Summary
Intern lungyta (ISA) är ett kritiskt kriterium för bedömning av lungmorfologi och fysiologi vid lungsjukdomar och skada-inducerad alveolär regenerering. Vi beskriver här en standardiserad metod som kan minimera mätförskjutningen för ISA i både lungpneumonektomi och protesimplantationsmusmodeller.
Introduction
Lungens grundläggande funktion är utbyte av syre och koldioxid mellan blodkärl och atmosfären. Lungsjukdomar som bronkopulmonell dysplasi (BPD), kronisk obstruktiv lungsjukdom (COPD) och akut respiratoriska infektioner resulterar i minskad ISA 2 . Forskare som studerar lungsjukdomar har utvecklat flera kvantitativa metoder för att utvärdera morfologiska förändringar i lungorna, inklusive MLI, ILV, antal gasutbytesenheter, ISA och lungvävnadsöverensstämmelse 2 , 3 . Banbrytande studier av Weibel et al. 4 och Duguid et al. 5 fastställde tillsammans att ISA kan användas som en direkt åtgärd av lunggasutbytesförmåga i människa lungor och kan användas som kriterium för att bestämma emfysem svårighetsgrad. Ett antal studier som publicerats under de senaste fem åren har använt lungmorfologiska parametrar ( t.ex. 6 och under återhämtning från skada PNX 1 , 7 . ISA beräknas med användning av ekvation 1 8 , 9 :
, Där ILV är den interna lungvolymen och MLI är en mellanliggande parameter som representerar lungens perifera luftrumsstorlek 10 .
PNX, det kirurgiska avlägsnandet av en eller flera lunglober, har rapporterats allmänt för att inducera alveolär regenerering hos många arter, inklusive människor 11 , möss 1 , hundar 12 , råttor 13 och kaniner 14 , 15 . En studY av mösslungor vid fjorton dagar efter PNX visade att både expansionen av existerande alveoler och de novo- bildningen av alveoler bidrar till återställandet av ISA, ILV och antalet alveoler i de återstående lungvävnaderna 1 . Vi och andra har visat att införandet av material som svamp, vax eller en anpassad protes i den tomma bröstkaviteten efter PNX ( dvs protesimplantation) försämrar alveolär regenerering. Det är nu bestämt att mekanisk kraft fungerar som en av de viktigaste faktorerna för initiering av alveolär regenerering 1 , 16 , 17 . Sådana studier har framhävt effektiviteten av att använda ISA-värden från PNX-behandlade och protes-implanterade lungor som ett kriterium för att kvantitativt utvärdera alveolär regenerering.
Observera bias är känt för att väsentligt påverka uppmätt vaLues för lungmorfologiska parametrar ( t.ex. MIL och ILV). Standardiserade protokoll kan användas för att eliminera denna bias vid bestämning av både ILV och MLI, vilka är de två parametrar som används vid beräkningen av ISA. Här tillhandahåller vi mycket detaljerade, standardiserade protokoll för mätning av dessa lungparametrar. Det är viktigt att förmågan att noggrant kvantifiera ISA lovar att förbättra tillförlitligheten och reproducerbarheten av studier av lungfunktion i skadade inducerade alveolära regenereringsmodeller och bör underlätta mekaniska upptäckter vid flera lungsjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som används i detta protokoll utfördes i enlighet med rekommendationerna i riktlinjerna för vård och användning av laboratoriedjur vid National Institute of Biological Sciences, Beijing. 8 veckor gamla CD-1 hanmöss hölls i en specifik patogenfri (SPF) anläggning tills experimenten genomfördes. Surgerier utfördes med användning av fullständigt bedövade möss ( dvs utan tånklämningsresponser). Efter operationen behöll mössen i ett varmt, fuktigt rum med tillräcklig mat och färskvatten. Mössen offrades med användning av en överdosering av bedövning levererad genom intraperitoneal injektion.
1. Mus PNX-kirurgi
- Helbedöva mössen med natriumfenobarbital (120 mg / kg kroppsvikt) och buprenorfin (0,1 mg / kg kroppsvikt) via intraperitoneal (IP) injektion. Utför kirurgi när möss inte reagerar på tån.
- Ta bort håret på vänster bröstkorg hos mössen med kemisk depåIlatory treatment (~ 3 x 3 cm 2 area).
- Säkra varje mus på en intubationsplattform med sin ventrala sida vänd mot operatören ( Figur 1A ).
- Dra ut muskulaturen och belysa vokalband med ett litet laryngoskop med litet djur som innehåller ett hak för att leda katetrar 18 ( Figur 1A ).
- Distingudera vokalband genom att observera rörelserna i vokalband under andning. Sätt försiktigt in en 20 G intravenös intubationskanyl i luftröret i en främre vinkel 19 .
- Placera möss i ett höger sidoläge och koppla kanylen till en mekanisk ventilator ( t.ex. tryckstyrd, se materialet ). Kontrollera infästningen av kanylen i luftstrupen genom att observera muskammarens andningsrörelser ( Figur 1B ).
- Ställ in det inspirerande trycket of ventilatorn till 12 cm H2O och ställ in andningsfrekvens till 120 andetag per minut (Figur 1B).
- Dekontaminera huden i operationsområdet med betadin och 70% etanol.
- Gör en 2 - 3 cm posterolateral thorakotomi snitt i utrymmet vid 5: e mellankroppen, skär genom huden och musklerna med Noyes Spring Scissors (skärkant: 14 mm, spetsdiameter: 0,275 mm) ( Figur 2B , C ). Kirurgiska instrument som används för thorakotomi-förfarandet steriliseras före användning.
- Gör ett 1,5 cm snitt vid 5: e mellankostutrymmet för att exponera vänster lunga ( Figur 2D , E ). Under operationen ska du använda en högtemperaturkärl för att stoppa blödningen.
- Lyft en tredjedel av den vänstra lungloben från bröstet med trubbiga spetspincett ( figur 2F ) och använd sedan en bomullspinne för att dra ut hela vänsterLunga ( figur 2G ).
- Identifiera lungartären och bronkierna i vänstra lungloben ( Figur 2G ).
- Lätt ligera bronkierna och kärlen i hilumet med en silk kirurgisk sutur och skär ut den vänstra lungloben vid 3-4 mm från ligationen ( Figur 2H , I ).
OBS! Var försiktig så att du inte skär av suturknutarna på vänster hilum, vilket kan orsaka pneumotorax ( dvs. luft eller gas i bröstkorgens hålrum) . - Stäng bröstväggen med 1 sutur, och stik sedan muskelskiktet och skiktet i följd med 5-6 avbrutna suturer. Lämna ett gap mellan 3 och 4 mm mellan varje sutur ( Figur 2M , 2N ).
OBS: Håll den kirurgiska suturnålen bort från hjärtat; Oavsiktlig hjärtpickning kommer att resultera i omedelbar död. - Desinficera det kirurgiska området med povidon-jod.
- afteR kirurgisk operation, placera musen på en 38 ° C termisk kudde och anslut musen till ventilatorn tills spontana andningsrörelser börjar ( Figur 2O ).
2. Protesimplantation
- Utför steg 1.1 - 1.13 i PNX-proceduren (det vill säga upp till den punkt då musens vänstra lunglob är borttagen).
- Klämma i mitten av silikonprotesen (kundtillverkad, 12 mm i längd, 3 mm i tjocklek, 7 mm i bredd, 0,2 g, ellipsoidformad) med hjälp av trubbiga tångar ( Figur 2J ). Sterilisera silikonprotesen före införandet.
- Håll revbenet med tångar med en hand för att exponera bröstkaviteten, och sätt sedan in protesen i den vänstra tomma bröstkaviteten med en annan hand.
OBS: Insättningsvinkeln är ungefär 45 grader mellan protesens främre plan och bröstytan ( Figur 2K ,L). Var väldigt försiktig när du sätter in protesen. Överdriven kraft kommer att resultera i pleurala rupturer. - Justera protesens orientering med trubbiga tångar för att säkerställa att protesen upptar den vänstra tomma bröstkaviteten.
- Utför steg 1.14 - 1.16 av mus PNX proceduren.
3. Mätning av ILV
- Förbered en anpassad enhet ("inflationsrör") som består av en kolv borttagen från en engångs serologisk pipett (10 ml), ett 40 cm långt flexibelt rör med en nåladapter, en flödesreglerventil och en 18 G nål. Efter montering, säkra pipetten på ett bräda med tejp ( Figur 3A ). Avståndet mellan pipettens övre del och försöksbänken måste vara minst 30 cm.
- Förbered färsk 4% paraformaldehyd (PFA) fixeringslösning genom att lösa 20 g PFA i 500 ml förvärmd 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i ett 55 ° C vattenbad, skaka manuellt påUppe varje 10 min tills lösningen är klar. Efter kylning till rumstemperatur, filtrera lösningen med ett 0,45 μm filter.
VARNING: Använd lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) vid hantering av PFA. - Offermöss med överdosering av narkos (0,8% fenobarbitalnatrium, 1000 U / ml heparin).
- Säkra varje mus på en polystyren-dissektionsplatta och spray den med 70% alkohol.
- Öppna försiktigt muskisten och skär ut båren med hjälp av sax för att grundligt exponera lungloberna.
- Ta bort överdriven vävnad med hjälp av sax för att exponera luftröret. Se till att separera luftröret från matstrupen.
- Klipp abdominal aorta och sätt in en 25-gauge nål i hjärtans högra hjärtkärl; Anslut nålen till en 20 ml spruta innan denna införs. Tryck långsamt 1x PBS i hjärtat för att ta bort blodceller tills lungorna blir vita. Typiskt krävs 5 - 10 ml PBS för att rensa lungkärlen.
- Fyll thE skräddarsydda inflationsrör med 4% färsk PFA och ta bort alla bubblor från inflationsröret.
- Sätt in 18-gauge nålen i inflationsröret i luftröret och klistra i luftröret med kärlklämmor för att undvika vätskeläckage.
- Blåsa lungorna med 4% PFA vid ett konstant lungtryck av 25 cm / H 2 O 2, 20. Inkubera lungorna vid rumstemperatur i 2 timmar för att uppnå fullständigt expanderade lungor. Detta "prefix" -steg är avgörande för att bevara lungmorfologin.
- Genom att övervaka inflationsröret registrerar du värdet på den ursprungliga 4% PFA-volymen och registrerar slutvolymen. Den interna lungvolymen motsvarar den initiala 4% PFA-volymen minus den slutliga 4% PFA-volymen.
- Lätt luftröret och använd sax, dissekera försiktigt ut lungorna (håll lungorna intakta) från omgivande bindväv. Var mycket försiktig för att undvika att skada lungorna.
- IncuBada lungorna i ett 50 ml koniskt rör fyllt med 4% PFA i 12 timmar vid 4 ° C med försiktig skakning på en skakare (50 rpm). Fortsätt till vävnadsbehandling och färgning (se avsnitt 4).
4. Tissue Embedding, Sectioning och Hematoxylin & Eosin (H & E) Staining
- Efter fixering, använd Noyes Spring Scissors för att trimma hjärtat och överdriven bindväv från lungorna. Skär försiktigt de enskilda lungloberna genom att klippa bort bronkinet som förbinder lungloberna i luftstrupen.
- Tvätta lungloben 3 - 4 gånger i 50 mL 1x PBS (30 min / tvätt) på en orbital shaker (50 rpm).
- Efter den slutliga tvätten krypskyddas lungloberna genom att nedsänka dem i en 30% sackaroslösning (i 1x PBS) vid 4 ° C tills vävnaden sänker sig till botten av de 50 ml koniska rören (cirka 12 timmar).
- Före inbäddning och kryosektion av vävnaderna, ta bort lunglobproverna från rören med pincett, behåll accessenSörjande lobes för den histologiska analysen, dab den återstående sackaroslösningen från ytan av tillbehörslobproverna och försiktigt försiktigt provet i en petriskål som innehåller en optimal skärningstemperatur (OCT) -förening i ca 30 min.
- Frys de OCT-inbäddade tillbehörslobproverna i flytande kväve med hjälp av kryoljor. Placera lobens största ytarea parallellt med formens botten.
- Förbereda totalt tre 10 μm tjocka sektioner för varje prov under kryosektion för histologisk analys. Kassera den första 1 mm vävnaden, samla en 10 μm tjock sektion, kassera 0,5 mm vävnad, samla in en annan sektion, kassera 0,5 mm vävnad och samla den tredje (sista) delen.
- Torka av sektionerna i 1 h innan du utför H & E-färgning.
- Utför H & E-färgning
- Tvätta sektionerna i 3 - 4 förändringar av kranvatten och fläck sedan av sektionerna i friskt hematoxylin i 2 minuter; Skölj avsnittet under rinnande kranvatten. Fördjupa sektionen två gånger i en 1% HCl-70% etanollösning för att avlägsna överskott av hematoxylin.
- Stänk sektionen i färskt eosin i 3 minuter; Dehydrera sektionerna med två på varandra följande 30 s tvättar i 95% etanol och två 30 s tvättar med 100% etanol; Rensa sektionerna i xylen i 30 s, upprepa clearingsteget en gång i färskt xylen; Montera glidbanorna med monteringsmedium med glasskydd.
5. Kvantificering av MLI
- Förvärva digitala bilder av H & E-färgade tillbehörslobsektionerna (20X förstoring) med hjälp av ett ljusfältmikroskop.
- För att kvantifiera MLI väljer du totalt 15 icke överlappande vyer (1000 μm x 1000 μm) slumpmässigt från de lämpliga områdena (utan artärer och vener, huvudvägar och alveolära kanaler) med 3 sektioner.
- Placera ett rutnät med 10 jämnt fördelade vertikala linjer och 10 lika fördelade horisontella linjer med definierad lenGth (1000 μm) på de valda områdena med hjälp av ett linjalverktyg; Varje linje är sålunda åtskild 100 μm ifrån varandra ( figur 4B ).
- Definiera värdet av en avlyssning som den linjära längden mellan två intilliggande alveolära epiteler. Mäta värdena på alla avlyssningar längs varje 1000 μm längdlinje.
- För varje rutnät, kvantifiera värdena för alla avlyssningar bland de 10 horisontella 1,000 μm längdlinjerna och de 10 vertikala 1 000 μm längdlinjerna.
OBS: MLI är medelvärdet för avlyssningslängderna från totalt 15 rutor analyserade bland de 3 sektionerna som är förberedda för var och en av accessoarloberna.
6. Beräkning av ISA
- Beräkna ISA med hjälp av ekvation 1 (se Introduktionen ). Se avsnitt 3 för mätning av ILV och hänvisa till avsnitt 5 för kvantifiering av MLI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi utförde här ett experiment med en PNX-behandlad grupp och en protesimplantation (protesimplantat) grupp. Dessa grupperingar är desamma som de grupperingar som användes i en tidigare publicerad studie från vår forskningsgrupp 14 .
Mus PNX och protesimplantationsprocedurer visas i Figur 2 . 8 veckor gamla CD-1 manliga möss används för operationerna och för kvantifiering. I den PNX-behandlade gruppen och den protes-implanterade gruppen återvände de vänstra lungloberna båda ( Figur 2A - 2I ). I den protesimplanterade gruppen infördes en protes som efterliknar storleken och formen på den vänstra lungloben i bröstet efter att den vänstra lungloben togs bort ( Figur 2J - 2L ).
Fjärde dagar efter operationen användes ett skräddarsytt inflationsrör för att bestämma ILV för de återstående högerlungorna ( Figur 3A ). Den genomsnittliga ILV för den återstående höger Lungorna hos de 5 PNX-behandlade mössen var ungefär 1,4 ml, signifikant högre än 1,05 ml ILV-värden av de högra lungorna hos de 5 protesimplanterade mössen ( Figur 3B , Tabell 1 ).För MLI-mätningen analyserades totalt 15 visningar bland de 3 sektionerna som framställdes från varje mus. Figur 4A visar en sammanslagen bild från en tillbehörslobsektion och den morfologiska standarden för ett valt område (t ex vy 1 - 3) eller ett icke valt område (t ex vy 4-5) som används för kvantifiering av MLI. Här ses vy 3 från en tillhörande lunglobsektion i den PNX-behandlade gruppen som ett exempel förMätningen av MLI ( figur 4B ). En förstorad bild av bild 3 visas också för illustration ( figur 5A ). Linje 3 presenteras som ett exempel: längden på ett avlyssat alveolärt luftutrymme som indikeras av dubbelpilad pillinjer. Vår analys visade att MLI-värdena i de resterande högerlungorna hos de PNX-behandlade mössen var signifikant större än de av de återstående högerlungorna hos de protesimplanterade mössen ( Figur 5B , Tabell 1 ). Alla data presenteras som medelvärdet ± SEM ( Figur 5B ).
ISA beräknades med användning av ekvation 1 . Tabell 1 visar ILV-värdena, MLI-värdena och ISA hos alla lungor. ISA av de protesimplanterade mössen var signifikant mindre än för de PNX-behandlade mössen, vilket demonstrerade att insertionenN av protesförsvagad PNX-inducerad regenerering.
Figur 1: Endotracheal musintubation och mekanisk ventilation. ( A ) Endotracheal intubation med en 20 G intravenös intubationskanyl via laryngoskopi. ( B ) Anslut den helt anestesierade musen till en tryckstyrd mekanisk ventilator före operationen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Muspneumonektomi (PNX) och protesimplantation. ( A - C ) Skär huden och muskelskiktet; Sluta bHöjning med en högtemperatur-värmeväxlare under operationsoperationen. ( D - E ) Gör ett 1,5 cm snitt vid 5: e mellankostrummet. ( F - H ) Dra ut vänster lunglobe med trubbiga tångar och identifiera lungartären och bronkierna, ligate vid hilum. Arrowheads representerar lungartären och bronkierna i vänster lunglobe. ( I ) Den vänstra lungloben resekterades vid 3 - 4 mm från ligationen. ( J - L ) Sätt en protes i vänster bröstkorg. ( M, N ) Sutur bröstet, muskelskiktet och hudskiktet. ( O ) Övervaka mössen tills spontana andningsrörelser börjar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Mätning av de inre lungvolymerna (ILV) hos de återstående högerlungorna. ( A ) En anpassad anordning ("inflationsrör") för att mäta de interna lungvolymerna. ( B ) ILV: erna (medelvärdet ± SEM) av de återstående högerlungorna i den PNX-behandlade gruppen och protesimplantatmätningen mättes 14 dagar efter PNX. **, p <0,01, Studentens t- test. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Kvantifiering av medellinjäravskiljningen (MLI) för tillbehörsklubbar i de återstående högerlungorna. ( A ) En sammanslagna imÅlder för en tillbehörslobsektion visas. Exempel på utvalda områden ( t.ex. bild 1 - 3) och icke-valda områden ( t.ex. bild 4 - 5) som används för MLI-kvantifiering. ( B ) 10 jämnt fördelade vertikala linjer och 10 jämnt fördelade horisontella linjer med definierad längd (1000 μm) placerades på det valda området. Skala bar = 1 mm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Kvantificering av MLI i PNX-behandlade lungor och protesimplanterade lungor. ( A ) En förstorad bild av vy 3 i figur 4B visas. Rödfärgade linjer med dubbla pilhuvud representerar längden på en linjär avlyssning. ( B ) MLI-värdena (medelvärde ± SEM.) av accessoriska lobor av PNX-behandlade möss och protes-implanterade möss uppmättes 14 dagar efter PNX. *, P <0,05, Studentens t- test. Skalstång: 100 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
| 14 dagar efter operationen | Inre lungvolym (ml) | Medellinjär avlyssning (mm) | Inre lungyta = 4ILV / MLI (cm 2 ) |
| PNX-behandlad | 1,5 | 57,8 | 1038,06 |
| 1,35 | 49,6 | 1088,71 | |
| 1,42 | 48,5 | 1171,13 | |
| 1,4 | 51,5 1087,38 | ||
| 1,4 | 54,6 | 1025,64 | |
| Protes-implanterad | 1,1 | 49,6 | 887,10 |
| 1 | 50,5 | 792,08 | |
| 1,1 | 47,3 | 930,23 | |
| 1,15 | 44,8 | 1026,79 | |
| 0,86 | 46,3 | 742,98 |
Tabell 1: Beräkning av ISA-värdena hos PNX-behandlade och protesimplanterade möss. Värdena för ILV, MLI och ISA hos tillbehöret löper vid 14 dagar efter PNX.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll tillhandahåller vi detaljerade beskrivningar om mätningen av lungparametrarna efter muskeln kvar lung PNX och protesimplantation. ISA anses nu vara en nyckelfaktor för bedömning av andningsfunktionen vid många lungsjukdomar och vid skada-inducerad alveolär regenerering. Även om lungforskningsgemenskapen är överens om användningen av ISA som en användbar mätning, har dock hittills inte beaktats standardiseringen av mätningen av ILV och MLI, de två parametrar som används för att beräkna ISA. Självklart är det som med alla mätningar viktigt att försöka få obearbetad data. Kärnpunkten för den nuvarande forskningsinsatsen är att upprätta ett standardiserat protokoll för användning av den murina lungforskningsgruppen.
Vi försökte minska källa för mätförskjutning på ett antal sätt när vi utvecklade detta protokoll. Vi fann att variationen i ILV-mätningar kan vara rödUced genom att förhindra vätska läckage genom att försäkra att storleken på nålen insatt i luftröret är dimensionellt matchad (vi fann att 18-gauge nålar nära matchade möss tracheae). Vi fann också att muskammarväggen måste avlägsnas noggrant före PFA-inflationen, eftersom detta minimerar bröstväggens potentiella påverkan på ILV-mätningarna. MLI-värden beror i stor utsträckning på alveolär morfologi. Följaktligen är, förutom vikten av att använda åldersmatchade och sexmatchade möss, det korrekta underhållet av alveolär morfologi under lungfixeringsprocedurerna kritiskt viktigt. Vi här används en allmänt antagen fixeringsmetod: vi uppblåsta lungorna vid ett transpulmonellt tryck av 25 cm H2O med nyberedd 4% PFA att fullt dilatera lungvävnad. Enligt vår erfarenhet kan lägre distanstryck leda till vävnadskontraktion, onormal alveolär morfologi, och resultera slutligen i lägre MLI-värden.
Observationer iVåra tidigare studier har visat att den kvarvarande lungens tillbehörslåda uppvisar maximal volymetrisk expansion jämfört med de andra tre lobesna i höger lunga efter PNX-regenerering; Tillbehörsloben hos den återstående lungen uppvisar också maximala ökningar av värdet av morfologiska parametrar ( t.ex. MLI) 21 , 22 , 23 , 24 . Därför analyserade vi bara sektioner från accessoarer lobes för att undvika variation från olika lunglober. För att minska variationen mellan de olika sektionerna som användes vid kvantifieringen av MLI kontrollerade vi lobens orientering under inbäddning: vi placerade lobens största yta parallellt med botten av cryomolden. Vi kontrollerade också noggrant tjockleken på provskivor, sekvensen av sektionsprovtagning och skärpositionen vid snittning. Förutom provbehandling, en annan importanT aspekt av standardiseringen är att alla artärer och vener, pleura, större luftvägar och alveolära kanaler måste uteslutas från de vävnadsområden som utvärderas under MLI-kvantifiering. Arterier, vener och alveolära kanaler är alla mycket större än alveoler (4-10 gånger), så att de här stora strukturerna är viktiga för att få tillförlitliga avlyssmätningar. För varje grupp är 5 möss tillräckliga för kvantifieringen. För varje mus valdes totalt 15 icke-överlappande vyer (1000 μm x 1000 μm) slumpmässigt från de lämpliga områdena (utan artärer och vener, huvudvägar och alveolära kanaler) av de 3 sektionerna av tillbehörslåsen. Provinsättningsmetoden och MLI-mätningen kan också appliceras på paraffinbehandlade lungvävnader.
Medan andra har definierat MLI som den totala linjelängden dividerad med antalet avlyssningar med korsade alveolära väggar 25 , använde vi här en linjär avlyssning som linjär längdMellan två intilliggande alveolära epithelialväggar i MLI-beräkningar, med hänsyn tagen till tjockleken hos mesenkym från MLI-data. Följaktligen beräknade vi ISA med hjälp av ILV men inte den totala lungvolymen.
För PNX- och protesimplantationsförfarandena varierade överlevnadshastigheten hos möss som genomgår PNX från 85% till 90%. Överlevnadshastigheten hos möss som genomgått protesimplantation var omkring ~ 80%. Under alla operationer bör flera steg vidtas för att förbättra mössöverlevnad. 1) Korrekt införande av katetern i luftröret är en förutsättning för en lyckad PNX-operation. Med vägledning av ett laryngoskop kan muskällan lätt observeras för att underlätta säker och effektiv endotracheal intubation. 2) Sticka inte lungorna eller hjärtan under proceduren. Se till att bröstkorgen i det femte vänstra interkostala rummet öppnas allmänt och att hilum i vänster lob klart identifieras före lobektomi. När du utför vänster lunglobe reAvsnittet, se till att vänsterloben är intakt genom användning av trubbiga tångar för att undvika lungblödning och / eller lobarbrott. Under sårluckan, håll spetsen på den kirurgiska nålen borta från hjärtat och lungorna. 3) Var försiktig när du sätter protesen i den tomma thoraxhålan, eftersom överdriven kraft kan orsaka rubbning av pleura. 4) Mössen bör placeras på en 38 ° C termisk kudde och övervakas tills deras sinnen återhämtar, eftersom postoperativ hypotermi är känd för att öka musmorbiditeten.
Efter borttagning av vänstra lungloben minskades både lung-respiratoriska enheter och interna lunggasutbytesområde avsevärt. 14 dagar efter operationen var ILV, MLI och ISA i den återstående lungvävnaden väsentligt större i den PNX-behandlade gruppen möss än i den protes-implanterade gruppen, vilket starkt föreslår att införandet av en protesblockerad PNX-inducerad alveolär regeneration. Således, både PNX och protesimplantationsmuslägeDet kan användas som kraftfulla verktyg för undersökning av cell- och molekylhändelser som uppstår vid mekanisk kraftinducerad re-alveolarisering. Dessutom var ISA-värdena för Yap AT2-nollungor signifikant mindre än de hos kontrolllungor vid post-PNX-dag 14 1 , vilket indikerar att vårt protokoll också är lämpligt för att detektera nedsatt regenerering av genetiska mutantmöss. De stränga och standardiserade kvantitativa metoderna som presenteras i denna studie kan användas för att mäta lungparametrarna och ISA i utvecklingsstudier och med genetiskt modifierade djurmodeller av multipla sjukdomar, inklusive emfysem vid kroniska obstruktiva lungsjukdomar, alveolär regenerering efter lungskador och lungutveckling defekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Författarna skulle vilja erkänna National Institute of Biological Sciences, Beijing för hjälp. Detta arbete stöddes av Beijing Municipal Natural Science Foundation (nr. Z17110200040000).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low cost cautery kit | Fine Science Tools | 18010-00 | |
| Noyes scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Vessel clips | Fine Science Tools | 18374-44 | |
| I. V. Cannula-20 gauge | Jinhuan Medical Product Co., LTD. | 29P0601 | |
| Surgical suture | Jinhuan Medical Product Co., LTD. | F602 | |
| Mouse intubation platform | Penn-Century, Inc | Model MIP | |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century, Inc | Model LS-2-M | |
| TOPO Small Animal Ventilator | Kent Scientific | RSP1006-05L | |
| Thermal pad | Stuart equipment | SBH130D | |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| Hematoxylin Solution | Sigma | GHS132 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma | HT110116 | |
| 10 mL Pipette | Thermo Scientific | 170356 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| O.C.T Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| cryosection machine | Leica | CM1950 | |
| Disposable Base Molds | Fisher HealthCare | 22-363-553 | |
| 18 gauge needle | Becton Dickinson | 305199 | |
| Povidone iodine | Fisher Scientific | 19-027132 | |
| 70% ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | |
| Infusion sets for single use | Weigao | SFDA 2012 3661704 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 | |
| Tapes | 3M Scotch | 8915 | |
| Cotton pad | Vinda | Dr.P | |
| Silicone prosthesis | Custom made | ||
| Brightfield microscope | Olympus | VS120 | |
| Ruler tool | Adobe Photoshop |
References
- Liu, Z., et al. MAPK-Mediated YAP Activation Controls Mechanical-Tension-Induced Pulmonary Alveolar Regeneration. Cell Rep. 16 (7), 1810-1819 (2016).
- Thurlbeck, W. M. Internal surface area and other measurements in emphysema. Thorax. 22 (6), 483-496 (1967).
- Knudsen, L., Weibel, E. R., Gundersen, H. J. G., Weinstein, F. V., Ochs, M. Assessment of air space size characteristics by intercept (chord) measurement: an accurate and efficient stereological approach. J Appl Physiol. 108 (2), 412-421 (2010).
- Weibel, E. R. Morphometry of the Human Lung. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1963).
- Duguid, J. B., Young, A., Cauna, D., Lambert, M. W. The internal surface area of the lung in emphysema. J Pathol Bacteriol. 88, 405-421 (1964).
- Branchfield, K., et al. Pulmonary neuroendocrine cells function as airway sensors to control lung immune response. Science. 351 (6274), 707-710 (2016).
- Ding, B. -S., et al. Endothelial-derived angiocrine signals induce and sustain regenerative lung alveolarization. Cell. 147 (3), 539-553 (2011).
- Dunnill, M. S. Quantitative methods in the study of pulmonary pathology. Thorax. 17 (4), 320-328 (1962).
- Weibel, E. R., Gomez, M. Architecture of the human lung. Use of quantitative methods establishes fundamental relations between size and number of lung structures. Science. 137 (3530), 577-585 (1962).
- Thurlbeck, W. M. The internal surface area of nonemphysematous lungs. Am Rev Respir Dis. 95 (5), 765-773 (1967).
- Butler, J. P., et al. Evidence for adult lung growth in humans. N Engl J Med. 367 (16), 244-247 (2012).
- Hsia, C. C. W., Herazo, L. F., Fryder-Doffey, F., Weibel, E. R. Compensatory lung growth occurs in adult dogs after right pneumonectomy. J Clin Invest. 94 (1), 405-412 (1994).
- Thurlbeck, S. W. M. Pneumonectomy in Rats at Various Ages. Am Rev Respir Dis. 120 (5), 1125-1136 (1979).
- Cagle, P. T., Langston, C., Thurlbeck, W. M. The Effect of Age on Postpneumonectomy Growth in Rabbits. Pediatr Pulmonol. 5 (2), 92-95 (1988).
- Langston, C., et al. Alveolar multiplication in the contralateral lung after unilateral pneumonectomy in the rabbit. Am Rev Respir Dis. 115 (1), 7-13 (1977).
- Cohn, R. Factors Affecting The Postnatal Growth of The Lung. Anatomical Record. 75 (2), 195-205 (1939).
- Hsia, C. C., Wu, E. Y., Wagner, E., Weibel, E. R. Preventing mediastinal shift after pneumonectomy impairs regenerative alveolar tissue growth. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 281 (5), L1279-L1287 (2001).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. -Y. S., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp. (73), e50318 (2013).
- Liu, S., Cimprich, J., Varisco, B. M. Mouse pneumonectomy model of compensatory lung growth. J Vis Exp. (94), (2014).
- Silva, M. F. R., Zin, W. A., Saldiva, P. H. N. Airspace configuration at different transpulmonary pressures in normal and paraquat-induced lung injury in rats. Am J Respir Crit Care Med. 158 (4), 1230-1234 (1998).
- Yilmaz, C., et al. Noninvasive quantification of heterogeneous lung growth following extensive lung resection by high-resolution computed tomography. J Appl Physiol. 107 (5), 1569-1578 (2009).
- Voswinckel, R., et al. Characterisation of post-pneumonectomy lung growth in adult mice. Eur Respir J. 24 (4), 524-532 (2004).
- Ravikumar, P., et al. Regional Lung Growth and Repair Regional lung growth following pneumonectomy assessed by computed tomography. J Appl Physiol. 97, 1567-1574 (2004).
- Gibney, B. C., et al. Detection of murine post-pneumonectomy lung regeneration by 18FDG PET imaging. EJNMMI Res. 2 (1), (2012).
- Muñoz-Barrutia, A., Ceresa, M., Artaechevarria, X., Montuenga, L. M., Ortiz-De-Solorzano, C. Quantification of lung damage in an elastase-induced mouse model of emphysema. Int J Biomed Imaging. 2012, (2012).
