Summary
Биосенсор microfluidic платформа была разработана и изготовлены с использованием технологии лоу кост сухой пленки фоторезиста для быстрого и чувствительной квантификации различных аналитов. Эта система одноразовых позволяет для электрохимических индикация по чип прикол энзим соединенный анализов методике стоп потока.
Abstract
В последние годы биомаркер диагностика стала незаменимым инструментом для диагностики заболеваний человека, особенно для диагностики точки обслуживания. Платформы easy-to-use и лоу кост датчик весьма желательно измерить различные типы аналитов (например, биомаркеры, гормоны и наркотики), количественно и конкретно. По этой причине сухой пленки фоторезиста технологии - включение дешево, снисходительный и высок объём изготовления - был использован для изготовления microfluidic биосенсор, представленные здесь. В зависимости от помощи биопроб, используемые впоследствии универсальная платформа способен обнаруживать различные типы биомолекул. Для изготовления устройства платиновые электроды строятся на гибкой полиимидные (PI) фольги в шаг только чистый номер процесса. PI фольги служит субстрат для электродов, которые изолированы на основе эпоксидных фоторезиста. Microfluidic канал впоследствии генерируется путем разработки и ламинирования сухой пленки фоторезиста (DFR) фольги на вафельные PI. С помощью гидрофобные остановки барьер в канал, канал разделяется на две конкретные области: иммобилизации раздел для энзим соединенный assay и электрохимические измерения ячеек для считывания сигнала растворенного в воде.
На чипе биопроб иммобилизации осуществляется путем адсорбции биомолекул на поверхности канала. Фермента глюкоза оксидаза используется как датчик для генерации электрохимических сигнала. Присутствии субстрат, глюкоза, производится перекиси водорода, который обнаружен на Платиновый рабочих электродом. Остановка потока техника применяется для получения усиления сигнала наряду с быстрого обнаружения. Различные биомолекул количественно может быть измерена с помощью системы внедрены microfluidic, давая указание различных видов заболеваний, или, относительно лечебного препарата мониторинг, содействие персонализированной терапии.
Introduction
За последние два десятилетия диагностические приложения стали элементарных для углубленных исследований в области глобального общественного здравоохранения. Традиционно лабораторные диагностические инструменты используются для обнаружения заболеваний. Даже несмотря на то, что они по-прежнему играть ключевую роль в диагностике заболеваний, тестирования точки обслуживания (POCT) выполнена у пациента или пациент сам стал более и более распространенным явлением в последние годы. Особенно в таких случаях, которые требуют немедленного лечения, например, острый инфаркт миокарда или диабет мониторинг быстрое подтверждение клинического вывод имеет важное значение. Следовательно существует растущая потребность POCT устройств, которая может эксплуатироваться не экспертами и что одновременно способны выполнять точные в vitro диагностические тесты в короткое время1,2,3,4 .
Уже достигнуты значительные успехи, достигнутые в области POCT. Однако есть еще много проблем, чтобы преодолеть5,6,,78. Для платформы POCT будет успешно запущен на рынок и конкурировать с лабораторной диагностики, устройство должно строго соответствовать следующим требованиям: (i) предоставлять точные и количественные результаты, которые согласуются с лабораторией выводы; (ii) имеют короткий пример к результат раз, позволяя немедленного лечения пациента; (iii) располагают незатрудненного и простой обработки, даже при ведении неподготовленных людей и требуют вмешательства свернутого пользователя; и (iv) состоят из датчика лоу кост подразделение, предназначены для однократного использования приложений. Кроме того оборудование Бесплатная диагностика благоприятны, главным образом в бедных ресурсами среды3,4,6.
Из-за этих серьезных требований только две POCT систем на основе электрохимических обнаружения (например, глюкозы в крови тест полоски) и иммуноанализа бокового потока (например, домашние тесты беременности) были успешно начаты на рынок так далеко. Однако обе системы страдают от недостатков, таких, как низкая производительность (т.е. мониторинга глюкозы крови имеет неточные результаты и анализы бокового потока только предоставляют результаты качественных измерений (положительный или отрицательный))4, 6. Эти недостатки обычных систем POCT привели растущий спрос на изучение новых технологий, которые предлагают быстрый, лоу кост и количественного обнаружения точки зрения ухода за4,5.
Для решения этих задач, стоящих перед POCT устройств, технология DFR недавно использовалась для изготовления одноразовых и лоу кост биодатчики9,10,11,12, 13 , 14. по сравнению с мягких и жидких литографических материалы, такие как PDMS или Су-8, DFRs настоящее время множество преимуществ: они (i) доступны в различных композиций и толщины (от нескольких микрон до нескольких миллиметров); (ii) имеют очень грубо площадь поверхности, которая облегчает адгезии к различным материалам; (iii) функция Потрясающе толщина единообразия; (iv) предлагают дешевые, снисходительный и высок объём производства для массового производства; (v) являются легко резать с различными инструментами лоу кост, как пару простых ножницы; и (vi) позволяют для создания трехмерных структур, таких как microfluidic каналы, путем укладки нескольких DFR слои друг на друга.
С другой стороны DFRs в целом имеют относительно бедных разрешение по сравнению с жидкой фоторезистов, который является главным образом вызваны толщины пленки и увеличение расстояния между DFR благодаря защитной пленке, которая дополнительно позволяет света и маски рассеяние. Тем не менее для изготовления комплексных microfluidic биодатчиков, DFRs очень подходит для лоу кост массового производства.
Таким образом мы представляем в этой работы, изготовление и применение биосенсор на основе DFR электрохимических microfluidic. Подробный протокол описывает каждый шаг производства биосенсор платформы, на чипе иммобилизации модель на основе ДНК анализа, и ее электрохимических индикация с использованием метода stop потока. Это универсальная платформа позволяет выявлять многочисленные виды биомолекул, используя различные пробирного технологий (целломике,например, геномики и протеомики) или пробирного форматов (например, конкурентоспособной, бутерброд или прямой). Основываясь на такой платформе DFR, наша группа ранее успешно продемонстрировала быстрый и чувствительных квантификации различных аналитов, включая антибиотики13,,1516 (тетрациклин, pristinamycin и β лактамные антибиотики), тропонин я17и вещество P-18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Изготовление Microfluidic биосенсор технологии с использованием DFR
- приготовления Пи вафель.
- Вырезать PI субстрата в 6 - в круглых пластин. Поместить пи пластин в духовке при температуре 120 ° C для примерно 1 час для обезвоживания выпекать.
- Первый шаг фотолитографии старт процесса.
- Программа спин-нанесения покрытий на время 30-s спиннинг при 3000 об/мин, с ускорением 2000 об/мин/s. место PI пластин на спин coater и исправить ее, применяя вакуум. Отказаться от 2 мл сопротивляться, позволяя старт процесса и запустите программу, спин-нанесения покрытий. Удаление пластины из спин coater и софт Выпекать PI пластин на горячей плите 2 мин на 100 ° C.
- Настроить желаемый маска для структурирования электродов на Пи пластины с нагим глазом и подвергать 400 МДж/см 2 УФ света (365 Нм). Место заполнены с разработчиком соответствия сопротивляться на орбитальный шейкер вафельные в миску и дайте ему встряхнуть немного за 1 мин
- После удаляется избыток сопротивляться, использовать телевизор для полоскания PI вафельные с дейонизированной водой (ди вода) на мокрой скамейке и сушить потом с помощью сжатого воздуха.
- Осаждения платины для формирования электродов.
- Использовать процесс осаждения стандартная ионно депозит 200 Нм платины на вафельные 19.
- Место вафля в миску. Добавление сопоставления для удаления в миску и удалите старт сопротивление при слегка покачивая пластины на орбитальный шейкер, до тех пор, пока все платиновые избыток удаляется. Сполосните и высушите PI пластин, как описано в шаге 1.2.3.
- Второй шаг фотолитографии: формирование слоя изоляции.
- Поставить PI пластин в духовке, разогретой до 120 ° C за 5 мин до обезвоживает it.
- Программа первый шаг спин coater 5 s спиннинг время 500 об/мин. Программа второй шаг за 30 сек при 4000 об/мин, с ускорением 700 об/мин/s.
- Место PI пластин на спин coater и исправить ее, применяя вакуум. Отказаться от 4 мл соответствующей основе эпоксидной фоторезиста перед запуском программы спин coater.
- Soft выпекать покрытые вафельной 3 мин при 95 ° C на горячей плите.
- Настроить маску для слоя изоляции на пластины, с использованием соответствующих выравнивания знаки и глазной линзы. Разоблачить вафельные 100 МДж/см 2 УФ света (365 Нм).
- Для постконтактная выпечки, место пластины на разогретой плита на 2 мин на 95 ° C.
- Место вафля в миску и развивать сопротивление с подходящей разработчика (например, 1-метокси-2-пропил используется для 2 мин, в случае Су-8) на орбитальный шейкер.
- Сначала промыть PI вафельные изопропиловый спирт и затем промыть и высушить его, как описано в шаге 1.2.3.
- Хард выпекать фоторезиста в духовке в течение 3 часов при 150 ° C.
- При помощи плазменной очистки электродов.
- Для удаления фоторезиста остатков, использовать кислород плазмы с стандартной плазменного. Запуск программы очистки, мощность 200 Вт низкой частоты с помощью 100% O 2 потока, скорость 250 sccm и общее время 3 мин
- Место PI пластины в камере плазмы, исправить пластины на пластину заземлением с помощью стеклянные крышки и начать процесс плазменной.
- Серебро и осаждении хлорида серебра: создание электрода опорного.
- Passivate платины контакта колодки вафли с УФ чувствительных клейкой лентой. Разрезать фольгу 5 мм в ширину и 11 см длинные полосы и прикрепить их к пластины, защита частей не на хранение с серебром.
- Осаждения серебра, поместить звуковой ванны (35 кГц) в вытяжной шкаф и вставьте контейнер раствор серебра электролита (100 г/Л Ag, pH 12,5) в ванну. Установить звуковой ванны до комнатной температуры и мощности на 10%.
Предупреждение: Серебряный электролит решения являются высокотоксичными и следует подходить с крайней осторожностью. Никогда не должно быть вдыхании паров. - Подключите основной контакт ссылку электродов к источника постоянного тока. Подключить счетчик электрода, серебряной проволоки, который погружен в раствор серебра электролита, к текущему источнику с использованием стандартных соединительных кабелей.
- Установить источник тока DC и плотность тока -4,5 мА/см 2, что приводит к серебряной наплавки примерно 0,3 мкм/мин начать звуковой ванны и пусть текущий источник баллотироваться на 10 минут промойте пластины с ди воды
- Для хлорирования электрод сравнения, судно 0,1 М раствора хлорида калия (KCl) Вставьте звуковой ванны. Подключите основной контакт пластины и Платиновый электрод, который погружен в еще несогретом растворе с постоянным текущего источника.
- Установить источник тока DC и плотность тока + 0,6-+ мА/см 2, что приводит к скорость осаждения приблизительно 0,075 мкм/мин начать звуковой ванны и пусть текущий источник баллотироваться на 7,5 мин
- Промыть и высушить PI пластины, как описано в шаге 1.2.3.
- Снять ленту УФ чувствительных после УФ (365 Нм) воздействия 300 МДж/см 2, промыть и высушить PI пластины, снова, как описано в шаге 1.2.3.
- Третий шаг фотолитографии: с помощью DFRs для создания каналов microfluidic.
- Сократить необходимые слои DFR размер похож на вафельные (2 20 x 20 см). Исправьте желаемого маски на экспозиции блок и выровнять DFR слоя на маску, используя невооруженным глазом. Осветить противостоять с 250 МДж/см 2 УФ света (365 Нм).
- Удалить защитную пленку фоторезиста и развивать сопротивление примерно 2 мин (в зависимости от структуры) в 1% раствор карбоната натрия (Na 2 CO 3), используя стандартный звуковой ванна (35 кГц), разогретую до 42 ° C и звуковой мощности 100%. Немедленно остановить реакции, встряхните сопротивляться за 1 мин в бане 1% HCl на орбитальный шейкер. Сполосните и высушите каждый слой DFR, как описано в шаге 1.2.3.
Примечание: В общей сложности, четыре DFR слои должны быть обработаны как указано в шаге 1.7: один канал слоя, один слой и два слоя зад (Предотвращение изгиба в конце биосенсор).
- Ламинирование DFR слои на подложке PI.
- Место PI пластин на накладных сетку прозрачности и исправить это с помощью стандартных липкая лента. Отрегулируйте уровень DFR канала на Пи пластины под микроскопом, используя соответствующие выравнивание структуры.
- Для ламинирования, использовать стандартный Горячий ролл ламинатор и Разогрейте верхнего рулона до 100 ° C и снизу рулона до 60 ° C. установить давление на 3 бар, с скорости 0,3 м/мин место вафельные с фиксированной DFR слоя в середине ламинатор и запустить это; DFR выталкивается через ламинатор. Повторите шаг после вращающихся пластин на 180°.
- Для предотвращения изгиба биосенсор, ламинат два слоя развитых зад на вафельные, следующие шаги 1.8.1-1.8.2.
- Использованием гидрофобных остановки барьер и герметизации чип.
- Удалить защитный слой от лицевой стороны канала DFR заложитьER, поместив стандартных липкая лента на одном конце DFR и потянув ее вверх. Используйте ручной дозатор с 0,004 в трубы отказаться от мелких капель растворяют политетрафторэтилена в скважины слоя изоляции. Для герметизации microfluidic чип, ламинат DFR слоя на слой канала, как описано в шаге 1.8.
- Хард выпечка microfluidic биодатчик.
- Удалить все защитные пленки на обложке и зад DFR слои. Нарежьте полосками, с использованием обычной пары ножниц биодатчиков. Вылечить фишки в духовке при температуре 160 ° С в течение 3 ч.
2. Assay иммобилизации процедуры на чипе
- адсорбции авидин в иммобилизации области канала.
- Приготовляют раствор авидин 100 мкг/мл в 10 мм фосфат амортизированное saline (PBS) при рН 7,4.
- Отказаться от 2 мкл авидин раствора на входе биодатчик.
Примечание: Канал заполняется капиллярных сил до тех пор, пока жидкость достигает гидрофобные остановки барьер. - Для обеспечения что аэрогидродинамических держит останавливаясь на барьер во время всей инкубации, лунки 2 мкл ди воды на выходе микросхемы. Инкубировать чип при 25 ° C в течение 1 ч в закрытом контейнере.
- Удалить избыток реагентов через вход микросхемы, применяя вакуум. Промойте канал с 50 мкл буфера мытья (PBS с 0,05% 20 анимации), обойтись на выходе, в то время как вакуум применяется. Сухие канал для 30 s в то время как вакуум применяется.
- Блокировка поверхности канала, чтобы препятствовать неспецифические привязки.
- Приготовляют раствор 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в 10 мм PBS при рН 7,4.
- Пипетки 2 мкл 1% BSA раствора на входе и 2 мкл ди-воды на выходе из канала. Инкубируйте чип при 25 ° C в течение 1 ч в закрытом контейнере. Удалите избыток реагентов и высушить канал, как описано в шаге 2.1.4.
- Инкубации ДНК oligos помечены биотина и 6-FAM.
- Подготовить различные концентрации (0,001-5 мкм) ДНК раствора в 10 мм PBS при рН 7,4.
- Отказаться от 2 мкл одной концентрации ДНК раствора на входе и 2 мкл ди-воды на выходе. Инкубировать чип при 25 ° C в течение 15 мин в закрытом контейнере.
- Повторите шаг 2.3.2 другие концентрации ДНК, с использованием дополнительных биосенсор чипов.
- Удалить избыток реагентов и высушить канал, как описано в шаге 2.1.4.
- Иммобилизации GOx-обозначенного антитела 6-FAM.
- Сформулировать 5 мкг/мл концентрация антител 6-FAM в 10 мм PBS при рН 7,4.
- Ввести 2 мкл антител раствора на входе и 2 мкл ди-воды на выходе из канала. Инкубируйте обозначенные антитела при 25 ° C в течение 15 мин в закрытом контейнере. Удалите избыток реагентов, как описано в шаге 2.1.4.
3. Амперометрическое сигнал обнаружения с помощью метода Stop потока
- приготовления раствора субстрата для электрохимических обнаружения.
- Сформулировать раствором глюкозы 40-мм в 0,1 М PBS при рН 7,4 в ультра-чистой воде.
- Для предварительного лечения, приготовляют раствор 0,1 М PBS на рН 7,4 в ультра-чистой воде.
- Предварительная обработка рабочих электродов.
- Использовать держателя на заказ чип, чтобы позволить легко размещения чипа и оптимизированных и электрические подключения.
- Электрически соединить потенцио биодатчик. Обеспечить аэрогидродинамических контакт microfluidic канала шприцевый насос и водохранилище реагента, используя заказные адаптер и трубки. Запустите ноутбук, который подключен к потенцио и запустить контроллер насоса шприца, оптимизированных потока через чип.
- Вручную, запустите шприцевый насос с PBS 0,1 М со скоростью потока 20 мкл/мин. На рабочем электроде против электрод сравнения на чипе, применять чередуя напряжения 0,8 и -0.05 V 5 s 30 циклов. После этого, окисляет рабочих электродом, применяя напряжения 0,8 V 60 s.
- Assay индикация с использованием метода stop поток.
- Начать пробирного индикация сигнала, ждать до тех пор, пока стабилизирует текущего измеряемого сигнала. Остановить шприцевый насос и переключения реагент от 0,1 М PBS в растворе глюкозы 40-мм и запустить программное обеспечение на контроллер насоса шприца; он автоматически остановит поток для 1, 2 или 5 мин и затем перезапустить поток снова. Наблюдать за полученный текущей пик.
Примечание: Для анализа данных, либо текущий пик или заряд пик могут рассматриваться, как описано в модели электрохимического сигнала индикации ( рис. 2).
- Начать пробирного индикация сигнала, ждать до тех пор, пока стабилизирует текущего измеряемого сигнала. Остановить шприцевый насос и переключения реагент от 0,1 М PBS в растворе глюкозы 40-мм и запустить программное обеспечение на контроллер насоса шприца; он автоматически остановит поток для 1, 2 или 5 мин и затем перезапустить поток снова. Наблюдать за полученный текущей пик.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Проектирование и изготовление биосенсор Microfluidic платформа:
Изготовление чипов биосенсор microfluidic реализуется на уровне вафельные методами стандартных офсетным, используя несколько слоев DFR. Эта стратегия изготовление опирается на ламинирование развитые слои DFRs на подложке платины узорные PI, образуя microfluidic каналы. На рисунке 1приводится краткое резюме, изображающие различные изготовления шаги. Один 6 - в вафельных состоит из 130 microfluidic биодатчики, каждый с размером 8 × 10 мм2.
Рисунок 1. Графическая иллюстрация различных изготовление шаги microfluidic платформа биодатчик. ) субстрата вырезать PI в 6 - в круглых пластин. b) воздействия возможных спин покрытием старт противостоять, используя соответствующие маски для платины патронирования. c) субстрат после воздействия, обратно после воздействия и разработке фоторезиста. d) физическое парофазное осаждение платины на подложке. e) процесс старт, чтобы удалить избыток фоторезиста. f) спин покрытие Су-8, образуя слой изоляции. g) O2 плазменный процесс для удаления остатков Су-8 на электродах Pt. h) гальванического осаждения Ag/AgCl электродов ссылки. i) УФ-облучения и развитие различных DFR слоев. j) ламинирования DFR слоев на вафельные PI. k) дозирования решена политетрафторэтилена, образуя гидрофобные остановки барьер между иммобилизации капилляров и электрохимической ячейки. l) окончательный электрохимических microfluidic биодатчик. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Каждый биосенсор состоит из одной microfluidic канала, разделены на две отдельные области гидрофобные остановки барьером: Секция иммобилизации и электрохимической ячейки, помеченные в красный и синий, соответственно, на рисунке 2. Иммобилизация часть микроканальные имеет поверхности объем 10.34 мм2 и объем 580 nL, что приводит к высокой поверхности для тома отношение 155 см-1. Электрохимической ячейки включает электрод сравнения на чипе серебро/серебро хлорида и счетчика и рабочих платинового электрода. Это разделение области иммобилизации и электрохимических индикация assay предотвращает любое загрязнение электродов с биомолекулами и поэтому тормозит обрастание электродов. Кроме того он позволяет точный замер иммобилизации реагентов, капиллярного заполнения.
Рисунок 2. Иллюстрация принцип электрохимических microfluidic платформа. ) схемы модели анализа, основанный на авидин. b) фотография microfluidic биосенсор показаны основные элементы, включая счетчик электрода (CE), электрод сравнения (RE), рабочих электродом (мы) и остановки барьер (SB). Иммобилизация область выделена красным, и электрохимической ячейки помечается синим цветом. c) схема реакции окисления производства перекиси водорода на рабочем электроде Pt для обнаружения Амперометрическое внутри электрохимической ячейки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Используя DFRs для изготовления датчика, производственный процесс позволяет для высокой пропускной способности на уровне пластин. Таким образом расходы могут храниться до минимума. Развитие всех слоев DFR сделано с помощью простых и недорогостоящих фольги маски и блок вакуумного воздействия, а не дорогостоящие хром маски и маски каппу. Кроме того сокращение необходимого процесса очистки обслуживание шагов до минимума снижает расходы на изготовление еще больше. В общей сложности изготовление процедура принимает нагрузку примерно 10 h, исключая время выпечки и физическое парофазное осаждение платины.
На чипе Assay инкубации:
На чипе пробирного инкубации делается только на капиллярных сил. По дозирования капли различных реагентов на входе канала microfluidic жидкости управляются через канал капиллярности действий до тех пор, пока они достигнут барьера гидрофобные остановки. В условиях устойчивого состояния реагентов затем инкубируют собственный время. Это пассивная система позволяет капиллярного заполнения канала, без необходимости каких-либо внешних приборов как шприцевый насос и для точного дозирования реагентов, как жидкость автоматически останавливается на остановки барьер. Кроме того рабочий процесс согласуется с тем из обычных ELISA, и он работает с высокой вязкости жидкостей как сыворотки или крови.
Для целей этого эксперимента чип операции подтверждается пробирного простой тест, используя авидин биотин взаимодействия, как показано на рисунке 2. На чипе пробирного инкубации начинается с адсорбции авидин капиллярного поверхность для 1 h, последовал блокировки шаг с BSA еще 1 ч. Впоследствии 6-FAM/биотин меченых ДНК инкубировали в капиллярной 15 мин, где он связывается с молекулами авидин иммобилизации. Между каждым шагом инкубации Стиральная шаг удаляются любые свободные биомолекул. Мыть буфер применяется через выход канала с помощью заказной Вакуумный адаптер. На последнем шаге глюкоза оксидаза меченых antifluorescein антитела вводятся в канал 15 мин. После этого биосенсор готова для электрохимических индикация, используя раствор глюкозы 40-мм как субстрат.
Индикация Амперометрическое сигнала с использованием метода Stop потока:
Для считывания сигнала иммобилизованных assay ферменты продукта (H2O2, здесь), производится в присутствии его субстрат, глюкоза, электрохимически могут быть обнаружены на рабочем электроде в электрохимическом. Для достижения быстрого обнаружения вместе с усиления сигнала, так называемый стоп поток техника-используется13. В этом методе прекращается поток субстрата, что приводит к накоплению продукта внутри капилляра. Количество выпускаемых H2O2 поэтому зависит количество связанных глюкозооксидазы и зависит от количества привязанных биотинилированным ДНК. После перезагрузки потока, расширенной H2O2 концентрация впоследствии промыта электрохимические измерения клетки, что приводит к текущей сигнал пик, как показано на рисунке 3.
Для анализа данных, метод стоп потока предлагает два различных параметров: максимальная высота и заряд (т.е., интеграл) пика сигнала. Оба параметра прямо пропорциональна времени остановкии поэтому может использоваться для анализа данных. С учетом данных оценки, при использовании высота пика высота сигнала зависит на максимальной концентрации H2O2 и таким образом на его коэффициент диффузии и прикладной конечное время. Чем длиннее время остановки, тем выше ответ измеряемого сигнала. По этой причине высота калиброванными пик остается постоянной, вплоть до минимальной длины капиллярных иммобилизации. Эта особенность техники стоп потока позволяет резкое сокращение размеров чип, особенно в длину капилляров, сохраняя чувствительности датчика.
Рисунок 3. Модель обычно полученные электрохимических сигнала индикации энзим соединенный assay с использованием метода stop поток. ) был применен поток раствора глюкозы 40-мм со скоростью 20 мкл/мин. Во время этапа остановка (1, 2 или 5 мин), производство ферментов H2O2 продолжается. Перезапустив потока, накопленные H2O2 очищается через электрохимической ячейки, где электрохимически обнаруживается перекиси водорода. Повторяя измерения несколько раз (планки погрешностей; SEM), на чипе калибровки кривая b) получается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представленные здесь для изготовления microfluidic электрохимический биодатчик протокол позволяет развитие лоу кост, компактный и простой в использовании платформа для обнаружения биомолекул. В зависимости от assay, потом используется на биосенсор могут быть обнаружены несколько различных биомаркеров. Это делает платформ очень разносторонний и обеспечивает широкий доступ для различных областей применения, от стандартных диагностических тестов (например, определения наличия конкретных заболеваний в офисе доктора) для точки обслуживания приложений (например, терапевтического мониторинга лекарственных препаратов пациента для индивидуальной лекарственной терапии). Особенно в момент ухода диагностики, миниатюрных биодатчики имеют много преимуществ над традиционными методами, которые обычно требуют обширной лабораторного оборудования, специализированных сотрудников и большие реагента и образца томов и длинный поворот раз.
Изготовление это биосенсор требует строго после протокола; в противном случае может произойти производственных проблем. Один из вопросов, наиболее часто наблюдаемых является смещение различных слоев. Это может быть легко решена с помощью более продвинутых аппарат для процесса изготовления, что позволяет легче и более точное выравнивание различных слоев.
DFR технология дает возможность быстро и низкой стоимости изготовления. С другой стороны технология ограничено с точки зрения резолюции. К примеру microfluidic каналы очень малых структур (менее 100 мкм) не могут быть реализованы с использованием протокола, представленные здесь. В таком случае фотолитографии должны выполняться высокой точности маски выравниватель с фотошаблонов стекла. Кроме того слишком широкий канал также может быть проблематичным, поскольку канал может согнуть вниз, уменьшение высоты канала и влиять на поведение microfluidic чипа.
Мы считаем, что DFR технология будет больше присутствует в будущих приложений, потому что его можно легко вычислить по маштабу для коммерческого использования. Массовое производство датчиков на основе DFR microfluidic будет не является препятствием, когда она попадает на рынок, потому что техника устоявшихся в других областях применения (например, Гибкая электроника).
С точки зрения уменьшения сложности системы в целом, наша будущая работа будет сосредоточена на разработке и осуществлении одноразовые microfluidic картриджа, который включает биосенсор чип; отходов водохранилище; и предварительно загруженных реагенты, такие как мыть буфера и другие компоненты пробирного. Для измерения растворенного в воде доставки образца и другие реагенты затем может обеспечиваться пневматического привода. Это будет осуществляться портативный читатель и будет двигаться через чип биосенсор microfluidic отходов водохранилище.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить немецкого фонда научных исследований (DFG) для частичного финансирования этой работы в рамках гранта чисел UR 70/10-01 и UR 70/12-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Pyralux | DuPont | AP8525R | Used as polyimide substrate |
| MA-N 1420 | Micro Resist Technology | MA-N1420 | Lift-off resit to define the platinum depostion |
| Ma-D 533s | Micro Resist Technology | MaD533S | Developer for MA-N1420 |
| Platinum | - | - | Electrode and contact pad material |
| Ma-R 404s | Micro Resist Technology | MaR404S | Remover for MA-N1420 |
| SU-8 3005 | MicroChem Corp. | SU-8-3005 | Photoresist to define the electrode area and as insulation |
| 1-methoxy-2-propanol acetate | Sigma-Aldrich | 108-65-6 | Developer for SU-8 3005 |
| 2-Propanol | VWR | 8.18766.2500 | Removing of the SU-8 developer |
| 1020R | Ultron Systems Inc. | 1020R | UV sensitive adhesive tape for protection of contact pads |
| Arguna S | Degussa | 1935 | For Silver depostion on reference electrode |
| KCl | Methrom | 62308.020 | For chloridation of the silver reference electrode |
| Pyralux | DuPont | PC1025 | Dry film photoresist |
| Sodium carbonat | Fluka | 71352 | Developer for Pyralux PC1025 |
| Hydrogen chloride | Sigma-Aldrich | 30720 | To top the development of the DFR |
| Teflon AF 1600 | DuPont | AF1600 | For employing the stopping barrier |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PA104 | Mega Electronics | - | Bubble etch tank |
| FED 53 | Binder | 9010-0018 | Oven |
| SPIN150 | APT | - | Spin coater |
| Präzitherm | Harry Gestigkeit GmbH | PZ 28-2 | Hot plate |
| Hellas | Bungard Elektronik | 40000 | Exposure unit |
| Tetra30-LF-PC | Diener | - | Plasma unit |
| Univex 500 | Leybold | - | Physical vapor deposition unit |
| Shaker S4 | ELMI | - | Orbital shaker |
| Sonorex Super 10 P | Bandelin | 783 | Sonic bath |
| 6221 DC and AC | Keithley | - | Current source |
| HRL 350 | Ozatec | - | Laminator unit |
| Vaccum pen | EFD | - | Vacuum pen |
References
- Spindel, S., Sapsford, K. E. Evaluation of optical detection platforms for multiplexed detection of proteins and the need for point-of-care biosensors for clinical use. Sensors (Basel). 14 (12), 22313-22341 (2014).
- Luppa, P. B., Bietenbeck, A., Beaudoin, C., Giannetti, A. Clinically relevant analytical techniques, organizational concepts for application and future perspectives of point-of-care testing. Biotechnol Adv. 34 (3), 139-160 (2016).
- Gauglitz, G. Point-of-Care Platforms. Annu Rev Anal Chem. 7 (1), 297-315 (2014).
- Jung, W., Han, J., Choi, J. W., Ahn, C. H. Point-of-care testing (POCT) diagnostic systems using microfluidic lab-on-a-chip technologies. Microelectron Eng. 132, 46-57 (2014).
- Yager, P., et al. Microfluidic diagnostic technologies for global public health. Nature. 442 (7101), 412-418 (2006).
- Fu, E., Yager, P., Floriano, P. N., Christodoulides, N., McDevitt, J. T. Perspective on diagnostics for global health. IEEE Pulse. 2 (6), 40-50 (2011).
- Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Ann Rev Biomed Eng. 10, 107-144 (2008).
- Dincer, C., Bruch, R., Kling, A., Dittrich, P. S., Urban, G. A. Multiplexed point-of-care testing - xPOCT. Trends Biotechnol. 35, (2017).
- Horak, J., Dincer, C., Bakirci, H., Urban, G. A disposable dry film photoresist-based microcapillary immunosensor chip for rapid detection of Epstein-Barr virus infection. Sens Actuators B Chem. 191, 813-820 (2014).
- Method for the fabrication of a "lab on chip" from photoresist material for medical diagnostic applications. US patent. Jobst, G., Gamp, T. , 7,691,623 (2010).
- Kling, A., Dincer, C., Armbrecht, L., Horak, J., Kieninger, J., Urban, G. Electrochemical microfluidic platform for simultaneous multi-analyte detection. Procedia Eng. 120, 916-919 (2015).
- Armbrecht, L., Dincer, C., Kling, A., Horak, J., Kieninger, J., Urban, G. Self-assembled magnetic bead chains for sensitivity enhancement of microfluidic electrochemical biosensor platforms. Lab Chip. 15, 4314-4321 (2015).
- Dincer, C., et al. Designed miniaturization of microfluidic biosensor platforms using the stop-flow technique. Analyst. 141, 6073-6079 (2016).
- Weltin, A., Kieninger, J., Enderle, B., Gellner, A. K., Fritsch, B., Urban, G. A. Polymer-based, flexible glutamate and lactate microsensors for in vivo applications. Biosens Bioelectron. 61, 192-199 (2014).
- Kling, A., et al. Multianalyte Antibiotic Detection on an Electrochemical Microfluidic Platform. Anal Chem. 88 (20), 10036-10043 (2016).
- Bruch, R., et al. Clinical on-site monitoring of ß-lactam antibiotics for a personalized antibiotherapy. Sci Rep. , (2017).
- Horak, J., Dincer, C., Qelibari, E., Bakirci, H., Urban, G. Polymer-modified microfluidic immunochip for enhanced electrochemical detection of troponin i. Sens Actuators B Chem. 209, 478-485 (2015).
- Horak, J., Dincer, C., Bakirci, H., Urban, G. Sensitive, rapid and quantitative detection of substance P in serum samples using an integrated microfluidic immunochip. Biosens Bioelectron. 58, 186-192 (2014).
- Mattox, D. M. Handbook of Physical Vapor Deposition (PVD) Processing. , Elsevier Inc. (2010).
