Summary
내부 폐 표면적 (ISA)은 폐 질환 및 부상 유발 폐포 재생에서 폐 형태 및 생리학을 평가하는 데 중요한 기준입니다. 폐 절제술 및 인공 삽입물 마우스 모델에서 ISA의 측정 편향을 최소화 할 수있는 표준화 된 방법을 설명합니다.
Introduction
폐의 기본 기능은 혈관과 대기 사이의 산소와 이산화탄소의 교환입니다. 기관지 폐 이형성증 (BPD), 만성 폐색 성 폐 질환 (COPD) 및 급성 호흡기 감염과 같은 폐 질환은 ISA 2 를 감소시킵니다. 폐 질환을 연구하는 연구자들은 MLI, ILV, 기체 교환 단위 수, ISA 및 폐 조직 적합성 2 , 3을 포함하여 폐의 형태 학적 변화를 평가하기위한 몇 가지 정량적 방법을 개발했습니다. Weibel 등의 선구자 연구 4 및 Duguid et al. 5는 함께 ISA가 인간의 폐에서 폐 가스 교환 용량의 직접 척도로 사용될 수 있음을 입증했으며 기종의 심각성을 판단하는 기준으로 사용할 수있다. 지난 5 년 동안 발표 된 여러 연구에서 폐 형태 학적 매개 변수 ( 예 : 6 및 부상 PNX 1 (7)로부터 복구시 쥐의 폐에 형태 학적 및 기능적 변화를 평가한다. ISA는 식 1 8 , 9를 사용하여 계산됩니다.
, ILV 내부 폐 용적이며 MLI는 말초 폐 공역 10 크기를 나타내는 매개 변수이다.
하나 이상의 폐엽의 외과 적 제거 인 PNX는 인간 11 , 마우스 1 , 개 12 , 쥐 13 및 토끼 14 , 15를 비롯한 많은 종에서 폐포 재생을 유도하는 것으로 널리보고되었습니다. 스터드PNX 후 14 일째 생쥐의 폐는 기존 폐포의 팽창과 폐포의 새로운 형성 모두 남아있는 폐 조직에서 ISA, ILV 및 폐포의 수를 회복시키는 데 기여한다고보고했다 1 . 우리와 다른 사람들은 스폰지, 왁스 또는 주문형 보철물과 같은 재료를 PNX ( 즉 , 보철물 삽입) 후 빈 흉부 공동에 삽입하면 폐포 재생을 손상시키는 것으로 나타났습니다. 기계적 힘은 폐포 재생을 시작하는 가장 중요한 요인 중 하나로 작용한다고 확고하게 확립되었습니다 1 , 16 , 17 . 이러한 연구는 PNX 치료 및 인공 삽입물 폐에서 ISA 값을 사용하여 폐포 재생을 정량적으로 평가하는 기준으로 사용하는 것이 효과적이라는 것을 강조했습니다.
옵서버 바이어스는 측정 된 VA에 유의 한 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다.폐 형태 학적 매개 변수 ( 예 : MIL 및 ILV)에 대한 정보. 표준화 된 프로토콜은 ISA 계산에 사용 된 두 가지 매개 변수 인 ILV와 MLI를 결정할 때이 편향을 없애기 위해 사용할 수 있습니다. 여기서는 이러한 폐 매개 변수를 측정하기위한 매우 상세한 표준화 된 프로토콜을 제공합니다. 중요하게도, ISA를 정확히 정량화하는 능력은 손상 유발 폐포 재생 모델에서 폐 기능 연구의 신뢰성과 재현성을 향상시키고 다중 폐 질환에서 기계적 발견을 촉진해야한다고 약속한다.
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Protocol
이 프로토콜에 사용 된 모든 절차는 국립 생물 과학 연구소의 실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 지침의 권장 사항에 따라 수행되었습니다. 8 주된 CD-1 수컷 마우스를 실험이 수행 될 때까지 특정 병원균이없는 (SPF) 시설에 수용했다. 수술은 완전히 마취 된 마우스를 사용하여 수행되었습니다 ( 즉 , 발가락 핀치 반응없이). 수술 후 쥐는 충분한 음식과 담수가있는 따뜻하고 습기가 많은 방에 보관했다. 복강 내 주사에 의해 전달 된 과량의 마취제를 사용하여 마우스를 희생시켰다.
1. 마우스 PNX 수술
- 복막 내 (IP) 주사를 통해 sodium phenobarbital (120 mg / kg body weight)과 buprenorphine (0.1 mg / kg body weight)으로 마우스를 완전히 마취하십시오. 쥐가 더 이상 발가락에 눌려지지 않을 때 수술을하십시오.
- 화학 요원으로 마우스의 왼쪽 흉부에있는 머리카락을 제거하십시오.흉내 치료 (~ 3 x 3 cm 2 영역).
- 복부 측면이 조작자를 향하게하여 삽관 플랫폼에 각 마우스를 고정시킵니다 ( 그림 1A ).
- 마우스 혀를 당기고 유도 카테터 18 ( 그림 1A )에 대한 노치가 들어있는 작은 동물 후두경으로 성대를 밝히십시오.
- 호흡 중 성대의 움직임을 관찰하여 성대를 구분하십시오. 20G의 정맥 내 삽관 캐뉼라를 전방 각으로 기관에 부드럽게 삽입하십시오 19 .
- 우측 가로 누운 위치에 마우스를 위치시키고 기계적 인공 호흡기에 연결 캐 뉼러 (예를 들어, 제어 된 압력은, 재료의 도표 참조). 마우스 가슴 ( 그림 1B )의 호흡 움직임을 관찰하여 기관에 캐뉼라의 삽입을 확인합니다.
- 흡기 압력을 설정하십시오.f 인공 호흡기를 12cm H 2 O에 놓고 호흡 속도를 분당 120 회 호흡으로 설정합니다 ( 그림 1B ).
- 베타 딘과 70 % 에탄올로 수술 부위의 피부를 오염 제거하십시오.
- Noyes Spring Scissors (절삭 날 14 mm, 팁 직경 0.275 mm)로 피부와 근육을 절단하여 5 번째 늑간 간격의 공간에서 2 - 3 cm 외측 개흉술 절개를합니다 ( 그림 2B , C ). thoracotomy 절차에 사용되는 수술 악기는 사용하기 전에 소독됩니다.
- 5 번째 늑간에서 1.5 cm 절개하여 왼쪽 폐를 노출시킵니다 ( 그림 2D , E ). 수술 중 고열 소작 기계를 사용하여 출혈을 중지하십시오.
- 무뚝뚝한 팁 겸자 ( 그림 2F )와 가슴에서 왼쪽 폐엽의 3 분의 1을 들어 올린 다음 면봉을 사용하여 왼쪽 전체를 꺼내십시오폐 ( 그림 2G ).
- 왼쪽 폐엽의 폐동맥과 기관지를 확인하십시오 ( 그림 2G ).
- hilum에서 기관지와 혈관을 실크 수술 봉합사로 단단히 묶고 결찰 후 3 - 4 mm 지점에서 왼쪽 폐엽을 잘라냅니다 ( 그림 2H , I ).
참고 : 기흉을 일으킬 수있는 왼쪽 고관절의 봉합 매듭을 자르지 않도록주의하십시오 ( 즉 , 흉부의 공동에 공기 또는 가스가 발생할 수 있음) . - 1 봉합으로 가슴 벽을 닫은 다음 5 ~ 6 개의 중단 봉합을 사용하여 근육 층과 피부 층을 순차적으로 꿰맬 수 있습니다. 각 봉합사 사이에 3 - 4 mm 간격을 두십시오 ( 그림 2M , 2N ).
참고 : 외과 봉합 바늘을 심장에서 멀리 떨어지십시오. 부주의 한 심장 천자로 인해 즉시 사망 할 수 있습니다. - 포비돈 요오드로 수술 부위를 소독합니다.
- 애프터외과 수술에서 마우스를 38 ° 열 패드에 놓고 마우스를 인공 호흡 운동이 시작될 때까지 인공 호흡기에 연결하십시오 ( 그림 2O ).
2. 보형물 삽입
- PNX 절차의 1.1-1.13 단계를 수행하십시오 (즉, 마우스의 왼쪽 폐엽이 제거 될 때까지).
- 무딘 집게 ( 그림 2J )를 사용하여 실리콘 보철의 중심을 고정하십시오 (길이 12 mm, 두께 3 mm, 너비 7 mm, 0.2 g, 타원체 모양). 실리콘 삽입물을 삽입하기 전에 소독하십시오.
- 한 손으로 집게로 늑골을 잡고 흉강을 노출시킨 다음 다른 손으로 왼쪽 빈 가슴 흉강에 인공 삽입물을 삽입하십시오.
참고 : 삽입 각도는 보철의 정면과 흉부 표면 사이에서 약 45도입니다 ( 그림 2K ,L). 인공 삽입물 삽입시 매우 부드럽게하십시오. 과도한 힘은 흉막 파열로 이어질 것입니다. - 보철물이 왼쪽 빈 흉강을 차지하도록 무딘 집게로 보철물의 방향을 조정하십시오.
- 마우스 PNX 절차의 1.14-1.16 단계를 수행하십시오.
3. ILV 측정
- 일회용 혈청 피펫 (10 mL)에서 꺼낸 플런저, 바늘 어댑터가 달린 40 cm 길이의가요 관, 유속 조절 밸브 및 18 G 바늘로 구성된 맞춤 장치 ( "팽창 튜브")를 준비하십시오. 조립 후 테이프로 보드에 피펫을 고정시킵니다 ( 그림 3A ). 피펫 상단과 실험대 사이의 거리는 최소 30cm 이상이어야합니다.
- 55 ° C의 수 욕조에서 500 mL의 예비 가열 된 1x 인산 완충 생리 식염수 (PBS)에 20 g의 PFA를 용해시켜 신선한 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 고정 용액을 수동으로 흔들어서 준비하십시오용액이 깨끗해질 때까지 매 10 분마다. 실온으로 냉각시킨 후, 용액을 0.45 ㎛ 필터로 여과한다.
주의 : PFA를 취급 할 때는 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하십시오. - 과량의 마취제 (0.8 % 페노바르비탈 나트륨, 1,000 U / mL 헤파린)로 마우스를 희생시킵니다.
- 폴리스티렌 해부 플레이트에 각 마우스를 고정하고 70 % 알콜로 뿌리십시오.
- 조심스럽게 마우스 가슴을 열고 가위를 사용하여 흉골을 잘라내어 폐엽을 철저히 노출시킵니다.
- 기관을 가위로 가위로 과도한 조직을 제거하십시오. 기관과 식도를 분리하십시오.
- 복부 대동맥을 잘라 심장의 오른쪽 심실에 25 게이지 바늘을 삽입합니다. 이 삽입 전에 바늘을 20 mL 주사기에 연결하십시오. 폐가 흰색으로 변할 때까지 천천히 1x PBS를 심장에 밀어 넣어 혈액 세포를 제거하십시오. 일반적으로 폐 혈관을 치우기 위해 5 - 10 mL PBS가 필요합니다.
- 채우기e 4 % 신선한 PFA로 인플레이션 튜브를 주문 제작하고 인플레이션 튜브에서 모든 거품을 제거하십시오.
- 팽창 튜브의 18 게이지 바늘을 기관에 삽입하고 유체 누출을 피하기 위해 혈관 클립으로 기관을 클립하십시오.
- 25cm의 일정한 압력 경폐 / H 2 O 2 (20)에 4 % PFA와 폐 팽창. 완전히 확장 된 폐를 달성하기 위해 2 시간 동안 실온에서 폐를 품어. 이 "예비 고정"단계는 폐 형태를 보존하는 데 중요합니다.
- 팽창 튜브를 모니터링하여 초기 4 % PFA 볼륨의 값을 기록하고 최종 볼륨을 기록하십시오. 내부 폐 부피는 초기 4 % PFA 체적에서 최종 4 % PFA 체적을 뺀 값과 같습니다.
- 기관지를 가리고 가위로 가볍게 주변의 결합 조직에서 폐를 해부합니다 (폐를 손상시키지 않음). 폐를 손상시키지 않도록 매우 조심하십시오.
- 인큐4 ℃에서 12 시간 동안 4 % PFA로 채워진 50-mL 원추형 튜브에서 폐를 흔들어 쉐이커 (50 rpm)에서 부드럽게 흔들어줍니다. 조직 처리 및 염색으로 진행하십시오 (4 절 참조).
4. 조직 Embedding, 단면 및 Hematoxylin & Eosin (H & E) 염색
- 고정 후 Noyes Spring Scissors를 사용하여 폐에서 심장 및 과도한 결합 조직을 잘라냅니다. 폐 엽을 기관과 연결하는 기관지를 잘라내어 각 폐엽을 부드럽게 분리하십시오.
- 궤도 진탕 기 (50 rpm)에서 50 mL 1x PBS (30 분 / 세척)로 폐 엽을 3 ~ 4 회 씻어냅니다.
- 최종 세척 후, 조직이 50 ML 원추형 튜브 (약 12 H)의 바닥에 싱크 때까지 4 ° C에서 30 % 자당 솔루션 (1x PBS)에 그들을 immersing하여 폐엽을 cryoprotect.
- 조직을 임베딩하고 cryosectioning하기 전에 포셉과 튜브에서 폐엽 샘플을 제거하고, 액세스를 유지(sory lobes)을 이용하여 부엽 시료의 표면에서 남아있는 자당 용액을 추출한 다음 최적 절단 온도 (OCT) 화합물이 들어있는 페트리 접시에 시료를 약 30 분 동안 담그십시오.
- Cryomolds를 사용하여 액체 질소로 OCT 임베디드 액세서리 엽 샘플을 고정합니다. 로브의 가장 큰 표면적을 몰드 바닥에 평행하게 위치시킵니다.
- 조직학 분석을위한 cryosectioning 동안 각 샘플에 대한 총 세 μm의 두께 섹션을 준비합니다. 처음 1 mm 조직을 버리고 10 μm 두께의 부분을 하나씩 수집하고 0.5 mm 조직을 버리고 다른 부분을 수집 한 다음 0.5 mm 조직을 버리고 세 번째 (최종) 부분을 수집합니다.
- H & E 염색을하기 전에 1 시간 동안 공기 건조하십시오.
- H & E 얼룩 수행
- 수돗물을 3 ~ 4 차례 변경 한 다음 신선한 hematoxylin에서 2 분 동안 얼룩을 지우십시오; 흐르는 수돗물 아래의 섹션을 헹구십시오; 과량의 헤 마톡 실린을 제거하기 위해 1 % HCl-70 % 에탄올 용액에 2 번 섹션을 담그십시오.
- 3 분 동안 신선한 에오 신의 섹션 얼룩; 95 % 에탄올에서 2 번 연속으로 30 번 세척하고 100 % 에탄올로 2 번 30 번 세척하여 절편을 탈수시킵니다. 30 초 동안 크실렌의 단면을 깨끗이하고, 신선한 크실렌에서 1 회 제거 단계를 반복한다; 유리 coverslips를 사용하여 마운트 매체와 슬라이드를 탑재하십시오.
5. MLI의 정량화
- 명 시야 현미경을 사용하여 H & E로 염색 한 액세서리 로브 섹션 (20X 배율)의 디지털 이미지를 수집하십시오.
- MLI를 정량화하려면 3 개의 섹션으로 구성된 적절한 영역 (동맥 및 정맥, 주요기도 및 폐포 덕트 없음)에서 총 15 개의 중첩되지 않는 뷰 (1,000 μm x 1,000 μm)를 무작위로 선택하십시오.
- 10 개의 고르게 분포 된 수직선과 정의 된 len의 균등하게 분포 된 10 개의 수평선이있는 격자 배치눈금자 도구를 사용하여 선택한 영역에서 gth (1,000 μm); 따라서 각 라인은 100 μm 떨어져 있습니다 ( 그림 4B ).
- 하나의 절편 값을 인접한 두 개의 폐포 상피 사이의 직선 길이로 정의하십시오. 1,000 μm 길이 선을 따라 모든 절편 값을 측정하십시오.
- 각 그리드에 대해 가로 10 개, 세로 1,000 개, 세로 10 개 사이의 모든 절편 값을 계량화하십시오.
참고 : MLI는 각각의 액세서리 로브에 대해 준비된 3 개의 섹션 중에서 분석 된 총 15 개의 그리드로부터 절편 길이의 평균값입니다.
6. ISA의 계산
- 등식 1을 사용하여 ISA를 계산하십시오 ( 소개 참조). ILV의 측정에 대해서는 3 장을 참조하고 MLI의 정량화에 대해서는 5 장을 참조하십시오.
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Representative Results
우리는 여기서 PNX 치료군과 인공 삽입물 (인공 삽입물)을 사용한 실험을 수행했습니다. 이러한 그룹은 이전에 발표 된 연구 그룹의 연구에서 사용한 그룹과 동일합니다 14 .
마우스 PNX 및 보철물 삽입 절차는 그림 2에 나와 있습니다. 8 주 된 CD-1 수컷 마우스가 수술과 정량화에 사용됩니다. PNX로 치료 한 군과 인공 삽입물을 삽입 한 군에서 좌측 폐엽을 모두 절제 하였다 ( 그림 2A - 2I ). 인공 삽입물 군에서는 좌측 폐 엽을 제거한 후 좌측 폐 엽의 크기와 모양을 모방 한 인공 삽입물을 가슴에 삽입했습니다 ( 그림 2J - 2L ).
수술 후 14 일째 남은 오른쪽 폐의 ILV를 결정하기 위해 주문 제작 된 팽창 튜브를 사용했다 ( 그림 3A ). 나머지 오른쪽의 평균 ILV 5 PNX 처리 마우스의 폐가 약 1.4 mL로 5 개의 보철물이 삽입 된 마우스의 오른쪽 폐의 1.05 mL ILV 값보다 유의하게 높았다 ( 그림 3B , 표 1 ).MLI 측정을 위해 각 마우스에서 준비된 3 개의 섹션 중에서 총 15 개의 뷰를 분석했습니다. 그림 4A 는 액세서리 로브 섹션에서 병합 된 이미지와 MLI의 부량에 사용되는 선택된 영역 ( 예 : 뷰 1 - 3) 또는 선택되지 않은 영역 ( 예 : 뷰 4 - 5)에 대한 형태 학적 표준을 보여줍니다. 여기에서 PNX로 치료 한 그룹의 부속 폐 폐엽 단면으로부터의 3 번을MLI의 측정 ( 그림 4B ). 또한, 뷰 (3)의 확대 된 화상은 설명을 위해 디스플레이된다 ( 도 5a ). 라인 3은 예로서 제시된다 : 양두형 화살표 라인에 의해 표시된 차단 된 폐포 공기 공간의 길이. 우리의 분석에 따르면 PNX로 처리 한 마우스의 나머지 오른쪽 폐의 MLI 값은 보형물이 삽입 된 마우스의 나머지 오른쪽 폐의 MLI 값보다 훨씬 컸습니다 ( 그림 5B , 표 1 ). 모든 데이터는 평균 ± SEM ( 도 5B ).
ISA는 식 1을 사용하여 계산되었습니다. 표 1 은 모든 폐의 ILV 값, MLI 값 및 ISA를 보여줍니다. 보형물 주입 마우스의 ISA는 PNX 처리 마우스의 ISA보다 유의하게 작았으며, 삽입 마우스보철물의 n은 PNX 유도 재생을 손상시켰다.
그림 1 : 마우스 Endotracheal 삽관 법 및 기계 환기. ( A ) 후두 경간 경유 20 G 정맥 삽관 캐뉼라로 기관 내 삽관. ( B ) 수술 전에 완전 마취 된 마우스를 압력 조절 식 인공 호흡기에 연결하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 마우스 폐렴 절제술 (PNX) 및 보철물 삽입. ( A - C ) 피부와 근육층을 자릅니다. B 중지외과 수술 중 고온 소작술로 출혈. ( D - E ) 5 번째 늑간 공간에서 1.5 cm 절개합니다. ( F - H ) 무뚝뚝한 집게로 왼쪽 폐엽을 당기고 폐동맥과 기관지를 확인하고, 고관절에 결찰하십시오. 화살촉은 왼쪽 폐엽의 폐동맥과 기관지를 나타냅니다. ( I ) 왼쪽 폐엽을 결찰 후 3-4 mm 지점에서 절제 하였다. ( J - L ) 왼쪽 흉강에 보철물을 삽입하십시오. ( M, N ) 가슴, 근육층 및 피부층을 봉합합니다. ( O ) 자발적인 호흡 운동이 시작될 때까지 마우스를 모니터하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 남아있는 폐의 내부 폐활량 (ILV) 측정. ( A ) 내부 폐 부피를 측정하기위한 맞춤 장치 ( "팽창 튜브"). ( B ) PNX 치료군과 인공 삽입물 군의 나머지 오른쪽 폐의 ILVs (평균 ± SEM)는 PNX 후 14 일째에 측정되었다. **, p <0.01, 학생 t- 검사 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 남은 오른쪽 폐에서 액세서리 로브의 평균 선형 차단 (MLI)의 부량. ( A ) 병합 된 메신저액세서리 로브 섹션의 나이가 표시됩니다. MLI 수치화에 사용되는 선택 영역 ( 예 : 보기 1 - 3) 및 선택되지 않은 영역 ( 예 : 보기 4 - 5)의 예 ( B ) 10 개의 일정한 간격의 수직선과 10 개의 일정한 간격의 수평선 (1,000 μm)이 선택된 영역에 배치되었습니다. 눈금 막대 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : PNX 치료 폐 및 보형물 이식 폐에서 MLI의 정량화. ( A ) 도 4B 의 확대 도 3이 도시된다. 이중 화살촉이있는 붉은 색 선은 하나의 선형 절편의 길이를 나타냅니다. ( B ) MLI 값 (mean ± SEPNX 처리 마우스 및 보형물 삽입 마우스의 부엽 (葉)의 수는 PNX 후 14 일째에 측정되었다. *, p <0.05, 학생 t- 검사 . 스케일 바 : 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 수술 후 14 일 | 내부 폐 용적 (ml) | 평균 선형 절편 (mm) | 폐 내부 표면적 = 4ILV / MLI (cm 2) |
| PNX 처리 | 1.5 | 57.8 | 1038.06 |
| 1.35 | 49.6 | 1088.71 | |
| 1.42 | 48.5 | 1171.13 | |
| 1.4 | 51.5 1087.38 | ||
| 1.4 | 54.6 | 1025.64 | |
| 보철 삽입 | 1.1 | 49.6 | 887.10 |
| 1 | 50.5 | 792.08 | |
| 1.1 | 47.3 | 930.23 | |
| 1.15 | 44.8 | 1026.79 | |
| 0.86 | 46.3 | 742.98 |
표 1 : PNX 처리 및 보철 주입 마우스의 ISA 값 계산 PNX 후 14 일째 부속 낭의 ILV, MLI 및 ISA 값
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Discussion
이 프로토콜에서는 마우스 왼쪽 폐 PNX 및 보철물 삽입 후 폐 매개 변수 측정에 대한 자세한 설명을 제공합니다. ISA는 현재 많은 폐 질환 및 부상 유발 폐포 재생에서 호흡 기능 평가의 주요 척도로 간주됩니다. 그러나 폐 연구 공동체가 ISA의 유용성에 관해서는 유용한 척도로 동의하고 있지만 현재까지는 ISA를 계산하는 데 사용 된 두 가지 매개 변수 인 ILV 및 MLI 측정의 표준화에 대해서는 거의 고려되지 않았습니다. 모든 측정과 마찬가지로 분명히 편향된 데이터를 얻는 것이 중요합니다. 현재 연구 노력의 핵심 목표는 쥐 폐 연구 공동체가 사용하기위한 표준화 된 프로토콜을 확립하는 것이다.
우리는이 프로토콜을 개발할 때 여러 가지 방법으로 측정 바이어스의 출처를 줄이려고했습니다. 우리는 ILV 측정에서의 변화가 적색기관에 삽입 된 바늘의 크기가 차원 적으로 일치하는지 확인하여 유체 누출을 방지함으로써 예방할 수 있습니다 (18 게이지 바늘은 마우스 기관과 매우 유사합니다). 우리는 또한 PFA 팽창 이전에 마우스 흉부 벽을 철저히 제거해야한다는 것을 발견했다. 이는 ILV 측정에서 가슴 벽의 잠재적 인 영향을 최소화하기 때문이다. MLI 값은 폐포 형태학에 크게 의존합니다. 따라서 연령 일치 및 성 대조 마우스 사용의 중요성 외에도 폐 고정 과정에서 폐포 형태의 적절한 유지 관리가 매우 중요합니다. 우리는 여기에 널리 채택 고정 방법을 사용 : 우리가 완전히 폐 조직을 팽창하기 위해 새로 제조 된 4 % PFA와 25cm의 H 2 O의 경폐 압력으로 폐를 팽창. 우리의 경험에서 압박감이 낮 으면 조직 수축, 비정상적인 폐포 형태로 이어져 궁극적으로 MLI 값이 낮아질 수 있습니다.
에 관측우리의 이전 연구는 PNX 재생 후, 나머지 폐의 부엽이 다른 폐의 3 엽과 비교하여 최대 체적 팽창을 나타냄을 나타 냈습니다. 남아있는 폐의 부엽도 형태 학적 매개 변수 ( 예 : MLI) 21 , 22 , 23 , 24 의 값에서 최대 증가를 보입니다. 그러므로 우리는 단지 다른 폐엽의 편차를 피하기 위해 부엽의 절편만을 분석했습니다. MLI의 정량화에 사용 된 다양한 섹션 간의 편차를 줄이기 위해 삽입하는 동안 로브의 방향을 제어했습니다. 우리는 로브의 가장 큰 표면을 저온 냉각 장치의 바닥과 평행하게 배치했습니다. 우리는 또한 절편시 샘플 조각의 두께, 절편 샘플링 순서 및 절단 위치를주의 깊게 조절했습니다. 샘플 처리 외에도 다른 importan표준화의 측면은 모든 동맥과 정맥, 흉막, 주요기도 및 폐포 덕트가 MLI 정량화 과정에서 평가되는 조직 영역에서 제외되어야한다는 것입니다. 동맥, 정맥 및 폐포 덕트는 모두 폐포보다 크기가 커서 (4 ~ 10 배), 이러한 큰 구조물을 제외하면 신뢰할 수있는 절편 측정을 얻는 데 중요합니다. 각 그룹에 대해 5 마리의 마우스가 정량화에 적합합니다. 각 마우스에 대해 부엽의 3 개 섹션 중 적절한 영역 (동맥 및 정맥, 주요기도 및 폐포 덕트 없음)에서 무작위로 총 15 개의 중첩되지 않는 뷰 (1,000 μm x 1,000 μm)를 선택했습니다. 샘플 삽입 방법 및 MLI 측정은 파라핀 처리 된 폐 조직에도 적용될 수 있습니다.
다른 것들은 MLI를 전체 라인 길이를 교차 된 치조 벽 25를 가진 인터셉터의 수로 나눈 값으로 정의 하였지만, 여기서는 선형 길이를 선형 길이로 사용했습니다MLI 계산에서 두 개의 인접한 폐포 상피 벽 사이에, MLI 데이터로부터 간엽의 두께를 무시한 것. 따라서, 우리는 ILV를 사용하여 ISA를 계산하였으나 총 폐량은 계산하지 않았다.
PNX 및 보철물 삽입 절차의 경우 PNX를받는 생쥐의 생존율은 85 %에서 90 %까지 다양했습니다. 보철물 이식을받는 생쥐의 생존율은 ~ 80 % 정도였습니다. 모든 수술 중에 생쥐 생존율을 높이기 위해 여러 단계를 거쳐야합니다. 1)기도에 카테터를 올바르게 삽입하는 것이 성공적인 PNX 수술을위한 전제 조건입니다. 후두경의 안내에 따라 안전하고 효과적인 기관 내 삽관을 용이하게하기 위해 마우스의 기관을 쉽게 관찰 할 수 있습니다. 2) 수술 중에 폐나 심장을 뚫지 마십시오. 다섯 번째 왼쪽 늑간 공간의 흉부가 넓게 열려 있는지, 그리고 좌측 엽의 hilum이 lobectomy 이전에 명확하게 확인되었는지 확인하십시오. 왼쪽 폐엽을 다시 수행 할 때섹션에서 폐 출혈 및 / 또는 폐엽의 파열을 피하기 위해 무딘 집게를 사용하여 왼쪽 엽이 손상되지 않았는지 확인하십시오. 상처 봉합 중에 수술 바늘의 끝을 심장과 폐에서 멀리 떨어지십시오. 3) 과도한 힘이 흉막의 파열을 일으킬 수 있으므로 빈 가슴 틈에 보철물을 삽입 할 때 조심하십시오. 4) 수술 후 저체온이 마우스 이환율을 증가시키는 것으로 알려져 있으므로 마우스를 38 ° 열 패드 위에 놓고 감각이 회복 될 때까지 모니터해야합니다.
좌측 폐엽을 제거한 후, 폐 호흡기와 내부 폐가 스 영역 모두가 현저히 감소되었다. 수술 후 14 일째 남아있는 폐 조직의 ILV, MLI, ISA는 PNX로 치료 한 군에서 인공 삽입물 군에 비해 유의하게 더 컸다. 이는 인공 삽입물이 삽입 된 PNX 유도 폐포 재건. 따라서, PNX 및 보철 - 주입 마우스 모드ls는 기계적 힘 유도 재 폐구 (re-alveolarization) 도중에 발생하는 세포 및 분자 현상을 조사하기위한 강력한 도구로 사용될 수 있습니다. 또한 얍 AT2 널 폐 ISA 값은 우리의 프로토콜은 또한 유전자 변이 생쥐의 손상 회복을 검출하기에 적합한 것을 나타내는 PNX 후 14 일 (1)에서 제어 폐보다 크게 적었다. 이 연구에서 제시된 엄격하고 표준화 된 정량적 방법은 발달 연구 및 만성 폐색 성 폐 질환의 폐기종, 폐 손상 후 폐포 재생 및 폐 발달과 같은 여러 질병의 유전자 변형 동물 모델을 사용하여 폐 매개 변수와 ISA를 측정하는 데 적용 할 수 있습니다 결함.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 북경 생물 과학 연구소 (Beijing Institute of Biological Sciences)에 도움을 청한다. 이 연구는 베이징 시립 자연 과학 재단 (No. Z17110200040000)의 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low cost cautery kit | Fine Science Tools | 18010-00 | |
| Noyes scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Vessel clips | Fine Science Tools | 18374-44 | |
| I. V. Cannula-20 gauge | Jinhuan Medical Product Co., LTD. | 29P0601 | |
| Surgical suture | Jinhuan Medical Product Co., LTD. | F602 | |
| Mouse intubation platform | Penn-Century, Inc | Model MIP | |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century, Inc | Model LS-2-M | |
| TOPO Small Animal Ventilator | Kent Scientific | RSP1006-05L | |
| Thermal pad | Stuart equipment | SBH130D | |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| Hematoxylin Solution | Sigma | GHS132 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma | HT110116 | |
| 10 mL Pipette | Thermo Scientific | 170356 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| O.C.T Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| cryosection machine | Leica | CM1950 | |
| Disposable Base Molds | Fisher HealthCare | 22-363-553 | |
| 18 gauge needle | Becton Dickinson | 305199 | |
| Povidone iodine | Fisher Scientific | 19-027132 | |
| 70% ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | |
| Infusion sets for single use | Weigao | SFDA 2012 3661704 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 | |
| Tapes | 3M Scotch | 8915 | |
| Cotton pad | Vinda | Dr.P | |
| Silicone prosthesis | Custom made | ||
| Brightfield microscope | Olympus | VS120 | |
| Ruler tool | Adobe Photoshop |
References
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