Summary
El área de superficie pulmonar interna (ISA) es un criterio crítico para evaluar la morfología pulmonar y la fisiología en las enfermedades pulmonares y la regeneración alveolar inducida por lesiones. Describimos aquí un método estandarizado que puede minimizar el sesgo de medición para ISA tanto en neumonectomía pulmonar como en modelos de ratón de implantación de prótesis.
Introduction
La función fundamental del pulmón es el intercambio de oxígeno y dióxido de carbono entre los vasos sanguíneos y la atmósfera. Las enfermedades pulmonares como la displasia broncopulmonar (BPD), la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y las infecciones respiratorias agudas, resultan en una disminución de la ISA 2 . Los investigadores que estudian la enfermedad pulmonar han desarrollado varios métodos cuantitativos para evaluar los cambios morfológicos en los pulmones, incluyendo MLI, ILV, el número de unidades de intercambio de gases, ISA, y el tejido pulmonar cumplimiento [ 2 , 3] . Los estudios pioneros de Weibel et al. 4 y Duguid et al. 5 juntos establecieron que la ISA puede usarse como una medida directa de la capacidad de intercambio de gas pulmonar en los pulmones humanos y puede usarse como criterio para determinar la gravedad del enfisema. Varios estudios publicados en los últimos cinco años han utilizado parámetros morfológicos pulmonares ( por ejemplo, 6 y durante la recuperación de la lesión PNX 1 , 7 . ISA se calcula utilizando la ecuación 1 8 , 9 :
, Donde ILV es el volumen pulmonar interno y MLI es un parámetro intermedio que representa el espacio periférico pulmonar tamaño 10 .
La PNX, la extirpación quirúrgica de uno o más lóbulos pulmonares, ha sido ampliamente reportada para inducir la regeneración alveolar en muchas especies, incluyendo humanos 11 , ratones 1 , perros 12 , ratas 13 y conejos 14 , 15 . Un sementalY de los pulmones de ratones a los catorce días post-PNX mostró que tanto la expansión de los alvéolos pre-existentes y la formación de novo de los alvéolos contribuir a la restauración de ISA, ILV, y el número de alveolos en los tejidos pulmonares restantes [ 1] . Nosotros y otros hemos demostrado que la inserción de materiales como esponja, cera o una prótesis personalizada en la cavidad torácica vacía después de PNX ( es decir , la implantación de la prótesis) impide la regeneración alveolar. Ahora está firmemente establecido que la fuerza mecánica funciona como uno de los factores más importantes para iniciar la regeneración alveolar 1 , 16 , 17 . Tales estudios han puesto de relieve la eficacia del uso de los valores ISA de los pulmones tratados con PNX y prótesis implantada como criterio para evaluar cuantitativamente la regeneración alveolar.
Se sabe que el sesgo del observador influye significativamente en la vaPara los parámetros morfológicos pulmonares ( por ejemplo , MIL e ILV). Se pueden utilizar protocolos estandarizados para obviar este sesgo en la determinación de ILV y MLI, que son los dos parámetros utilizados en el cálculo de ISA. Aquí, proporcionamos protocolos altamente detallados y estandarizados para medir estos parámetros pulmonares. Es importante destacar que la capacidad de cuantificar con precisión ISA promete mejorar la fiabilidad y la reproducibilidad de los estudios de la función pulmonar en modelos de regeneración alveolar inducidos por lesiones y facilitar los descubrimientos mecanísticos en múltiples enfermedades pulmonares.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los procedimientos utilizados en este protocolo se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones de las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Instituto Nacional de Ciencias Biológicas de Beijing. Se alojaron ratones machos CD-1 de 8 semanas de edad en una instalación libre de patógenos específicos (SPF) hasta que se llevaron a cabo los experimentos. Las cirugías se realizaron utilizando ratones completamente anestesiados ( es decir , sin ninguna respuesta pellizcadora del dedo). Después de la cirugía, los ratones se mantuvieron en una habitación cálida y húmeda con suficiente comida y agua dulce. Los ratones se sacrificaron usando una sobredosis de anestésico administrado por inyección intraperitoneal.
1. Cirugía de ratón PNX
- Anestesiar completamente a los ratones con fenobarbital sódico (120 mg / kg de peso corporal) y buprenorfina (0,1 mg / kg de peso corporal) mediante inyección intraperitoneal (IP). Realizar la cirugía cuando los ratones ya no reaccionan a pellizcar el dedo.
- Quitar el pelo en el tórax izquierdo de los ratones con dep(3 x 3 cm 2 de área).
- Asegure cada ratón en una plataforma de intubación con su lado ventral hacia el operador ( Figura 1A ).
- Saque la lengua del ratón e ilumine las cuerdas vocales con un pequeño laringoscopio animal que contiene una muesca para guiar los catéteres 18 ( Figura 1A ).
- Distinguir las cuerdas vocales observando los movimientos de las cuerdas vocales durante la respiración. Inserte suavemente una cánula de intubación intravenosa de 20 G en la tráquea con un ángulo anterior 19 .
- Coloque los ratones en una posición recostada lateral derecha y conecte la cánula a un ventilador mecánico ( por ejemplo, controlado por presión, consulte la Tabla de materiales ). Compruebe la inserción de la cánula en la tráquea observando los movimientos respiratorios del tórax del ratón ( Figura 1B ).
- Ajuste la presión inspiratoria of el ventilador a 12 cm H 2 O y establecer la frecuencia respiratoria de 120 respiraciones por minuto (Figura 1B).
- Descontaminar la piel en el área quirúrgica con betadina y etanol al 70%.
- Hacer una incisión posterolateral de 2 - 3 cm en el espacio en el 5 º espacio intercostal, cortado a través de la piel y los músculos con tijeras de primavera Noyes (borde de corte: 14 mm, diámetro de la punta: 0,275 mm) ( Figura 2B , C ). Los instrumentos quirúrgicos utilizados para el procedimiento de toracotomía se esterilizan antes del uso.
- Hacer una incisión de 1,5 cm en el espacio intercostal 5º para exponer el pulmón izquierdo (Figura 2D, E). Durante la operación, use un cauterizador de alta temperatura para detener el sangrado.
- Levante un tercio del lóbulo pulmonar izquierdo del tórax con una pinza de punta roma ( Figura 2F ) y luego use un hisopo de algodón para extraer la totalidad de la izquierdaPulmón ( Figura 2G ).
- Identificar la arteria pulmonar y los bronquios del lóbulo pulmonar izquierdo ( Figura 2G ).
- Se liga ligeramente los bronquios y vasos en el hilio con una sutura quirúrgica de seda y se corta el lóbulo pulmonar izquierdo a 3-4 mm de la ligadura ( Figura 2H , I ).
NOTA: Tenga cuidado de no cortar los nudos de sutura en el hilio izquierdo, lo que puede causar neumotórax ( es decir , aire o gas en la cavidad del tórax) . - Cierre la pared torácica con 1 sutura y luego sutura la capa muscular y la capa de la piel secuencialmente, usando 5 a 6 suturas interrumpidas. Deje una separación de 3 a 4 mm entre cada sutura ( Figura 2M , 2N ).
NOTA: Mantenga la aguja de sutura quirúrgica lejos del corazón; La punción cardiaca inadvertida causará la muerte inmediata. - Desinfectar el área quirúrgica con povidona yodada.
- AfteR la operación quirúrgica, coloque el ratón sobre una almohadilla térmica de 38 ° C y conecte el ratón al ventilador hasta que comiencen los movimientos respiratorios espontáneos ( Figura 2O ).
2. Implantación de prótesis
- Realice los pasos 1.1 - 1.13 del procedimiento PNX (es decir, hasta el punto en que se elimina el lóbulo pulmonar izquierdo del ratón).
- Abrazadera del centro de la prótesis de silicona (cliente hecho, 12 mm de largo, 3 mm de espesor, 7 mm de ancho, 0,2 g, de forma elipsoide) con fórceps rombo ( Figura 2J ). Esterilizar la prótesis de silicona antes de la inserción.
- Sostenga la costilla con fórceps con una mano para exponer la cavidad torácica, e inserte la prótesis en la cavidad torácica vacía izquierda con otra mano.
NOTA: El ángulo de inserción es de aproximadamente 45 grados entre el plano frontal de la prótesis y la superficie torácica ( Figura 2K ,L). Sea muy suave al insertar la prótesis. La fuerza excesiva resultará en rotura pleural. - Ajuste la orientación de la prótesis con fórceps romos para asegurar que la prótesis ocupe la cavidad torácica vacía izquierda.
- Realice los pasos 1.14 - 1.16 del procedimiento PNX del ratón.
3. Medición de ILV
- Prepare un dispositivo personalizado ("tubo de inflado") que consiste en un émbolo extraído de una pipeta serológica desechable (10 ml), un tubo flexible de 40 cm de largo con un adaptador de aguja, una válvula de control de caudal y una aguja de 18 G. Después del montaje, asegure la pipeta en una tabla con cinta adhesiva ( Figura 3A ). La distancia entre la parte superior de la pipeta y el banco experimental debe ser de al menos 30 cm.
- Preparar una solución de fijación de paraformaldehído (PFA) al 4% fresco disolviendo 20 g de PFA en 500 ml de solución salina tamponada con fosfato 1x 1x (PBS) precalentada en un baño de agua a 55ºC, agitando manualmenteCe cada 10 min hasta que la solución sea clara. Después de enfriar a temperatura ambiente, se filtra la solución con un filtro de 0,45 μm.
PRECAUCIÓN: Use equipo protector personal (EPP) apropiado cuando maneje PFA. - Sacrifique a los ratones con una inyección de sobredosis de anestésico (0,8% de fenobarbital sódico, 1.000 U / ml de heparina).
- Asegure cada ratón en una placa de disección de poliestireno y rocíe con alcohol al 70%.
- Cuidadosamente abra el pecho del ratón y corte el esternón con tijeras para exponer a fondo los lóbulos del pulmón.
- Retire el tejido excesivo con una tijera para exponer la tráquea. Asegúrese de separar la tráquea del esófago.
- Corte la aorta abdominal e inserte una aguja de calibre 25 en el ventrículo derecho del corazón; Conecte la aguja a una jeringa de 20 ml antes de esta inserción. Lentamente empuje 1x PBS en el corazón para eliminar las células sanguíneas hasta que los pulmones se vuelvan blancos. Típicamente, se requiere 5 - 10 ml de PBS para limpiar los vasos sanguíneos pulmonares.
- LlenarE tubo de inflado construido a la medida con 4% de PFA fresco y eliminar todas las burbujas del tubo de inflado.
- Inserte la aguja calibre 18 del tubo de inflado en la tráquea y clip de la tráquea con clips de vaso para evitar fugas de líquido.
- Inflar los pulmones con PFA al 4% a una presión transpulmonar constante de 25 cm / H 2 O 2 , 20 . Incubar los pulmones a temperatura ambiente durante 2 h para lograr pulmones completamente expandidos. Este paso de "pre-fijación" es crítico para preservar la morfología pulmonar.
- Mediante la monitorización del tubo de inflado, registre el valor del volumen inicial de 4% de PFA y registre el volumen final. El volumen pulmonar interno es igual al volumen inicial de 4% de PFA menos el volumen final de 4% de PFA.
- Ligate la tráquea y con tijeras, disecar suavemente los pulmones (manteniendo los pulmones intactos) de los tejidos conectivos circundantes. Sea muy suave para evitar dañar los pulmones.
- IncuBate los pulmones en un tubo cónico de 50 ml lleno de PFA al 4% durante 12 h a 4 ° C con agitación suave en un agitador (50 rpm). Proceder al procesamiento y tinción de los tejidos (ver sección 4).
4. Incorporación de tejidos, secciones y tinción con hematoxilina y eosina (H & E)
- Después de la fijación, utilice las tijeras del resorte de Noyes para recortar el corazón y los tejidos conectivos excesivos de los pulmones. Separar suavemente los lóbulos pulmonares individuales cortando el bronquio que conecta los lóbulos pulmonares con la tráquea.
- Lavar extensamente los lóbulos pulmonares 3 - 4 veces en 50 mL 1x PBS (30 min / lavado) en un agitador orbital (50 rpm).
- Después del lavado final, crioprotect los lóbulos pulmonares sumergiéndolos en una solución de sacarosa al 30% (en 1x PBS) a 4 ° C hasta que el tejido se hunde hasta el fondo de los tubos cónicos de 50 mL (aproximadamente 12 h).
- Antes de incrustar y cryosectioning los tejidos, quitar las muestras de lóbulo pulmonar de los tubos con fórceps, conservar el accesoPara el análisis histológico, se seca la solución de sacarosa restante de la superficie de las muestras de lóbulo accesorio y luego se sumerge bien la muestra en una placa de Petri que contiene el compuesto de temperatura de corte óptimo (OCT) durante aproximadamente 30 min.
- Congelar las muestras de lóbulo accesorio OCT-embedded en nitrógeno líquido usando cryomolds. Coloque la mayor superficie del lóbulo paralela a la parte inferior del molde.
- Prepare un total de tres secciones de 10 μm de espesor para cada muestra durante la criosección para análisis histológico. Deseche los primeros 1 mm de tejido, recoja una sección de 10 μm de espesor, deseche 0,5 mm de tejido, recoja otra sección, deseche 0,5 mm de tejido y recoja la tercera sección (final).
- Secar al aire las secciones durante 1 h antes de realizar la tinción con H & E.
- Realizar la tinción de H & E
- Lavar las secciones en 3-4 cambios de agua del grifo y luego teñir las secciones en hematoxilina fresca durante 2 min; Enjuague la sección debajo del agua corriente del grifo; Sumerja la sección dos veces en una disolución de etanol al 1% al 70% para eliminar el exceso de hematoxilina.
- Mancha la sección en eosina fresca durante 3 min; Deshidratar las secciones con dos lavados sucesivos de 30 s en etanol al 95% y dos lavados de 30 segundos con etanol al 100%; Limpiar las secciones en xileno durante 30 s, repetir el paso de limpieza una vez en xileno fresco; Monte las diapositivas con el medio de montaje utilizando cubreobjetos de vidrio.
5. Cuantificación del MLI
- Adquirir imágenes digitales de las secciones del lóbulo accesorio manchado de H & E (ampliación 20X) usando un microscopio de campo brillante.
- Para cuantificar el MLI, seleccione un total de 15 vistas no superpuestas (1,000 μm x 1.000 μm) aleatoriamente de las áreas adecuadas (sin arterias y venas, vías aéreas principales y conductos alveolares) de 3 secciones.
- Coloque una cuadrícula con 10 líneas verticales uniformemente distribuidas y 10 líneas horizontales igualmente distribuidas de len definidoGth (1.000 μm) en las áreas de visión elegidas usando una herramienta de regla; Cada línea está así separada 100 μm entre sí ( Figura 4B ).
- Defina el valor de un intercepto como la longitud lineal entre dos epitelios alveolares adyacentes. Mida los valores de todas las interceptaciones a lo largo de cada línea de 1.000 μm de longitud.
- Para cada cuadrícula, cuantifique los valores de todas las interceptaciones entre las 10 líneas horizontales de 1.000 μm de longitud y las 10 líneas verticales de 1.000 μm de longitud.
NOTA: MLI es el valor promedio de las longitudes de interceptación de un total de 15 redes analizadas entre las 3 secciones preparadas para cada uno de los lóbulos accesorios.
6. Cálculo de ISA
- Calcular el ISA utilizando la ecuación 1 (véase la introducción ). Consulte la sección 3 para la medición de ILV y consulte la sección 5 para la cuantificación de MLI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Realizamos aquí un experimento con un grupo tratado con PNX y un grupo de implantación de prótesis (implante de prótesis). Estas agrupaciones son las mismas que las agrupaciones utilizadas en un estudio previamente publicado por nuestro grupo de investigación 14 .
Los procedimientos de implante de PNX de ratón y prótesis se muestran en la Figura 2 . Ratones machos CD-1 de 8 semanas de edad se usan para las cirugías y para la cuantificación. En el grupo tratado con PNX y en el grupo de prótesis implantada, se resecaron los lóbulos pulmonares izquierdos ( Figura 2A - 2I ). En el grupo de prótesis implantada, una prótesis que imita el tamaño y la forma del lóbulo pulmonar izquierdo se insertó en el tórax después de que se extrajo el lóbulo pulmonar izquierdo ( Figura 2J - 2L ).
Catorce días después de la cirugía, se utilizó un tubo de inflado a medida para determinar la ILV de los pulmones derechos restantes ( Figura 3A ) .La ILV media de la derecha restante Pulmones de los 5 ratones tratados con PNX fue de aproximadamente 1,4 ml, significativamente superior a los valores de ILV de 1,05 ml de los pulmones derechos de los 5 ratones implantados con prótesis ( Figura 3B , Tabla 1 ).Para la medición MLI, se analizaron un total de 15 vistas de entre las 3 secciones preparadas de cada ratón. La figura 4A muestra una imagen combinada de una sección de lóbulo accesoria y el patrón morfológico para un área elegida ( por ejemplo, vista 1 - 3) o un área no elegida ( por ejemplo, vista 4 - 5) utilizada para la cuantificación de MLI. En este caso, la vista 3 de una sección de lóbulo pulmonar accesorio del grupo tratado con PNX se tomó como ejemplo paraLa medición de MLI ( Figura 4B ). También se muestra una imagen ampliada de la vista 3 para ilustración ( Figura 5A ). La línea 3 se presenta como un ejemplo: la longitud de un espacio de aire alveolar interceptado indicado por las líneas de flecha de doble cabeza. Nuestro análisis mostró que los valores de MLI en el resto de los pulmones derechos de los ratones tratados con PNX fueron significativamente mayores que los de los restantes pulmones derecho de la prótesis implantada ratones ( Figura 5B , Tabla 1 ]. Todos los datos se presentan como la media ± SEM ( Figura 5B ).
ISA se calculó utilizando la ecuación 1 . La Tabla 1 muestra los valores de ILV, MLI y ISA de todos los pulmones. El ISA de la prótesis de ratones implantados fue significativamente menor que la de los ratones tratados con PNX, lo que demuestra que la insertioN de una prótesis dañó la regeneración inducida por PNX.
Figura 1: Intubación endotraqueal del ratón y ventilación mecánica. ( A ) Intubación endotraqueal con una cánula de intubación intravenosa de 20 G vía laringoscopia. ( B ) Conecte el ratón completamente anestesiado a un ventilador mecánico controlado por presión antes de la cirugía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Neumonectomía de ratón (PNX) e implante de prótesis. ( A - C ) Corte la piel y la capa muscular; Parada bLeeding con un cauterizador de alta temperatura durante la operación quirúrgica. ( D - E ) Hacer una incisión de 1,5 cm en el 5 º espacio intercostal. ( F - H ) Extraer el lóbulo pulmonar izquierdo con fórceps romos e identificar la arteria pulmonar y los bronquios, ligados en el hilio. Las puntas de flecha representan la arteria pulmonar y los bronquios del lóbulo pulmonar izquierdo. ( I ) El lóbulo pulmonar izquierdo se resecó a 3-4 mm de la ligadura. ( J - L ) Insertar una prótesis en la cavidad torácica izquierda. ( M, N ) Suturar el pecho, la capa muscular y la capa de la piel. ( O ) Vigilar a los ratones hasta que comiencen los movimientos respiratorios espontáneos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Medición de los volúmenes pulmonares internos (ILVs) de los pulmones derecho restantes. ( A ) Un dispositivo personalizado ("tubo de inflado") para medir los volúmenes pulmonares internos. ( B ) Se midieron los ILVs (media ± SEM) de los pulmones derechos restantes del grupo tratado con PNX y del grupo implantado en prótesis a los 14 días después de PNX. **, p <0,01, prueba t de Student. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cuantificación de la media de intercepción lineal (MLI) de los lóbulos accesorias en el resto de los pulmones derecho. ( A ) Una fusión de imEdad de una sección de lóbulo accesorio. Ejemplos de áreas elegidas ( por ejemplo, vista 1 - 3) y áreas no elegidas ( por ejemplo, vista 4 - 5) usadas para la cuantificación de MLI. ( B ) se colocaron 10 líneas verticales uniformemente espaciadas y 10 líneas horizontales uniformemente espaciadas de longitud definida (1.000 $ μ $ m) en el área elegida. Barra de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Cuantificación del MLI en pulmones tratados con PNX y pulmones implantados en prótesis. ( A ) Se muestra una imagen ampliada de la vista 3 en la figura 4B . Las líneas de color rojo con doble punta de flecha representan la longitud de un intercepto lineal. ( B ) Los valores de MLI (media ± SEM.) de lóbulos accesorios de ratones tratados con PNX y ratones implantados con prótesis se midieron a los 14 días después de PNX. *, P <0,05, t de Student. Barra de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| 14 días después de la cirugía | Volumen pulmonar interno (ml) | Intercepción lineal media (mm) | área interna superficie pulmonar = 4ILV / MLI (cm 2) |
| Tratado con PNX | 1,5 | 57,8 | 1038,06 |
| 1,35 | 49,6 | 1088,71 | |
| 1,42 | 48,5 | 1171,13 | |
| 1,4 | 51,5 1087,38 | ||
| 1,4 | 54,6 | 1025,64 | |
| Prótesis implantada | 1.1 | 49,6 | 887,10 |
| 1 | 50,5 | 792,08 | |
| 1.1 | 47,3 | 930,23 | |
| 1,15 | 44,8 | 1026,79 | |
| 0,86 | 46,3 | 742,98 |
Tabla 1: Cálculo de los valores ISA de ratones tratados con PNX y implantados en prótesis. Los valores de ILV, MLI y ISA de los lóbulos accesorios a los 14 días post-PNX.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En este protocolo, proporcionamos descripciones detalladas sobre la medición de los parámetros pulmonares después de la PNX del pulmón izquierdo del ratón y la implantación de la prótesis. La ISA se considera ahora una métrica clave para la evaluación de la función respiratoria en muchas enfermedades pulmonares y en la regeneración alveolar inducida por lesiones. Sin embargo, aunque la comunidad de investigación pulmonar está de acuerdo sobre la utilidad de la ISA como una métrica útil, hasta la fecha, ha habido poca consideración de la estandarización de la medición de ILV y MLI, los dos parámetros utilizados para calcular ISA. Obviamente, como con cualquier medida, es importante intentar obtener datos imparciales. El objetivo principal del presente esfuerzo de investigación es establecer un protocolo estandarizado para su uso por la comunidad de investigación pulmonar murina.
Intentamos reducir las fuentes de sesgo de medición de varias maneras a medida que desarrollamos este protocolo. Se encontró que la variación en las mediciones ILV podría ser rojoEvitando la fuga de fluidos, asegurando que el tamaño de la aguja insertada en la tráquea es dimensionalmente coincidente (encontramos que las agujas de calibre 18 coincidían estrechamente con los ratones traqueos). También se encontró que la pared torácica del ratón debe ser eliminada completamente antes de la inflación de PFA, ya que esto minimiza la influencia potencial de la pared torácica en las mediciones ILV. Los valores de MLI dependen en gran medida de la morfología alveolar. En consecuencia, además de la importancia de utilizar ratones pareados por edad y sexo, el mantenimiento adecuado de la morfología alveolar durante los procedimientos de fijación pulmonar es de importancia crítica. Utilizamos un método de fijación ampliamente adoptado: inflado los pulmones a una presión transpulmonar de 25 cm H 2 O con PFA al 4% recién preparado para dilatar completamente el tejido pulmonar. En nuestra experiencia, presiones de distensión más bajas pueden conducir a la contracción del tejido, morfología alveolar anormal, y en última instancia resultan en valores más bajos de MLI.
Observaciones enNuestros estudios previos han indicado que el lóbulo accesorio del pulmón restante exhibe una expansión volumétrica máxima, en comparación con los otros tres lóbulos del pulmón derecho, después de la regeneración de PNX; El lóbulo accesorio del pulmón restante también exhibe aumentos máximos en el valor de los parámetros morfológicos ( por ejemplo, MLI) 21 , 22 , 23 , 24 . Por lo tanto, sólo se analizaron secciones de los lóbulos accesorios para evitar la variación de diferentes lóbulos pulmonares. Para ayudar a reducir la variación entre las diversas secciones utilizadas en la cuantificación de MLI, controlamos la orientación del lóbulo durante la incorporación: colocamos la mayor superficie del lóbulo paralela a la parte inferior del criomolde. También controlamos cuidadosamente el grosor de los cortes de muestra, la secuencia de muestreo de sección y la posición de corte durante el corte. Además del procesamiento de muestras, otroEl aspecto de la estandarización es que todas las arterias y venas, la pleura, las vías respiratorias principales y los conductos alveolares necesitan ser excluidos de las áreas tisulares que se evalúan durante la cuantificación del MLI. Las arterias, las venas y los conductos alveolares son mucho más grandes que los alvéolos (de 4 a 10 veces), por lo que excluir estas grandes estructuras es importante para obtener mediciones confiables de intercepción. Para cada grupo, 5 ratones son adecuados para la cuantificación. Para cada ratón, se seleccionaron aleatoriamente un total de 15 vistas no superpuestas (1.000 mu m x 1.000 mu m) de las áreas adecuadas (sin arterias y venas, vías aéreas principales y conductos alveolares) de las 3 secciones del lóbulo accesorio. El método de inclusión de muestra y la medición de MLI pueden aplicarse también a tejidos pulmonares tratados con parafina.
Mientras que otros han definido MLI como la longitud total de la línea dividida por el número de intercepciones con paredes alveolares cruzadas 25 , aquí utilizamos un intercepto lineal como la longitud linealEntre dos paredes epiteliales alveolares adyacentes en los cálculos MLI, sin tener en cuenta el grosor del mesénquima de los datos MLI. En consecuencia, se calculó ISA utilizando el ILV, pero no el volumen pulmonar total.
Para los procedimientos de implantación de PNX y prótesis, la tasa de supervivencia de ratones sometidos a PNX osciló entre el 85% y el 90%. La tasa de supervivencia de ratones sometidos a implantación de prótesis fue aproximadamente ~ 80%. Durante todas las cirugías, se deben tomar varias medidas para mejorar la supervivencia de los ratones. 1) La inserción adecuada del catéter en la tráquea es un requisito previo para una operación PNX exitosa. Con la guía de un laringoscopio, la tráquea del ratón se puede observar fácilmente para facilitar la intubación endotraqueal segura y eficaz. 2) No perfore los pulmones o los corazones durante el procedimiento. Asegúrese de que el tórax del quinto espacio intercostal izquierdo esté ampliamente abierto y que el hilio del lóbulo izquierdo esté claramente identificado antes de la lobectomía. Cuando se realiza el lóbulo pulmonar izquierdo, Asegúrese de que el lóbulo izquierdo está intacto mediante el uso de fórceps romos para evitar la hemorragia pulmonar y / o la ruptura lobar. Durante el cierre de la herida, mantenga la punta de la aguja quirúrgica alejada del corazón y los pulmones. 3) Sea suave al insertar la prótesis en la cavidad vacía del tórax, ya que una fuerza excesiva puede causar ruptura de la pleura. 4) Los ratones deben colocarse en una almohadilla térmica de 38 ° C y monitoreados hasta que sus sentidos se recuperen, ya que se sabe que la hipotermia postoperatoria aumenta la morbilidad del ratón.
Después de la extirpación del lóbulo pulmonar izquierdo, tanto las unidades respiratorias pulmonares como el área interna de intercambio de gas pulmonar se redujeron significativamente. 14 días después de la cirugía, el ILV, el MLI y el ISA en el tejido pulmonar restante fueron significativamente mayores en el grupo de ratones tratados con PNX que en el grupo implantado con prótesis, sugiriendo fuertemente que la inserción de una prótesis bloqueaba la formación alveolar inducida por PNX regeneración. Por lo tanto, tanto PNX y la prótesis-implante modo de ratónLs puede ser utilizado como herramientas poderosas para la investigación de los eventos celulares y moleculares que se producen durante la reavivorización inducida por la fuerza mecánica. Además, los valores de la ISA de Yap AT2 pulmones nulos fueron significativas más pequeñas que las de control de los pulmones en el post-PNX días 14 1, lo que indica que nuestro protocolo también es adecuado para la detección de la regeneración deficiente de ratones mutantes genéticos. Los métodos cuantitativos rigurosos y estandarizados presentados en este estudio pueden aplicarse para medir los parámetros pulmonares y la ISA en estudios de desarrollo y con modelos animales modificados genéticamente de múltiples enfermedades incluyendo enfisema en enfermedades pulmonares obstructivas crónicas, regeneración alveolar después de lesiones pulmonares y desarrollo pulmonar Defectos
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer el apoyo del Instituto Nacional de Ciencias Biológicas de Beijing. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Municipal de Ciencias Naturales de Beijing (No. Z17110200040000).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low cost cautery kit | Fine Science Tools | 18010-00 | |
| Noyes scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Vessel clips | Fine Science Tools | 18374-44 | |
| I. V. Cannula-20 gauge | Jinhuan Medical Product Co., LTD. | 29P0601 | |
| Surgical suture | Jinhuan Medical Product Co., LTD. | F602 | |
| Mouse intubation platform | Penn-Century, Inc | Model MIP | |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century, Inc | Model LS-2-M | |
| TOPO Small Animal Ventilator | Kent Scientific | RSP1006-05L | |
| Thermal pad | Stuart equipment | SBH130D | |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| Hematoxylin Solution | Sigma | GHS132 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma | HT110116 | |
| 10 mL Pipette | Thermo Scientific | 170356 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| O.C.T Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| cryosection machine | Leica | CM1950 | |
| Disposable Base Molds | Fisher HealthCare | 22-363-553 | |
| 18 gauge needle | Becton Dickinson | 305199 | |
| Povidone iodine | Fisher Scientific | 19-027132 | |
| 70% ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | |
| Infusion sets for single use | Weigao | SFDA 2012 3661704 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 | |
| Tapes | 3M Scotch | 8915 | |
| Cotton pad | Vinda | Dr.P | |
| Silicone prosthesis | Custom made | ||
| Brightfield microscope | Olympus | VS120 | |
| Ruler tool | Adobe Photoshop |
References
- Liu, Z., et al. MAPK-Mediated YAP Activation Controls Mechanical-Tension-Induced Pulmonary Alveolar Regeneration. Cell Rep. 16 (7), 1810-1819 (2016).
- Thurlbeck, W. M. Internal surface area and other measurements in emphysema. Thorax. 22 (6), 483-496 (1967).
- Knudsen, L., Weibel, E. R., Gundersen, H. J. G., Weinstein, F. V., Ochs, M. Assessment of air space size characteristics by intercept (chord) measurement: an accurate and efficient stereological approach. J Appl Physiol. 108 (2), 412-421 (2010).
- Weibel, E. R. Morphometry of the Human Lung. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1963).
- Duguid, J. B., Young, A., Cauna, D., Lambert, M. W. The internal surface area of the lung in emphysema. J Pathol Bacteriol. 88, 405-421 (1964).
- Branchfield, K., et al. Pulmonary neuroendocrine cells function as airway sensors to control lung immune response. Science. 351 (6274), 707-710 (2016).
- Ding, B. -S., et al. Endothelial-derived angiocrine signals induce and sustain regenerative lung alveolarization. Cell. 147 (3), 539-553 (2011).
- Dunnill, M. S. Quantitative methods in the study of pulmonary pathology. Thorax. 17 (4), 320-328 (1962).
- Weibel, E. R., Gomez, M. Architecture of the human lung. Use of quantitative methods establishes fundamental relations between size and number of lung structures. Science. 137 (3530), 577-585 (1962).
- Thurlbeck, W. M. The internal surface area of nonemphysematous lungs. Am Rev Respir Dis. 95 (5), 765-773 (1967).
- Butler, J. P., et al. Evidence for adult lung growth in humans. N Engl J Med. 367 (16), 244-247 (2012).
- Hsia, C. C. W., Herazo, L. F., Fryder-Doffey, F., Weibel, E. R. Compensatory lung growth occurs in adult dogs after right pneumonectomy. J Clin Invest. 94 (1), 405-412 (1994).
- Thurlbeck, S. W. M. Pneumonectomy in Rats at Various Ages. Am Rev Respir Dis. 120 (5), 1125-1136 (1979).
- Cagle, P. T., Langston, C., Thurlbeck, W. M. The Effect of Age on Postpneumonectomy Growth in Rabbits. Pediatr Pulmonol. 5 (2), 92-95 (1988).
- Langston, C., et al. Alveolar multiplication in the contralateral lung after unilateral pneumonectomy in the rabbit. Am Rev Respir Dis. 115 (1), 7-13 (1977).
- Cohn, R. Factors Affecting The Postnatal Growth of The Lung. Anatomical Record. 75 (2), 195-205 (1939).
- Hsia, C. C., Wu, E. Y., Wagner, E., Weibel, E. R. Preventing mediastinal shift after pneumonectomy impairs regenerative alveolar tissue growth. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 281 (5), L1279-L1287 (2001).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. -Y. S., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp. (73), e50318 (2013).
- Liu, S., Cimprich, J., Varisco, B. M. Mouse pneumonectomy model of compensatory lung growth. J Vis Exp. (94), (2014).
- Silva, M. F. R., Zin, W. A., Saldiva, P. H. N. Airspace configuration at different transpulmonary pressures in normal and paraquat-induced lung injury in rats. Am J Respir Crit Care Med. 158 (4), 1230-1234 (1998).
- Yilmaz, C., et al. Noninvasive quantification of heterogeneous lung growth following extensive lung resection by high-resolution computed tomography. J Appl Physiol. 107 (5), 1569-1578 (2009).
- Voswinckel, R., et al. Characterisation of post-pneumonectomy lung growth in adult mice. Eur Respir J. 24 (4), 524-532 (2004).
- Ravikumar, P., et al. Regional Lung Growth and Repair Regional lung growth following pneumonectomy assessed by computed tomography. J Appl Physiol. 97, 1567-1574 (2004).
- Gibney, B. C., et al. Detection of murine post-pneumonectomy lung regeneration by 18FDG PET imaging. EJNMMI Res. 2 (1), (2012).
- Muñoz-Barrutia, A., Ceresa, M., Artaechevarria, X., Montuenga, L. M., Ortiz-De-Solorzano, C. Quantification of lung damage in an elastase-induced mouse model of emphysema. Int J Biomed Imaging. 2012, (2012).
