Summary
منطقة سطح الرئة الداخلية (عيسى) هو معيار حاسم لتقييم مورفولوجيا الرئة وعلم وظائف الأعضاء في أمراض الرئة والتجدد السنخي الناجم عن الاصابة. نحن تصف هنا طريقة موحدة التي يمكن أن تقلل من التحيز قياس عيسى في كل من استئصال رئوي الرئوي ونماذج الفئران زرع الاصطناعية.
Introduction
الوظيفة الأساسية للرئة هي تبادل الأكسجين وثاني أكسيد الكربون بين الأوعية الدموية والغلاف الجوي. أمراض الرئة مثل خلل التنسج القصبي الرئوي (بد)، مرض الانسداد الرئوي المزمن (كوبد)، والتهابات الجهاز التنفسي الحادة، ويؤدي إلى انخفاض عيسى 2 . وقد طور الباحثون الذين يدرسون أمراض الرئة العديد من الطرق الكمية لتقييم التغيرات المورفولوجية في الرئتين، بما في ذلك ملي، إلف، وعدد من وحدات تبادل الغاز، عيسى، والالتزام أنسجة الرئة 2 ، 3 . دراسات رائدة من قبل ويبل وآخرون. 4 و دوغويد إت آل. 5 معا أن المعیار الدولي للتدقیق یمکن استخدامھ کمقیاس مباشر لقدرة تبادل الغاز الرئوي في الرئتین البشریة ویمکن استخدامھ کمعیار لتحدید شدة انتفاخ الرئة. وقد استخدم عدد من الدراسات التي نشرت في السنوات الخمس الماضية المعلمات المورفولوجية الرئة (على سبيل المثال، 6 وخلال الانتعاش من إصابة ينكس 1 ، 7 . ويحسب عيسى باستخدام المعادلة 1 8 و 9 :
، حيث إلف هو حجم الرئة الداخلية و ملي هو وسيط المعلمة التي تمثل المجال الجوي الطرفية الرئوية حجم 10 .
ينكس، إزالة جراحية واحدة أو أكثر من فصوص الرئة، تم الإبلاغ على نطاق واسع للحث على تجديد السنخية في العديد من الأنواع، بما في ذلك البشر 11 ، الفئران 1 ، الكلاب 12 ، الفئران 13 ، والأرانب 14 ، 15 . مسمارذ من الرئتين الفئران في أربعة عشر يوما بعد بنكس أظهرت أن كلا من التوسع في الحويصلات الهوائية الموجودة مسبقا وتشكيل دي نوفو من الحويصلات الهوائية تسهم في استعادة عيسى، إلف، وعدد من الحويصلات الهوائية في أنسجة الرئة المتبقية 1 . لقد أظهرنا نحن وآخرون أن إدخال مواد مثل الإسفنج أو الشمع أو بدلة على شكل مخصص في التجويف الصدري الفارغ بعد بنكس ( أي زرع الأطراف الاصطناعية) يضعف تجديد السنخية. ومن الثابت الآن أن القوة الميكانيكية تعمل باعتبارها واحدة من أهم العوامل لبدء تجديد السنخية 1 ، 16 ، 17 . وقد سلطت هذه الدراسات الضوء على فعالية استخدام قيم عيسى من بنكس المعالجة والرئة الاصطناعية مزروع كمعيار لتقييم كميا تجديد السنخية.
ومن المعروف أن التحيز المراقب تؤثر تأثيرا كبيرا فازهري لمعلمات المورفولوجية الرئة (على سبيل المثال، MIL وILV). ويمكن استخدام بروتوكولات موحدة لتفادي هذا التحيز في تحديد كل من إلف و ملي، وهما البارامترات المستخدمة في حساب عيسى. هنا، ونحن نقدم بروتوكولات مفصلة للغاية، موحدة لقياس هذه المعلمات الرئة. الأهم من ذلك، القدرة على تحديد بدقة عيسى وعد بتحسين موثوقية واستنساخ الدراسات من وظائف الرئة في نماذج تجديد السنخية الناجم عن إصابة وينبغي أن تسهل الاكتشافات الميكانيكية في أمراض رئوية متعددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الإجراءات المستخدمة في هذا البروتوكول نفذت وفقا للتوصيات الواردة في المبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية للمعهد الوطني للعلوم البيولوجية، بكين. تم إيواء الفئران الذكور من نوع سد-1 البالغ عمرها 8 أسابيع في منشأة خالية من مسببات الأمراض (سف) حتى أجريت التجارب. أجريت العمليات الجراحية باستخدام الفئران تخدير تماما ( أي دون أي ردود قرصة أخمص القدمين). بعد الجراحة، تم الاحتفاظ بالفئران في غرفة دافئة رطبة مع ما يكفي من الغذاء والمياه العذبة. تم التضحية الفئران باستخدام جرعة زائدة من مخدر تسليمها عن طريق الحقن داخل الصفاق.
1. ماوس ينكس جراحة
- تخدير كامل الفئران مع فينوباربيتال الصوديوم (120 ملغ / كغ من وزن الجسم) والبوبرينورفين (0.1 ملغ / كغ من وزن الجسم) عن طريق الحقن داخل الصفاق (إب). إجراء الجراحة عندما الفئران لم تعد تتفاعل مع معصم القدمين معسر.
- إزالة الشعر على الصدر الأيسر من الفئران مع ديب الكيميائيةإلاتوري العلاج (~ 3 × 3 سم 2 منطقة).
- تأمين كل الماوس على منصة التنبيب مع الجانب البطني التي تواجه المشغل ( الشكل 1A ).
- سحب اللسان الماوس وإلقاء الضوء على الحبال الصوتية مع منظار الحنجرة الحيوانية الصغيرة التي تحتوي على درجة لتوجيه القسطرة 18 ( الشكل 1A ).
- التمييز بين الحبال الصوتية من خلال مراقبة تحركات الحبال الصوتية أثناء التنفس. إدراج بلطف 20 G قنية التنبيب عن طريق الوريد في القصبة الهوائية في زاوية الأمامية 19 .
- وضع الفئران في موقف راقد الجانبي الأيمن وربط قنية إلى التنفس الصناعي الميكانيكية (على سبيل المثال، والضغط تسيطر عليها، انظر جدول المواد ). تحقق من إدراج قنية في القصبة الهوائية من خلال مراقبة حركات التنفس من الصدر الماوس ( الشكل 1B ).
- تعيين الضغط الشهيق of التنفس الصناعي إلى 12 سم H 2 O وتعيين معدل التنفس إلى 120 الأنفاس في الدقيقة ( الشكل 1B ).
- تطهير الجلد في منطقة العمليات الجراحية مع بيتادين و 70٪ من الإيثانول.
- جعل 2 - شق بضع الصدر 3 سم الخلفي الوحشي في الفضاء في الفضاء وربي ال 5، وقطع طريق الجلد والعضلات مع نويس الربيع مقص (قطع حافة: 14 مم؛ قطر الحافة: 0.275 مم) (الشكل 2B، C). يتم تعقيم الأدوات الجراحية المستخدمة لإجراء بضع الصدر قبل الاستخدام.
- جعل شق 1.5 سم في الفضاء وربي الموافق 5 لفضح الرئة اليسرى (الشكل 2D، E). أثناء العملية، استخدام ارتفاع درجة الحرارة كويريزر لوقف النزيف.
- رفع ثلث الفص الرئة اليسرى من الصدر مع ملقط طرف حادة ( الشكل 2F )، ومن ثم استخدام مسحة القطن لسحب اليسار بأكملهالرئة ( الشكل 2G ).
- تحديد الشريان الرئوي والشعب الهوائية من الفص الرئة الأيسر ( الشكل 2G ).
- ليغات بإحكام الشعب الهوائية والسفن في هيلوم مع خياطة الجراحية الحرير وقطع الفص الرئة اليسرى في 3-4 ملم من ربط ( الشكل 2H ، I ).
ملاحظة: يجب الحرص على عدم قطع عقدة خياطة على نقي اليسرى، والتي يمكن أن تسبب استرواح الصدر ( أي الهواء أو الغاز في تجويف الصدر) . - إغلاق جدار الصدر مع 1 خياطة، ومن ثم غرزة طبقة العضلات وطبقة الجلد بالتتابع، وذلك باستخدام 5 - 6 توقف الغرز. ترك فجوة 3 - 4 ملم بين كل خياطة ( الشكل 2M ، 2N ).
ملاحظة: الحفاظ على إبرة خياطة الجراحية بعيدا عن القلب. فإن ثقب القلب غير مقصود يؤدي إلى الموت الفوري. - تطهير المنطقة الجراحية مع البوفيدون اليود.
- بعد عملية الشراءr العملية الجراحية، ضع الماوس على لوحة الحرارية 38 درجة مئوية وربط الماوس إلى التنفس الصناعي حتى حركات التنفس العفوية تبدأ ( الشكل 2O ).
2. زرع الاصطناعية
- تنفيذ الخطوات 1.1 - 1.13 من الإجراء بنكس (وهذا هو، حتى النقطة التي يتم فيها إزالة الفص الرئة اليسرى من الماوس).
- المشبك مركز الاصطناعي سيليكون (العملاء المقدمة، 12 مم في الطول، 3 مم في سمك، 7 ملم في العرض، 0.2 غرام، شكل بيضاوي الشكل) باستخدام ملقط حادة ( الشكل 2J ). تعقيم بدلة سيليكون قبل الإدراج.
- عقد الضلع مع ملقط بيد واحدة لفضح تجويف الصدري، ومن ثم إدراج بدلة في تجويف الصدر فارغة الأيسر مع يد أخرى.
ملاحظة: زاوية الإدراج حوالي 45 درجة بين الطائرة الأمامية من الأطراف الصناعية والسطحية الصدرية ( الشكل 2K ،L). يكون لطيف جدا عند إدخال الأطراف الاصطناعية. سوف تؤدي القوة المفرطة إلى تمزق الجنبي. - ضبط اتجاه الأطراف الاصطناعية مع ملقط حادة للتأكد من أن بدلة تحتل اليسار تجويف الصدر فارغة.
- تنفيذ الخطوات 1.14 - 1.16 من إجراء الماوس الماوس.
3. قياس إلف
- إعداد جهاز مخصص ("أنبوب التضخم") الذي يتكون من المكبس إزالة من ماصة المصلية المتاح (10 مل)، أنبوب مرن 40 سم طويلة مع محول الإبرة، صمام التحكم معدل التدفق، وإبرة 18 G. بعد التجمع، وتأمين ماصة على متن مع الشريط ( الشكل 3A ). المسافة بين الجزء العلوي من ماصة والمقعد التجريبية يجب أن يكون على الأقل 30 سم.
- إعداد الطازجة 4٪ بارافورمالدهيد (بفا) حل التثبيت عن طريق إذابة 20 غرام بفا في 500 مل قبل تسخينها 1X الفوسفات مخزنة المالحة (بس) في حمام مائي 55 درجة مئوية، والهز يدويا علىسي كل 10 دقيقة حتى الحل واضح. بعد التبريد لدرجة حرارة الغرفة، وتصفية الحل مع مرشح 0.45 ميكرون.
تنبيه: ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة (ب) عند التعامل مع بفا. - التضحية الفئران مع حقن جرعة زائدة من مخدر (0.8٪ الفينوباربيتال الصوديوم، 1000 U / مل الهيبارين).
- تأمين كل الماوس على لوحة تشريح البوليسترين ورذاذ مع الكحول 70٪.
- فتح بعناية الماوس الماوس وقطع من القص باستخدام مقص لتعريض بدقة فصوص الرئة.
- إزالة الأنسجة المفرطة باستخدام مقص لفضح القصبة الهوائية. تأكد من فصل القصبة الهوائية من المريء.
- قطع الشريان الأورطي البطني وإدراج إبرة 25 قياس في البطين الأيمن من القلب. ربط الإبرة إلى حقنة 20 مل قبل هذا الإدراج. دفع ببطء 1X برنامج تلفزيوني في القلب لإزالة خلايا الدم حتى الرئتين تتحول إلى اللون الأبيض. عادة، مطلوب 5 - 10 مل بس لمسح الأوعية الدموية الرئوية.
- ملء ثه أنبوب التضخم التي شيدت خصيصا مع بفا 4٪ الطازجة وإزالة جميع الفقاعات من أنبوب التضخم.
- إدراج إبرة 18 قياس أنبوب التضخم في القصبة الهوائية وقصبة القصبة الهوائية مع مقاطع السفينة لتجنب تسرب السوائل.
- تضخيم الرئتين مع بفا 4٪ في الضغط المستمر عبر الرئوي من 25 سم / H 2 O 2 ، 20 . احتضان الرئتين في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة لتحقيق الرئتين الموسعة بالكامل. هذه الخطوة "ما قبل الإصلاح" أمر بالغ الأهمية للحفاظ على مورفولوجيا الرئة.
- من خلال مراقبة أنبوب التضخم، تسجيل قيمة الأولي 4٪ بفا حجم وتسجيل الحجم النهائي. حجم الرئة الداخلية يساوي حجم بفا الأولي 4٪ ناقص حجم بفا النهائي 4٪.
- ليغات القصبة الهوائية واستخدام مقص، تشريح بلطف من الرئتين (الحفاظ على الرئتين سليمة) من الأنسجة الضامة المحيطة بها. يكون لطيف جدا لتجنب إتلاف الرئتين.
- Incuباتي الرئتين في أنبوب مخروطي 50 مل مليئة 4٪ بفا لمدة 12 ساعة في 4 درجات مئوية مع هز لطيف على شاكر (50 دورة في الدقيقة). انتقل إلى معالجة الأنسجة وتلطيخ (انظر القسم 4).
4. الأنسجة التضمين، سيكتيونينغ، و هيماتوكسيلين و يوسين (H & E) تلطيخ
- بعد التثبيت، استخدم مقص نويس الربيع لتقليم القلب والأنسجة الضامة المفرطة قبالة الرئتين. فصل بلطف فصوص الرئة الفردية عن طريق قطع القصبات التي تربط فصوص الرئة إلى القصبة الهوائية.
- غسل على نطاق واسع فصوص الرئة 3-4 مرات في 50 مل 1X بس (30 دقيقة / غسل) على شاكر المداري (50 دورة في الدقيقة).
- بعد غسل النهائي، كريوبروتيكت فصوص الرئة عن طريق غمر لهم في محلول السكروز 30٪ (في برنامج تلفزيوني 1X) في 4 درجات مئوية حتى يغسل الأنسجة إلى الجزء السفلي من أنابيب مخروطية 50 مل (حوالي 12 ساعة).
- قبل تضمين و كريوسكتيونينغ الأنسجة، وإزالة عينات الفص الرئة من الأنابيب مع ملقط، والاحتفاظ أسيسالفصوص السوري للتحليل النسيجي، داب محلول السكروز المتبقية من سطح عينات الفص التبعي، ومن ثم تزج بدقة العينة في طبق بتري تحتوي على درجة حرارة القطع الأمثل (أكتوبر) مجمع لمدة 30 دقيقة تقريبا.
- تجميد أوكت جزءا لا يتجزأ من عينات الفص ملحق في النيتروجين السائل باستخدام كريومولدز. وضع أكبر مساحة سطح الفص موازية إلى الجزء السفلي من القالب.
- إعداد ما مجموعه ثلاثة أقسام 10 ميكرون سميكة لكل عينة خلال كريوسكتيونينغ للتحليل النسيجي. تجاهل أول 1 ملم من الأنسجة، وجمع واحد 10 ميكرون سميكة القسم، وتجاهل 0.5 ملم من الأنسجة، وجمع قسم آخر، وتجاهل 0.5 ملم من الأنسجة، وجمع القسم الثالث (النهائي).
- الهواء الجاف أقسام لمدة 1 ساعة قبل أداء H & E تلطيخ.
- أداء H & E تلطيخ
- غسل المقاطع في 3-4 التغييرات من مياه الصنبور ثم وصمة عار أقسام في الهيماتوكسيلين جديدة لمدة 2 دقيقة. شطف القسم تحت تشغيل مياه الصنبور. تزج القسم مرتين في محلول الإيثانول هكل-70٪ 1٪ لإزالة الهيماتوكسيلين الزائدة.
- وصمة عار القسم في يوزين طازج لمدة 3 دقائق. يذوى المقاطع مع اثنين متتالية 30 ثانية يغسل في الايثانول 95٪ واثنين من 30 ثانية يغسل مع الايثانول بنسبة 100٪. مسح المقاطع في زيلين لمدة 30 ثانية، كرر خطوة المقاصة مرة واحدة في الزيلين الطازج. جبل الشرائح مع تصاعد المتوسطة باستخدام كوفرسليبس الزجاج.
5 - التحديد الكمي للمعهد المتعدد الأطراف
- الحصول على الصور الرقمية من H & E أقسام الفص ملحق الملون (20X التكبير) باستخدام المجهر مشرق الميدان.
- لتحديد الكمية المتعددة، حدد ما مجموعه 15 وجهات النظر غير متداخلة (1000 ميكرون × 1000 ميكرون) عشوائيا من المناطق المناسبة (دون الشرايين والأوردة، الشعب الهوائية الرئيسية، والقنوات السنخية) من 3 أقسام.
- وضع شبكة مع 10 خطوط رأسية موزعة بالتساوي و 10 خطوط أفقية موزعة بالتساوي من لين محددةغث (1،000 ميكرون) على المناطق المختارة للعرض باستخدام أداة حاكم؛ وبالتالي تباعد كل سطر 100 ميكرون وبصرف النظر ( الشكل 4B ).
- تحديد قيمة اعتراض واحد كما طول الخطية بين اثنين من الظهارة السنخية المجاورة. قياس قيم جميع الاعتراضات على طول كل 1000 ميكرون طول الخط.
- ولكل شبكة، تحدد قيم جميع الاعتراضات بين خطوط الطول الأفقي البالغ طولها 1000 ميكرون وخطوط الطول العمودي البالغ طولها 1000 ميكرون.
ملاحظة: ملي هو متوسط قيمة أطوال اعتراض من ما مجموعه 15 شبكة تحليلها من بين الأقسام الثلاثة المعدة لكل من الفصوص التبعي.
6. حساب عيسى
- احسب المعیار الدولي للتدقیق باستخدام المعادلة 1 (انظر المقدمة ). يرجى الرجوع إلى القسم 3 لقياس إلف والرجوع إلى القسم 5 من أجل التحديد الكمي لمؤشر الضعف المتعدد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أجرينا هنا تجربة مع مجموعة معالجة ينكس ومجموعة زرع الاصطناعية (الاصطناعية). هذه المجموعات هي نفس المجموعات المستخدمة في دراسة نشرت سابقا من مجموعتنا البحثية 14 .
يظهر الماوس وينكس وإجراءات زرع الاصطناعية في الشكل 2 . وتستخدم الفئران الذكور سد-1 من العمر 8 سنوات للعمليات الجراحية وللتقدير الكمي. في المجموعة المعاملة بنكس ومجموعة بروسثيسيس المزروع، تم استئصال فصوص الرئة اليسرى على حد سواء ( الشكل 2A - 2I ). في المجموعة الاصطناعية المزروع، تم إدخال بدلة تحاكي حجم وشكل الفص الرئة الأيسر في الصدر بعد إزالة الفص الرئة الأيسر ( الشكل 2J - 2L ).
_content "فو: كيب-together.within-بادج =" 1 "> أربعة عشر يوما بعد الجراحة، تم استخدام أنبوب التضخم حسب الطلب لتحديد إلف من الرئتين اليمنى المتبقية ( الشكل 3A )، متوسط إيلف من الحق المتبقي كانت الرئتين من 5 الفئران المعالجة بنكس حوالي 1.4 مل، أعلى بكثير من 1.05 مل قيم إلف من الرئتين اليمنى من 5 الفئران الاصطناعية المزروع ( الشكل 3B ، الجدول 1 ).لقياس ملي، تم تحليل ما مجموعه 15 وجهات النظر من بين الأقسام الثلاثة التي أعدت من كل الماوس. ويظهر الشكل 4A صورة مدمجة من قسم الفص الملحق والمعيار المورفولوجي للمنطقة المختارة (على سبيل المثال، عرض 1 - 3) أو منطقة غير مختارة (على سبيل المثال، عرض 4 - 5) تستخدم في تحديد الكميات المليئة بالمستوى. هنا، عرض 3 من مقطع الفص الرئة ملحق من مجموعة معاملة ينكس اتخذت كمثال لوقياس ملي ( الشكل 4B ). يتم عرض صورة مكبرة للعرض 3 أيضا للتوضيح ( الشكل 5A ). يتم عرض السطر 3 كمثال على ذلك: طول مساحة الهواء السنخية المعترضة التي تشير إليها خطوط الأسهم ذات الرأسين. أظهر تحليلنا أن قيم ملي في الرئتين اليمنى المتبقية من الفئران المعالجة بنكس كانت أكبر بكثير من تلك الموجودة في الرئتين اليمنى المتبقية من الفئران الاصطناعية المزروع ( الشكل 5B ، الجدول 1 ). يتم عرض جميع البيانات كمتوسط ± سيم ( الشكل 5B ).
تم حساب المعیار الدولي للتدقیق باستخدام المعادلة 1 . ويبين الجدول 1 قيم إلف، قيم ملي، و عيسى من جميع الرئتين. كان عيسى من الفئران الاصطناعية المزروع أصغر بكثير من الفئران المعالجة بنكس، مما يدل على أن الإدراجn من اصطناعية ضعف ينكس-- تجديدها.
الشكل 1: التنبيب الرغامي الماوس والتهوية الميكانيكية. ( A ) التنبيب الرغامي مع 20 G قنية التنبيب عن طريق الوريد عن طريق تنظير الحنجرة. ( B ) توصيل الماوس تخدير كامل إلى التنفس الصناعي الميكانيكية التي تسيطر عليها الضغط قبل الجراحة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: استئصال رئوي الماوس (بنكس) وزرع الاصطناعية. ( A - C ) قطع الجلد وطبقة العضلات. توقف ب ليدينغ مع ارتفاع درجة الحرارة كويريزر أثناء العملية الجراحية. (D - E) جعل شق 1.5 سم في الفضاء وربي الموافق 5. ( F - H ) سحب الفص الرئة الأيسر مع ملقط حادة وتحديد الشريان الرئوي والقصبات الهوائية، ليغات في الحرق. الرؤوس تمثل الشريان الرئوي والشعب الهوائية من الفص الرئة اليسرى. ( I ) تم قطع الفص الرئة اليسرى في 3-4 ملم من ربط. ( J - L ) إدراج بدلة في تجويف الصدر الأيسر. ( M، N ) خياطة الصدر، وطبقة العضلات، وطبقة الجلد. ( O ) مراقبة الفئران حتى تبدأ حركات التنفس العفوية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
رقيقة الصفحات = "1"> 
الشكل 3: قياس حجم الرئة الداخلية (إلفس) من الرئتين اليمين المتبقية. ( A ) جهاز مخصص ("أنبوب التضخم") لقياس حجم الرئة الداخلية. ( B ) تم قياس إلفس (يعني ± سيم) من الرئتين اليمنى المتبقية من المجموعة المعالجة بنكس ومجموعة الاصطناعية المزروع في 14 يوما بعد بنكس. **، p <0.01، t -test الطالب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (4): الكمي لمتوسط اعتراض الخطي (ملي) من اللوز التبعي في الرئتين اليميني المتبقية. ( A ) دمج إمعمر قسم الفص ملحق. أمثلة على المناطق المختارة (على سبيل المثال، عرض 1 - 3) والمناطق غير المختارة (على سبيل المثال، عرض 4 - 5) المستخدمة في تحديد كميتها. ( ب ) 10 خطوط عمودية متباعدة بالتساوي و 10 خطوط أفقية متباعدة بالتساوي طول محدد (1000 ميكرون) وضعت على المنطقة المختارة. شريط مقياس = 1 ملم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: الكمي من الرنين المغناطيسي في الرئة المعالجة بنكس والرئة الاصطناعية المزروع. ( A ) يتم عرض صورة مكبرة للعرض 3 في الشكل 4B . خطوط حمراء اللون مع السهام مزدوجة تمثل طول اعتراض خطي واحد. ( B ) القيم ملي (يعني ± سيM.) من فصوص التبعي من الفئران المعالجة بنكس والفئران المزروع-تم زرعها في 14 يوما بعد بنكس. *، p <0.05، t -test الطالب. شريط مقياس: 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| 14 يوما بعد الجراحة | حجم الرئة الداخلي (مل) | يعني اعتراض الخطي (مم) | منطقة سطح الرئة الداخلية = 4ILV / ملي (سم 2 ) |
| PNX المعالجة | 1.5 | 57.8 | 1038.06 |
| 1.35 | 49.6 | 1088.71 | |
| 1.42 | 48.5 | 1171.13 | |
| 1.4 | 51.5 1087.38 | ||
| 1.4 | 54.6 | 1025.64 | |
| ، زرع الأطراف الاصطناعية | 1.1 | 49.6 | 887.10 |
| 1 | 50.5 | 792.08 | |
| 1.1 | 47.3 | 930.23 | |
| 1.15 | 44.8 | 1026.79 | |
| 0.86 | 46.3 | 742.98 |
الجدول 1: حساب قيم عيسى من الفئران التي تتم معالجتها بنكس و بريسثيسيس المزروع. قيم إلف، ملي، و عيسى من فصوص ملحق في 14 يوما بعد ينكس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول، ونحن نقدم أوصاف مفصلة عن قياس المعلمات الرئوية بعد الماوس اليسار الرئة ينكس وزرع الاصطناعية. ويعتبر عيسى الآن مقياسا رئيسيا لتقييم وظيفة الجهاز التنفسي في العديد من الأمراض الرئوية وفي تجديد السنخية الناجم عن الإصابة. ومع ذلك، على الرغم من أن مجتمع البحث الرئوي في اتفاق حول فائدة عيسى كمقياس مفيد، حتى الآن، كان هناك القليل من الاعتبار لتوحيد قياس إلف و ملي، وهما البارامترات المستخدمة لحساب عيسى. من الواضح، كما هو الحال مع أي قياس، من المهم محاولة الحصول على البيانات غير منحازة. والهدف الأساسي من جهود البحث الحالية هو وضع بروتوكول موحد لاستخدامها من قبل مجتمع أبحاث الرئة الفئران.
حاولنا الحد من مصادر التحيز القياس في عدد من الطرق كما وضعنا هذا البروتوكول. وجدنا أن الاختلاف في قياسات إلف يمكن أن يكون أحمرأوسيد عن طريق منع تسرب السوائل عن طريق التأكد من أن حجم الإبرة إدراجها في القصبة الهوائية هو متطابق الأبعاد (وجدنا أن الإبر 18 قياس مطابقة بشكل وثيق الفئران القصبة الهوائية). وجدنا أيضا أن جدار الصدر الماوس يحتاج إلى إزالة تماما قبل التضخم بفا، وهذا يقلل من التأثير المحتمل للجدار الصدر على قياسات إلف. قيم ملي تعتمد إلى حد كبير على مورفولوجيا السنخية. وفقا لذلك، بالإضافة إلى أهمية استخدام العمر المتطابقة والفئران مطابقة الجنس، والصيانة المناسبة للمورفولوجيا السنخية أثناء إجراءات تثبيت الرئة أمر بالغ الأهمية. نحن هنا تستخدم طريقة التثبيت المعتمدة على نطاق واسع: نحن تضخم الرئتين في ضغط عبر الرئة من 25 سم H 2 O مع الطازجة بفا 4٪ لتوسيع تماما أنسجة الرئة. في تجربتنا، وانخفاض الضغوط ديستندينغ يمكن أن يؤدي إلى تقلص الأنسجة، مورفولوجيا السنخية غير طبيعية، ويؤدي في نهاية المطاف إلى انخفاض القيم ملي.
ملاحظات فيوقد أشارت دراساتنا السابقة أن الفص ملحق من الرئة المتبقية المعارض التوسع الحجمي الأقصى، بالمقارنة مع الفصوص الثلاثة الأخرى من الرئة اليمنى، بعد تجديد بنكس. والفص ملحق من الرئة المتبقية كما يظهر الزيادات القصوى في قيمة المعلمات المورفولوجية (على سبيل المثال، ملي) 21 ، 22 ، 23 ، 24 . ولذلك فإننا فقط تحليل أقسام من الفص التبعي لتجنب الاختلاف من فصوص الرئة المختلفة. للمساعدة في الحد من الاختلاف بين مختلف الأقسام المستخدمة في تحديد كمي من معهد الطب النووي، ونحن تسيطر على اتجاه الفص أثناء التضمين: وضعنا أكبر سطح مواز الفص إلى الجزء السفلي من كريومولد. نحن أيضا التحكم بعناية سمك شرائح العينة، تسلسل أخذ العينات القسم، و موقف القطع خلال باجتزاء. بالإضافة إلى تجهيز العينة، استيراد آخرt الجانب من التوحيد هو أن جميع الشرايين والأوردة، غشاء الجنب، الشعب الهوائية الرئيسية، والقنوات السنخية تحتاج إلى استبعادها من مناطق الأنسجة التي يتم تقييمها خلال معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا الكمي. الشرايين والأوردة، والقنوات السنخية كلها أكبر بكثير من الحويصلات الهوائية (من 4 إلى 10 مرات)، وذلك باستثناء هذه الهياكل الكبيرة مهم للحصول على قياسات اعتراض موثوق بها. لكل مجموعة، 5 الفئران هي كافية لتقدير الكمي. لكل الماوس، تم اختيار ما مجموعه 15 وجهات النظر غير متداخلة (1000 ميكرون × 1000 ميكرون) عشوائيا من المناطق المناسبة (دون الشرايين والأوردة، والممرات الهوائية الرئيسية، والقنوات السنخية) من 3 أقسام من الفص ملحق. طريقة التضمين العينة وقياس ملي يمكن تطبيقها أيضا على البارافين أنسجة الرئة المعالجة.
في حين أن الآخرين قد عرفت معهد الطب النووي كما طول الخط الإجمالي مقسوما على عدد من الاعتراضات مع الجدران السنخية عبرت 25 ، ونحن هنا تستخدم اعتراض الخطي كما الطول الخطيبين اثنين من الجدران الظهارية السنخية المجاورة في حسابات معهد الطب العدلي، بغض النظر عن سمك اللحمة المتوسطة من البيانات ملي. وفقا لذلك، قمنا بحساب عيسى باستخدام إلف ولكن ليس مجموع حجم الرئة.
ل ينكس وإجراءات زرع الاصطناعية، تراوحت نسبة البقاء على قيد الحياة من الفئران التي تمر بنكس من 85٪ إلى 90٪. كان معدل البقاء على قيد الحياة من الفئران التي تمر زرع الاصطناعية حوالي ~ 80٪. خلال جميع العمليات الجراحية، ينبغي اتخاذ عدة خطوات لتحسين بقاء الفئران. 1) الإدراج الصحيح للقسطرة في القصبة الهوائية هو شرط أساسي لعملية بنكس ناجحة. بتوجيه من منظار الحنجرة، القصبة الهوائية من الماوس يمكن ملاحظتها بسهولة لتسهيل التنبيب الرغامي آمنة وفعالة. 2) لا ثقب الرئتين أو قلوب أثناء الإجراء. تأكد من أن القفص الصدري للورق الخامس الوربي الأيسر قد تم فتحه على نطاق واسع، وأنه يتم تحديد قشر الفص الأيسر بوضوح قبل استئصال الفصوص. عند تنفيذ اليسار الفص الرئة إعادةالقسم، وضمان أن الفص الأيسر سليمة عن طريق استخدام ملقط حادة لتجنب النزف الرئوي و / أو تمزق فصي. خلال إغلاق الجرح، والحفاظ على طرف من إبرة الجراحية بعيدا عن القلب والرئتين. 3) يكون لطيف عند إدخال الأطراف الاصطناعية في تجويف الصدر فارغة، كما القوة المفرطة يمكن أن يسبب تمزق الغشاء الجنبي. 4) ينبغي وضع الفئران على لوحة الحرارية 38 درجة مئوية ورصدها حتى استعادة الحواس، كما هو معروف انخفاض حرارة الجسم بعد العملية الجراحية لزيادة اعتلال الماوس.
بعد إزالة الفص الرئة اليسرى، تم تخفيض كل من وحدات الجهاز التنفسي الرئوي ومنطقة الرئة الداخلية تبادل الغاز بشكل كبير. بعد 14 يوما من الجراحة، و إيلف، ملي، و عيسى في أنسجة الرئة المتبقية كانت أكبر بكثير في مجموعة معاملة ينكس من الفئران مما كانت عليه في المجموعة الاصطناعية مزروع، مما يشير بقوة إلى أن إدراج بدلة سدت ينكس الناجم عن السنخية تجديد. وهكذا، على حد سواء ينكس و الاصطناعي-وضع غرس الماوسلس يمكن استخدامها كأدوات قوية للتحقيق في الأحداث الخلوية والجزيئية التي تحدث أثناء القوة الميكانيكية التي يسببها إعادة السنخية. بالإضافة إلى ذلك، فإن قيم ISA ياب AT2 الرئتين فارغة أصغر أهمية من تلك الرئتين تحكم في ما بعد PNX يوم 14 1، مشيرا إلى أن بروتوكول لدينا هو أيضا مناسبة للكشف عن تجديد ضعاف من فئرانا معدلة وراثيا الوراثية. ويمكن تطبيق الأساليب الكمية الصارمة والموحدة المعروضة في هذه الدراسة لقياس معلمات الرئة و عيسى في الدراسات التنموية ومع النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا لأمراض متعددة، بما في ذلك انتفاخ الرئة في أمراض الرئة الانسدادي المزمن، تجديد السنخية بعد إصابات الرئة، وتطوير الرئة عيوب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
ويود المؤلفون أن يعترفوا بالمعهد الوطني للعلوم البيولوجية، بيجين، على المساعدة. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية لبلدية بكين (رقم Z17110200040000).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low cost cautery kit | Fine Science Tools | 18010-00 | |
| Noyes scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Vessel clips | Fine Science Tools | 18374-44 | |
| I. V. Cannula-20 gauge | Jinhuan Medical Product Co., LTD. | 29P0601 | |
| Surgical suture | Jinhuan Medical Product Co., LTD. | F602 | |
| Mouse intubation platform | Penn-Century, Inc | Model MIP | |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century, Inc | Model LS-2-M | |
| TOPO Small Animal Ventilator | Kent Scientific | RSP1006-05L | |
| Thermal pad | Stuart equipment | SBH130D | |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| Hematoxylin Solution | Sigma | GHS132 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma | HT110116 | |
| 10 mL Pipette | Thermo Scientific | 170356 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| O.C.T Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| cryosection machine | Leica | CM1950 | |
| Disposable Base Molds | Fisher HealthCare | 22-363-553 | |
| 18 gauge needle | Becton Dickinson | 305199 | |
| Povidone iodine | Fisher Scientific | 19-027132 | |
| 70% ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | |
| Infusion sets for single use | Weigao | SFDA 2012 3661704 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 | |
| Tapes | 3M Scotch | 8915 | |
| Cotton pad | Vinda | Dr.P | |
| Silicone prosthesis | Custom made | ||
| Brightfield microscope | Olympus | VS120 | |
| Ruler tool | Adobe Photoshop |
References
- Liu, Z., et al. MAPK-Mediated YAP Activation Controls Mechanical-Tension-Induced Pulmonary Alveolar Regeneration. Cell Rep. 16 (7), 1810-1819 (2016).
- Thurlbeck, W. M. Internal surface area and other measurements in emphysema. Thorax. 22 (6), 483-496 (1967).
- Knudsen, L., Weibel, E. R., Gundersen, H. J. G., Weinstein, F. V., Ochs, M. Assessment of air space size characteristics by intercept (chord) measurement: an accurate and efficient stereological approach. J Appl Physiol. 108 (2), 412-421 (2010).
- Weibel, E. R. Morphometry of the Human Lung. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1963).
- Duguid, J. B., Young, A., Cauna, D., Lambert, M. W. The internal surface area of the lung in emphysema. J Pathol Bacteriol. 88, 405-421 (1964).
- Branchfield, K., et al. Pulmonary neuroendocrine cells function as airway sensors to control lung immune response. Science. 351 (6274), 707-710 (2016).
- Ding, B. -S., et al. Endothelial-derived angiocrine signals induce and sustain regenerative lung alveolarization. Cell. 147 (3), 539-553 (2011).
- Dunnill, M. S. Quantitative methods in the study of pulmonary pathology. Thorax. 17 (4), 320-328 (1962).
- Weibel, E. R., Gomez, M. Architecture of the human lung. Use of quantitative methods establishes fundamental relations between size and number of lung structures. Science. 137 (3530), 577-585 (1962).
- Thurlbeck, W. M. The internal surface area of nonemphysematous lungs. Am Rev Respir Dis. 95 (5), 765-773 (1967).
- Butler, J. P., et al. Evidence for adult lung growth in humans. N Engl J Med. 367 (16), 244-247 (2012).
- Hsia, C. C. W., Herazo, L. F., Fryder-Doffey, F., Weibel, E. R. Compensatory lung growth occurs in adult dogs after right pneumonectomy. J Clin Invest. 94 (1), 405-412 (1994).
- Thurlbeck, S. W. M. Pneumonectomy in Rats at Various Ages. Am Rev Respir Dis. 120 (5), 1125-1136 (1979).
- Cagle, P. T., Langston, C., Thurlbeck, W. M. The Effect of Age on Postpneumonectomy Growth in Rabbits. Pediatr Pulmonol. 5 (2), 92-95 (1988).
- Langston, C., et al. Alveolar multiplication in the contralateral lung after unilateral pneumonectomy in the rabbit. Am Rev Respir Dis. 115 (1), 7-13 (1977).
- Cohn, R. Factors Affecting The Postnatal Growth of The Lung. Anatomical Record. 75 (2), 195-205 (1939).
- Hsia, C. C., Wu, E. Y., Wagner, E., Weibel, E. R. Preventing mediastinal shift after pneumonectomy impairs regenerative alveolar tissue growth. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 281 (5), L1279-L1287 (2001).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. -Y. S., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp. (73), e50318 (2013).
- Liu, S., Cimprich, J., Varisco, B. M. Mouse pneumonectomy model of compensatory lung growth. J Vis Exp. (94), (2014).
- Silva, M. F. R., Zin, W. A., Saldiva, P. H. N. Airspace configuration at different transpulmonary pressures in normal and paraquat-induced lung injury in rats. Am J Respir Crit Care Med. 158 (4), 1230-1234 (1998).
- Yilmaz, C., et al. Noninvasive quantification of heterogeneous lung growth following extensive lung resection by high-resolution computed tomography. J Appl Physiol. 107 (5), 1569-1578 (2009).
- Voswinckel, R., et al. Characterisation of post-pneumonectomy lung growth in adult mice. Eur Respir J. 24 (4), 524-532 (2004).
- Ravikumar, P., et al. Regional Lung Growth and Repair Regional lung growth following pneumonectomy assessed by computed tomography. J Appl Physiol. 97, 1567-1574 (2004).
- Gibney, B. C., et al. Detection of murine post-pneumonectomy lung regeneration by 18FDG PET imaging. EJNMMI Res. 2 (1), (2012).
- Muñoz-Barrutia, A., Ceresa, M., Artaechevarria, X., Montuenga, L. M., Ortiz-De-Solorzano, C. Quantification of lung damage in an elastase-induced mouse model of emphysema. Int J Biomed Imaging. 2012, (2012).
