Summary
Dit werk presenteert een nieuw verwerkings- en beeldprotocol voor dikke, driedimensionale weefsel doorsnede analyse die de volledige exploitatie van confocale beeldvormingsmodaliteiten mogelijk maakt. Dit protocol behoudt de antigeniciteit en vertegenwoordigt een robuust systeem om huidhistologie en mogelijk andere weefstypen te analyseren.
Abstract
Het verwerken van een weefsel van belang om een microscopisch beeld te genereren dat een wetenschappelijk argument ondersteunt, kan uitdagend zijn. De aanschaf van microscopische beelden van hoge kwaliteit is niet volledig afhankelijk van de kwaliteit van de microscoop, maar ook op de weefselsverwerking, die vaak meerdere kritische acties of stappen omvat. Bovendien vormen mesenchymale celsoorten in de huid en andere weefsels een nieuwe uitdaging voor weefselbereiding en beeldvorming. Hier presenteren we een compleet proces, van weefsel oogst naar microscopie. Onze techniek, genaamd "horizontale gehele berg", is een die beginners snel kunnen begrijpen en die het mogelijk maakt om antigeen te behouden en te detecteren in 60-300 μm dikke delen die met een cryostat worden gesneden. Afdelingen van deze dikte zorgen voor een verbeterde visualisatie van weefselmicroarchitectuur in een driedimensionale omgeving. Daarnaast behoudt het protocol mesenchymale cellen op een manier die de beeldkwaliteit verhoogt wanneerVergeleken met standaard cryostat of paraffine secties, waardoor de werkzaamheid en betrouwbaarheid van immunostaining verhoogd worden. Wij geloven dat dit protocol alle laboratoria die de huid visualiseren, en eventueel andere weefsels en organen zullen kunnen profiteren.
Introduction
De omwenteling van microscopische beeldapparatuur zorgt voor geavanceerde beeldvormingsinstrumenten met hoge resolutie. Bij het verwerven van een microscopische afbeelding van een complete driedimensionale (3D) weefsel dwarsdoorsnede, levert het voorbereiden van een monster aanzienlijke uitdagingen op en kan de beperkende factor zijn bij de bepaling van de beeldkwaliteit. Elke afzonderlijke stap verdient een zorgvuldige overweging om de weefselmorfologie en de antigeniciteit van doelwit proteïnen te behouden, om verwerkingsgeïnduceerde artefacten te minimaliseren en de uiteindelijke beeldkwaliteit te maximaliseren. Bijvoorbeeld, de traditionele analyse van de huid vereist een beeld met het oog op de epidermis en dermis, met haarfollikels die goed zijn georiënteerd, waardoor de anatomische analyse van stamcellencompartimenten aan de homeostase 1 , 2 van de huid mogelijk is . Dit vereist een grondige concentratie op hoe de huid ingebed en gesneden is. Het is belangrijk dat haarfollikels dikker zijnDan 100 μm, die de standaard paraffine of bevroren sectie dikte aanzienlijk overschrijdt, wat resulteert in een lagere standaard van analyse ten opzichte van gehele montages of dikke dwarsdoorsneden 3 , 4 , 5 .
Samengevat is elke stap van het voorbereiden van het monster voor microscopische analyse een kritische determinant die beeldanalyse zal beïnvloeden. Hier wordt een nieuw verwerkingsprotocol voor dikke 3D-weefsel-doorsnede-analyse, die we "horizontale gehele berg" noemen, gepresenteerd. Het protocol behoudt de antigeniciteit sterk en maakt het mogelijk om dikke delen van de huid optimaal te gebruiken door gebruik te maken van standaard confocal beeldvormende apparatuur. Dit is een complete gids voor het gebruik van de huid voor het verwerken en imaging van weefsel dwarsdoorsnede, inclusief weefseloogst en paraformaldehyde (PFA) -assistente cryopreservering (stap 1), de generatie van 100 μm dikke weefsel dwarsdoorsneden met een cryostat (stap 2), En immunofluorescente etikettering en montage (stappen 3 en 4). De representatieve resultaten vergelijken confocale beelden van twee verschillende histologische voorbereidingstechnieken-klassieke cryosectie en dikke 3D-weefsel dwarsdoorsneden-de voordelen van "horizontale gehele mounts" voor de potentiële gebruiker van dit protocol te benadrukken.
Protocol
Alle dierproeven werden onderworpen aan lokale ethische goedkeuring en uitgevoerd onder de voorwaarden van een Britse regeringskantoor.
1. Skin Harvest en Cryopreservation
- Voorbereidende werkzaamheden.
- Bereid één 100 mm kweekschotel met 25 ml 4% PFA en twee 100 mm kweekgerechten met 25 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Vul rechthoekige afscheidende cryomolds met tweederde met optimale snijtemperatuurverbinding (OCT).
- Plaats een metalen plaat waarop de cryoblocks in een latere stap kunnen worden geplaatst in de -80 ° C vriezer.
- Huid oogsten, fixatie en cryopreservering.
- Knip het dorsale gebied van de dierencadaver met een droge elektrische scheerapparaat.
OPMERKING: In dit voorbeeld werden postnatale dag 21 wildtype muizen gebruikt. - Oog de gebieden van belang op de huid op.
OPMERKING: Het dorsomediale gebied van de muishuid (- Trim de geoogste huid in rechthoekige stukken van passende grootte om in de bodem van de cryomold te passen, waarbij rekening wordt gehouden met de richtinggroei van de haarfollikelkoren.
OPMERKING: Kleiner huidschijven kunnen makkelijker zijn voor beginners, aangezien ze minder waarschijnlijk zijn tijdens het incubatie- en montageproces. Het hier getoonde voorbeeld is een gebied van 1 cm 2 dorsale huid, die past in een 22 x 30 x 20 mm cryomold ( figuur 2a ).- Bevestig de huid bij kamertemperatuur in 25 ml 4% PFA gedurende 10-30 minuten, afhankelijk van de dikte van de huidmonsters ( Figuur 1b ).
- Was de huidmonsters twee keer in 25 ml PBSVoor tenminste 5 minuten elk ( figuur 1b ).
- Druppel de huidmonsters op een papieren handdoek om het weefsel van overtollig PBS zorgvuldig af te voeren, wat kan resulteren in kristallisatie tijdens het vriesproces en kan de cryosectie resultaten beïnvloeden.
OPMERKING: een standaard sucrose gradiënt is niet nodig. Dit kan echter ook in het protocol worden opgenomen in de discretie van de gebruiker.- Wees bewust van de oriëntatie van de haarfollikels voor elk huidmonster. Gebruik een dissectiemicroscoop voor visuele bijstand (vooral iemand die het protocol voor het eerst uitvoert). Steek het huidmonster in de OCT-gevulde cryomold en evenwicht alle gebieden van de huid met OCT door luchtbellen aan de bovenkant van het geknipt haar te verwijderen door middel van tang ( figuren 2a en 2b ).
- Duw de huid naar de bodem van het OCT gevulde blok, zodat het in de bodem ligt.
OPMERKING: De huid kan in elke richting worden georiënteerd, aS lang als de korrel van de haarfollikel wordt genoteerd voor de juiste snijprocedures. De cryomolds worden opnieuw georiënteerd wanneer de blokken aan de cryostat worden gekoppeld voor cryosectie. Merk de hair follicle oriëntatie op de cryomold, aangezien deze stap de latere oriëntatie van de cryostat snede bepaalt.- Breng de cryoblocks op de metalen plaat in de -80 ° C vriezer om zwevend en ontwrichting van het weefsel te vermijden.
- Bewaar het vriesproces om de oriëntatie van de huid onder de cryomold te behouden, aangezien onzichtbare luchtbellen de huid tot het oppervlak van de cryomold kunnen opkomen.
OPMERKING: Cryomolds met bevroren weefsel kunnen langer dan een jaar bij -80 ° C worden opgeslagen en kunnen worden hergebruikt voor extra afdelingen. - Trim de geoogste huid in rechthoekige stukken van passende grootte om in de bodem van de cryomold te passen, waarbij rekening wordt gehouden met de richtinggroei van de haarfollikelkoren.
- Knip het dorsale gebied van de dierencadaver met een droge elektrische scheerapparaat.
Figuur 1. Oogst en fixatie van de muishuid. (A) Huidweefsel werd geoogst uit de dorsomediale gebied van het dier kadaver. Haarfollikels in deze regio zijn evenwijdig geplaatst en uitgelijnd en zorgen dus voor een optimale oriëntatie tijdens het snijden, zoals aangegeven door de pijlen. ( B ) Na het knippen van vierkanten van een passende grootte die in de cryomold past, werd het huidweefsel gedurende 15 minuten in 4% PFA gefixeerd en gedurende 5 minuten twee keer in PBS gewassen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Dikte Weefsel Doorsnede
- Voorbereiding en weefsel oriëntatie om op de cryostat te monteren.
- Bereid een 100 mm kweekschotel met 15 ml PBS. Plaats het op een gemakkelijk toegankelijke plaats op de cryostat. Voer daarnaast een 12-putjesplaat op met 2,5 ml PBS per putje; Label volgens de monsters voor de lange termijn opslag van de zeeCtions bij 4 ° C. Gebruik pincet om de secties te behandelen.
- Stel de temperatuur van de cryostat in op -20 ° C.
OPMERKING: de temperatuur kan de doorsnede beïnvloeden, maar een goede gids moet beginnen bij -20 ° C. - Om afdelingen ongeveer twee haarfollikels dik te maken, pas de cryostaat aan om 150 μm dik te snijden.
OPMERKING: De dikte van de sectie kan worden gevarieerd, afhankelijk van de behoeften van de gebruiker en de beperkingen van de microscoop die gebruikt wordt voor analyse.
OPMERKING: De oriëntatie van het monster is van cruciaal belang voor het verkrijgen van huiddelen met haarfollikels in de juiste oriëntatie. Dit wordt bereikt door goed op het cryostatblok te monteren. Zorg ervoor dat het deelvlak parallel is met de haarfollikelrichting ( Figuur 2c ). Zoals eerder vermeld, is de juiste oriëntatie van het snijvlak in het huidmonster een cruciale stap om de kwaliteit van de afbeeldingen te bepalen die worden verworven inEen latere stap.
Figuur 2. Inbedding, cryopreservering en sectie.
(A) Het markeren van de haarfollikelrichting (HF) op de cryomold, aangegeven door de zwarte pijlen, is belangrijk voor een goede oriëntatie tijdens cryosectie. ( B ) Het deelvlak moet worden afgestemd op de haarfollikeloriëntatie om secties te genereren waarin de volledige lengte van de haarfollikels intact blijft. ( C ) Afdelingen werden gesneden per de hair follicle orientatie die door de zwarte pijlen op de cryomold. ( D ) De dikke weefsel dwarsdoorsneden werden verzameld met metalen tang en ( e ) overgebracht in een 100 mm kweekschotel die 1x PBS bevatte. ( F ) Bij kamertemperatuur lost de PBS de OC weg.T. Verbinding die de dikke weefsel dwarsdoorsneden omringt, zoals aangegeven door de witte pijlen. De secties drijven dan vrij in de PBS. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Cryosectioning.
- Snijd een sectie met behulp van de cryostat. Gebruik pincet om de OCT te verzamelen die het ingebedde stukje huid bevat ( Figuur 2d ).
OPMERKING: gebruik een cryostaat die de onafhankelijke beweging en aanpassing mogelijk maakt langs de axes X, Y en Z voor een optimale positionering van het monster. Dit zorgt voor het genereren van ideaal uitgelijste weefsel dwarsdoorsneden. - Breng het gedeelte uit de cryostaat over in de 100 mm kweekschaal, gevuld met PBS, en ga verder met de volgende plak. Verzamel de monsters niet op een dia ( Figuur 2e ).
OPMERKING: bij kamertemperatuur zal de PBS oplossenDe OCT, waardoor de plakken die makkelijk te hanteren zijn met handvaten ( figuur 2f ) verlaten.
OPMERKING: Verse PBS kan nodig zijn in de 100 mm kweekschotel na het oplossen van veel weefselsecties 100 μm dik en kunnen dienovereenkomstig worden gewijzigd. - Gebruik pincet om de drijvende huidafdelingen over te brengen naar de goed gemarkeerde put in een 12-vel plaat gevuld met 2,5 ml PBS ( Figuur 3a , links).
OPMERKING: bij 4 ° C kunnen de monsters gedurende minstens twee dagen worden opgeslagen. Voor de langdurige opslag van OCT-blokken na het snijden van de huid, sluit het snijvlak met een druppel verse OCT. Na het vriezen van de OCT-druppel, draai het gebruikte OCT-blok in parafilm en plaats deze terug in de -80 ° C diepvriezer .
- Snijd een sectie met behulp van de cryostat. Gebruik pincet om de OCT te verzamelen die het ingebedde stukje huid bevat ( Figuur 2d ).
3. Immunofluorescente etikettering.
- Bereid de PB buffer (PBS aangevuld met 0,5% schuimmelkpoeder, 0,25% vishuidgelatine en 0,5% Triton X-100) bij leasT 2 uur van tevoren, zoals eerder beschreven 5 .
OPMERKING: Natriumazide kan worden toegevoegd aan PB buffer voor het behoud van antilichamen voor het herhaalde gebruik van de kleurbuffer. - Meng 1,5 ml microcentrifugebuizen en voeg 500 μL PB buffer per buis toe. Gebruik pincet zorgvuldig om de huidplakken van de PBS in aparte buizen over te brengen die de PB-buffer bevatten om te blokkeren ( Figuur 3a , rechts). Zorg ervoor dat alle huidplakken volledig ondergedompeld zijn. Plaats de microcentrifugebuizen op een zaagzaagrooster bij snelheden van niet meer dan 10 oscillaties per minuut, die de weefselintegriteit niet moeten verstoren gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat de snelheid niet meer dan 10 oscillaties per minuut overschrijdt op de zaagknijper, aangezien het in beweging komt.- Terwijl het mogelijk is om meer dan een snij per microcentrifugebuis toe te voegen, om antilichamen op te slaan, plaatst u slechts een snij per buis. Gebruik een volume om het antilichaamgebruik te verminderenVan 250 μl.
OPMERKING: vervang eventueel microcentrifugebuizen met bijvoorbeeld 96-putjesplaten. Echter, de plaatsing van de dikke weefsel dwarsdoorsneden in 1,5 ml microcentrifuge buizen zorgt voor de meest effectieve antilichaam penetratie in het weefsel als gevolg van de verhoogde vloeistof verstoring.
- Terwijl het mogelijk is om meer dan een snij per microcentrifugebuis toe te voegen, om antilichamen op te slaan, plaatst u slechts een snij per buis. Gebruik een volume om het antilichaamgebruik te verminderenVan 250 μl.
- Label aparte 1,5 ml microcentrifugebuizen voor elke huidschijf en voeg 500 μl PB buffer en de geschikte hoeveelheid primaire antilichaam toe. Na 1 uur blokkeren, verplaats de huidplakken in de vers bereide buizen die de antilichamen bevatten. Incubeer de plakjes bij 4 ° C overnacht.
OPMERKING: In dit voorbeeld werden de volgende primaire antilichamen gebruikt: FITC rat anti-menselijke CD49f bij een concentratie van 1:50 en geit anti-muis / rat integrin alpha 8 bij een concentratie van 1: 100. - De volgende dag bereiden twee afzonderlijke 1,5 ml microcentrifugebuizen die 500 μl PBS per monster bevatten. Was de snijplakken twee keer gedurende 1 uur bij kamertemperatuure.
- Bereid aparte 1,5 ml microcentrifugebuizen die 500 μl PB buffer bevatten met de juiste concentratie van toepasselijke secundaire antilichamen en 4 ', 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI).
OPMERKING: De secundaire antilichamen die in dit voorbeeld worden gebruikt zijn Alexa Fluor 488 ezel anti-rat IgG en Alexa Fluor 555 ezel anti-geiten IgG in een concentratie van 1: 500. DAPI werd gebruikt bij een concentratie van 1: 100. - Verzorg de huidmonsters zorgvuldig in de PB buffer, die het secundaire antilichaam en DAPI bevat, en incubeer de huidschijven bij kamertemperatuur gedurende 1 uur bij een lage snelheid op een rotator of shaker.
- Bewaar de plakjes bij 4 ° C in de PB buffer die het secundaire antilichaam en DAPI bevat gedurende maximaal vier dagen, en mogelijk langer als natriumazide aan de PBS wordt toegevoegd.
4. Montage voor microscopische visualisatie 
Figuur 3. ImmunofluorescEtikettering en montage.
(A) De drijvende weefsel doorsneden kunnen worden opgeslagen in 12-putsplaten gedurende ten minste twee dagen bij 4 ° C. Voordat immunofluorescerende (IF) etikettering de overige delen van het weefsel overbrengen in 1,5 ml microcentrifugebuizen die PB buffer bevatten om te blokkeren, zoals aangegeven door pijl 1. Voor IF-etikettering, houden u aan bij de multi-step procedure die in stap 3 is uitgewerkt. Onderdeel van stap 3 vereist de zorgvuldige overdracht van de weefsel dwarsdoorsneden in vers bereide microcentrifugebuizen die primaire antilichaamoplossing, secundaire antilichaamoplossing of wasbuffer bevatten, die door pijl 2 wordt aangegeven. ( B ) na de IF-etikettering, Secties worden ontrafeld en platgedraaid in een druppel glycerol, met behulp van de hulp van een dissectiemicroscoop. ( C ) Zodra het weefsel dwarsdoorsnede volledig op de bodem van een deklaag is afgemaakt, wordt er een regelmatige microscoopschuif gebruikt om het gedeelte te monteren.
OPMERKING: als de schijf in de gly drijftCerol druppel, kan het untangled worden door de natuurlijke geneigdheid van het weefsel te coaxeren om terug te keren naar zijn normale vorm. Doe niet de onnatuurlijke rechthoek van de plak, want dit kan schade aan het weefsel veroorzaken.
OPMERKING: Vermijd luchtbevestiging ( Figuur 3c ).
OPMERKING: Langdurige opslag heeft een weerslag op de weefsel- en beeldkwaliteit. In dit voorbeeld werden alle beelden verkregen met een oprechte confocale microscoop met een 20x doelstelling.
Representative Results
Om de voordelen van onze techniek te benadrukken hebben we onze dikke 3D-weefsel doorsnedechniek, "horizontale gehele berg", vergeleken met klassieke bevroren delen. Klassieke bevroren delen werden gesneden zoals eerder beschreven 5 . Om een visuele structuur voor de epidermis in te microscopische beelden te geven, immunostainen we voor integrin alpha-6 (Itga6), dat een component is die epidermale cellen verankert naar het onderliggende keldermembraan 6 . We hebben ook de arrector pili spier (APM) genoemd, die verantwoordelijk is voor piloerectie (ook bekend als "goosebumps"), met integrin alpha-8 7 . In de klassieke bevroren secties werden de meeste haarfollikels die met Itga6 werden zichtbaar niet doorsneden over de gehele lengte, waardoor overwegend onvolledige haarfollikels per sectie werden genereerd in vergelijking met horizontale gehele mounts ( Figuur 4a -4d Figuur 4a -4d ). Daarnaast wordt de weefselintegriteit van het hypodermale compartiment bewaard in horizontale gehele mounts, in vergelijking met de vernietiging van adipocyten wanneer cryosecties zijn gehecht aan glazen glijbanen, die een bekend bevriezing ontdooft artefact is ( Figuur 4a- b , vergelijk hypodermale Regio's) 8 .
Figuur 4. Horizontale gehele mouNt vergeleken met een klassieke cryosectie.
(A) Klassiek verkregen huid vriescoupes 10 urn dik en (b) 100 urn dikke 3D weefsel doorsneden werden gemerkt met integrine alfa-6 (Itga6) en integrine alfa-8 (Itga8) te visualiseren de epidermale compartiment en arrector pili spieren , Respectievelijk. De afbeeldingen van de dikke weefsel dwarsdoorsneden worden weergegeven als maximale projecties van een grote Z-stack. De witte frames geven aan op de gebieden die worden vergroot, weergegeven in ( c ) de klassieke en ( d ) horizontale gehele bergafdelingen. ( E ) Intacte haarfollikels en ( f ) intacte arrector-pili-spieren werden gekwantificeerd in zowel de klassieke als de horizontale gehele secties. Schaalstaven geven 100 μm aan. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaardfout van de gemiddelde (SEM). Een sectie per biologisch replicaat ( n = 3) werd gekwantificeerd. Unpaired t-test * P <0,05, *** P <0,0005. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Disclosures
De auteurs zouden willen onthullen dat de publicatie van dit manuscript werd gefinancierd door Thermo-Fisher Scientific Inc.
Acknowledgments
De auteurs erkennen sponsoring van Thermo-Fisher Scientific en bedanken het Nikon Imaging Center bij Kings College London voor ondersteuning tijdens confocal image acquisition.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | homemade | ||
| Gelatin, from cold water fish skin | Sigma | G7765 | 250ML |
| Glycerol | BDH Laboratory Supplies | 444482V | |
| O.C.T. compound | VWR chemicals | 361603E | |
| Peel-A-Way embedding molds | Sigma | E6032-1CS | Square S-22 |
| Non-Fat Powdered Milk | Bio Basic Inc. | NB0669 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | 500ML |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | |
| FITC Rat Anti-Human CD49f | BD Pharmingen | 555735 | |
| Mouse/Rat Integrin alpha 8 Antibody | R&D Systems | AF4076 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG | Life Technologies | A21208 | |
| Alexa Fluor 555 donkey anti-goat IgG | Life Technologies | A21432 | |
| CryoStar NX70 | Thermo Fisher Scientific | ||
| 100mm Culture dishes | |||
| Disposable scalpels | Swann-Morton | Ref 0501 | |
| pointed metal forceps | |||
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR | 211-2130 | |
| 12 Well plates | Sigma | CLS3513 | |
| Dissecting microscope | Nikon | ||
| 20 ul and 1000 ul Pipette | Gilson | ||
| 1000µl XL Graduated TipOne Filter Tip (Sterile) | Star Lab | S1122-1830 | |
| 20µl Bevelled TipOne Filter Tip (Sterile) | Star Lab | S1120-1810 | |
| Rocking shaker plate | |||
| Microscope slides, menzel Glaeser | Thermos Scientific | 631-9483 | Superfrost Plus |
| Cover Glasses, Menzel Glaeser | Thermos Scientific | MENZBB024060AB | 24 x 60 mm |
| Confocal microscope | Nikon |
References
- Plikus, M. V., et al. Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration. Nature. 451 (7176), 340-344 (2008).
- Zhang, Y. V., Cheong, J., Ciapurin, N., McDermitt, D. J., Tumbar, T. Distinct self-renewal and differentiation phases in the niche of infrequently dividing hair follicle stem cells. Cell Stem Cell. 5 (3), 267-278 (2009).
- Jensen, U. B., Lowell, S., Watt, F. M. The spatial relationship between stem cells and their progeny in the basal layer of human epidermis: a new view based on whole-mount labelling and lineage analysis. Development. 126 (11), 2409-2418 (1999).
- Braun, K. M., et al. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Driskell, R. R., Giangreco, A., Jensen, K. B., Mulder, K. W., Watt, F. M. Sox2-positive dermal papilla cells specify hair follicle type in mammalian epidermis. Development. 136 (16), 2815-2823 (2009).
- Niculescu, C., et al. Conditional ablation of integrin alpha-6 in mouse epidermis leads to skin fragility and inflammation. Eur J Cell Biol. 90 (2-3), 270-277 (2011).
- Fujiwara, H., et al. The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche. Cell. 144 (4), 577-589 (2011).
- Desciak, E. B., Maloney, M. E. Artifacts in frozen section preparation. Dermatol Surg. 26 (5), 500-504 (2000).
- Driskell, R., Jahoda, C. A., Chuong, C. M., Watt, F., Horsley, V. Defining dermal adipose tissue. Exp Dermatol. 23 (9), 629-631 (2014).
- Driskell, R. R., et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).
- Snippert, H. J., Schepers, A. G., Delconte, G., Siersema, P. D., Clevers, H. Slide preparation for single-cell-resolution imaging of fluorescent proteins in their three-dimensional near-native environment. Nat Protoc. 6 (8), 1221-1228 (2011).
- Sada, A., et al. Defining the cellular lineage hierarchy in the interfollicular epidermis of adult skin. Nat Cell Biol. 18 (6), 619-631 (2016).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Tetteh, P. W., et al. Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters. Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).
