Summary
Bu iletişim kuralı boğaza aşılamalar Fischer 344 sıçan ile açıklar FRANCISELLA tularensis. Bu yordamı insanlar pulmoner maruz kalma bu potansiyel biothreat Ajan taklit eder ve aşı ve tedavi edici etkinliği pulmoner Tularemi karşı test etmek için kullanılabilir.
Abstract
Pulmoner enfeksiyon bakteri FRANCISELLA tularensis ile ciddi ve ölümcül hastalık, Tularemi, insanlarda yol açabilir. Bir onaylanmış Tularemi aşısı insanlar için geçerli olmaması nedeniyle araştırma uygun hayvan modelleri kullanan aşı geliştirme üzerine odaklanmıştır. Fischer 344 sıçan F. tularensis enfeksiyon insan duyarlılık yansıtır ve bu nedenle Tularemi aşısı geliştirme için çekici bir model bir model olarak ortaya çıkmıştır. F. tularensis Fischer 344 fareyle boğaza aşı insanlarda akciğer pozlama taklit eder. Sıçan nefes borusu içine başarılı teslimat Akciğer teslimat için önemlidir. Laringoskop aydınlatma ile düzgün imzalat sıçan tracheae entübasyon için kullanılır; Nefes borusu içinde doğru bulma nefes algılamak için basit bir aygıt tarafından belirlenir. Entübasyon, F. tularensis kültürü şırınga ile ölçülen bir doz teslim edilir. Bu teknik aşısı etkinliğini değerlendirmek için fare nefes borusu içinde F. tularensis pulmoner teslim standartlaştıran.
Introduction
F. tularensis (Ft) insan hastalık nedenleri Tularemi. Bakteriler akciğer yönlendirme yolu iktisap zaman, bu yüksek morbidite ve mortalite1öğretilenbir Tularemi için yol açar. F. tularensis aerosolize formlarla ilişkili tehlike nedeniyle bir biothreat ajan olarak kabul edilir ve şu anda ABD'de insan kullanımı için onaylanan aşı Yoğun bir çaba aşı ve bu bakteriyel biothreat insan nüfusu ve yasadışı kullanıma karşı korumak için öğretilenbir Tularemi karşı tedavi edici önlemler geliştirmek için şu sıralar başlatıldı.
Tularemi araştırma çoğunu fareler F. tularensis enfeksiyon için aşırı duyarlılık ve reaktifler yaygınlığı nedeniyle fare modeli üzerinde odaklanmıştır. Ancak, fareler için bu model2aşı etkinlik gösteren zorluğu nedeniyle aşı geliştirme zor bir model olduğu kanıtlanmıştır. Son zamanlarda, Fischer 344 sıçan Tularemi aşısı geliştirme3için bir model olarak geliştirilmiştir. Çeşitli F. tularensis alttür Fischer 344 fare duyarlılığını insan duyarlılığı4taklit eder ve fareler F. tularensis pulmoner meydan karşı korumak için bilinen bir canlı aşı suşu ile aşı tarafından korunabilir insanlar5,6,7. F. tularensis enfeksiyon insanların bazı özellikleri Fischer 344 fare modelleri, pulmoner F. tularensis karşı koruyan bir aşı geliştirilmesi için son derece faydalı bir model olması olabilir maruz kalma.
Etkili bir aşı insanlara F. tularensispulmoner maruz karşı korumak gerekir. Büyük olasılıkla pulmoner maruz kalma weaponized F. tularensis aerosolize bakteriler akciğer8içine inhale olurdu. Bununla birlikte, F. tularensis nesil aerosol tehlikeli ve hantal ve özel ekipman ve koruma gerekir. Alternatif bir yol içinde belki de daha fazla olduğunu sıçan pulmoner maruz kalma uyarlanabilir birden fazla laboratuarlar için özel ekipman eksik boğaza aşı6yolu ile konuşuyor. Laringoskop bir kateter imzalat bir sıçan Trakea içinde doğru yerleşimini için bu tekniği kullanır. Nefes borusu, yemek borusu yerine içinde bulma dan akciğerlere hava akımı görüntüler basit bir aygıt tarafından doğrulanır. F. tularensis daha sonra kateter aracılığıyla ciğerlerine yönetim tarafından bakteri pulmoner teslim edilmesini sağlamak için kateter hava giriş tarafından takip bir şırınga ile teslim edilir. Buna ek olarak, Sıçanlarda etkilerinin bu aşı belirten Jemski,5 içine Fischer 344 fareler burunici rota yolu ile aşılanmış F. tularensis akciğerlerden 3 gün sonrası aşılama kadar kültürlü değil ki daha önce rapor mu değil doğrudan teslim sonuç ciğerlerine bakterilerin.
F. tularensis (F. tularensis subsp. tularensis, F. tularensis subsp. holarctica) SELECT Ajan formları videografisi önleyecek Biyogüvenlik seviye 3 (BSL3) kapsama yordamlar gerektirir. Ancak, F. novicida (Fn) seçin Aracısı durumu nedeniyle onun avirulence sağlıklı insanlarda muaf ve seviye 2 (BSL2) koşulları9,10altında güvenle kullanılabilir. Ayrıca, Fn via boğaza aşılama11,12,13teslim F. tularensis pulmoner pozlama karşı koruyabilirsiniz canlı zayıflatılmış aşılar için temel olarak hizmet vermektedir. Burada sunulan tekniği fareler insanlar için bir model olarak kullanan pulmoner rota üzerinden oluşan enfeksiyonlar incelenmesi için izin verir. Bu teknik özel aerosol üreten ekipman için gerek kalmadan gerçekleştirilebilir. FN burada filme teknikleri için kullanıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu iş için bakım ve kullanım laboratuvar hayvanları Ulusal Sağlık Enstitüleri Kılavuzu'nda bulunan öneriler ile sıkı uygun olarak gerçekleştirildi. Kemirgenler içeren hayvan iletişim kuralları onayladı tarafından University of Texas San Antonio kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) iletişim kuralı'nı MU009(RA).
1. kateter hazırlamak, Trakea göstergesi ve F. tularensis Inoculum
- Hazırlamak kateter (20 G x 2 inç)
- 20 G x 2 iğne ve künt ve düz iğne ucu bitirmek ile eziyet kesilmiş bir döner aracı.
Not: Körelmenin iğne uzunluğu yaklaşık 3 mm zaman tamamen körelmenin iğne oturmuş kateter kol içine iptal edin metal uç izin vermelisiniz. Körelmenin iğne kateter yapısal sertlik Trakea kateter yerleştirme olanak verir ve kateter kol çıkıntılı körelmenin iğne ucu yokluğu nefes borusu yaralanma engeller. - Körelmenin iğneler ve % 70 etanol kullanarak Kateterler temiz ve 15 dakika süreyle UV ışık altında sterilize
- 20 G x 2 iğne ve künt ve düz iğne ucu bitirmek ile eziyet kesilmiş bir döner aracı.
- Hazırlamak Trakea göstergesi
- bir kateter açılış içine oturup bir hava geçirmez mühür formu ipucu izin vermek için 1.000 µL pipet ucu Trim.
- 'İ 200 µL aerosol bariyer pipet ucu ve önceden kesilmiş 1.000 µL pipet ucu yerde bir filtreyi kaldırmak.
- Filtre taşıyabilirsiniz serbestçe 1.000 µL pipet ucu içinde belgili tanımlık uç uç aşağı işaretlendiğinde olun.
- F. tularensis Inoculum
- Grow F. tularensis yük gecede uygun agar plaka 37 ° C. Scrape yaklaşık 100 µL agar plaka ile steril bir bakteriyel çim aşı döngü ve 500 mL Erlenmeyer uygun sıvı büyüme ortamının 250 mL içeren flask aşılamak için kullanın (için Fn: %0,1 L-sistein hidroklorür monohidrat ile desteklenmiş tryptic soya suyu (TSB)) ve gecede 37, sallayarak kuluçkaya ° C.
Not: video kullanılan F. novicida %0,1 L-sistein hidroklorür monohidrat ile desteklenmiş bir tryptic soya agar (TSA) plaka üzerinde büyüdü. - 4,221 x g, oda sıcaklığında 10 dakika için de gecede yetişkin sıvı kültür santrifüj kapasitesi ve süpernatant bakteri Pelet aksatmadan kaldırın.
Uyarı: Lütfen kurum izleyin ' süpernatant atmak için s Biyogüvenlik önerileri. - Yavaşça bakteriyel Pelet uygun sıvı orta 25 mL ile yeniden askıya alma (Fn: %0,1 L-sistein hidroklorür monohidrat ile desteklenmiş TSB) % 10 gliserol, 25 mL pipet kullanarak içeren.
- 1 mL pipet, aliquot tüpleri, 500 µL aliquots içine resuspended bakteri kültürü kullanarak bir kuru buz/etanol banyosunda donma ve depolamak-80 ° C. Donmuş kültür tüpleri titresi belirlemek için
- -80 ° C'de depolanan iki donmuş şişeleri Kaldır, çözülme buzda ve seri dilutions içinde fosfat tamponlu tuz (kaplama tarafından uygun büyüme medyada takip PBS) gerçekleştirmek (Fn: %0,1 içeren TSA L-sistein hidroklorid). 37 ° C'de inkübe 24-48 h tabaklar ve koloni oluşturan birimler (CFU) bakteri hücreleri içinde donmuş kültür tüpleri (iki şişe ortalaması) sayısını hesaplamak için numaralandırılır.
- Bakteriyel inoculum donmuş bir şişe buz çözdürme tarafından hazırlamak ve PBS ile Kültür 10 7 CFU/100 µL son konsantrasyonu oranında seyreltin. İnoculum 100 µL istenen CFU ortaya çıkarır bir konsantrasyon olmalıdır (gliserol inoculum içinde son konsantrasyonu fazla % 3, farenin boğulma önlemek için olamaz). Donmuş kültür tüpleri-80 ° C'de depolanan-ebilmek var olmak kullanılmış için altı ay sonra hazırlık.
- Grow F. tularensis yük gecede uygun agar plaka 37 ° C. Scrape yaklaşık 100 µL agar plaka ile steril bir bakteriyel çim aşı döngü ve 500 mL Erlenmeyer uygun sıvı büyüme ortamının 250 mL içeren flask aşılamak için kullanın (için Fn: %0,1 L-sistein hidroklorür monohidrat ile desteklenmiş tryptic soya suyu (TSB)) ve gecede 37, sallayarak kuluçkaya ° C.
2. Sıçan anestezi
- anestezi odası bir anestezi makinesi uygun şekilde çalışan isoflurane vaporizatör için bağlanmak.
- Tüp gaz sistemi atma anestezi odasına atma gaz bağlayın.
- Oksijen akışı 4 L/dak için anestezi makinede açın
- % 5 isoflurane Buharlaştırıcı ayarla.
- Anestezi odasında fare yerleştirin.
Not: Biz genellikle kullanmak fareler arasında 8-10 hafta eski (130-180 g); Genç sıçanlar ağız boşluğuna küçük boyutu nedeniyle bu tekniği ile aşılamak zor.
Anestezi indüksiyon, gerçekleştiğinde - korumak %5 isoflurane, sıçan, 2 L/dak oksijen etkisi. Bu yaklaşık 3-10 dakika sürer
- Kalite ve solunum ve kalp atışı ve refleks uyarım ayak çimdik testi olduğu gibi tepki oranı ile anestezi derinliği belirler. İdeal anestezi derinliği 1-1.5 s sayım her nefes arasında belirttiği.
3. Boğaza aşılama
- fare anestezi odasından çıkarın ve sıçan dorsally kemirgen entübasyon kürsüye yerleştirin. Sıçan tutmak için tutucu sıçan ön dişleri iliştirin.
Not: sıçan işlem sırasında uyandırmak başlarsa, kateter-ebilmek var olmak çıkarmak ve fare anestezi daha derin bir uçak ulaşmak için anestezi odasına döndü. - Dil desteği el olarak aynı tarafında geniş nokta soyunma başparmak Forseps ile hareket için dominant el kullanın.
- Kullanım desteklemek el ve dil laringoskop karşı fare ile güvenli ' s alt çene ve trakea ve yemek borusu hayvan görselleştirin. Nefes borusu açık ve fare nefes alır gibi yakın. Bir 20'lik blunted-iğne, içeren kateter
- Ekle hazırlanan adım 1.1, nefes borusu içine. Hafif direnç olabilir ve nefes borusu içine ekleme olabilir " inişli çıkışlı " trakeal kıkırdak sürtünme kateter nedeniyle. Nem veya sığ solunum nedeniyle, Trakea Trakea görselleştirme önleyen gırtlak kapağını tarafından karşılanabilir. Yavaşça gırtlak kapağını kıkırdak kenarına dokunmak kıkırdak kapağı açın ve nefes borusu ortaya çıkarmak neden olur.
- Kör iğne kateter sağlanması sırasında kateter üzerinden kalır borusunda kaldır.
- İzin için nefes borusu eklenen kateter çevresinde edebilmek iri fare geçmek için birkaç saniye.
- Sıkıca Trakea göstergesi üzerine açılış kateter koltuk. Aerosol bariyer hareket belirtmek kateter borusu eklenen doğru.
- Öyle ki hayvanın göğüs uçak entübasyon stand dik bakan sıçan entübasyon kürsüye yatıyor emin olmak.
- Nefes borusu gösterge kaldırmak ve 100 µL teslim (10 7 CFU) F. tularensis 200 µL pipet ucu kullanarak içeren inoculum sıkıca uç kateter açılış karşı oturma.
- Hava ile dolu bir 1 mL kayma ipucu tüberkülin şırınga ve hava inoculum sıçan akciğerlere ulaşır emin olmak için 300 µL gönderin.
- Kateter sıçan cerrahi perondan sökün trakea ve.
- Uyandırmak ve kafes dönmek fareyi izin. Solunum normale döndü emin olun.
- F. tularensis CFU belirlemek 1.3.5 CFU onaylamak için adımda anlatıldığı gibi inoculum teslim borusunda.
- 3.1-3,9 unvaccinated (saf) hayvanlar ile inoculum yerine 100 µL PBS üzerinde adımlarını yineleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
F. tularensis boğaza aşı içinde fare humoral yanıt enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) bakteri, UV-inaktive karşı tarafından belirlenen11daha önce açıklandığı gibi. Toplam immünoglobulin G (IgG) Fischer 344 sıçan Inaktif tüm cep telefonu bakteri öldürülmesinin biçilen post-boğaza aşılama ile Fn bir zayıflatılmış strain (107 CFU inoculum) 14 gün ve gün 28 (şekil 1). Sahte aşı fareler PBS intratracheally aldı. Serum antikor titreleri Fn sonrası aşılama naif hayvanlar sahte aşı göre karşı bir artış boğaza aşı etkinliği gösterir. Düşük serum reaktivite yanlış boğaza yerleşim gösterebilir.
Şekil 1: Toplam IgG zayıflatılmış Fn boğaza aşılama F344 fareler içinde yaşamak için yanıt. Sera F344 fareler üzerinden (n = 5) aşısını intratracheally ile bir canlı zayıflatılmış Fn zorlanma (107 CFU) toplam IgG düzeyleri tüm cep telefonu Fn ile reaktif için gün 14 ve 28 gün sonrası aşılama analiz edildi. Sahte aşı (saf) fareler (n = 5) intratracheally PBS ile aşılanmış olduğunu. Kırmızı alan reaktivite saf sera (F344 Rat PBS ile sahte aşı) gösterir. Hata çubukları SEM temsil Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fischer 344 sıçan Tularemi aşısı geliştirme3için önemli bir model haline geliyor. Bunlar aerosoller teslim edildiğinden F. tularensis maruz pulmoner rota üzerinden weaponized F. tularensis, türlü karşı etkinlik gösteren için önemlidir. Farenin boğaza aşılama maruz sıçan akciğerlerinin F. tularensis ekipmanları üreten büyük, pahalı ve karmaşık aerosol gerek kalmadan kolaylaştırır. F. tularensis seçin Aracısı formları Ayrıca kullanan tüm deneylerin genellikle ciddi bir şekilde kısıtlı alanda ortaya çıkar BSL3 koruma gerektirir. Böylece, bu tekniği bu iş ortamında muhafaza için ihtiyacı ek donanımları miktarını en aza indirir.
Çünkü FN videografisi için kullanılan F. tularensis zorlanma, tüm teknikleri BSL2 koruma altında yapıldı. Bu teknik BSL3 ortamına uyum içinde bir biyogüvenlik kabini Biyogüvenlik Dişli (tam hood, güçlendirilmiş hava arındırıcı maske (PAPR'la), tüm hood, çift eldiven, patik ile koruyucu kapak), giyen personeli tarafından gerçekleştirilen tüm yordamları içerir ve bu uyarlamalar hareketlilik, el becerisi ve görünürlüğü azaltmak. Trakea göstergesi kateter kez aksi takdirde BSL3 koşullar altında çalışırken bu tespiti yapmak zordur dikkate alınarak Trakea içinde doğru bir şekilde yerleştirildi onay veren önemli bir bileşenidir.
"Bir nefes borusu ve yemek borusu anatomik sıçan simülatörleri" ve bunlar önce canlı hayvanlarla çalışma tekniği mükemmelleştirmek faydalıdır. Ancak, simülatör ile çalışma canlı fare ile çalışmak için aynı değil. Bu teknik canlı hayvan doğru gerçekleştirilen eğer belirlemek için bir Trypan mavi boya imzalat bir fare üzerinde inoculum olarak kullanmak ve işlemden sonra hemen hayvan ötenazi için yoludur. Akciğer dokusu ve mide diseksiyon boya akciğerler ve yemek borusu teslim edildi ortaya çıkaracaktır. Fn/Ft ile bu tekniği ile aşı bir sıçan da kısa bir süre sonra aşılama ve akciğer içinde gerçek ifade belirlemek için kaplama Akciğer doku euthanized.
Doğru boğaza aşılama Tularemi aşısı etkinliğini Fischer 344 fare içinde değerlendirilmesi için önemli olacak, ama aynı zamanda diğer aşı ve/veya biodefense gibi fareler de, tedavi uygulamalarında için yararlı olabilir. Böylece, bu tekniğin çeşitli pulmoner uygulamalar fare modeli kullanmak için adapte olabilir. Cihaz üreten bir aerosol tarafından teslim biothreat senaryoya daha benzer olsa da, F. tularensis boğaza aşılama Tularemi aşısı geliştirme için nispeten basit, uygun maliyetli bir alternatif temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa yoktur
Acknowledgments
Bu çalışmada sözleşmeli HDTRA1-14-C-0116 savunma tehdit azaltma Ajansı (DTRA) ve enfeksiyon genomik (DOD #W911NF-11-1-0136) mükemmellik merkezi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GreenLine fiber optic blade size 0 | Carefusion | 5-5231-00 | Macintosh American profile |
| GreenLight system laryngoscope handle | Carefusion | 4559GSP | |
| Exel International Safelet I.V. Catheter | EXEL INTERNATIONAL | 26743 | |
| Slip Tip Sterile Syringes 1mL | BD | 309659 | |
| Broad Point Dressing Thumb Forceps | Thermo Scientific | 76-302 | |
| 200 μL barrier tip | GeneseeScientific | 24-142 | |
| 1,000 μL pipette tip | Olympus Plastics | 24-173 | |
| Dremel 3000-2/28 Rotary tool kit | Dremel | 3000228 | |
| Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific | RIS 200 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Rodent anesthesia machine | Surgivet | VTC302 Classic T3 | |
| Rodent Anesthesia chamber | Braintree Scientific | AB 1 |
References
- Ellis, J., Oyston, P. C. F., Green, M., Titball, R. Tularemia. Clin Microbiol Rev. 15 (4), 631-646 (2002).
- Lyons, C. R., Wu, T. H. Animal models of Francisella tularensis infection. Ann N Y Acad Sci. 1105, (2007).
- Hutt, J. A., Lovchik, J. A., Dekonenko, A., Hahn, A. C., Wu, T. H. The Natural History of Pneumonic Tularemia in Female Fischer 344 Rats after Inhalational Exposure to Aerosolized Francisella tularensis subspecies tularensis Strain Schu S4. Am J Pathol. 187 (2), 252-267 (2017).
- Ray, H. J., et al. The Fischer 344 rat reflects human susceptibility to Francisella pulmonary challenge and provides a new platform for virulence and protection studies. PloS one. 5, e9952 (2010).
- Jemski, J. V. Respiratory tularemia: comparison of selected routes of vaccination in Fischer 344 rats. Infect Immun. 34 (3), 766-772 (1981).
- Wu, T. H., et al. Vaccination of Fischer 344 rats against pulmonary infections by Francisella tularensis type A strains. Vaccine. 27 (34), 4684-4693 (2009).
- Mara-Koosham, G., Hutt, J. A., Lyons, C. R., Wu, T. H. Antibodies contribute to effective vaccination against respiratory infection by type A Francisella tularensis strains. Infect Immun. 79 (4), 1770-1778 (2011).
- Oyston, P. C., Sjostedt, A., Titball, R. W. Tularaemia: bioterrorism defence renews interest in Francisella tularensis. Nat Rev Microbiol. 2 (12), 967-978 (2004).
- Kingry, L. C., Petersen, J. M. Comparative review of Francisella tularensis and Francisella novicida. Front Cell Infect Microbiol. 4, 35 (2014).
- Rohmer, L., et al. Comparison of Francisella tularensis genomes reveals evolutionary events associated with the emergence of human pathogenic strains. Genome Biol. 8 (6), R102 (2007).
- Chu, P., et al. Live attenuated Francisella novicida vaccine protects against Francisella tularensis pulmonary challenge in rats and non-human primates. PLoS Pathog. 10 (10), e1004439 (2014).
- Signarovitz, A. L., et al. Mucosal Immunization with Live Attenuated Francisella novicida U112ΔiglB Protects against Pulmonary F. tularensis SCHU S4 in the Fischer 344 Rat Model. PloS one. 7 (10), e47639 (2012).
- Cunningham, A. L., et al. Enhancement of vaccine efficacy by expression of a TLR5 ligand in the defined live attenuated Francisella tularensis subsp. novicida strain U112DiglB::fljB. Vaccine. 32 (40), 5234-5240 (2014).
