Summary
Этот протокол описывает трахею прививки Фишер 344 крыс с Francisella tularensis. Эта процедура повторяет легочной подверженности людей этого потенциального агента отражению и может использоваться для тестирования вакцин и терапевтической эффективности против легких туляремии.
Abstract
Легочные инфекции с бактерией Francisella tularensis может привести к серьезным и потенциально смертельным заболеванием, туляремии, в организме человека. Из-за отсутствия утвержденных туляремии вакцины для людей исследования сосредоточена на разработке вакцины, используя соответствующие Животные модели. Фишер 344 крыса стала модель, которая отражает человека восприимчивость к инфекции F. tularensis и таким образом является привлекательной моделью для разработки вакцины против туляремии. Прививка трахею крыс Фишер 344 с F. tularensis имитирует легочной экспозиции в организме человека. Успешной доставке в трахею крыс имеет решающее значение для легких доставки. Ларингоскоп с подсветкой используется для того, чтобы должным образом интубировать трахею наркотизированных крыс; правильное размещение внутри трахеи определяется простым устройством для обнаружения дыхание. После интубации F. tularensis культуры поставляется в измеренной дозы через шприц. Эта техника стандартизирует легочной доставки F. tularensis внутри трахеи крыс для оценки эффективности вакцины.
Introduction
F. tularensis (Ft) причины болезней человека, туляремии. Когда бактерии приобретаются через легочной маршрут, это приводит к легочной туляремии, которая имеет высокие показатели заболеваемости и смертности1. F. tularensis считается отражению агент из-за опасности, связанные с аэрозольных форм и в настоящее время вакцины не одобрен для использования человеком в США В настоящее время ведется интенсивные усилия для разработки вакцин и терапевтических мер против легочной туляремии, для защиты населения против незаконного использования этого бактериальных отражению.
Большая часть исследований туляремии была сосредоточена на модель мыши, из-за повышенной чувствительности мыши F. tularensis инфекции и распространенность реагентов. Однако мышей доказали быть сложной модели для разработки вакцины, из-за сложности продемонстрировать эффективность вакцины в этой модели2. Недавно Фишер 344 крыса была разработана как модель для разработки вакцины против туляремии3. Чувствительность Фишер 344 крысы различных подвидов F. tularensis имитирует человеческое чувствительность4, и крысы могут быть защищены от F. tularensis легочной вызов вакцинации с живой вакцинного штамма, известный для защиты люди5,6,7. Потому что Фишер 344 крыса модели некоторые функции F. tularensis инфекции людей, это может быть чрезвычайно полезной моделью для разработки вакцины, которая защищает от легких F. tularensis экспозиции.
Эффективной вакцины необходимо защитить людей против легких подверженности F. tularensis. Скорее всего легочной облучения от боеприпас F. tularensis бы аэрозольных бактерий, вдыхается в легкие8. Однако аэрозольные поколение F. tularensis опасных и громоздкой и требует специализированного оборудования и сдерживания. Альтернативный маршрут легочной воздействия в крысу, которая, возможно, более пригодных для нескольких лабораторий специализированное оборудование отсутствует через трахею прививка6. Этот метод использует Ларингоскоп для правильного размещения катетера в трахею наркотизированных крыс. Размещение в трахею, а не пищевода, проверяется простое устройство, которое отображает поток воздуха из легких. F. tularensis впоследствии доставлены в легкие через катетер администрацией с помощью шприца, с последующим введением воздуха в катетер для обеспечения легких доставки бактерий. В отличие от Jemski5 ранее сообщалось, что F. tularensis прививку в Фишер 344 крыс через интраназального маршрут может не культивировали от легких до 3 дней после прививки, указывающее, что интраназальной прививки в крыс делает не результат в прямой доставки бактерий в легкие.
Выберите агент формы F. tularensis (F. tularensis subsp. tularensis, F. tularensis subsp. holarctica) требуют биобезопасности уровня 3 (BSL3) включения процедур, которые бы предотвратить видеосъемка. Однако, F. novicida (Fn) освобождается от состояния выберите агента из-за его avirulence у здоровых людей и может безопасно использоваться под 2-го уровня биобезопасности (BSL2) условия9,10. Кроме того Fn служит основой для живых ослабленных вакцин, которые могут защитить от F. tularensis легочной экспозиции при доставке через трахею прививка11,12,13. Техника, представленная здесь позволяет для изучения инфекций, которые происходят через легочной маршрут, используя крыс как модель для людей. Этот метод может выполняться без необходимости специализированного оборудования генерации аэрозоля. FN использовался для методов снят здесь.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эта работа была выполнена в строгом соответствии с рекомендациями руководства для ухода и использования лабораторных животных национальных институтов здоровья. Животных с участием грызунов протоколы были одобрены Техасского университета в Сан-Антонио институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) по протоколу MU009(RA).
1. подготовить катетер, индикатор трахеи и F. tularensis посевным материалом
- Подготовить катетера (20 G x 2 в) вырезать 20 G x 2 иглы и молоть кончик иглы на тупую и гладкой отделки с роторный инструмент.
Примечание: Длину затупленными игла должна позволить металлический наконечник отменить приблизительно 3 мм в катетер рукав когда полностью вошли в разъемы на притупляются иглы. Притупляются иглы дает катетер структурную жесткость, чтобы позволить размещение катетера в трахею, и отсутствие кончик иглы притупляются, торчащий из катетера рукав предотвращает травмы трахеи. - Очистить затупленными иглами и катетеры, используя 70% этанола и стерилизовать под УФ светом за 15 мин.
- Подготовить катетера (20 G x 2 в) вырезать 20 G x 2 иглы и молоть кончик иглы на тупую и гладкой отделки с роторный инструмент.
- Подготовить трахеи индикатор
- Trim наконечник пипетки 1000 мкл чтобы кончик сидеть в катетер открытия и формируют герметичным уплотнением.
- Удалить фильтр из 200 мкл аэрозоля барьер пипеткой подсказки и место внутри наконечник пипетки ранее обрезанные 1000 мкл.
- Обеспечить фильтр может свободно перемещаться внутри наконечник пипетки 1000 мкл когда кончик указал наконечник вниз.
- F. tularensis посевным материалом
- растут F. tularensis штамм ночь на соответствующие агар пластины на 37 ° C. Scrape приблизительно 100 мкл бактериальной газона от плиты агара с стерильных прививки петлю и использовать для инокуляции 500 мл колбу Эрленмейера, содержащий 250 мл соответствующие жидкие роста средних (для Fn: tryptic соевый бульон (TSB) дополнены 0,1% L-цистеина гидрохлорида моногидрата) и инкубировать встряхивания на ночь на 37 ° C.
Примечание: F. novicida, используемые в видео был выращен на плите tryptic соевый агар (TSA) дополнены 0,1% L-цистеина гидрохлорида моногидрата. - Центрифуга ночь выросли жидкого культуры на 4 221 x g при комнатной температуре в течение 10 минут и удалить супернатант без нарушения бактерии Пелле.
Предупреждение: Пожалуйста, следуйте учреждение ' s биобезопасности рекомендации отказаться супернатант. - Нежно вновь приостановить бактериальных лепешка с 25 мл соответствующих жидкой среды (Fn: TSB, дополнена 0,1% L-цистеина гидрохлорида моногидрата) содержит 10% глицерина, с помощью пипетки 25 мл.
- С помощью пипетки 1 мл, Алиготе ресуспензированы бактериальной культуры в 500 мкл аликвоты во флаконах, заморозить в ванне с сухим льдом/этанол и хранить на -80 ° C.
- Для определения титра замороженных культуры флаконы, удалить два замороженных флаконов, температуре-80 ° C, оттепель на льду и выполнять серийных разведений в фосфат амортизированное Saline (PBS) следуют покрытие на соответствующий рост средних (Fn: TSA, содержащие 0,1% L-цистеин гидрохлорид). Плиты являются инкубирован 24-48 ч при 37 ° C, и колонии формируя единиц (CFU) перечисляются вычислить количество бактериальных клеток в замороженных культуры ампул (в среднем двух флаконов).
- Подготовить бактериальных посевным материалом, оттаивания замороженных флакона на льду, а затем разбавляют культуры с PBS до конечной концентрации 10 7 кое/100 мкл. Посевным материалом должен быть в концентрации, которая даст желаемого кое в 100 мкл (конечная концентрация глицерина в пределах посевным материалом не может быть более чем на 3%, чтобы предотвратить удушение крысы). Замороженные культуры флаконы по температуре-80 ° C может использоваться на срок до шести месяцев после подготовки.
- растут F. tularensis штамм ночь на соответствующие агар пластины на 37 ° C. Scrape приблизительно 100 мкл бактериальной газона от плиты агара с стерильных прививки петлю и использовать для инокуляции 500 мл колбу Эрленмейера, содержащий 250 мл соответствующие жидкие роста средних (для Fn: tryptic соевый бульон (TSB) дополнены 0,1% L-цистеина гидрохлорида моногидрата) и инкубировать встряхивания на ночь на 37 ° C.
2. Крыса анестезии
- подключить камеру анестезии исправный испарителем изофлюрановая анестезия машины.
- Подключение газовой очистки трубки на камере анестезии для очистки системы газ.
- Открыть поток кислорода на машине анестезии 4 Л/мин
- Установить изофлюрановая испарителем до 5%.
- Место крыса в зале анестезии.
Примечание: Мы обычно используют крыс между 8-10 недель (130-180 g); Молодые крысы трудно прививать через эту технику из-за небольшого размера полости рта. - При индукции анестезии имело место, поддерживать крысы на 5% изофлюрановая, 2 Л/мин кислорода для эффекта. Это занимает около 3-10 мин
- Определить глубины анестезии, качество и скорость дыхания и пульса, и реакция на рефлекторной стимуляции как мыс щепотку тест. Идеальные глубины анестезии обозначается s количество 1-1.5 между каждым вдохом.
3. Прививка трахею
- Удалить крысы из камеры для анестезии и место крыса дорзально на стенде грызунов интубации. Прикрепите передние зубы крыса держателю держать крыс на месте.
Примечание: Если крыса начинает пробудить во время процедуры, катетер может быть удален и крыса вернулся в палату анестезии для достижения глубокого плоскости анестезии. - Использовать доминирующей рукой для перемещения язык в той стороне, поддержка руку с широкой точки Туалетная пальца щипцы.
- Использование поддержки руку и закрепите язык ларингоскопа с крыса ' s Нижняя челюсть и визуализировать трахеи и пищевода животного. Трахеи будет открываться и закрываться как крыса дышит.
- Вставить катетер, содержащий 20-затуплены иглы, подготовленную на этапе 1.1, в трахею. Там может быть некоторое сопротивление, и вставки в трахеи может быть " неровной " благодаря катетер, потирая хрящи трахеи. Из-за влаги или поверхностное дыхание трахеи могут быть покрыты надгортанник, который предотвращает визуализации трахеи. Нежно Касаясь края хряща надгортанника вызовет хряща лоскут, чтобы открыть и раскрыть трахеи.
- Удаление затуплены иглы из катетера при одновременном обеспечении катетер остается в трахею.
- Позволяют в считанные секунды передать для крыс иметь возможность дышать вокруг катетера, вставляется в трахею.
- Твердо сидения трахеи индикатор на открытие катетера. Перемещения барьера аэрозоля укажет катетер вводится правильно в трахею.
- Убедитесь, что крыса лежит на стенде интубации, таким образом, чтобы грудь животного сталкивается перпендикулярно плоскости стенда интубации.
- Удалить индикатор трахеи и доставить 100 мкл (10 7 кое) по посевным материалом, содержащие F. tularensis с помощью кончика пипетки 200 мкл, твердо Гостиный кончик против открытия катетера.
- Присоединения 1 мл скольжения кончик туберкулин шприц наполняется воздухом и доставить 300 мкл воздуха для обеспечения посевным материалом достигает легких крыс.
- Катетер из трахеи и удалите крысы из платформе хирургической.
- Позволяют крысиного пробудить и вернуться к клетке. Убедитесь, что дыхание вернулся к нормальной.
- Определить кое в F. tularensis посевным материалом, как описано в шаге 1.3.5 для подтверждения кое доставлены в трахею.
- Повторите пункты 3.1-3,9 на непривитых (наивно) животных с 100 мкл PBS вместо посевные.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Гуморальный ответ на вакцинацию F. tularensis трахею крыс может определяться энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) против УФ инактивированных бактерий, как описано выше11. Общая иммуноглобулина G (IgG) ответ Фишер 344 крыс клеточных инактивированных бактерий был начисленных пост трахею прививка с ослабленный штамм Fn (107 кое посевным материалом) на 14 день и день 28 (рис. 1). Макет прививки крыс получил PBS intratracheally. Увеличение в сыворотке титры антител против Fn после прививки относительно наивно макет вакцинированных животных показывает эффективность вакцинации трахею. Низкая сыворотки реактивности может свидетельствовать о неправильной трахею размещения.
Рисунок 1: общее IgG ответы жить прививка аттенуированные Fn трахею крыс F344. Sera F344 крыс (n = 5) привитых intratracheally с живой ослабленный штамм Fn (107 кое) были проанализированы на общее IgG уровня реактивной с клеточных Fn в день 14 и 28 дней после прививки. Макет прививки (наивно) крыс (n = 5) были привитых intratracheally с PBS. Красная область обозначает реактивности наивно сывороток (F344 крысы привиты макета с PBS). Планки погрешностей представляют SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Крыса 344 Фишер становится важной моделью для разработки вакцины против туляремии3. Подверженности F. tularensis через легочной маршрут имеет решающее значение для демонстрации эффективности против вепонизации форм F. tularensis, потому что они поставляются в виде аэрозолей. Прививка трахею крыс облегчает воздействие легких крыс F. tularensis без необходимости для крупных, дорогостоящих и сложных аэрозоля генерации оборудования. Все эксперименты, используя формы выберите агент F. tularensis дополнительно требуют BSL3 сдерживания, которое обычно происходит в строго ограниченном пространстве. Таким образом этот метод уменьшает количество дополнительного оборудования, которое необходимо быть размещены в пределах этой рабочей среды.
Потому что Fn F. tularensis штамм, используемых для видеосъемка, все методы были выполнены под BSL2 сдерживания. Адаптация этой техники для BSL3 окружающей среды включает в себя все процедуры в рамках биобезопасности кабинета персоналом носят одежду по биобезопасности (полный Гуд, питание Воздушные очищающие респиратор (PAPR), чехол с капюшоном, перчатки, пинетки), и эти приспособления уменьшить мобильность, ловкость и видимость. Трахея индикатор-это важный компонент, который позволяет подтвердить, что катетер был правильно помещен в трахею, учитывая, что часто бывает трудно сделать в противном случае это определение при работе в условиях BSL3.
Есть анатомически правильное крыса «тренажеры» которые имеют трахеи и пищевода, и они являются полезными для совершенствовать технику до работы с живыми животными. Однако работая с тренажера не идентичен работает с живой крысы. Одним из способов определить, если этот метод выполняется правильно в живое животное является использовать Трипановый синий краситель как посевным материалом на наркотизированных крыс, и после процедуры немедленно усыпить животных. Рассечение ткани легких и желудка покажет, если краситель был доставлен в легкие и не пищевода. Крысы, которые были вакцинированы с Fn/футов, этот метод также может быть euthanized вскоре после прививки и легочную ткань покрытием для определения фактической осаждения в легких.
Правильное трахею прививка будет иметь важное значение для оценки эффективности вакцины против туляремии в Фишер 344 крыса, но она также может быть полезным для других вакцин и/или терапевтического применения крыс, включая биозащиты. Таким образом этот метод может быть адаптирована к целый ряд легких приложений, используя модель крыса. Хотя доставка аэрозоля генерации устройств может быть больше похож на сценарий отражению, трахею прививка F. tularensis представляет собой относительно простой, экономически эффективные альтернативы для разработки вакцины против туляремии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать
Acknowledgments
Это исследование было поддержано обороны агентства сокращения угрозы (DTRA) по контракту HDTRA1-14-C-0116 и центром передового опыта в области геномики (DOD #W911NF-11-1-0136) инфекции.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GreenLine fiber optic blade size 0 | Carefusion | 5-5231-00 | Macintosh American profile |
| GreenLight system laryngoscope handle | Carefusion | 4559GSP | |
| Exel International Safelet I.V. Catheter | EXEL INTERNATIONAL | 26743 | |
| Slip Tip Sterile Syringes 1mL | BD | 309659 | |
| Broad Point Dressing Thumb Forceps | Thermo Scientific | 76-302 | |
| 200 μL barrier tip | GeneseeScientific | 24-142 | |
| 1,000 μL pipette tip | Olympus Plastics | 24-173 | |
| Dremel 3000-2/28 Rotary tool kit | Dremel | 3000228 | |
| Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific | RIS 200 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Rodent anesthesia machine | Surgivet | VTC302 Classic T3 | |
| Rodent Anesthesia chamber | Braintree Scientific | AB 1 |
References
- Ellis, J., Oyston, P. C. F., Green, M., Titball, R. Tularemia. Clin Microbiol Rev. 15 (4), 631-646 (2002).
- Lyons, C. R., Wu, T. H. Animal models of Francisella tularensis infection. Ann N Y Acad Sci. 1105, (2007).
- Hutt, J. A., Lovchik, J. A., Dekonenko, A., Hahn, A. C., Wu, T. H. The Natural History of Pneumonic Tularemia in Female Fischer 344 Rats after Inhalational Exposure to Aerosolized Francisella tularensis subspecies tularensis Strain Schu S4. Am J Pathol. 187 (2), 252-267 (2017).
- Ray, H. J., et al. The Fischer 344 rat reflects human susceptibility to Francisella pulmonary challenge and provides a new platform for virulence and protection studies. PloS one. 5, e9952 (2010).
- Jemski, J. V. Respiratory tularemia: comparison of selected routes of vaccination in Fischer 344 rats. Infect Immun. 34 (3), 766-772 (1981).
- Wu, T. H., et al. Vaccination of Fischer 344 rats against pulmonary infections by Francisella tularensis type A strains. Vaccine. 27 (34), 4684-4693 (2009).
- Mara-Koosham, G., Hutt, J. A., Lyons, C. R., Wu, T. H. Antibodies contribute to effective vaccination against respiratory infection by type A Francisella tularensis strains. Infect Immun. 79 (4), 1770-1778 (2011).
- Oyston, P. C., Sjostedt, A., Titball, R. W. Tularaemia: bioterrorism defence renews interest in Francisella tularensis. Nat Rev Microbiol. 2 (12), 967-978 (2004).
- Kingry, L. C., Petersen, J. M. Comparative review of Francisella tularensis and Francisella novicida. Front Cell Infect Microbiol. 4, 35 (2014).
- Rohmer, L., et al. Comparison of Francisella tularensis genomes reveals evolutionary events associated with the emergence of human pathogenic strains. Genome Biol. 8 (6), R102 (2007).
- Chu, P., et al. Live attenuated Francisella novicida vaccine protects against Francisella tularensis pulmonary challenge in rats and non-human primates. PLoS Pathog. 10 (10), e1004439 (2014).
- Signarovitz, A. L., et al. Mucosal Immunization with Live Attenuated Francisella novicida U112ΔiglB Protects against Pulmonary F. tularensis SCHU S4 in the Fischer 344 Rat Model. PloS one. 7 (10), e47639 (2012).
- Cunningham, A. L., et al. Enhancement of vaccine efficacy by expression of a TLR5 ligand in the defined live attenuated Francisella tularensis subsp. novicida strain U112DiglB::fljB. Vaccine. 32 (40), 5234-5240 (2014).
