Summary
Denne protokol beskriver intratrakeal vaccinationer af Fischer 344 rotter med Francisella tularensis. Denne procedure efterligner pulmonal eksponering af mennesker til denne potentielle biothreat agent og kan bruges til at teste vaccine og terapeutiske virkning mod pulmonal tularæmi.
Abstract
Pulmonal infektion med bakterien Francisella tularensis kan føre til alvorlige og potentielt dødelige sygdom, tularæmi, hos mennesker. På grund af den nuværende mangel på en godkendt tularæmi vaccine til mennesker, er forskning fokuseret på vaccine udvikling udnytter passende dyremodeller. Fischer 344 rotte fremstod som en model, der afspejler menneskelige modtagelighed for F. tularensis infektion, og er således en attraktiv model for tularæmi vaccine udvikling. Intratrakeal podning af Fischer 344 rotte med F. tularensis efterligner pulmonal eksponering hos mennesker. Den succesrige levering i rotte luftrøret er kritisk for pulmonal levering. En laryngoscope med belysning bruges til korrekt intubate tracheae af bedøvede rotter; den korrekte placering i luftrøret bestemmes ved en simpel anordning at opdage vejrtrækning. Efter intubation, F. tularensis kultur leveres i en afmålt dosis via sprøjte. Denne teknik standardiserer pulmonal levering af F. tularensis i rotte luftrøret til at evaluere vaccine effektivitet.
Introduction
F. tularensis (Ft) forårsager sygdom hos mennesker tularæmi. Når bakterier er erhvervet gennem ruten pulmonal, fører dette til lungerne tularæmi, som har høj sygelighed og dødelighed1. F. tularensis betragtes som en biothreat agent på grund af risikoen forbundet med aerosolmaterialer former, og der er i øjeblikket ingen vaccine godkendt til human brug i USA En intensiv indsats er i øjeblikket undervejs at udvikle vacciner og terapeutiske foranstaltninger mod lungerne tularæmi, at beskytte befolkningen mod ulovlig brug af denne bakterielle biothreat.
Meget af tularæmi forskning har fokuseret på musemodel, på grund af den ekstreme følsomhed mus til F. tularensis infektion, og forekomsten af reagenser. Mus har imidlertid vist sig for at være en vanskelig model for vaccine udvikling, på grund af vanskeligheden ved at demonstrere vaccine effekt i denne model2. For nylig, Fischer 344 rotte er blevet udviklet som en model for tularæmi vaccine udvikling3. Følsomheden af Fischer 344 rotte til forskellige F. tularensis underart efterligner menneskets følsomhed4, og rotter kan beskyttes mod F. tularensis pulmonal udfordring ved vaccination med levende vaccinestammer kendt for at beskytte mennesker5,6,7. Da Fischer 344 rotte modeller nogle funktioner af F. tularensis infektion hos mennesker, kan det være en særdeles nyttig model for udviklingen af en vaccine, der beskytter mod lunge F. tularensis eksponering.
En effektiv vaccine skal beskytte mennesker mod pulmonal eksponering for F. tularensis. Den mest sandsynlige pulmonal eksponering fra weaponized F. tularensis ville være aerosolmaterialer bakterier inhaleret i lungerne8. Dog aerosol generation af F. tularensis er både farlig og besværlig, og kræver specialudstyr og indeslutning. En alternativ rute af pulmonal eksponering i rotter, som måske er mere fleksibel for flere laboratorier mangler specialiseret udstyr er via intratrakeal podning6. Denne teknik anvender en laryngoscope til den korrekte placering af et kateter i luftrøret af en bedøvede rotte. Placering i luftrøret, i stedet for i spiserøret, er kontrolleret af en simpel anordning, der visualiserer luftstrøm fra lungerne. F. tularensis leveres efterfølgende ned i lungerne gennem kateteret af administrationen med en sprøjte, efterfulgt af indførelsen af luft ind i kateteret at sikre pulmonal levering af bakterier. Derimod Jemski5 tidligere rapporteret at F. tularensis inokuleres i Fischer 344 rotter via intranasal rute ikke kunne blive kulturperler fra lungerne indtil 3 dage efter podning, der angiver, at intranasal podning i rotter gør ikke resultere i direkte levering af bakterier ned i lungerne.
Vælg agent former af F. tularensis (F. tularensis subsp. tularensis, F. tularensis subsp. holarctica) kræver biosikkerhed niveau 3 (BSL3) indeslutning procedurer, hvilket ville forhindre videography. Men F. novicida (Fn) er undtaget fra Vælg agent status på grund af sin avirulence hos raske mennesker, og kan udnyttes sikkert under biosikkerhedsniveau 2 (BSL2) betingelser9,10. Desuden tjener Fn som grundlag for levende svækkede vacciner, der kan beskytte mod F. tularensis pulmonal eksponering når leveret via intratrakeal podning11,12,13. Teknikken præsenteres her tillader for studiet af infektioner, der opstår gennem ruten pulmonal udnytter rotter som en model for mennesker. Denne teknik kan udføres uden behov for specialiserede aerosol-generering udstyr. FN blev brugt til teknikker filmet her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
dette arbejde blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Animalske protokoller der involverer gnavere blev godkendt ved University of Texas i San Antonio institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) under protokollen MU009(RA).
1. forberede kateter, luftrøret indikator og F. tularensis inokulum
- Forberede kateter (20 G x 2 i)
- skære 20 G x 2 i nål og grind spidsen af nålen til en stump og glat finish med en roterende værktøj.
Bemærk: Længden af den afrundede nål bør tillade metalspids til at ophæve ca 3 mm i kateteret ærme når helt sidder på afrundede nålen. Afrundede nålen giver kateter strukturelle stivhed til at tillade placeringen af kateter i luftrøret, og fraværet af afrundede nål spidsen fremspringende fra kateteret ærme forhindrer skade at luftrøret. - Rengør afrundede nåle og katetre med 70% ethanol og sterilisere under UV-lys i 15 min.
- skære 20 G x 2 i nål og grind spidsen af nålen til en stump og glat finish med en roterende værktøj.
- Forberede luftrøret indikator
- trimme en 1.000 µL pipette tip til at tillade tip til at sidde i et kateter åbning og danne en lufttæt forsegling.
- Fjerne et filter fra en 200 µL aerosol barriere pipette tip og sted inde tidligere trimmet 1.000 µL pipette tip.
- Sikre, at filteret kan flytte frit inde i 1.000 µL pipette tip når spidsen peger tip-down.
- F. tularensis inokulum
- vokse F. tularensis stamme natten på passende agar plade på 37 ° C. Skrab ca 100 µL af bakteriel græsplænen fra agar plade med en steril vaccinere loop og bruge til podes en 500 mL Erlenmeyer-kolbe, som indeholder 250 mL af passende flydende vækstmediet (for Fn: tryptic soja bouillon (TSB) suppleret med 0,1% L-Cystein hydrochlorid monohydrat) og inkuberes ryster natten over ved 37 ° C.
Bemærk: F. novicida anvendes i videoen blev dyrket på en tryptic soja agar (TSA) plade suppleret med 0,1% L-Cystein hydrochlorid monohydrat. - Centrifugeres overnight dyrket flydende kultur på 4,221 x g ved stuetemperatur i 10 min og Fjern supernatanten uden at forstyrre bakterier pellet.
Forsigtig: Følg institution ' s biosikkerhed anbefalinger til at kassere supernatanten. - Forsigtigt genopslæmmes den bakterielle pellet med 25 mL af passende flydende medium (Fn: TSB suppleret med 0,1% L-Cystein hydrochlorid monohydrat) som indeholder 10% glycerol, ved hjælp af en 25 mL pipette.
- Ved hjælp af 1 mL pipette, alikvot resuspenderet bakteriekulturen til 500 µL delprøver i hætteglas, fryse i et bad med tøris/ethanol, og opbevares ved-80 ° C.
- Til at bestemme titer af frosne kultur hætteglas, fjerne to frosne hætteglas opbevares ved-80 ° C, tø på ice og udføre serielle fortyndinger i phosphat bufferet saltvand (PBS) efterfulgt af plating på passende vækstmediet (Fn: TSA der indeholder 0,1% L-Cystein hydrochlorid). Pladerne inkuberes 24-48 timer ved 37 ° C, og koloni danner enheder (CFU) optælles for at beregne antallet af bakterieceller inden for frosne kultur hætteglas (gennemsnit af to hætteglas).
- Forbered den bakterielle inokulum ved optøning af en frosset hætteglas på is, og derefter fortyndes kultur med PBS til den endelige koncentration af 10 7 CFU/100 µL. Inokulat bør være i en koncentration, der vil give den ønskede CFU i 100 µL (slutkoncentration af glycerol inden for inokulat kan ikke være mere end 3%, at forhindre kvælning af rotte). Frosne kultur hætteglas opbevares ved-80 ° C kan bruges i op til seks måneder efter tilberedning.
- vokse F. tularensis stamme natten på passende agar plade på 37 ° C. Skrab ca 100 µL af bakteriel græsplænen fra agar plade med en steril vaccinere loop og bruge til podes en 500 mL Erlenmeyer-kolbe, som indeholder 250 mL af passende flydende vækstmediet (for Fn: tryptic soja bouillon (TSB) suppleret med 0,1% L-Cystein hydrochlorid monohydrat) og inkuberes ryster natten over ved 37 ° C.
2. Rotte anæstesi
- tilsluttes korrekt drift isofluran vaporizer af en anæstesi maskine anæstesi afdeling.
- Tilslut gas scavenging røret på anæstesi kammer til gas scavenging system.
- Åbn ilt flowet på anæstesi maskine til 4 L/min.
- Sæt isofluran vaporizer til 5%.
- Placere rotten i anæstesi afdeling.
Bemærk: Vi typisk udnytter rotter mellem 8-10 uger gamle (130-180 g); yngre rotter er vanskelige at podes via denne teknik på grund af den lille størrelse af munden hulrummet. - Når induktion af anæstesi har fundet sted, opretholde den rotte på 5% isofluran, 2 L/min ilt til effekt. Dette tager ca. 3-10 min.
- Bestemme dybden af anæstesi af kvalitet og hastighed af åndedræt og hjerterytme og reaktion på refleks stimulation som i tå knivspids test. Ideel dybde af anæstesi er angivet med 1-1,5 s tæller mellem hvert åndedrag.
3. Intratrakeal podning
- fjerne rotten fra anæstesi kammer og placere rotten dorsalt på gnavere intubation stand. Tillægger indehaveren til at holde rotte i sted fortænderne af rotte.
Bemærk: Hvis rotten begynder at vække under proceduren, kateteret kan fjernes og rotten returneres anæstesi herhen for at nå frem til et dybere plan af anæstesi. - Bruge dominerende hånd for at flytte tungen til samme side som støtte hånd med bred punkt dressing tommelfinger pincet.
- Brug støtte hånd og sikre tungen med laryngoscope mod rotten ' s lavere kæben og visualisere luftrøret og spiserøret af dyret. Luftrør vil åbne og lukke som rotten ånder.
- Indsæt kateteret indeholdende en 20-gauge afrundede-nål, forberedt i trin 1.1, ind i luftrøret. Der kan være let modstand, og indsættelse i luftrøret kan være " ujævn " på grund af det kateter, gnide de trakeale brusk. På grund af fugt eller lavvandede respiration, kan luftrøret dækkes af den strubelåget, som forhindrer visualisering af luftrøret. Forsigtigt at røre ved kanten af epiglottis brusk vil forårsage brusk klap til at åbne og afdække luftrøret.
- Fjern afrundede nålen fra kateteret samtidig sikre kateteret forbliver i luftrøret.
- Giver mulighed for et par sekunder til at passere til rotte at kunne trække vejret omkring kateter indsættes i luftrøret.
- Fast sæde luftrøret indikator på kateteret åbning. Flytning af aerosol barriere angiver kateteret er indsat korrekt i luftrøret.
- Sikre, at rotten håndspålæggelsen intubation standeren, så brystet af dyret står vinkelret på planet for intubation standeren.
- Fjerne indikatoren for luftrøret og levere 100 µL (10 7 CFU) af inokulum indeholdende F. tularensis ved hjælp af en 200 µL pipette tip, fast siddepladser spids mod kateter åbningen.
- Vedhæfte en 1 mL slip tip tuberkulin sprøjte fyldt med luft og levere 300 µL af luft at sikre inokulum når frem til lungerne af rotten.
- Fjerne kateteret fra luftrøret og fjerne rotten fra den kirurgiske platform.
- Tillade rotte vække og vende tilbage til buret. Sørg for, at vejrtrækningen er vendt tilbage til normal.
- Afgøre CFU i F. tularensis inokulum som beskrevet i trin 1.3.5 at bekræfte CFU leveret i luftrøret.
- Gentag trin 3.1-3,9 på uvaccinerede (naivt) dyr med 100 µL PBS i stedet for inokulat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det humorale respons til intratrakeal podning af F. tularensis i rotter kan bestemmes ved enzymmaerket assay (ELISA) mod UV-inaktiverede bakterier, som tidligere beskrevet11. Samlede Immunoglobulin G (IgG) reaktion Fischer 344 rotter til inaktiverede hele cellen bakterier var vurderet post-intratrakeal podning med en svækket stamme af Fn (107 CFU inokulum) på dag 14 og 28 (figur 1). Mock-vaccinerede rotter modtaget PBS intratracheally. En stigning i serum antistof titers mod Fn efter podning i forhold til naive mock-vaccinerede dyr angiver intratrakeal vaccination effektivitet. Lavt serum reaktivitet kan indikere forkert intratrakeal placering.
Figur 1: Total IgG svar til Live svækkede Fn intratrakeal podning i F344 rotter. Sera fra F344 rotter (n = 5) podede intratracheally med en levende svækket Fn stamme (107 CFU) blev analyseret for total IgG niveauer reaktivt med hele cellen Fn på dag 14 og dag 28 efter podning. Mock-vaccineret (naivt) rotter (n = 5) var podede intratracheally med PBS. Rød område angiver reaktivitet af naive sera (F344 rotter mock-vaccineret med PBS). Fejllinjer udgør SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fischer 344 rotte er ved at blive en vigtig model for tularæmi vaccine udvikling3. Eksponering for F. tularensis gennem ruten pulmonal er kritisk for at vise effekten af weaponized former af F. tularensis, fordi disse leveres som aerosoler. Intratrakeal podning af rotten letter eksponering af rotte lungerne til F. tularensis uden behov for stort, dyrt og kompliceret aerosol generering udstyr. Alle forsøg udnytte Vælg agent former af F. tularensis desuden kræve BSL3 indeslutning, som typisk opstår i stærkt begrænset plads. Således, denne teknik minimerer mængden af ekstra udstyr, der skal være anbragt inden for at arbejdsmiljø.
Da Fn blev F. tularensis stamme udnyttede videography, blev alle teknikker udført under BSL2 indeslutning. Tilpasning af denne teknik til BSL3 miljø omfatter alle procedurer udføres inden for et kabinet biosikkerhed af personale iført biosikkerhed gear (fuld hood, drevet luft rensende respirator (PAPR), beskyttende dække alle med hætte, handsker, støvletter), og disse tilpasninger reducere mobiliteten, smidighed og synlighed. Indikatoren luftrøret er en vigtig komponent, der giver bekræftelse at kateteret blev placeret korrekt i luftrøret, overvejer det er ofte vanskeligt at ellers gøre denne bestemmelse, når de arbejder under BSL3 betingelser.
Der er anatomisk korrekte rat "simulatorer" der har en luftrøret og spiserøret, og disse er nyttige til at perfektionere teknikken inden arbejder med levende dyr. Arbejde med simulatoren er imidlertid ikke identisk med arbejder med en levende rotte. Et middel til at bestemme, om denne teknik er udført korrekt i det levende dyr er at udnytte Trypan blå farvestof som inokulat på en bedøvede rotte, og efter proceduren, der straks aflive dyret. Dissektion af lungevæv og mave vil afsløre, hvis farvestoffet blev leveret til lungerne og ikke i spiserøret. En rotte, der er blevet vaccineret med Fn/Ft af denne teknik kan også være euthanized kort efter podning og lungevæv belagt for at bestemme faktiske deposition i lungen.
Korrekte intratrakeal podning vil være vigtigt for evaluering af tularæmi vaccine effektivitet i Fischer 344 rotten, men det kan også være nyttige for andre vaccine og/eller terapeutiske applikationer i rotter samt, herunder biodefense. Denne teknik kan således tilpasses en bred vifte af pulmonale applications udnytter den rotte model. Selv om levering af en aerosol genererer enhed kan være mere ligner en biothreat scenario, repræsenterer intratrakeal podning af F. tularensis en forholdsvis enkel, omkostningseffektivt alternativ til tularæmi vaccine udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at videregive
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af Defense trussel reduktion agentur (DTRA) under kontrakt HDTRA1-14-C-0116 og Center for ekspertise inden for infektion genomforskning (DOD #W911NF-11-1-0136).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GreenLine fiber optic blade size 0 | Carefusion | 5-5231-00 | Macintosh American profile |
| GreenLight system laryngoscope handle | Carefusion | 4559GSP | |
| Exel International Safelet I.V. Catheter | EXEL INTERNATIONAL | 26743 | |
| Slip Tip Sterile Syringes 1mL | BD | 309659 | |
| Broad Point Dressing Thumb Forceps | Thermo Scientific | 76-302 | |
| 200 μL barrier tip | GeneseeScientific | 24-142 | |
| 1,000 μL pipette tip | Olympus Plastics | 24-173 | |
| Dremel 3000-2/28 Rotary tool kit | Dremel | 3000228 | |
| Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific | RIS 200 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Rodent anesthesia machine | Surgivet | VTC302 Classic T3 | |
| Rodent Anesthesia chamber | Braintree Scientific | AB 1 |
References
- Ellis, J., Oyston, P. C. F., Green, M., Titball, R. Tularemia. Clin Microbiol Rev. 15 (4), 631-646 (2002).
- Lyons, C. R., Wu, T. H. Animal models of Francisella tularensis infection. Ann N Y Acad Sci. 1105, (2007).
- Hutt, J. A., Lovchik, J. A., Dekonenko, A., Hahn, A. C., Wu, T. H. The Natural History of Pneumonic Tularemia in Female Fischer 344 Rats after Inhalational Exposure to Aerosolized Francisella tularensis subspecies tularensis Strain Schu S4. Am J Pathol. 187 (2), 252-267 (2017).
- Ray, H. J., et al. The Fischer 344 rat reflects human susceptibility to Francisella pulmonary challenge and provides a new platform for virulence and protection studies. PloS one. 5, e9952 (2010).
- Jemski, J. V. Respiratory tularemia: comparison of selected routes of vaccination in Fischer 344 rats. Infect Immun. 34 (3), 766-772 (1981).
- Wu, T. H., et al. Vaccination of Fischer 344 rats against pulmonary infections by Francisella tularensis type A strains. Vaccine. 27 (34), 4684-4693 (2009).
- Mara-Koosham, G., Hutt, J. A., Lyons, C. R., Wu, T. H. Antibodies contribute to effective vaccination against respiratory infection by type A Francisella tularensis strains. Infect Immun. 79 (4), 1770-1778 (2011).
- Oyston, P. C., Sjostedt, A., Titball, R. W. Tularaemia: bioterrorism defence renews interest in Francisella tularensis. Nat Rev Microbiol. 2 (12), 967-978 (2004).
- Kingry, L. C., Petersen, J. M. Comparative review of Francisella tularensis and Francisella novicida. Front Cell Infect Microbiol. 4, 35 (2014).
- Rohmer, L., et al. Comparison of Francisella tularensis genomes reveals evolutionary events associated with the emergence of human pathogenic strains. Genome Biol. 8 (6), R102 (2007).
- Chu, P., et al. Live attenuated Francisella novicida vaccine protects against Francisella tularensis pulmonary challenge in rats and non-human primates. PLoS Pathog. 10 (10), e1004439 (2014).
- Signarovitz, A. L., et al. Mucosal Immunization with Live Attenuated Francisella novicida U112ΔiglB Protects against Pulmonary F. tularensis SCHU S4 in the Fischer 344 Rat Model. PloS one. 7 (10), e47639 (2012).
- Cunningham, A. L., et al. Enhancement of vaccine efficacy by expression of a TLR5 ligand in the defined live attenuated Francisella tularensis subsp. novicida strain U112DiglB::fljB. Vaccine. 32 (40), 5234-5240 (2014).
