यह काम मोम, तीन आयामी ऊतक क्रॉस-सेक्शन विश्लेषण के लिए एक उपन्यास प्रसंस्करण और इमेजिंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो कन्फोकल इमेजिंग रूपरेखाओं का पूरा शोषण करने में सक्षम होता है। यह प्रोटोकॉल प्रतिजन को सुरक्षित रखता है और त्वचा की ऊतक विज्ञान और संभावित अन्य ऊतक प्रकारों का विश्लेषण करने के लिए एक मजबूत प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है।
एक सूक्ष्म चित्र उत्पन्न करने के लिए ब्याज की एक ऊतक संसाधित करना जो वैज्ञानिक तर्क को समर्थन देता है, चुनौतीपूर्ण हो सकता है। उच्च गुणवत्ता वाले सूक्ष्म चित्रों का अधिग्रहण पूरी तरह से माइक्रोस्कोप की गुणवत्ता पर निर्भर नहीं है, बल्कि ऊतक प्रसंस्करण के तरीकों पर भी होता है, जिसमें अक्सर कई महत्वपूर्ण कार्य या कदम शामिल होते हैं। इसके अलावा, त्वचा और अन्य ऊतकों में mesenchymal सेल प्रकार ऊतक की तैयारी और इमेजिंग के लिए एक नई चुनौती का प्रतिनिधित्व करते हैं। यहां, हम ऊतक फसल से माइक्रोस्कोपी तक पूरी प्रक्रिया पेश करते हैं। हमारी तकनीक, जिसे "क्षैतिज पूरे माउंट" कहा जाता है, एक है कि नौसिखिया जल्दी से कुशल हो सकते हैं और जो क्रिस्टोस्ट के साथ 60-300 माइक्रोन-मोटे वर्गों में प्रतिजन संरक्षण और पता लगाने के लिए अनुमति देता है। इस मोटाई के अनुभागों को तीन आयामी परिवेश में ऊतक माइक्रोआर्किटेक्चर के विस्तारित दृश्य प्रदान किया गया है। इसके अलावा, प्रोटोकॉल मेसेनकाइमल कोशिकाओं को ऐसे तरीके से सुरक्षित रखता है जो छवि गुणवत्ता बढ़ाता है जबमानक क्रिस्टेट या पैराफिन वर्गों की तुलना में, जिससे इम्यूनोस्टेन्सी की प्रभावकारीता और विश्वसनीयता बढ़ती जा रही है। हम मानते हैं कि इस प्रोटोकॉल ने सभी प्रयोगशालाओं को लाभ दिलाया है जो त्वचा को कल्पना करते हैं, और संभवत: अन्य ऊतकों और अंगों।
सूक्ष्म इमेजिंग उपकरणों की क्रांति परिष्कृत, उच्च संकल्प इमेजिंग उपकरणों के लिए प्रदान करता है। हालांकि, जब एक पूर्ण तीन-आयामी (3 डी) ऊतक क्रॉस-सेक्शन की सूक्ष्म छवि प्राप्त होती है, नमूना तैयार करने में काफी चुनौतियां होती हैं और छवि गुणवत्ता को परिभाषित करने में सीमित कारक हो सकता है। प्रसंस्करण प्रेरित कलाकृतियों को कम करने और अंतिम छवि गुणवत्ता को अधिकतम करने के लिए प्रत्येक अलग कदम को टिशू आकारिकी और लक्ष्य प्रोटीनों की प्रतिजनता को संरक्षित करने के लिए सावधानीपूर्वक विचार करना चाहिए। उदाहरण के लिए, त्वचा के पारंपरिक विश्लेषण के लिए त्वचा होमोस्टेसिस 1 , 2 में स्टेम कोशिका डिब्बेशन योगदान के शारीरिक विश्लेषण के लिए अनुमति देने वाले बाल follicles के साथ, एपिडर्मिस और डेमिस के दृश्य के साथ एक छवि की आवश्यकता होती है। इसके लिए त्वचा को कैसे एम्बेडेड और वर्गीकृत किया गया है, यह पूरी तरह से एकाग्रता की आवश्यकता है। महत्वपूर्ण रूप से, बाल follicles मोटा हो सकता है100 माइक्रोन से, जो मानक पैराफिन या फ्रोजन सेक्शन मोटाई को बहुत ज्यादा पार करता है, जिसके परिणामस्वरूप पूरे माउंट या मोटे क्रॉस-सेक्शन 3 , 4 , 5 के मुकाबले विश्लेषण का एक कम मानक होता है।
सूक्ष्म विश्लेषण के लिए नमूना तैयार करने के प्रत्येक चरण के साथ, एक महत्वपूर्ण निर्धारक है जो छवि विश्लेषण को प्रभावित करेगा। यहां, मोटी, 3 डी ऊतक क्रॉस-सेक्शन विश्लेषण के लिए एक उपन्यास प्रसंस्करण प्रोटोकॉल, जिसे हम "क्षैतिज पूरे माउंट" कहते हैं, प्रस्तुत किया गया है। प्रोटोकॉल अत्यधिक एंटीजेनेसिटी को सुरक्षित रखता है और मानक confocal इमेजिंग उपकरण का उपयोग करके त्वचा के मोटे हिस्से का पूरा शोषण सक्षम बनाता है। यह ऊतक ऊतक क्रॉस-सेक्शन प्रसंस्करण और इमेजिंग के लिए त्वचा का उपयोग करने के लिए एक पूर्ण गाइड है, जिसमें ऊतक फसल और पैराफॉर्मालाहैड (पीएफए) -सॉस्टेड क्रियोप्रेजेशन (चरण 1), क्रिस्टोस्ट (चरण) के साथ 100 माइक्रोन-मोटी ऊतक क्रॉस-सेक्शन 2), और immunofluorescent लेबलिंग और बढ़ते (चरण 3 और 4)। प्रतिनिधि परिणाम दो अलग-अलग हिस्टोलॉजिकल तैयारी तकनीकों- शास्त्रीय cryosectioning और मोटी, 3 डी ऊतक क्रॉस-सेक्शनिंग की confocal छवियों की तुलना करें- इस प्रोटोकॉल के संभावित उपयोगकर्ता के लिए "क्षैतिज पूरे माउंट" के फायदे को उजागर करते हैं।
Here, we present the “horizontal whole mount” technique, which has several advantages over classical frozen sections. One advantage of our technique is that it can easily be performed with standard histology equipment and a confocal microscope. Second, the tissue integrity is preserved in a superior manner when compared to standard cryosections. For example, adipocytes within the hypodermal layer (i.e., dermal white adipocytes (DWAT))9 are severely disrupted in standard cryosections, which makes studying tissues that are adipose-laden impossible. Our technique allows for the full analysis of the adipocytes in this layer and may be adapted to other tissues with high adipocyte contents. Furthermore, this allows for the improved detection of mesenchymal cells in lineage-tracing studies 2,10.
Standard cryosections, by their very nature, can never reveal the true 3D aspects of a tissue through confocal microscopy. This means that thicker sections are advantageous in the analysis of skin, since hair follicles, as well as their substructures, can traverse a depth that exceeds the standard thickness of 10 µm used in classical crysosections. We are intrigued that other tissues, such as the intestine and brain, for example, possess similar challenges with regard to viewing the tissue as a 3D structure2,7,11,12,13. Intriguingly, our technique has already been shown to be beneficial for use in certain applications in the intestines14. We believe that our horizontal whole-mount protocol has the potential be applied to any other tissue requiring 3D analysis.
The authors have nothing to disclose.
लेखकों ने थर्मो-फ़िशर वैज्ञानिक से प्रायोजन स्वीकार किया है और कन्फोकल छवि अधिग्रहण के दौरान समर्थन के लिए किंग्स कॉलेज लंदन में निकॉन इमेजिंग सेंटर का धन्यवाद किया है।
PBS | homemade | ||
Gelatin, from cold water fish skin | Sigma | G7765 | 250ML |
Glycerol | BDH Laboratory Supplies | 444482V | |
O.C.T. compound | VWR chemicals | 361603E | |
Peel-A-Way embedding molds | Sigma | E6032-1CS | Square S-22 |
Non-Fat Powdered Milk | Bio Basic Inc. | NB0669 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | 500ML |
4′,6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | |
FITC Rat Anti-Human CD49f | BD Pharmingen | 555735 | |
Mouse/Rat Integrin alpha 8 Antibody | R&D Systems | AF4076 | |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG | Life Technologies | A21208 | |
Alexa Fluor 555 donkey anti-goat IgG | Life Technologies | A21432 | |
CryoStar NX70 | Thermo Fisher Scientific | ||
100mm Culture dishes | |||
Disposable scalpels | Swann-Morton | Ref 0501 | |
pointed metal forceps | |||
1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR | 211-2130 | |
12 Well plates | Sigma | CLS3513 | |
Dissecting microscope | Nikon | ||
20 ul and 1000 ul Pipette | Gilson | ||
1000µl XL Graduated TipOne Filter Tip (Sterile) | Star Lab | S1122-1830 | |
20µl Bevelled TipOne Filter Tip (Sterile) | Star Lab | S1120-1810 | |
Rocking shaker plate | |||
Microscope slides, menzel Glaeser | Thermos Scientific | 631-9483 | Superfrost Plus |
Cover Glasses, Menzel Glaeser | Thermos Scientific | MENZBB024060AB | 24 x 60 mm |
Confocal microscope | Nikon |