv ut till alla lediga platser" ( Tilläggsbild 5A ).
- På fliken "Microarray" väljer du det horisontella och vertikala avståndet (5,9 mm och 4,325 mm från steg 3.8.2) och antalet horisontella och vertikala mikroarrayer (2). Välj "Skriv utMicroarray horisontellt "|" Print Duplicate Microarray "( tilläggs figur 5B ).
- På fliken underarray väljer du det maximala antalet kolumner (12), det maximala antalet rader (18) och avståndet mellan kolumnerna och raderna (275 μm) ( tilläggs figur 5C ).
- På mätfliken väljer du avståndet från glidens vänstra sida (5,5 mm), avståndet från glidens övre del (3,5 mm, beräknat i steg 3.8.2), bredden på tryckglaset (25 mm) , Och höjden på skrivglaset (75 mm) ( tilläggsbild 5D ). Tryck på "OK" | "OK."
- Klicka på den högra sidan av "Microarray Print Designs" -cellen och välj den definierade designen ("JoVE array" från steg 3.8.3; Kompletterande Figur 6 ).
- Definiera "Slide Count" (56) och ändra "Position Offset" (0). Detta bestämmer poSition för den första bilden som ska skrivas ut på arraydäcket ( tilläggsbild 6 ).
- Definiera "Microarray Pre-Print Design" ( Kompletterande Figur 6 ). Välj "Glass Block" | "Förtryck 1 x 4 mm stiftverktyg".
OBSERVERA: Denna inställning med spot-spacing möjliggör 46.464 pre-fläckar (för alla 4 stift) på glasblocket, sålunda 46.464 / 4 = 11.616 pre-spots per stift. När utrymmet på förutskrivningsblocket hade använts stannar skrivaren och blocket måste vändas över.
OBS: För att beräkna efter hur många prover blocket är fullt, överväga följande: Varje prov tas med 8 pin-dips i 384-brunnsplattan för att slutföra 56 bilder (7 bilder per dip) och varje dip Har ytterligare 20 pre-spots, vilket ger totalt 160 pre-spots per prov. Därför 11,616 / 160 = 72,6 prover. Sålunda skulle förtrycksglasblocket behöva vändas över efter 72 prov (för att utvärdera tiden för bläddring, mäta hOw lång tar det för ett prov att slutföra en full körning på 56 bilder och multiplicera sedan med 72). - Välj "Använd PrePrint Design" | "Ja" | "Skanna streckkoder" (Nej) | "Skriv ut enbart replikat" (Nej) ( Tilläggsbild 6 ).
- Klicka på "Validera" ( Kompletterande figur 6 ).
- Klicka på "Spara" och spara metoden som en arr-fil ( t.ex. "JoVE array.arr," Supplementary Figure 6 ).
4. Utskrift av designerade arrays
OBS! Alla steg ska utföras i ett rent rum med en fuktighet på 60-70% och med lämpliga handskar och kläder för skydd
- Sätt på nano-skrivaren och luftfuktaren.
- För tvättbufferten och befuktningen fyll i med DI-vatten. Töm tvättflaskan (avlopp) och fuktighetsfälla-karossen ( Tilläggs figur 7A ).
- Ställ luftfuktaren på70% fuktighet och startfuktning.
- Rengör alla tappar före utskrift. Förbered 50 ml hett rengöringslösning (65 ° C) med rengöringsmedel (15 g rengöringsreagens och 50 ml 65 ° C vatten, blanda noggrant tills det fasta reagenset löser sig fullständigt).
- Applicera rengöringslösningen på varje stiftspets genom att doppa penselborsten (fin) i stiftstensrengöringslösningen och borsta ytan på varje stiftspets.
OBS: Spetspetsrengöringslösningen är frätande och giftig. Var noga med att använda handskar och skyddsglasögon när du använder denna lösning. Blötläggningstoppar i stiftrengöringslösning i mer än några minuter kan resultera i permanent stiftskada. - Fyll ultraljudsbadet med 1 liter destillerat vatten och placera stiften i ett flytbart stiftrengöringsstativ i badet. Sonikera i 5 minuter och ta bort tapparna. Låt torka och försiktigt torka med rena specialtorkar.
- Applicera rengöringslösningen på varje stiftspets genom att doppa penselborsten (fin) i stiftstensrengöringslösningen och borsta ytan på varje stiftspets.
- Öppna "Microarray Manager" -utskriftEr programvara; När anslutningsuppsättningen är aktiverad, tänds skrivarlampan (röd / grön). Tryck på "Stop" | "Rensa" | "Init" ( kompletterande figur 7B , steg 1-3); Tryckhuvudet återställer sedan X, Y, Z-inställningarna.
- För att ladda stiften i skrivhuvudet, tryck på "Ladda" ( Tilläggsbild 7B , steg 4) och placera stiften i skrivhuvudet enligt den definierade konfigurationen av utskrift / stiftverktygslayouten ( Tilläggs Figur 7C ); Denna layout använder 4 stift, var och en skriver 4 delrader på varje bild för att få totalt 16 delrader per bild ( Tilläggs Figur 1A ). När du har placerat stiften trycker du på "Init" igen.
- Montera diabilderna på arraydäcket. Öppna glidlådan och rengör varje glid genom att blåsa mycket hög renhets kvävegas. Placera önskat antal bilder på matrisplattformen. Håll skivorna med två fingrar i nedre hörnen och placera sedan bilden i dessplacera. Håll de två högra hörnen och tryck försiktigt de vänstra hörnen tills glidstiftet passar tätt i sitt läge. Skjut försiktigt mot vänster botten för att säkerställa en tätt passform ( tilläggsbild 7D ).
- Rengör förblåsglaset med destillerat vatten, 70% etanol och 100% etanol och låt det lufttorka (använd endast dedikerade rengöringsdukar). Placera förblåsglaset i sitt läge på däcken.
- Fyll ett ljudbad ( Tilläggs Figur 7B ). Tryck på "Fyll" i 55 s och tryck sedan på "OK". Töm ljudkällan genom att klicka "Drain" i 20 s och tryck sedan på "OK". Upprepa fyllningen och dränera en gång till och fyll sedan igen i 55 s.
- Fyll tvättbadet ( Tilläggsbild 7B ): Tryck på "Prime" i 40 s och tryck sedan på "OK".
- Placera 384-brunnsplattan med alikvotprover till platsen på arraydäcket och ta bort parafilmlocket.
- När utskrift är färdig, dränera ljudbadet ( tilläggs figur 7B ) och stäng av luftfuktaren.
- Låt glidorna torka på matrisdäcket i 16-24 timmar utan fuktning.
- Mata in bilderna med en alkohol / lösningsmedelsresistent märkpenna och förvara dem i en vakuumförseglad låda i mörkret.
5. Behandling och utveckling av arraysna
- Ta ut en glödlampa från den vakuumförseglade låsen och placera den i en kemisk huva i 5 minuter, array uppåt, för att förånga överskottsvätskan.
- Skanna bilden med högsta förstärkningen (950 PMT) för att säkerställa att alla fläckar har skrivits ut.
- Fortsätt med den kemiska blockeringen av epoxigrupper på bilden
- Framställ 50 ml etanolamin-blockerande lösning (0,1 M Tris-HCl, pH 8 och 0,05 M etanolamin). Blanda 140 ml DIW med 8,8 ml Tris-HCl (1,7 M, pH 8) och 0,45 ml etanolamin (16,6 M). Överför till en 50-ml färgrör ( tilläggs figur 8A ) och varma till 50 ° C.
- Hydratera bilden. Placera bilden i ett färgrör fyllt med DIW, täck det med folie och inkubera i 5 minuter med långsam och skonsam skakning vid RT.
- Blockera de reaktiva epoxigrupperna på bilden. Doppa sliden i 50 ml färgrör fyllt med förvärmd etanolaminblåsande lösning, täcka med folie och inkubera i 30 minuter med långsam och skonsam skakning vid RT.
- Kassera etanolamin-blockeringslösningen i lämplig biohazard-skräpbehållare och placera gliden i ett nytt, rent färgrör fyllt med 50 ° C DIW. Skydda med folie och inkubera i 10 minuter med långsam och skonsam skakning vid RT.
- Kassera vattnet och överför glidglasen till en glasfärghållare ( tilläggs bild 8B ). Placera glasfärghållaren i en svängplåthållare och centrifugera torkningen i 5 minuter vid 200 xg och RT.
- Placera bilden på en 16-brunnsdelare ( tilläggs figur 8C ).
- Förbered PBST tvättlösning: 50 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,4 + 0,1% Tween-20.
- Förbered biologisk blockeringslösning (PBS-OVA): 5 ml PBS, pH 7,4 + 1% kyckling ovalbumin (10 mg / ml).
OBS: Valet av blockerande reagens är avgörande för framgången med detektering av anti-Neu5Gc-antikroppar. Ovalbumin tillverkas hos kycklingar som, liksom människor, inte kan syntetisera Neu5Gc, vilket orsakar en brist på uttryck för denna Sia. För detektering av Neu5Gc kan även mindre föroreningar dramatiskt minska analysens känslighet, ibland till och med att det inte upptäcker någon anti-Neu5Gc-reaktivitet. Exempelvis innehåller det mest använda blockeringsreagenset, bovint serumalbumin (BSA), även om det inte glykosyleras i sig, bovin IgG-föroreningar som bär Neu5Gc-delar och konkurrerar därförMed tryckta glykaner när de binder till prov med anti-Neu5Gc-antikroppar 19 , 20 . - Prewet brunnarna. Använd en multipipett, alikvot 200 μl PBST i glidbrunnar, placera dem i en täckt fuktig kammare och skaka i 5 minuter.
OBS: Fuktkammaren är ett glasskål med ett vått handdukpapper, täckt med nylonfolie och folie för att skydda proven från ljus. - Ta bort PBST genom att blinka och knacka försiktigt på en ren pappershandduk och alikvot 200 μl PBS-OVA-blockerande buffert i varje brunn. Placera i en fuktig kammare och inkubera i 1 h vid RT med försiktig skakning.
- Förbered primärdetektering utspädd i PBS-OVA-blockerande buffert, som anges i tabell 2 .
OBS! För kvalitetskontroll (QC) av denna sialoglycan-mikroarray, använd flera Sia-bindande proteiner: Sambucus nigra lectin (SNA), isolerat från elderbärbark, förväntas känna igen Sia &# 945; 26; Maackia Amurensis Lectin II (MALII) förväntas känna igen Siaa23; Och kyckling anti-Neu5Gc IgY förväntas erkänna alla Neu5Gc-innehållande sialoglykaner. Använd dessutom olika humana seraprover till profil anti-Neu5Gc IgG-respons. Koncentrationen av lektiner / antikroppar / sera bör kalibreras experimentellt. - Spola torr PBS-OVA-blockeringsbuffert och tillsätt 200 μl primär antikropp per brunn (minsta volym per brunn: 70 μl), inkubera i en fuktig kammare under 2 timmar.
- Flick torka den primära upptäckt och tvätta 4 gånger med PBST (mellan 3: e och 4: e tvätt, inkubera objektglaset i PBST under 5 minuter i fuktig kammare). Tvätta en gång med PBS.
- Förbered den sekundära antikroppen i PBS, som anges i tabell 2 .
- Flick torka PBS och tillsätt 200 μL sekundär antikropp. Inkubera i 1 timme vid RT med skakning.
- Torka den sekundära antikroppen och tvätta fyra gånger med PBST (mellan 3Rd och 4: e tvätt, inkubera gliden i PBST i 5 min i fuktkammaren).
- Ta försiktigt bort ramen och lägg glidarna i ett 50 ml glidrör fyllt med PBS och skaka i 5 min.
- Fyll två glidbatterier ( Tilläggs bild 8D ) med DIW, placera gliden i glidhållaren och doppa den inuti badet. Doppa snabbt 10 gånger och överför sedan till det andra badet och dopp 10 gånger. Inkubera i 10 minuter vid RT med skakning.
- Kassera vattnet och överför glidglaset till en glasfärghållare ( Tilläggs bild 8B , låt glidluften lufttorka). Placera glasfärghållaren i en svängplåthållare och centrifugera torkningen i 5 minuter vid 200 g och RT.
- Skanna bilden och förvara den i en vakuumförseglad låda i mörkret.
6. Array-skanning och dataanalys
- Öppna lysrörsskannern och låt den värma i 5 minuter. ÖppnaSkanning och analys av programvara.
- Ställ in skanningsparametrarna ( Tilläggsbild 9A ): Skanna vid 532 nm och 100% ström med en förstärkning på 350 PMT, med en linje till medelvärdet och en 0 μm fokusposition. Använd en upplösning på 10,0 μm pixelstorlek.
OBS: Skanningsparametrar kan anpassas till olika bildtyper, fluorescens och upplösning. - Skanna den utvecklade bilden. Öppna skannerdörren och placera bilden inuti, matrisen vänd nedåt. Starta scanning (grön "Play" -knappen på menyn för programvarans navigeringspanel, tilläggs figur 9B ).
- Spara de skannade bilderna som en tiff-fil.
- Förbered glid för analys. Välj "Load array list" och ladda upp lämplig GAL-fil som kartlägger arrayerna i varje block på bilden ( Tilläggs Figur 9C ).
OBS! GAL-filen innehåller information om både identiteten och platsen (X, Y) för varje plats i objektglaset. Den här filen kan skapasAv skrivarprogrammet som exporterar en flikavgränsad textfil baserad på samplingsidentiteter i 384-källkällan och den definierade utskriftsdesignen. - Ställ in justerings- och analysparametrarna. Tryck på "Alternativ" -knappen på menyn för programvarans navigeringspanel ( Tilläggsbild 10 ).
- Definiera inriktningsparametrarna. Hitta cirkulära funktioner, ändra storlek på funktioner under justering med 50 - 350%, begränsa funktionsrörelsen till en maximal översättning av 40 μm, unflag-funktioner som misslyckas med bakgrundsgränsen (KPI-tröskel 0), uppskatta omslaget och rotationen när du hittar block och automatisera bildregistrering (10 pixlar) ( Kompletterande Figur 10 ).
- Definiera analysparametrarna: W1 / 532-förhållande, normal standardavvikelse, analysera frånvarande funktioner och bakgrundsuttrag. Klicka på "välj" och sedan "Lokal bakgrundsmedian" och ställ in 2 pixlar för att utesluta och en bakgrund på 3 pixlar. Tryck på "OK". SeT Skannerns mättnadsnivå till standard ( Tilläggs Figur 10 ).
OBS: Bakgrundsutdragningsmetoden beror på experimentell design och kan ändras enligt specifika behov. - Anpassa funktionerna kartor. Ställ in programmet i blockläge (tryck på "B"), välj alla block (Ctrl + A), placera array-kartnät och justera alla block (Alt + Shift + F7) ( Tilläggsbild 11 ).
- Förbättra inriktningen i varje block. Zoom (tryck på "Z" för att komma in i zoomläge) i det övre vänstra blocket, tryck på "B" igen (blockläge) och tryck på rutnätet för det här blocket. Flytta bara rutnätet till det här blocket tills det passar perfekt med blockfläckarna och tryck på F5 för att justera funktionerna i det valda blocket. Upprepa nätrörelsen och F5-inriktningen tills fläckarna är perfekt cirklade. Gör detsamma för alla de 16 blocken tills alla galler är på plats.
- Analysera och spara data. Välj alla block (Crtl +A) och analysera sedan data (Alt + A). Spara analysresultaten (Ctrl + U) som en .gpr-fil.
- Öppna den sparade .gpr-filen i ett kalkylarkprogram och analysera intensiteten för varje punkt baserat på fluorescens efter lokal bakgrundsintertraktion (F532-B532).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Array Utskrift, utveckling och analys:
Att skriva ut en sialoglykan mikroarray med flera glykanprover och mänskliga IgG STD-kurvor i 16 olika block kräver noggrann kalibrering för att säkerställa att alla prover skrivs så jämnt som möjligt i alla 16 block per bild och till alla bilder i samma skrivare. Därför krävs flera kalibreringsexperiment innan de specifika tryckparametrarna bestäms, inklusive buffertkomposition för varje typ av prov, glidtyp och tillverkning, 384 brunnsplattortyp, fuktighetsnivåer, provvolym i 384 brunnsplattan, mängd pre -printing för varje typ av prov, humant IgG STD-kurvkoncentrationer och markörstyp. Slitstyrkan hos sådana tryckta sialoglycan array-glidbanor validerades för att hålla i upp till 10 månader i en vakuumförseglad låda i mörkret vid rumstemperatur. I varje utskriftsexperiment är likformighetYtterligare övervakas och valideras genom kvalitetskontrollexperiment med användning av Sia-bindande lektiner och antikroppar. Utvecklings- och avsökningsprotokollen hade optimerats för att uppnå jämnhet och noggrannhet genom att jämföra prover inom och mellan diabilder från samma utskriftskörning. Skivorna är utvecklade med 16-brunnsdelaren, som säkerställer en korrekt separation mellan blocken, med optimerade blockeringsförhållanden (kemiska och biologiska), tvättar och inkubationstider. Den primära och sekundära detektionen hade omfattande kalibrerats för att säkerställa maximal detektering med minimal bakgrund och icke-specifik bindning. Vid bildskanning och analys överfördes resultatresultaten till en kalkylarkfil och analyserades för att bestämma detekteringen på varje plats. Varje plats utsattes för en outlier-kontroll och utelämnades om den inte uppfyllde QC (om% CV är> 20 och platsen ligger utanför intervallet av en standardavvikelse bort från medelvärdet av de fyra replikaten). Då, den genomsnittliga signalintensiteten avteR subtraktionen av lokal bakgrund var medelvärde för replikat fläckar per prov för att alstra den relativa fluorescensenhetens (RFU) datapunkt per tryckt prov. När likformigheten av IgG STD-kurvorna validerades i alla testade block, normaliserades RFU-värdena i ng / μl IgG, vilket möjliggjorde chansen att bättre jämföra prover inom och mellan experiment.
Sia-bindande High-throughput Assay:
Sialoglycan-arrays kan användas för att detektera determinanter ( t.ex. proteiner, lektiner, antikroppar, virus etc. ) som binder Sia-innehållande glykaner. För QC efter utskrift används Sia-bindande plantelektiner och anti-Neu5Gc IgY 19 . SNA binder a2-6-länkad Sia, MALII binder α2-3-kopplad Sia och anti-Neu5Gc IgY binder Neu5Gc-innehållande sialoglykaner men bindar inte Neu5AC-innehållande sialoglykaner 19 , såsom visas i figur 2A . QC-experimentet syftar till att validera punktutskrift och identitet och bristen på variabilitet mellan de tryckta blocken med de fyra olika stiften. Block-to-block-variationen övervakas genom att man utvecklar fyra block för varje primär detektering per bild och genom att jämföra block som skrivs ut med var och en av de fyra pinnarna med samma primära detekteringsdel. En jämförelse görs då för att säkerställa att inga större skillnader föreligger.
Mänssera innehåller olika anti-Neu5Gc antikroppar 6 med implikation för olika humana sjukdomar 2 , 21 , 22 , 23 . För att utvärdera sialoglykanigenkänning i humant sera IgG analyserades 12 sera från friska humana givare på den tryckta sialoglykan-mikronenOarray och utvecklas med användning av fluorescensmärkt anti-human IgG ( Figur 2B ). Varje tryckt block innehåller en human IgG STD-kurva som är jämförbar och homogen i alla block ( Figur 2C ). Endast efter validering av kvaliteten på STD-kurvorna i varje block ( Figur 2C ) resulterar glykanfläckar normaliserade enligt höjden i blocket och multipliceras sedan med utspädningsfaktorn. Såsom visas i figur 2B innehåller alla testade humana sera olika nivåer av anti-Neu5Gc IgG, med nästan ingen igenkänning av de matchade paren Neu5Ac-innehållande sialoglykaner. Vidare är anti-Neu5Gc IgG-erkännande mönster mycket olika mellan dessa 12 olika serum, både i intensitetsnivå och mångfald.
Figur 1: ÖversiktAv Array-utskrift, utveckling och bildanalys. ( A ) Neu5Gc9Acα2-6GalNAcαProNH2 visas som en representativ Neu5Gc-containg Sia-glykan, med en primär amin som är tryckt på epoxi-belagda glasskivor. ( B ) Tryckta arrays utvecklas med olika Sia-bindande proteiner, följt av detektion med en lämplig fluorescensmärkt sekundär antikropp. Varje delmatris kan utvecklas individuellt. ( C ) Skanning av den proberade bilden i en fluorescensskanner alstrar en bild som analyseras ytterligare med hjälp av skannerbildsprogrammet. Sub-arraysna överlagras med en rutnätbildning varje plats på arraysna och fluorescensen detekterad för varje plats. Resultaten överförs sedan till en kalkylarkfil. En enda grupp i en enda brunn är schematiskt representerad. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Profiler av Sialoglycan Microarrays Användande Olika Sia-bindande Proteiner.
Skivor utvecklades med 16 olika primära detekteringsdelar, en i varje block. ( A ) Representant 3 block av en QC-bild som visar bindningsmönstren hos Sia-specifika växtelektinerna SNA och MALII och polyklonal monospecifik kyckling anti-Neu5Gc IgY. Resultaten presenteras som RFU i heatmap format för varje individuellt block (rött, vitt och blått, som representerar den 100: e, 50: e, och 0: e percentiler, respektive). ( B ) 12 olika friska humana sera testades vid en 1: 100 utspädning och detekterades med anti-huamn IgG till profil anti-Neu5Gc IgG-reaktivitet. RFU-data normaliserades till ng / μl genom att dividera varje värde med IgG STD-kurvhöjningen i varje specifikt blOck och multipliceras därefter med utspädningsfaktorn. Den data representeras i heatmap format för alla block kombinerade (rött, vitt och blått, som representerar te 100: e, 50: e, och 0: e percentilen, respektive). ( C ) Human IgG STD-kurvor av de 12 blocken som utvecklats med humana sera som hade använts för att normalisera data. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
| Glycan ID | Strukturera | |||
| 1 | Neu5,9Ac 2 α3Galβ4GlcNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 2 | Neu5Gc9Acα3Galβ4GlcNAcβO (CH 2) 2 CH 2 </ sub> NH 2 | |||
| 3 | Neu5,9Ac 2 α6Galβ4GlcNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 4 | Neu5Gc9Acα6Galβ4GlcNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 5 | Neu5Acα6GalNAcαO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 6 | Neu5Gcα6GalNAcαO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 7 | Neu5,9Ac 2 α3Galβ3GlcNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 8 | Neu5Gc9Acα3Galβ3GlcNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 9 | Neu5,9Ac 2 α3Galβ3GalNAcαO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 10 | Neu5Gc9Acα3Galβ3GalNAcαO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 11 | Neu5Acα3Galβ4GlcNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 12 | Neu5Gcα3Galβ4GlcNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 13 | Neu5Acα3Galβ3GlcNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 14 | Neu5Gcα3Galβ3GlcNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 15 | Neu5Acα3Galβ3GalNAcαO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 16 | 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 17 | Neu5Acα6Galβ4GlcNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 18 | Neu5Gcα6Galβ4GlcNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 19 | Neu5Acα6Galβ4GlcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 20 | Neu5Gcα6Galβ4GlcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 21 | Neu5Acα3Galβ4GlcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 22 | Neu5Gcα3Galβ4GlcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 23 | Neu5,9Ac 2 α6GalNAcαO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 24 | Neu5Gc9Acα6GalNAcαO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 25 | Neu5Acα3GalβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 26 | Neu5Gcα3GalβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 27 | Neu5Acα6GalβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 28 | Neu5Gcα6GalβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 29 | Neu5,9Ac 2 α3GalβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 30 | 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 31 | Neu5,9Ac 2 α6GalβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 32 | Neu5Gc9Acα6GalβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 33 | Neu5Acα3Galβ3GalNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 34 | Neu5Gcα3Galβ3GalNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 35 | Neu5,9Ac 2 α3Galβ3GalNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 36 | Neu5Gc9Acα3Galβ3GalNAcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| Neu5,9Ac 2 α6Galβ4GlcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | ||||
| 38 | Neu5Gc9Ac6Galβ4GlcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 39 | Neu5,9Ac 2 α3Galβ4GlcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
| 40 | Neu5Gc9Ac3Galβ4GlcβO (CH 2) 2 CH 2 NH 2 | |||
Tabell 1: Förteckning över tryckta glykaner.
| Primär / sekundär | Antikropp / Lektin | Lager koncentration | specificitet | Arbetsutspädning / koncentration |
| Primär detektering | Biotinylerad-MALII | 1 mg / ml | Sialinsyra i a2-3-bindning | 1:50, 20 | ig / ml |
| Biotinylerad-SNA | 2 mg / ml | Sialinsyra i a2-6-koppling | 1: 100, 20 | ig / ml | |
| Kyckling anti-Neu5Gc IgY | ND | Neu5Gc sialinsyra | 1: 7000 | |
| Humant serum | 100% | Många epitoper | 1: 100 | |
| Sekundär detektion | Cy3-Streptavidin | 0,75 mg / ml | biotin | 1: 500, 1,5 | ig / ml |
| Cy3-anti-kyckling IgY | 0,75 mg / ml | Kyckling IgY | 1: 2000, 0,375 μg / ml | |
| Cy3-anti-human IgG H + L | 0,6 mg / ml | HumaN IgG | 1: 1 500, 0,4 μg / ml |
Tabell 2: Förteckning över primär- och sekundärdetekteringsproteiner.
Tilläggsuppgifter: Vänligen klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En framgångsrik tillverkning av glykan mikroarray kräver noggrann planering och innehåller flera viktiga steg i protokollet. Dessa innefattar: (1) planering av block- och plattlayouterna som definierar alla efterföljande parametrar ( t.ex. avstånd, avstånd, mängd prov och utskrift); (2) städning av stiften och säkerställande av stiftintegritet, vilket är kritiskt för styrning av punkthomogenitet; (3) upprätthåller hög luftfuktighet under tryck, vilket är kritiskt för att undvika provdunstning under långa utskrifter, vilket kan äventyra spot-homogenitet; (4) välja lämpliga inriktnings- och analysparametrar, som kan påverka resultaten ( t.ex. bakgrundsintertraktionsmetod, tröskelvärde och punktstorleksflexibilitet).
Metoden kan modifieras ytterligare för att möta specifika experimentella mönster och mål. Exempelvis kan pre-spottingnumret modifieras för att bättre passa varje typ av material som ska skrivas ut på matrisen. Stifttvättsteget underUtskriften kan optimeras för att passa olika tryckta material, med antingen kortare eller längre tvättcykler. Dessutom kan mängden fläckar en stift skriver per dip modifieras för att inkludera fler eller färre fläckar, men kräver separat kalibrering för varje typ av material som används i matrisen. Typen av fluorescensmarkören och dess koncentration kan modifieras, så länge den innehåller den korrekta kemiska gruppen för konjugering ( dvs. primär amin för epoxidbelagda diabilder). Koncentrationerna och typerna av STD-kurvor kan förlängas ( t.ex. human / mus / annan organism IgG, IgM, IgA, etc. ). Buffertförhållandena kan optimeras för att passa olika material, som företrädesvis saknar material med primär amin för att undvika ospecifik bindning till matrisen, vilket skulle orsaka ökad bakgrund. Det är viktigt att, för optimal detektering av Neu5Gc, det biologiska blockerande reagenset vara fritt från Neu5Gc (t ex undvik BSA amd-mjölk), eftersom detta kan minska Neu5Gc-sialoglykan-detektion och jagNcrease background 19 , 20 . Primär- och sekundärdetekteringskoncentrationer bör optimeras för att undvika hög bakgrund och icke-specifik bindning. Dessutom kan skanningsparametrar ( t.ex. effekt, förstärkning och upplösning) ändras för att minska bakgrunden eller förbättra låga signaler. Slutligen kan anpassnings- och analysparametrar modifieras för att passa hög bakgrund eller olika formade egenskaper. Ytterligare information och riktlinjer angående de rekommenderade standarderna för rapportering av glykanmikroraydata har nyligen beskrivits av MIRAGE-initiativet 17 , vilket i sin tur kan underlätta datadeling och tolkning.
Sammanfattningsvis tillhandahåller glykanmikroarrays ett robust verktyg för att undersöka glykan-biomolekyl-interaktioner och kan anpassas till olika biologiska prover. Anti-Neu5Gc antikroppar spelar olika roller i människors sjukdom 23 . Till exempel i cancerAnti-Neu5Gc antikroppar spelar dubbla roller: å ena sidan tjänar de som potentiella biomarkörer, men å andra sidan tjänar de som potentiella terapier 7 , 21 , 24 . Dessa antikroppar bidrar också till exacerbationen av ateroskleros 25 , effektiviteten av xenotransplantation 20 , 26 och effekten av glykosylerade bioterapeutika 27 . Sålunda är profilering av anti-Neu5Gc-antikroppar i olika humana prover av växande intresse, och analyser med hög genomströmning, såsom den som beskrivs här, kan bidra till att förstärka vår förståelse av deras roller i människors hälsa och sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av ett forskningsprojekt för karriärutveckling från Israels cancerforskningsfond, ett bidrag från det israeliska nationella nanoteknologinitiativet och Helmsley Charitable Trust för ett fokalt tekniskt område för nanomedicin för personlig terapi (VP-K) och nationell Institut för hälsobidrag R01GM076360 (till XC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary-amine containing sialoglycans | Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services) | Contact info@glycohubusa.com for compound requests | Printed glycans |
| Monosodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | Printing buffer component |
| Disodium phosphate heptahydrate | Sigma | S9390 | Printing buffer component |
| Phosphate buffered saline | Hy-Labs | BP-507/500D | Printing buffer/ incubation/washing buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Slide blocking reagent |
| Glycerol | Sigma | G-7893 | Printing buffer component |
| Ethanolamine | Thermo-Fisher Scientific | 0700/08 | Slide blocking reagent |
| Ovalbumin (Grade V) | Sigma | A5503 | Slide Blocking protein |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | Slide washing detergent |
| Alexa 555-Hydrazide | Thermo-Fisher Scientific | A20501MP | Marker on array |
| ChromPure Human IgG, whole molecule | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Printing component |
| Biotinylated- SNA | Vector Laboratories | B-1305 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–6-linked |
| Biotinylated-MALII | Vector Laboratories | B-1265 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–3-linked |
| Chicken-anti Neu5Gc IgY | BioLegend | 146903 | Primary detection |
| Cy3-Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-0848 | Biotin binding |
| Cy3-anti Human IgG | Jackson Immunoresearch | 109-165-088 | Secondary detection against human IgG |
| Cy3-anti Chicken IgY | Jackson Immunoresearch | 703-165-155 | Secondary detection against chicken IgY |
| Human sera samples | Israeli Blood Bank | Primary detection | |
| Compressed Nitrogen (Grade 5) | General dusting/drying tool | ||
| Epoxy-coated slides | Corning | 40044 | Slides |
| Epoxy-coated slides | PolyAn | 2D 104-00-221 | Slides. In this type of slides the surface is more hydrophobic (compared to Coring slides) therefore the glycans Print Buffer would need to be supplemented with 0.005% Tween-20 to obtain 100 µm size spots. |
| 384-well microtiter plate | Genetix | 2070 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-310 | Slide labeling |
| Staining Tube | ArrayIt | MST | Slide developing tool |
| Staining bath | VWR | 25608-904 | Slide developing tool |
| Slides glass holders | VWR | 631-9321 | Slide developing tool |
| GenePix Scanner | Molecular devices | 4000B | Slide scanner |
| LM-60 NanoPrinter | ArrayIt | LM-60 | Array printer |
| Pins | ArrayIt | 946MP3 | Printing pins |
| ProPlate Module | Grace Bio-Labs | P37004 | Slide developing module |
| Distilled water | Bio-Lab | 2321020500 | Required for arrayer and humidifier |
| Electronic Multi Pippete, 8 Channel , volume range 2-125 μL | Thermo-Fisher Scientific (Matrix) | MA-2131 Impact2 Equalizer 384 | Multi pippete for sample dispansing into 384-well plate |
References
- Padler-Karavani, V. Aiming at the sweet side of cancer: Aberrant glycosylation as possible target for personalized-medicine. Cancer Lett. 352 (1), 102-112 (2014).
- Amon, R., Reuven, E. M., Leviatan Ben-Arye,, Padler-Karavani, S., V, Glycans in immune recognition and response. Carbohydr Res. 389, 115-122 (2014).
- Häuselmann, I., Borsig, L. Altered tumor-cell glycosylation promotes metastasis. Front Oncol. 4, (2014).
- Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (21), 12045-12050 (2003).
- Bardor, M., Nguyen, D. H., Diaz, S., Varki, A. Mechanism of uptake and incorporation of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells. J Biol Chem. 280 (6), 4228-4237 (2005).
- Padler-Karavani, V., et al. Diversity in specificity, abundance, and composition of anti-Neu5Gc antibodies in normal humans: potential implications for disease. Glycobiology. 18 (10), 818-830 (2008).
- Padler-Karavani, V., et al. Human xeno-autoantibodies against a non-human sialic acid serve as novel serum biomarkers and immunotherapeutics in cancer. Cancer Res. 71 (9), 3352-3363 (2011).
- Cao, H., Chen, X. General consideration on sialic acid chemistry. Methods Mol Biol. 808, 31-56 (2012).
- Deng, L., Chen, X., Varki, A. Exploration of sialic Acid diversity and biology using sialoglycan microarrays. Biopolymers. 99 (10), 650-665 (2013).
- Liang, C. H., Hsu, C. H., Wu, C. Y. Sialoside Arrays: New Synthetic Strategies and Applications. Top Curr Chem. 367, 125-149 (2015).
- Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Smith, D. F., Cummings, R. D. Glycan microarrays of fluorescently-tagged natural glycans. Glycoconj J. 32 (7), 465-473 (2015).
- Muthana, S. M., Gildersleeve, J. C. Glycan microarrays: powerful tools for biomarker discovery. Cancer Biomark. 14 (1), 29-41 (2014).
- Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
- Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F., Cummings, R. D. Preparation and analysis of glycan microarrays. Curr Protoc Protein Sci. 12 (10), (2011).
- Park, S., Gildersleeve, J. C., Blixt, O., Shin, I. Carbohydrate microarrays. Chem Soc Rev. 42 (10), 4310-4326 (2013).
- Struwe, W. B., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: sample preparation guidelines for reliable reporting of glycomics datasets. Glycobiology. 26 (9), 907-910 (2016).
- Liu, Y., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data. Glycobiology. , (2016).
- Hara, S., Yamaguchi, M., Takemori, Y., Furuhata, K., Ogura, H., Nakamura, M. Determination of mono-O-acetylated N-acetylneuraminic acids in human and rat sera by fluorometric high-performance liquid chromatography. Anal Biochem. 179 (1), 162-166 (1989).
- Padler-Karavani, V., et al. Cross-comparison of protein recognition of sialic acid diversity on two novel sialoglycan microarrays. J Biol Chem. 287 (27), 22593-22608 (2012).
- Padler-Karavani, V., Varki, A. Potential impact of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid on transplant rejection risk. Xenotransplantation. 18 (1), 1-5 (2011).
- Samraj, A. N., et al. A red meat-derived glycan promotes inflammation and cancer progression. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (2), 542-547 (2015).
- Pearce, O. M., Läubli, H. Sialic acids in cancer biology and immunity. Glycobiology. 26 (2), 111-128 (2016).
- Alisson-Silva, F., Kawanishi, K., Varki, A. Human risk of diseases associated with red meat intake: Analysis of current theories and proposed role for metabolic incorporation of a non-human sialic acid. Mol Aspects Med. 51, 16-30 (2016).
- Pearce, O. M., et al. Inverse hormesis of cancer growth mediated by narrow ranges of tumor-directed antibodies. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (16), 5998-6003 (2014).
- Pham, T., et al. Evidence for a novel human-specific xeno-auto-antibody response against vascular endothelium. Blood. 114 (25), 5225-5235 (2009).
- Reuven, E. M., et al. Characterization of immunogenic Neu5Gc in bioprosthetic heart valves. Xenotransplantation. 23 (5), 381-392 (2016).
- Ghaderi, D., Taylor, R. E., Padler-Karavani, V., Diaz, S., Varki, A. Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins. Nat Biotechnol. 28 (8), 863-867 (2010).
