Summary
En microfluidic biosensor plattform var designet og fabrikkert bruker rimelig tørr film photoresist teknologi for raskere og følsom kvantifisering av ulike analytter. Bruke én systemet tillater den elektrokjemiske avlesning av on-chip-immobilisert enzym knyttet analyser med stopp-flow teknikken.
Abstract
De siste årene ble biomarkør diagnostikk et uunnværlig verktøy for diagnostisering av menneskelig sykdom, spesielt for point-of-care diagnostikken. En lett-å-bruke og rimelig sensor plattform er svært ønskelig å måle ulike typer analytter (f.eks biomarkers, hormoner og narkotika) kvantitativt og spesielt. Derfor var tørr film photoresist teknologi - slik at billig, lettvinte og høy gjennomstrømming fabrikasjon - brukes til å produsere microfluidic biosensor presenteres her. Avhengig av bioassay brukes etterpå, er den allsidige plattformen stand til å oppdage ulike typer biomolecules. Fabrikasjon av enheten, er platina elektrodene strukturert på en fleksibel polyimid (pi) (PI) folie i bare ren-rom prosesstrinnet. PI folien fungerer som et substrat for elektrodene, som er isolert med en epoxy-baserte photoresist. Mikrovæskekanalen genereres senere utvikling og laminering av tørr filmen photoresist (DFR)-folier på PI kjeks. Ved hjelp av en hydrofobe stoppe barriere i kanalen, kanalen er delt i to spesielle områder: en immobilisering seksjon for enzym knyttet analysen og en elektrokjemisk målet cellen for amperometric signal avlesning.
På prosessoren bioassay immobilisering utføres av opptak av biomolecules til kanal overflaten. Glukose oksidase enzymet er brukt som en transducer for elektrokjemiske signal generasjon. I nærvær av underlaget, glukose, er hydrogenperoksid produsert, som er oppdaget på platina arbeider elektroden. Stopp-flow teknikken brukes for å få signalforsterkning med rask søking. Forskjellige biomolecules kan kvantitativt måles ved introdusert microfluidic system, som gir en indikasjon på ulike sykdommer, eller, i forhold til terapeutisk medikament overvåking, tilrettelegge en personlig terapi.
Introduction
De siste to tiårene, har diagnostiske programmer blitt elementære for grundige studier på utvikling av globale folkehelsen. Tradisjonelt brukes laboratorium diagnostiske verktøy for deteksjon av sykdommer. Selv om de fortsatt spiller en nøkkelrolle i diagnostisering av sykdommer, point-of-care testing (POCT) utføres i nærheten pasienten eller av pasienten selv har blitt mer og mer vanlig i de siste årene. Spesielt i slike saker som krever umiddelbar behandling, for eksempel hjerteinfarkt eller diabetes overvåking, er rask bekreftelse av et kliniske funn avgjørende. Derfor er det et økende behov for POCT enheter som kan betjenes av ikke-eksperter og som samtidig kan utføre presise i vitro diagnostiske tester i en kort tid1,2,3,4 .
Betydelige forbedringer har allerede oppnådd innen POCT. Men er det fortsatt mange utfordringer å overvinne5,6,7,8. For en POCT plattformen lanseres vellykket til markedet og være konkurransedyktig med laboratorium diagnostikk, enheten må strengt oppfylle følgende krav: (i) gir presis og kvantitativ testresultater som stemmer med laboratoriet funn; (ii) har kort prøve å resultatet ganger, slik at umiddelbar behandling av pasienten. (iii) har ukomplisert og enkel håndtering, selv når drives av utrente individer, og krever minimerte brukertilsyn; og (iv) består av en rimelig sensor utformet for engangs applikasjoner. Videre er utstyr-gratis diagnostikk gunstig, hovedsakelig i ressurs-fattig miljø3,4,6.
Disse alvorlige krav, har bare to POCT systemer basert på elektrokjemiske gjenkjenning (f.eks blod glukose teststrimler) og lateral flyt immunanalyser (f.eks graviditetstester) blitt med hell innlede på markedet så langt. Men begge systemer lider ulemper som dårlig ytelse (dvs. blod glukose overvåking har unøyaktig testresultater og lateral flyt analyser bare gi kvalitative (positiv eller negativ) måleresultatene)4, 6. Disse ulempene av konvensjonelle POCT har ført til en økt etterspørsel på å utforske nye teknologier som tilbyr raske, rimelige og kvantitative gjenkjenning på omsorg4,5.
For å møte disse utfordringene POCT enheter, har DFR teknologi vært nylig ansatt fabrikasjon av disponibel og rimelig biosensors9,10,11,12, 13 , 14. sammenlignet med myk og flytende litografisk materialer, for eksempel PDMS eller SU-8, DFRs presenterer mange fordeler: de (i) er tilgjengelige i en rekke komposisjoner og tykkelser (fra noen få mikroner til flere millimeter); (ii) har en svært grov areal som forenkler vedheft til ulike materialer; (iii) funksjonen utmerket tykkelse ensartethet; (iv) tilby billig, lettvinte og høy gjennomstrømming fabrikasjon for masseproduksjon; (v) er enkle å klippe med ulike rimelige verktøy, som et enkelt par saks; og (vi) tillate etablering av tre-dimensjonale strukturer, for eksempel microfluidic kanaler, ved stabling flere DFR lag oppå hverandre.
På den annen side, har DFRs generelt en relativt dårlig oppløsning sammenlignet med flytende photoresists, som er hovedsakelig forårsaket av filmen tykkelsen og økte avstanden mellom masken og DFR på grunn av beskyttende folie, som i tillegg gjør lys spredning. Likevel, for produksjon av integrerte microfluidic biosensors, DFRs er velegnet for rimelige masseproduksjon.
Derfor jobber vi i dette fabrikasjon og anvendelse av en DFR-baserte elektrokjemisk microfluidic biosensor. Protokollen som detaljert beskriver fremgangsmåten produksjon av biosensor plattformen, på prosessoren immobilisering av en DNA-basert modell analysen og den elektrokjemiske avlesning med stopp-flow teknikk. Denne universelle plattformen gjør det mulig for gjenkjenning av mange typer biomolecules, bruke forskjellige analysen teknologier (f.eks genomics, cellomics og Proteomikk) eller analysen formater (f.eks konkurransedyktig, sandwich eller direkte). Basert på slik DFR plattform, vist vår gruppe tidligere den raskere og følsom kvantifiseringen av forskjellige analytter, inkludert antibiotika13,15,16 (tetracycline, pristinamycin, og ß-Laktam antibiotika), troponin jeg17, og substans P18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fabrikasjon av Microfluidic Biosensor bruker DFR teknologi
- utarbeidelse av PI wafere.
- Kutt en PI underlaget i 6 - i runde wafere. Satt PI kjeks i en ovn ved 120 ° C i ca 1 time for en dehydrering bake.
- Klima og jordsmonn steg for lift-off prosessen.
- Programmet spin-coater til en 30-s spinning tid på 3000 rpm, med en akselerasjon av 2000 rpm/s. sted PI kjeks på spin-coater og fikse det, bruke et vakuum. Dispensere 2 mL en motstå, aktivere lift-off prosessen, og start programmet spin-coater. Fjern kjeks fra spin-coater og myk-bake PI kjeks på en varm plate i 2 minutter ved 100 ° C.
- Juster ønsket masken for mønstre elektrodene på PI kjeks med det blotte øye og utsette det til 400 mJ/cm 2 UV lys (365 nm). Kjeks i en bolle fylt med motstå-samsvarende utvikler på en orbital shaker og la det riste litt i 1
- Etter den overskytende motstå fjernes, bruk en dusj skyll PI kjeks med deionisert vann (DI-vann) på en våt benk og tørk den etterpå med trykkluft.
- Avsettelse av platinum for dannelsen av elektrodene.
- Bruker en standard fysisk vanndamp deponering prosess innskudd 200 nm Platinum bort på kjeks 19.
- Legg kjeks i en bolle. Legge til det tilsvarende fjerne bollen og fjerne lift-off motstå mens litt risting kjeks på en orbital shaker til alle overflødig platinum er fjernet. Skyll og tørk PI kjeks som beskrevet i trinn 1.2.3.
- Andre klima og jordsmonn trinnet: danner isolasjon laget.
- Sette PI kjeks i ovn forvarmet til 120 ° C i 5 min å tørke det.
- Programmet første trinn i en spinn-coater 5 s spinning tid på 500 rpm. Programmet det andre trinnet for 30 s ved 4000 o med en akselerasjon av 700 rpm/s.
- Plasser PI kjeks på spin-coater og fikse det, bruke et vakuum. Dispensere 4 mL av en passende epoxy-baserte photoresist før du starter programmet spin-coater.
- Soft-bake belagt kjeks i 3 minutter på 95 ° C på en kokeplate.
- Justere masken for isolasjon laget på kjeks med de respektive justering merkene og en okulær linse. Utsette wafer til 100 mJ/cm 2 UV lys (365 nm).
- For en post-eksponering bake, plassere kjeks på en forvarmet kokeplate i 2 minutter på 95 ° C.
- Plasser kjeks i en bolle og utvikle resist med en egnet utvikler (f.eks 1-metoksy-2-propyl-acetat i 2 minutter, i SU-8) på en orbital shaker.
- Skyll PI kjeks først med isopropanol og skyll og tørk den som beskrevet i trinn 1.2.3.
- Hard-bake photoresist i en ovn for 3t på 150 ° C.
- Plasma-assistert rengjøring av elektrodene.
- Fjerne photoresist rester, bruker oksygen plasma med en standard plasma enhet. Starter rengjøring programmet, med 200 W lavfrekvente kraften med 100% O 2 flyt, en pris av 250 sccm og totale tiden 3 min.
- Plasserer PI kjeks i plasma kammeret fikse kjeks på jordet platen bruker glass og starte plasma prosessen.
- Sølv og sølv klorid avsetning: opprette på prosessoren referanse elektroden.
- Passivate platina kontakt pads for kjeks med en UV-sensitive teip. Kuttet folien til 5 mm bred og 11 cm lang striper og knytte dem til kjeks, beskytte deler ikke å settes med sølv.
- Sølv ham, satt sonic badekar (35 kHz) i en røyk skap og sett en beholder med sølv electrolyte løsning (100 g/L Ag, pH 12,5) i badekaret. Satt sonic badet til romtemperatur og kraften til 10%.
Forsiktig: Sølv elektrolytt-løsninger er svært giftig og bør behandles med ekstrem forsiktighet. Røyk bør aldri inhaleres. - Koble bulk kontakt av referanse elektrodene til en konstant strømkilde. Koble counter elektroden, en sølv wire som er nedsenket i sølv elektrolytt løsningen strømkilde standard tilkoblingskabler.
- Angir gjeldende kilden til DC og en nåværende tetthet av-4.5 mA/cm 2, noe som resulterer i en sølv deponering rate på ca 0,3 µm/min. Start sonic badet og la den gjeldende kilden kjøre for 10 min. skyll kjeks med DI-vann
- For klorering av referanse elektrode, setter du inn et fartøy 0.1 M kalium klorid (KCl) løsning i sonic badekaret. Koble bulk kontakten kjeks og en platina elektrode som er nedsenket i KCl løsningen med konstant strømkilde.
- Angir gjeldende kilden til DC og en nåværende tetthet av +0.6 mA/cm 2, noe som resulterer i en avsetning rate på ca 0.075 µm/min. Start sonic badet og la den gjeldende kilden kjøre i 7,5 min.
- Skyll og tørk PI wafer, som beskrevet i trinn 1.2.3.
- Fjerne UV-sensitive båndet etter en UV (365 nm) eksponering av 300 mJ/cm 2 og skyll og tørk PI kjeks, igjen som beskrevet i trinn 1.2.3.
- Tredje klima og jordsmonn trinn: bruke DFRs til å opprette microfluidic kanalene.
- Kutt nødvendig DFR lagene til en størrelse ligner på kjeks (20 x 20 cm 2). Fastsette ønsket masken på eksponering enheten og Juster DFR laget på masken med det blotte øye. Belyse resist med 250 mJ/cm 2 UV lys (365 nm).
- Fjerne beskyttende folien av photoresist og utvikle resist i cirka 2 minutter (avhengig av strukturer) i en 1% natriumkarbonat (Na 2 CO 3) løsning å bruke standard sonic badekar (35 kHz) forvarmet til 42 ° C og en sonic makt 100%. For å stoppe reaksjonen umiddelbart, riste resist i 1 min i en 1% HCl bad på en orbital shaker. Skyll og tørk hvert DFR lag, som beskrevet i trinn 1.2.3.
Merk: Totalt fire DFR lag trenger å bli behandlet som nevnt i trinn 1.7: én kanal lag, ett dekke, og to baksiden lag (hindre biosensor bøyd på slutten).
- Laminering av DFR lag på PI underlaget.
- Plasser PI kjeks på en transparent overhead folie og fikse det ved hjelp av standard teip. Justere DFR kanallaget på PI kjeks under et mikroskop, ved hjelp av de respektive justering strukturene.
- For laminering, bruke en standard varme roll lamineringsmaskin og Forvarm topp rulle til 100 ° C og bunnen rulle til 60 ° C. satt presset til 3 bar med en fremover hastighet på 0,3 m/min. sted kjeks med faste DFR laget i lamineringsmaskin og starte det; DFR er presset gjennom lamineringsmaskin. Gjenta trinnet etter roterende kjeks 180 °.
- For å forhindre bøying av biosensor, laminat to utviklet baksiden lagene bort på kjeks følgende trinn 1.8.1-1.8.2.
- Ansette en hydrofobe stoppe barriere og tetting sjetongkassen.
- Fjern den beskyttende lag fra forsiden av DFR kanalen låeh ved å plassere standard teip i enden av DFR og trekke det oppover. Bruk en hånd dispenser med 0.004 i rør til å dispensere små dråper av oppløst polytetrafluoroethylene i brønnene for isolasjon laget. For å besegle microfluidic chip, laminat dekselet DFR laget på kanallaget, som beskrevet i trinn 1.8.
- Hard-bakervarer microfluidic-biosensor.
- Fjern all beskyttende foils på forsiden og baksiden DFR lag. Skjær i biosensors i strimler bruker en vanlig par saks. Kurere chips i en ovn ved 160 ° C i 3 h.
2. Analysen immobilisering prosedyren på prosessoren
- adsorpsjon av avidin i området immobilisering av kanalen.
- Forberede en 100 µg/mL avidin løsning i 10 mM fosfat-bufret saltvann (PBS) i en pH på 7,4.
- Dispensere 2 µL avidin løsningen på mengden av biosensor.
Merk: Kanalen er fylt av kapillære krefter til væsken når hydrofobe stoppe barrieren. - å sikre at den fluidic stopper på barrieren under hele inkubasjon tiden, dispensere 2 µL DI-vann på utløpet av chip. Inkuber chip ved 25 ° C i 1 time i en lukket beholder.
- Fjern overflødig reagenser gjennom mengden av chip ved å bruke et vakuum. Vask kanalen med 50 µL av vaskebuffer (PBS 0,05% mellom 20), utlevert på utløpet mens vakuum brukes. Tørr kanal for 30 s mens vakuum brukes.
- Blokkerer kanalen overflaten å hemme uspesifikke bindende.
- Forberede en 1% bovin serum albumin (BSA) løsning i 10 mM PBS på en pH på 7,4.
- Pipette 2 µL av 1% BSA løsningen på innløpet og 2 µL DI-vann på utløpet av kanalen. Inkuber chip ved 25 ° C i 1 time i en lukket beholder. Fjerne overflødig reagenser og tørr kanalen som beskrevet i trinn 2.1.4.
- DNA-inkubasjon oligos merket med biotin og 6-Jåblomfamilien
- Forberede ulike konsentrasjoner (0,001-5 µM) for DNA løsningen i 10 mM PBS på en pH på 7,4.
- Dispensere 2 µL av en konsentrasjon av DNA løsningen på innløpet og 2 µL DI-vann på utløpet. Inkuber chip ved 25 ° C i 15 min i en lukket beholder.
- Gjenta trinn 2.3.2 for de andre DNA konsentrasjonene bruker flere biosensor chips.
- Fjerne overflødig reagenser og tørr kanalen som beskrevet i trinn 2.1.4.
- Immobilisering av GOx-merket 6-FAM antistoffer.
- Formulere en 5 µg/mL konsentrasjonen av 6-FAM antistoffer i 10 mM PBS på en pH på 7,4.
- Presentere 2 µL av antistoff løsningen innløpet og 2 µL DI-vann til utløpet av kanalen. Inkuber merket antistoffer ved 25 ° C i 15 min i en lukket beholder. Fjern overflødig reagenser, som beskrevet i trinn 2.1.4.
3. Amperometric signalet oppdagelsen bruke Stop-flow teknikken
- tilberedning av underlaget for elektrokjemiske gjenkjenning.
- Formulere en 40 mM glukose løsning i 0.1 M PBS på en pH på 7.4 i ultra ren vann.
- For foreløpige behandlingen, forberede en 0.1 M PBS løsning på en pH på 7.4 i ultra ren vann.
- Foreløpig behandling av arbeider elektrodene.
- Bruker skreddersydd chip innehaveren for å tillate for enkel plassering av chip og fluidic og elektrisk tilkobling.
- Elektrisk tilkobling av biosensor til potentiostat. Sikre fluidic kontakt av mikrovæskekanalen en sprøytepumpe og reagens reservoaret skreddersydd kortet og rør. Start den bærbare datamaskinen som er koblet til potentiostat og start sprøyte pumpe kontrolleren, kontrollere fluidic flyten gjennom chip.
- Start sprøytepumpen manuelt med 0.1 M PBS på en flow rate på 20 µL/min. På arbeider elektroden versus på prosessoren referanse elektrode, bruke en vekslende spenning 0,8 og-0.05 V 5 s for 30 sykluser. Denne oksidere arbeider elektroden ved å bruke en spenning på 0,8 V 60 s.
- Analysen avlesning med stopp-flow teknikk.
- å starte analysen signal avlesning, vente til målt gjeldende signalet stabiliserer. Stoppe sprøytepumpen og bytte reagensen fra 0.1 M PBS 40 mM glukose løsningen og start programmet på sprøyten pumpe kontrolleren; det vil automatisk stoppe flyten for 1, 2 eller 5 min og startes deretter strømmen på igjen. Observere den resulterende gjeldende toppen.
Merk: For analyse av data, gjeldende toppen eller ansvaret for toppen kan betraktes, som beskrevet i modellen av en elektrokjemisk signal avlesning ( figur 2).
- å starte analysen signal avlesning, vente til målt gjeldende signalet stabiliserer. Stoppe sprøytepumpen og bytte reagensen fra 0.1 M PBS 40 mM glukose løsningen og start programmet på sprøyten pumpe kontrolleren; det vil automatisk stoppe flyten for 1, 2 eller 5 min og startes deretter strømmen på igjen. Observere den resulterende gjeldende toppen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Design og fabrikasjon av Microfluidic Biosensor plattform:
Fabrikasjon av microfluidic biosensor chips er realisert på wafer-nivå av standard photolithographic teknikk ansette flere DFR lag. Denne fabrikasjon strategien er avhengig av laminering utviklet lag av DFRs på en platinum-mønstret PI substratet microfluidic kanalene. Sammendrag viser forskjellige fabrikasjon trinnene er gitt i figur 1. En enkelt 6 - i-wafer består av 130 microfluidic biosensors, hver med en dimensjon av 8 × 10 mm2.
Figur 1. Grafisk illustrasjon av ulike fabrikasjon trinnene av microfluidic biosensor plattformen. a) kuttet PI underlaget i 6 - i runde wafere. b) eksponering av en mulig spinn-belagt lift-off motstå med respektive masken for platinum mønstre. c) substrat etter eksponering, post-eksponering ryggen og utvikling av photoresist. d) fysisk vanndamp deponering av platina på underlaget. e) lift-off prosessen å fjerne overflødig photoresist. f) spin-belegg SU-8, danner en isolasjon lag. g) O2 plasma prosess å fjerne SU-8 rester på Pt elektrodene. h) galvanic deponering av Ag/AgCl referanse elektroden. i) UV eksponering og utvikling av ulike DFR lag. j) laminering av DFR lag på PI kjeks. k) Dispensing løst polytetrafluoroethylene, danner en hydrofobe stoppe barriere mellom immobilisering kapillære og elektrokjemiske cellen. l) final elektrokjemisk microfluidic biosensor. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Hver biosensor består av en mikrovæskekanalen, delt inn i to forskjellige områder av en hydrofobe stoppe barriere: en immobilisering del og en elektrokjemiske cellen, merket i rødt og blått, henholdsvis i figur 2. Den immobilisering del av microchannel har en overflate volum av 10.34 mm2 og en mengde 580 nL, som resulterer i volum høy overflate-til forholdet mellom 155 cm-1. Den elektrokjemiske cellen inneholder en på prosessoren sølv/sølv klorid referanse elektrode og en teller og arbeide platinum elektroden. Dette innholdsskillet immobilisering området og den elektrokjemiske avlesning av analysen hindrer enhver kontaminering av elektrodene med biomolecules og dermed hindre elektrode begroing. Videre kan presise målingen av reagensene immobilisering av kapillær fylling.
Figur 2. Illustrasjon av operatørselskapene prinsippet om elektrokjemiske microfluidic plattformen. a) skjematisk av en modell analysen basert på avidin. b) bilde av microfluidic biosensor viser sine viktigste elementer, inkludert counter elektroden (CE), referanse elektroden (RE), arbeider elektroden (vi) og stoppe barrieren (SB). Immobilisering området er uthevet i rødt, og den elektrokjemiske cellen er merket i blått. c) skjematisk reaksjon av oksidasjon av produsert hydrogenperoksid på Pt arbeider elektroden for amperometric gjenkjenning i elektrokjemiske cellen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ved å bruke DFRs til fabrikasjon av sensoren, gir produksjonsprosessen høy gjennomstrømming på wafer-nivå. Kostnadene kan derfor holdes til et minimum. Utviklingen av alle DFR lag er gjort ved hjelp av enkle og rimelige folie masker og en vakuum eksponering, snarere enn kostbar krom masker og en maske aligner. I tillegg kutt reduksjon av de nødvendige rent-rom prosesstrinn til et minimum kostnadene for fabrikasjon enda mer. Totalt tar fabrikasjon prosedyren en arbeidsmengden omtrent 10 h, unntatt den bakervarer tid og fysisk vanndamp avsetning av platina.
On-chip analysen inkubasjon:
Den på prosessoren analyse inkubering gjøres bare ved kapillære krefter. Av pipettering dråper forskjellige reagenser på mengden av mikrovæskekanalen drives væsker gjennom kanalen av capillarity handlingen til de når hydrofobe stoppe barrieren. Under stabil forhold, er reagenser deretter ruges i forskjellige tid. Passiv systemet kan kapillær fylling av kanalen, uten behovet av alle eksterne instrumentering som en sprøytepumpe, og gir presise målingen av reagensene, som væske automatisk stopper på stoppe barrieren. Også arbeidsflyten er forenlig med det av en konvensjonell ELISA og fungerer med høy viskositet væsker som serum- eller blodprøver.
For dette eksperimentet, er chip operasjonen demonstrert ved en enkel test analysen ansette avidin-biotin samhandling, som vist i figur 2. Den på prosessoren analyse inkubasjon starter med opptak av avidin på kapillære overflaten 1t, etterfulgt av en blokkerende skritt med BSA for en annen 1t. Deretter er 6-FAM/biotin-merket DNA ruges i immobilisering kapillær i 15 min, der det binder seg til den avidin molekyler. Mellom hvert inkubasjon trinn fjernes alle ubundet biomolecules steg en vask. Vaske bufferen brukes via kanalen utgangen bruker en skreddersydd vakuum adapter. I det siste trinnet, blir glukose oksidase-merket antifluorescein antistoffer introdusert til kanalen i 15 min. Etter at er biosensor klar for den elektrokjemiske avlesning, med en 40 mM glukose løsning som underlaget.
Amperometric signalet avlesning med Stop-flow teknikk:
For signal-avlesning av immobilisert analysen, kan enzymer produktet (her, H2O2), produsert i nærvær av sine underlaget, glukose, electrochemically oppdaget på arbeider elektroden i elektrokjemiske cellen. For å oppnå rask oppdagelsen med signalforsterkning, er såkalte stopp-flow teknikken brukt13. I denne metoden er flyten av underlaget stoppet, som fører til en oppbygging av produktet innsiden av kapillær. Mengden av produsert H2O2 derfor avhenger av mengden bundet gluko og er avhengig av mengden bundet biotinylated DNA. Ved å starte strømmen, tømmes senere forbedret H2O2 konsentrasjonen gjennom elektrokjemiske måling cellen, noe som resulterer i en gjeldende topp signal, som vist i Figur 3.
For data-analyse, stoppe flyten teknikken tilbyr to forskjellige parametere: maksimumshøyden og pris (dvs. integralet) av topp signalet. Begge parameterne er direkte proporsjonal med stoppe tidenog kan derfor brukes til å analysere dataene. Vurderer data evalueringen, ved topp høyden, signalet høyden avhenger av maks H2O2 . og dermed sin diffusjon koeffisient og anvendt stopptid. Jo lenger stoppe tiden, jo høyere målt signal svaret. Derfor forblir gauged peak høyden konstant, ned Minimumslengden på immobilisering kapillær. Denne spesielle funksjonen av stopp-flow teknikken gir en drastisk reduksjon i chip dimensjoner, spesielt i kapillær lengden, stund preserving følsomheten til sensoren.
Figur 3. Modell av en typisk innhentet elektrokjemiske signal avlesning av enzymet knyttet analysen ved hjelp av stopp-flow teknikk. a) en strøm av 40 mM glukose løsning med en hastighet på 20 µL/min ble brukt. I fasen for stopp (1, 2 og 5 min), enzym produksjon av H2O2 fortsetter. Ved å starte strømmen, tømmes akkumulert H2O2 gjennom elektrokjemiske cellen, der hydrogenperoksid electrochemically er oppdaget. Ved å gjenta målingen flere ganger (feilfelt; SEM), en på prosessoren kalibrering kurven b) er oppnådd. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen presenteres her til fabrikasjon av et microfluidic elektrokjemisk biosensor gjør at utviklingen av en rimelig, kompakt og lett-å-bruke plattform for gjenkjenning av biomolecules. Avhengig av analysen brukt etterpå på biosensor, kan flere forskjellige biomarkers oppdages. Dette gjør plattformen svært allsidig og gir bred tilgang til ulike felt av programmer, fra standard diagnostiske tester (f.eks bestemme tilstedeværelsen av spesifikke sykdommer på legekontoret) til point-of-care programmer (f.eks terapeutisk medikament overvåking av en pasient for individualisert medikamentell behandling). Spesielt i point-of-care diagnostics, miniatyriserte biosensors har mange fordeler fremfor konvensjonelle metoder, som vanligvis krever omfattende laboratorieutstyr, spesialiserte ansatte, og store reagens og prøve volumer og har lang behandlingstid ganger.
Fabrikasjon av denne biosensor krever strengt følge protokollen; ellers kan produksjon problemer oppstå. En av de mest ofte observert problemene er misalignment de forskjellige lagene. Dette kan enkelt løses ved å bruke en mer avansert apparater for fabrikasjon prosessen, som gir enklere og mer nøyaktig justering av de forskjellige lagene.
DFR-teknologi gir mulighet for rask og rimelig fabrikasjon. På den annen side, er teknologien begrenset i form av oppløsning. For eksempel kan microfluidic kanaler av svært små strukturer (mindre enn 100 µm) bli realisert ved hjelp av protokollen som presenteres her. I slike tilfeller må den klima og jordsmonn utføres av en høy presisjon maske aligner med glass photomasks. I tillegg kan en for hele kanal også være problematisk, siden kanalen kan bøye seg ned, redusere høyden på kanalen og påvirke microfluidic virkemåten til chip.
Vi tror at DFR teknologi vil være mer tilstede i framtidige applikasjoner fordi det kan enkelt skaleres for kommersiell bruk. Masse-produksjon av DFR-baserte microfluidic sensorer er ingen hindring når den treffer markedet fordi teknikken er godt etablert i andre felt av programmet (f.eks fleksibel elektronikk).
Når det gjelder å redusere kompleksiteten i hele systemet, vil fremtidige arbeidet fokusere på design og implementering av en engangs microfluidic-kassett som inneholder biosensor chip; en søppelbeholder; og forhåndslastede reagenser, som vaskebuffer og andre analysen komponenter. For amperometric måling, kan levering av prøven og andre deretter forsynt av pneumatiske aktivering. Dette utføres av håndholdte leseren vil flytte gjennom microfluidic biosensor chip til en søppelbeholder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke tysk Research Foundation (DFG) for delvis finansiering dette arbeidet under Grant tall UR 70/10-01 og UR 70/12-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Pyralux | DuPont | AP8525R | Used as polyimide substrate |
| MA-N 1420 | Micro Resist Technology | MA-N1420 | Lift-off resit to define the platinum depostion |
| Ma-D 533s | Micro Resist Technology | MaD533S | Developer for MA-N1420 |
| Platinum | - | - | Electrode and contact pad material |
| Ma-R 404s | Micro Resist Technology | MaR404S | Remover for MA-N1420 |
| SU-8 3005 | MicroChem Corp. | SU-8-3005 | Photoresist to define the electrode area and as insulation |
| 1-methoxy-2-propanol acetate | Sigma-Aldrich | 108-65-6 | Developer for SU-8 3005 |
| 2-Propanol | VWR | 8.18766.2500 | Removing of the SU-8 developer |
| 1020R | Ultron Systems Inc. | 1020R | UV sensitive adhesive tape for protection of contact pads |
| Arguna S | Degussa | 1935 | For Silver depostion on reference electrode |
| KCl | Methrom | 62308.020 | For chloridation of the silver reference electrode |
| Pyralux | DuPont | PC1025 | Dry film photoresist |
| Sodium carbonat | Fluka | 71352 | Developer for Pyralux PC1025 |
| Hydrogen chloride | Sigma-Aldrich | 30720 | To top the development of the DFR |
| Teflon AF 1600 | DuPont | AF1600 | For employing the stopping barrier |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PA104 | Mega Electronics | - | Bubble etch tank |
| FED 53 | Binder | 9010-0018 | Oven |
| SPIN150 | APT | - | Spin coater |
| Präzitherm | Harry Gestigkeit GmbH | PZ 28-2 | Hot plate |
| Hellas | Bungard Elektronik | 40000 | Exposure unit |
| Tetra30-LF-PC | Diener | - | Plasma unit |
| Univex 500 | Leybold | - | Physical vapor deposition unit |
| Shaker S4 | ELMI | - | Orbital shaker |
| Sonorex Super 10 P | Bandelin | 783 | Sonic bath |
| 6221 DC and AC | Keithley | - | Current source |
| HRL 350 | Ozatec | - | Laminator unit |
| Vaccum pen | EFD | - | Vacuum pen |
References
- Spindel, S., Sapsford, K. E. Evaluation of optical detection platforms for multiplexed detection of proteins and the need for point-of-care biosensors for clinical use. Sensors (Basel). 14 (12), 22313-22341 (2014).
- Luppa, P. B., Bietenbeck, A., Beaudoin, C., Giannetti, A. Clinically relevant analytical techniques, organizational concepts for application and future perspectives of point-of-care testing. Biotechnol Adv. 34 (3), 139-160 (2016).
- Gauglitz, G. Point-of-Care Platforms. Annu Rev Anal Chem. 7 (1), 297-315 (2014).
- Jung, W., Han, J., Choi, J. W., Ahn, C. H. Point-of-care testing (POCT) diagnostic systems using microfluidic lab-on-a-chip technologies. Microelectron Eng. 132, 46-57 (2014).
- Yager, P., et al. Microfluidic diagnostic technologies for global public health. Nature. 442 (7101), 412-418 (2006).
- Fu, E., Yager, P., Floriano, P. N., Christodoulides, N., McDevitt, J. T. Perspective on diagnostics for global health. IEEE Pulse. 2 (6), 40-50 (2011).
- Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. Point-of-care diagnostics for global health. Ann Rev Biomed Eng. 10, 107-144 (2008).
- Dincer, C., Bruch, R., Kling, A., Dittrich, P. S., Urban, G. A. Multiplexed point-of-care testing - xPOCT. Trends Biotechnol. 35, (2017).
- Horak, J., Dincer, C., Bakirci, H., Urban, G. A disposable dry film photoresist-based microcapillary immunosensor chip for rapid detection of Epstein-Barr virus infection. Sens Actuators B Chem. 191, 813-820 (2014).
- Method for the fabrication of a "lab on chip" from photoresist material for medical diagnostic applications. US patent. Jobst, G., Gamp, T. , 7,691,623 (2010).
- Kling, A., Dincer, C., Armbrecht, L., Horak, J., Kieninger, J., Urban, G. Electrochemical microfluidic platform for simultaneous multi-analyte detection. Procedia Eng. 120, 916-919 (2015).
- Armbrecht, L., Dincer, C., Kling, A., Horak, J., Kieninger, J., Urban, G. Self-assembled magnetic bead chains for sensitivity enhancement of microfluidic electrochemical biosensor platforms. Lab Chip. 15, 4314-4321 (2015).
- Dincer, C., et al. Designed miniaturization of microfluidic biosensor platforms using the stop-flow technique. Analyst. 141, 6073-6079 (2016).
- Weltin, A., Kieninger, J., Enderle, B., Gellner, A. K., Fritsch, B., Urban, G. A. Polymer-based, flexible glutamate and lactate microsensors for in vivo applications. Biosens Bioelectron. 61, 192-199 (2014).
- Kling, A., et al. Multianalyte Antibiotic Detection on an Electrochemical Microfluidic Platform. Anal Chem. 88 (20), 10036-10043 (2016).
- Bruch, R., et al. Clinical on-site monitoring of ß-lactam antibiotics for a personalized antibiotherapy. Sci Rep. , (2017).
- Horak, J., Dincer, C., Qelibari, E., Bakirci, H., Urban, G. Polymer-modified microfluidic immunochip for enhanced electrochemical detection of troponin i. Sens Actuators B Chem. 209, 478-485 (2015).
- Horak, J., Dincer, C., Bakirci, H., Urban, G. Sensitive, rapid and quantitative detection of substance P in serum samples using an integrated microfluidic immunochip. Biosens Bioelectron. 58, 186-192 (2014).
- Mattox, D. M. Handbook of Physical Vapor Deposition (PVD) Processing. , Elsevier Inc. (2010).
