Summary
Det här protokollet beskriver de åtgärder som krävs för att erhålla subcellulär protein lokalisering resultat på zebrafiskar näthinnan genom att korrelera super-resolution ljusmikroskopi och elektronmikroskopi bilder scannas.
Abstract
Vi presenterar en metod för att undersöka subcellulär protein lokaliseringen i larval zebrafiskar näthinnan genom att kombinera super-resolution ljusmikroskopi och svepelektronmikroskopi. Sub diffraktion gränsen upplösning kapacitet super-resolution ljus Mikroskop tillåt att förbättra noggrannheten av korrelerade data. Kortfattat, 110 nanometer tjock cryo-sektioner överförs till en silicon wafer och, efter immunofluorescens färgning, är fotograferad av super-upplösning ljusmikroskopi. Därefter bevaras avsnitten i metylcellulosa och platina skuggad före imaging i ett svepelektronmikroskop (SEM). Bilder från dessa två mikroskopi modaliteter sammanfogas enkelt med hjälp av vävnad landmärken med öppen källkod. Här beskriver vi den anpassa metoden för larval zebrafiskar näthinnan. Men är denna metod också tillämpliga på andra typer av vävnader och organismer. Vi visar att den kompletterande information som erhålls av denna korrelation är kunna lösa uttrycket av mitokondrie proteiner i samband med membran och cristae av mitokondrier samt om andra delar av cellen.
Introduction
Metoder för att bestämma subcellulär lokalisering av proteiner och deras relation till olika delar av cellen är viktiga verktyg för att förstå deras funktioner och möjliga interaktioner. Super-resolution mikroskopi i kombination med elektronmikroskopi ger sådan information1. Grundtillståndet utarmning mikroskopi följt av enskilda molekylen avkastning (GSDIM) är en super-resolution mikroskopi teknik kompatibel med ett brett utbud av ekologiska och genetiskt kodade fluorophores2 och uppnår en lateral upplösning upp till 20 nm 3. införlivandet av metoder med högre upplösning än standard diffraktion begränsad mikroskopi ökar exaktheten i korrelation4,5,6. För att uppnå bästa korrelationen av proteinuttryck med en specifik subcellulär fack och minska volymen av osäkerhet7 användning av samma ultrathin avsnitt för ljus- och elektronmikroskopi rekommenderas. Bland de olika snittningen metoderna, Tokuyasu cryo-avsnitt protokollet kräver ingen dehydrering eller harts inbäddning och, dessutom bevarar antigenicitet av många epitoper och ger bra vävnad ultrastruktur8. Flera metoder har visat tillämpligheten av dessa avsnitt i korrelat ljus- och elektronmikroskopi (CLEM)4,5,9,10.
Zebrafiskar näthinnan är en värdefull modell för att studera visuell utveckling och mänsklig sjukdomsmekanismer gett dess mycket struktur och funktion över ryggradsdjur. I synnerhet, näthinnans fotoreceptorer display samma arkitektur som däggdjur fotoreceptorer, med en basal synaps, en apico-basally långsträckt kärna, klustring av mitokondrier i segmentet för mer apikala inre och ett yttre segment består av membran diskar i den apikala ställning11. Protein lokalisering till olika cellulära facken är bevarade mellan zebrafiskar och människa, så att utredningen av den biologiska funktionen av mänskliga sjukdom-relevanta proteiner12,13.
Här presenterar vi ett protokoll för att förbereda larval zebrafiskar näthinnan prover lösa localizationen av den mitokondriella yttre membranprotein Tom20 genom korrelat super-resolution ljus- och elektronmikroskopi. Metoden bygger på att samla cryo-avsnitten på kiselskivor och att få kontrast av topografisk information produceras efter applicering av ett tunt lager av platina. Dessa steg är klart tekniska förbättringar i form av enkel användning, reproducerbarhet och tid att slutföra experiment. Vi har nyligen visat tillämpligheten av metoden att upptäcka nukleära porer och mitokondrie proteiner i mus vävnad14.
Protocol
alla experiment utfördes i enlighet med programsatsen ARVO för användning av djur i oftalmologiska och Vision forskning och godkändes av de lokala myndigheterna.
1. beredning av ultratunna sektioner på kiselskivor
- prov fixering
- förbereda fixativ lösningen innehållande 0,1% glutaraldehyd, 4% formaldehyd i 0,1 M cacodylate buffert.
Obs: försiktighet! Var försiktig när du arbetar med glutaraldehyd, formaldehyd och cacodylate buffert, bära lämplig personlig skyddsutrustning och arbeta i dragskåp. - Euthanize 5 dagar efter befruktning (5 dpf) zebrafiskar larver med tricaine (etyl 3-aminobensoat methanesulfonate, 0,4% w/v i PBS (fosfatbuffert saltlösning, pH 7)) som tidigare beskrivits 15.
- Fixa larverna genom nedsänkning i förväg kylda fixativ lösning på is. Ta bort huvudet och inkubera över natten vid 4 ° C med mild vaggande.
- Dissekera ögonen genom putsning vävnaden runt ögat med fin pincett och en lokalt skalpell (under en kikare) i kylda fixativ lösning på en 1% agaros-bedded tallrik. Överföra ögonen till en tub med färska pre kylda fixativ.
- Tvätta två gånger i PBS (fosfatbuffert saltlösning, pH 7,4) för 5 min varje tvätt vid rumstemperatur (RT).
- förbereda fixativ lösningen innehållande 0,1% glutaraldehyd, 4% formaldehyd i 0,1 M cacodylate buffert.
- Gelatin infiltration och montering
- värma upp 15 mL lokal mat varumärke gelatin 12% w/v i PB (fosfatbuffert, 0.1 M pH 7,4) vid 40 ° C. bort PBS och lägga gelatin lösningen till rören som innehåller ögonen. Tryck röret försiktigt för att säkerställa att gelatin infiltrat provet och inkubera i 10-30 min vid 40 ° C i en thermoblock med milda skakningar eller i ett vattenbad.
- Fyller 12 x 5 x 3 mm kisel eller polyeten platt inbäddning formar med varma gelatin i 40 ° C vattenbad. Lägga till två ögon per mögel med pipett, justera dem ordentligt under en kikare med en dissektion nål och låt gelatinet svalna i rumstemperatur i 1 min och härda vid 4 ° C i 20 min.
- Åter trimma gelatin blocket under den kikärten att passa ett öga per block med ett rakblad.
- Överför gelatin inbäddade ögonen till 2,3 M sackaros i PB på is. Inkubera vid 4 ° C över natten.
- Utbyte till nya 2,3 M sackaroslösning och förvaras vid 4 ° C eller -20 ° C, efter detta steg, prover är redo för snittning eller kan lagras vid-20 ° C under flera veckor till månader.
- Trim åter gelatin blocket till nästan storlek i ögat innan du överför till en cryo-pin. Frysa i flytande kväve och överföring till en cryo-ultramicrotome.
- Kryosnitt
- skär 110 nm tjock-sektioner-120 ° c med en diamant kniv i den cryo-ultramicrotome.
- Plocka avsnitten med en fast slinga som innehåller ett droplet-program 2% metylcellulosa (i vatten) och 2,3 M sackaroslösning (1:1). Överföra sektioner till en 7 x 7 mm kisel wafer. Lagra sektioner vid 4 ° C tills vidarebehandling.
2. Immunolabelling
- tvätta wafers med PBS vid 0 ° C i 20 min på fyra droppar genom att placera wafers uppochner på dropparna. Tvätta i PBS 2 x 2 min i rumstemperatur.
- Inkubera 3 gånger till 0,15% glycin i PBS, för varje 1 min. Tvätta 3 x 1 min/tvätt med PBS. Pre incubate med PBG (PBS med 0,5% bovint serumalbumin BSA och 0,2% Gelatin typ B) för 5 min.
- Inkubera med kanin anti-Tom20 (se Tabell för material) i PBG (4 µg/mL) i 30 min i rumstemperatur.
- Tvätta 6 x 1 min/tvätt i PBG. Pre incubate med PBG för 5 min på RT. Inkubera med anti-kanin Alexa 647 F(ab') 2 (se Tabell för material) i PBG (7,5 µg/mL) för 30 min.
- Tvätta 6 x 1 min/tvätt i PBG. Tvätta 3 x 2 min i PBS. Inkubera med DAPI (4 µg/mL) i PBS för 10 s. Tvätta 2 x 2 min i PBS.
3. Super-resolution mikroskopi
- Inkubera rånet kort (10 s) genom att placera det på en droppe av en 1:1 lösning av glycerol (80%) och imaging buffert innehållande en syre rensning system (200 mM fosfatbuffert innehållande 10% glukos, 0,5 mg/mL glucoseoxidase, 40 µg/mL katalas, 15 mM beta-mercaptoethylamine hydroklorid (MEA HCL), pH 8,0).
- Överför wafers (avsnitt nedåt) till ett glas botten (tjocklek 170 ± 5 µm) Petri maträtt på en färsk droppe av en 1:1 blandning av glycerol (80%) och imaging buffert (som i steg 3.1).
- Bort från alla sidor, med en pipett, de flesta av vätskan under rånet. Använda silikon ränder fixar rånet till botten av petriskål.
Obs: Silikon ränder tillverkas av tvåkomponents silikon-lim (3 x 12 mm). - Bild sektioner på ett inverterat Mikroskop använda en hög numerisk bländare (e.g. 160 X / NA 1,43; Se Tabell för material) super upplösning hängiven oljeimmersionsobjektivet. Innan imaging, låt provet temperera vid Mikroskop temperatur för att minimera/minska laterala och axiella avdrift.
- Centrum området av intresse och förvärva första widefield epifluorescence referensbilder. Ändra till super upplösning driftläge. Justera exponeringstiden av kameran till 15 ms och ange elektronen att multiplicera (EM) vinst maximalt 300.
- Belysa provet med 642 nm kontinuerlig våg laser på maximal lasereffekt (motsvarande ~2.8 kW/cm 2) i epifluorescence läge. Så snart den enda molekylen blinkar är väl separerade i varje bildruta, så att sannolikheten är låg att individen signalerar överlappar, anger lasereffekten ~0.7 kW/cm 2. Spela in raw-bild i epifluorescence läge genom att förvärva minst 30.000 ramar.
Obs: Alla dessa parameter kan variera beroende på olika prover och märkning tätheter. - Från raw-data, generera en återuppbyggnad händelselista (lokaliseringar av varje enskild molekyl blink i raw-bilden) med ett upptäckt tröskelvärde på 30 fotoner (måste justeras efter provet) genom att klicka " utvärdera " i den ' t-serien analys ' under ' verktyg '.
- Visualisera de super upplösning av Gaussisk montering 16 tillämpa en rendering pixelstorlek 4 nm genom att klicka " skapa Image " i den ' händelsen lista bearbetning panel ' under ' verktyg. '
Obs: För att generera super löst bilden integrerad programvaruverktyg för det system som används i denna studie var anställda. Men beskrivs super upplösning imaging kan utföras på andra enda molekyl lokalisering baserat system och data kunde behandlas med öppen källkodsverktyg som åska 17.
4. Platina skuggning
- ta bort silicon ränder och Lägg en droppe av PBS nära kanterna på rånet att lyfta upp från petriskål. Tvätta rånet 2 x 2 min i PBS, då inlägget fixa det med 0,1% glutaraldehyd i PBS för 5 min. Tvätta 2 x 2 min/tvätta i PBS.
- Inkubera rånet två gånger för 5 min/inkubation i 1 droppe av metylcellulosa 2% i vatten på isen. Infoga rånet i ett centrifugrör och centrifugera vid 14 100 x g för 90 s. Montera det på väsentlig SEM aluminium med dirigering kol cement.
- Lägg ett lager av 2 till 10 nm platinum/kol på prov av roterande skuggning på 8° med en elektron strålar avdunstning Enhetsinställningar: 1,55 kV, 55 mA, vid 0,3 nm/s och en vinkel på 8°, rotation nivå 4.
5. Svepelektronmikroskopi
- bild sektioner med en scanning electron microscope 1,5 kV, 2 mm fungerar avstånd och med en i objektiv sekundär electron detektor.
6. Justering av ljus- och elektronmikroskopi bilder
- Öppna båda typer av bilder med Fiji 18 genom att klicka " filen | Öppna ". Justera duken storlek genom att klicka " bild | Justera | Duk storlek " och få en stack båda bilderna genom att klicka på " bild | Stackar | Bilder att stapla ". Spara fästisarna som tiff filtyp.
- I Fiji, öppna ett nytt TrackEM2 19 gränssnitt genom att klicka " filen | ny | TrackEM2 (ny) ". Importera stacken med båda bilderna genom att högerklicka på fönstret svart och välja " Import stack ".
- Justera Ljus microscopy bild till elektronmikroskopi bild manuellt med sevärdheter genom att använda en rätt musklick på bilden och välja " justera | Justera lager manuellt med sevärdheter ".
- Plocka Välj verktyg (den svarta pilen) för att lägga till sevärdheter. Använda formen av atomkärnor som referens för att välja samma kanterna i båda bilderna (kompletterande Figur1). Lägga till flera punkter (minst tre punkter måste väljas). Gäller anpassningen till en affine modell av höger musknapp och välja " använda transformering | Affine modell ".
- Ändra lagergenomskinlighet (se kompletterande Figur1) för att bedöma kvaliteten på justeringen.
Representative Results
Uttrycket av proteinet Tom20, en del av den translocase mitokondriella yttre membran komplexa20, bestämdes, i tunnslip av larval zebrafiskar näthinnan, super-upplösning ljusmikroskopi (figur 1) och denna information var kompletteras med topografiska signalen erhålls genom svepelektronmikroskopi efter platina skuggning av samma avsnitt. Uppgifterna korrelat bekräfta localizationen av ett protein i samband med ett särskilt fack, yttre mitokondriella membranet och dessutom ge information om relationen av protein med andra organeller i cellen.
Figur 1: CLEM på zebrafiskar näthinna. A. låg förstoring widefield bilden av ett 5 dpf zebrafiskar retinal avsnitt, kärnor fläckade DAPI (cyan). B. svepelektronmikroskopi i samma område. C. högre förstoring widefield bild av ram i B. kärnor fläckade av DAPI (cyan) och Tom20 mitokondriella färgning visas i rött. D. Widefield bild av samma avsnitt i högre förstoring. Mönstret av Tom20 uttryck är kluster av mitokondrier. E. uttryck av Tom20 (röda prickar) detekteras av GSDIM mikroskopi. Atomkärnor fläckade DAPI (cyan). F. samma avsnitt som E kombinerar korrelat super-upplösning och svepelektronmikroskopi. Tom20 färgning (röda prickar) visas på mitokondriell klustret (M) på de yttersta membran av mitokondrier. Fluorescens DAPI signal i kärnor (N) motsvarar topografin av SEM bilden. G. hög förstoring bild av ram i F. Scanning electron microscopy bilden ger sammanhanget att GSDIM bilden (röda prickar). Mitokondrisk crista syns tydligt och Tom20 färgningen är lokaliserad till de yttersta membran av mitokondrier. Membranen i det yttersta segmentet fotoreceptorer (OS) löses klart. Bilden pixel storlek 5 nm. Skala barer: A, B och C: 10 µm; D: 2 µm; E och F: 1 µm och G: 0,2 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Kompletterande Figur1: justering av ljus- och elektronmikroskopi bilder. A. skärmdump från TrackEM2 gränssnitt med SEM-bild och numrerade sevärdheter (gul) längs olika kärnor. B. skärmdump från TrackEM2 gränssnitt med fluorescens bild och numrerade sevärdheter (gul) längs olika DAPI missfärgade kärnor. Ändra lagergenomskinlighet skjutreglagen i vänstra övre delen av menyn kan användas. Skalstapeln: 1 µm. vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Discussion
Denna metod kombinerar Super löst protein lokalisering med kontextinformation att bestämma den exakta positionen av proteiner i en organell. Här visar vi slutförandet av experimentet att visualisera ett uttryck för Tom20 i det yttre membranet av mitokondrier, och dess förhållande till andra organeller som kärnor eller yttre segment av ljusmätare i larval zebrafiskar näthinnan.
Tokuyasu cryo-snittning kräver lite träning att förvärva välbevarad sektioner. Detta är dock en metod som används i många laboratorier med påvisad framgång21. Överföring av avsnitten till kisel rånet är mycket enkel och inga särskilda överväganden behövs. Användning av glycerol i imaging bufferten är ett mycket viktigt steg att undvika uttorkning av avsnitten. För super-upplösning imaging erhålls bäst resultat när rånet är mycket nära glas botten av petriskål. Silikon ränderna hjälper att upprätthålla rånet i denna position. Särskild omsorg måste tas medan du tar bort ränder för att undvika att skada avsnitten.
Tjockleken på cryo-avsnitten, runt 100 nm, tunnare än den optiska upplösningen i Z-dimensionen, dessutom underlättar riktigheten av denna korrelat metod som super-resolution mikroskopi signalen kommer endast från detta tunna skikt och det svepelektronmikroskop signal visar topografin av provet. Denna metod kan också kombineras med multicolor imaging. Särskild försiktighet måste dock iakttas att provet kan avbildas under samma förhållanden (t.ex. imaging buffert) och cross talk bör förhindras.
En begränsning med metoden är dess tvådimensionell närmar, eftersom endast ett begränsat antal seriella sektioner (ca 3 till 7 per wafer) kan samlas. Projekt som rör volym analys skulle således inte vara perfekt. Det är dock en metod som kan tillämpas för att upptäcka proteinuttryck i någon typ av vävnad genom enkla snittning av provet. Vi tillhandahåller en metod utan användning av klassiskt kontrastmedel som uranyl acetat eller bly citrat. Kontrasten av platina skuggning ger mycket informativ topografiska kontrast, men i vissa fall membran är svåra att lösa. Detta kan innebära problem för projekt som behöver, till exempel att bestämma uttrycket av proteiner i små blåsor.
Våra protokoll, baserat på Tokuyasu cryo-sektioner, använder standard utrustning för att få korrelat resultat från super-upplösning och Scanningelektronmikroskop. Insamling av sektioner på kiselskivor och användning av platina för kontrast är enkla steg att ge stabilitet och reproducerbarhet till provpreparering.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Finansiering ION och RGB: schweiziska National Science Foundation Ambizione-Poäng bevilja PZ00P3 142404/1 och PZ00P3 163979.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | #158127 | |
| Glutaraldehyde EM Grade | EMS, USA | #16220 | |
| Cacodylate | Merck | #8.20670 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | #886-86-2 | |
| Agarose, peqGOLD Universal | VWR International GmbH | 35-1020 | |
| Flat embedding molds | BEEM Flat | ||
| Local food brand gelatin | Dr.Oetker | Extra Gold | |
| Sucrose | Merck | #1.07687 | |
| Methylcellulose | Sigma | #M-6385 | |
| Glycine | Sigma | #G-7126 | |
| Gelatin type B | Sigma | #G-6650 | |
| BSA | Applichem | #A6588.0050 | |
| Silicon wafer | Si-Mat Silicon Materials | Type: P/Boron; Orientation <111> ON; Growth method: CZ; Resistivity:1-30 ohm/cm; Surface: polished; Laser cut at 7 x7 mm | |
| Cryo-pin | Baltic Preparation | #16701950 | |
| Wired loop "Perfect loop" | |||
| Silicone stripes | Picodent | Twinsil 22 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | #G8270 | |
| glucoseoxidase | Sigma-Aldrich | #G7141 | |
| catalase | Sigma-Aldrich | #C40 | |
| beta-Mercaptoethylamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | #M6500 | |
| anti-Tom20 | Santa Cruz Biotechnology | #sc - 11415 | |
| AlexaFluor 647 AffiniPure F(ab')2 fragment donkey anti rabbit IgG | Jackson Immuno-Research | #711-606-152 | |
| DAPI | ROCHE, Switzerland | #10236276001 | |
| Glycerol solution | Sigma-Aldrich | #49782 | |
| Glass bottom petri dish | Ibidi, Germany | u-Dish 35mm, high glass bottom, #81158 | |
| SEM aluminium stub | Agar Scientific | #G301F | |
| Conducting carbon cement Leit-C | Plano, Germany | AG3300 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Diamond Knife (Cryo Immuno) | Diatome | DCIMM3520 | |
| Cryo-ultramicrotome | Leica Microsystems | Leica EM FCS | |
| Widefield-TIRF microscope GSD Leica SR GSD 3D | Leica Microsystems | ||
| 160x 1.43 TIRF objective | Leica Microsystems | 11523048 | |
| SEM - Zeiss Supra 50 VP | Zeiss | Supra 50 VP | |
| FIB-SEM - Zeiss Auriga 40 | Zeiss | Auriga 40 |
References
- Hauser, M., Wojcik, M., Kim, D., Mahmoudi, M., Li, W., Xu, K. Correlative Super-Resolution Microscopy: New Dimensions and New Opportunities. Chem Rev. , (2017).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Fölling, J., Bossi, M., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).
- Betzig, E., Patterson, G. H., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science (New York, N.Y.). 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Kopek, B. G., Shtengel, G., Grimm, J. B., Clayton, D. A., Hess, H. F. Correlative photoactivated localization and scanning electron microscopy. PLOS one. 8 (10), e77209 (2013).
- Paez-Segala, M. G., Sun, M. G., et al. Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM. Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).
- Narayan, K., Subramaniam, S.
- Tokuyasu, K. T.
- Suleiman, H., Zhang, L., et al. Nanoscale protein architecture of the kidney glomerular basement membrane. eLife. 2, e01149 (2013).
- Kopek, B. G., Shtengel, G., Xu, C. S., Clayton, D. A., Hess, H. F. Correlative 3D superresolution fluorescence and electron microscopy reveal the relationship of mitochondrial nucleoids to membranes. Proc Nat Acad Sci U S A. 109 (16), 6136-6141 (2012).
- Avanesov, A., Malicki, J.
- Bachmann-Gagescu, R., Phelps, I. G., et al. The ciliopathy gene cc2d2a controls zebrafish photoreceptor outer segment development through a role in Rab8-dependent vesicle trafficking. Hum Mol Gen. 20 (20), 4041-4055 (2011).
- Bachmann-Gagescu, R., Dona, M., et al. The Ciliopathy Protein CC2D2A Associates with NINL and Functions in RAB8-MICAL3-Regulated Vesicle Trafficking. PLOS Gen. 11 (10), e1005575 (2015).
- Mateos, J. M., Guhl, B., et al. Topographic contrast of ultrathin cryo-sections for correlative super-resolution light and electron microscopy. Sci Rep. 6, 34062 (2016).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
- Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cardona, A., Saalfeld, S., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLOS one. 7 (6), e38011 (2012).
- Wurm, C. A., Neumann, D., et al. Nanoscale distribution of mitochondrial import receptor Tom20 is adjusted to cellular conditions and exhibits an inner-cellular gradient. Proc Nat Acad Sci U S A. 108 (33), 13546-13551 (2011).
- Slot, J. W., Geuze, H. J. Cryosectioning and immunolabeling. Nat Prot. 2 (10), 2480-2491 (2007).
