Summary
Este protocolo descreve inoculações intratraqueal de Fischer 344 ratos com Francisella tularensis. Este procedimento imita pulmonar exposição dos seres humanos a este potencial agente de ameaça biológica e pode ser usado para testar a vacina e a eficácia terapêutica contra tularemia pulmonar.
Abstract
Infecção pulmonar com a bactéria Francisella tularensis pode levar à doença grave e potencialmente fatal, tularemia, em seres humanos. Devido à atual falta de uma vacina de tularemia aprovado para os seres humanos, pesquisa está focada no desenvolvimento de vacinas utilizando modelos animais apropriados. O rato Fischer 344 tem emergido como um modelo que reflete a susceptibilidade humana à F. tularensis infecção e, portanto, é um modelo atraente para desenvolvimento de vacinas de tularemia. Intratraqueal de inoculação do rato Fischer 344 com F. tularensis imita exposição pulmonar em humanos. A entrega bem sucedida para a traqueia de rato é crítica para entrega pulmonar. Um laringoscópio com iluminação é usado corretamente entubar o tracheae de ratos anestesiados; o correto posicionamento dentro da traqueia é determinado por um dispositivo simples para detectar a respiração. Após a intubação, a cultura de F. tularensis é entregue em uma dose medida via seringa. Esta técnica padroniza entrega pulmonar de F. tularensis dentro da traqueia de rato para avaliar a eficácia da vacina.
Introduction
F. tularensis (Ft) faz com que a doença humana, tularemia. Quando as bactérias são adquiridas através da rota pulmonar, isto leva a tularemia pneumônica, que tem alta taxa de morbidade e mortalidade1. F. tularensis é considerada um agente de ameaça biológica devido ao perigo associado com formas de aerossol e não há atualmente nenhuma vacina aprovada para uso humano nos EUA Um esforço intenso está em andamento desenvolver vacinas e medidas terapêuticas contra tularemia pneumônica, para proteger a população humana contra o uso ilícito desta ameaça biológica bacteriana.
Muita da pesquisa de tularemia centrou-se no modelo do rato, devido a extrema sensibilidade de ratos para F. tularensis infecção e a prevalência dos reagentes. No entanto, os ratos têm provado para ser um modelo difícil para desenvolvimento de vacinas, devido à dificuldade de demonstrar a eficácia da vacina neste modelo2. Recentemente, o rato Fischer 344 foi desenvolvido como um modelo para tularemia vacina desenvolvimento3. A sensibilidade do rato Fischer 344 para várias subespécies de F. tularensis imita a sensibilidade humana4, e ratos podem ser protegidos contra F. tularensis desafio pulmonar por vacinação com uma cepa de vacina viva conhecida para proteger os seres humanos5,6,7. Porque o rato Fischer 344 modelos algumas características de F. tularensis infecção dos seres humanos, pode ser um modelo extremamente útil para o desenvolvimento de uma vacina que protege contra pulmonar F. tularensis exposição.
Precisa de uma vacina eficaz para proteger os seres humanos contra a exposição pulmonar a F. tularensis. A mais provável exposição pulmonar como arma F. tularensis seria aerossol bactéria inalada para os pulmões,8. No entanto, geração de aerossol de F. tularensis é perigoso e complicado e requer equipamento especializado e contenção. Uma rota alternativa de exposição pulmonar em ratos que é talvez mais adaptável para vários laboratórios falta equipamento especializado é via intratraqueal inoculação6. Esta técnica utiliza um laringoscópio para a colocação de um cateter dentro da traqueia de um rato anestesiado. Colocação dentro da traqueia, ao invés do esôfago, é verificada por um dispositivo simples que visualiza o fluxo de ar dos pulmões. F. tularensis é posteriormente entregue aos pulmões através do cateter pela administração com uma seringa, seguida pela introdução de ar dentro do cateter para assegurar a entrega pulmonar das bactérias. Em contraste, Jemski5 anteriormente relatados que F. tularensis inoculada em ratos Fischer 344 através da rota intranasal não poderiam ser cultivadas dos pulmões até pós-inoculação de 3 dias, indicando a inoculação intranasal em ratos que Não resultado na entrega direta de bactérias para os pulmões.
Agente selecione formas de F. tularensis (F. tularensis subsp. tularensis, F. tularensis subsp. holarctica) requerem procedimentos de contenção de biossegurança nível 3 (BSL3), que impediriam a videografia. No entanto, F. novicida (Fn) está isenta do status de agente selecione devido a sua avirulence em seres humanos saudáveis e pode ser utilizado com segurança em condições de biossegurança nível 2 (BSL2)9,10. Além disso, a Fn serve como base para as vacinas vivas atenuadas que pode proteger contra a exposição pulmonar de F. tularensis quando entregues via intratraqueal inoculação11,12,13. A técnica apresentada aqui permite o estudo de infecções que ocorrem através da rota pulmonar utilizando ratos como um modelo para os seres humanos. Esta técnica pode ser realizada sem a necessidade de equipamento especializado de geração de aerossol. FN foi usado para as técnicas filmadas aqui.
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Protocol
este trabalho foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório do institutos nacionais da saúde. Animais protocolos envolvendo roedores foram aprovados pela Universidade do Texas em San Antonio institucional Animal Care e Comissão de utilização (IACUC) sob o protocolo MU009(RA).
1. preparar o cateter, indicador de traqueia e inóculo de F. tularensis
- Preparar o cateter (20 x 2 polegadas)
- corta a 20 x 2 na agulha e moer a ponta da agulha para um blunt e suave terminar com um ferramenta rotativa.
Nota: O comprimento da agulha cega deve permitir que a ponta de metal rescindir cerca de 3 mm na manga cateter quando assentado sobre a agulha cega. A agulha cega dá a rigidez estrutural do cateter para permitir a colocação do cateter na traqueia, e a ausência da ponta da agulha cega salientes da manga do cateter evita prejuízo para a traqueia. - Limpar as agulhas embotadas e cateteres usando 70% de etanol e esterilizar sob luz UV de 15 min.
- corta a 20 x 2 na agulha e moer a ponta da agulha para um blunt e suave terminar com um ferramenta rotativa.
- Indicador de traqueia preparar
- Aparar uma ponta da pipeta 1.000 µ l para permitir que a ponta sentar-se em uma abertura do cateter e formar uma vedação estanque ao ar.
- Remover um filtro de um 200 µ l aerosol barreira pipeta ponta e lugar dentro a ponta da pipeta previamente aparado µ 1.000 l.
- Garantir o filtro pode mover-se livremente dentro a ponta da pipeta 1.000 µ l quando a ponta está apontada para baixo ponta.
- Inóculo de F. tularensis
- Grow F. tularensis tensão durante a noite em placa de ágar apropriado em 37 ° C. Scrape aproximadamente 100 µ l do gramado bacteriano da placa de ágar com um estéril Inocular loop e usar para inocular um frasco de Erlenmeyer contendo 250 mL do meio de cultura líquido apropriado de 500 mL (para Fn: caldo tryptic soja (TSB) suplementado com 0,1% L-cisteína cloridrato monohidratado) e incube a tremer durante a noite a 37 ° C.
Nota: F. novicida usada no vídeo foi cultivado em um prato de tryptic soy agar (TSA) suplementado com 0,1% L-cisteína cloridrato monohidratado. - Centrifugar a cultura líquida cresceu durante a noite a 4.221 x g em temperatura ambiente por 10 min e retire o sobrenadante sem perturbar o sedimento bactérias.
Atenção: Por favor, siga a instituição ' recomendações de biossegurança s para descartar o sobrenadante. - Suavemente Ressuspender o pellet bacteriano com 25 mL de meio líquido adequado (Fn: TSB suplementado com 0,1% L-cisteína cloridrato monohidratado) contendo 10% de glicerol, usando uma pipeta de 25 mL.
- Usando uma pipeta de 1 mL, alíquota a ressuspensa cultura bacteriana em 500 alíquotas µ l em frascos, congelar em um banho de gelo seco (etanol) e armazene a -80 ° C.
- Para determinar o título dos frascos de cultura congelada, retire dois frascos congelados armazenados a-80 ° C, descongelar no gelo e realizar diluições em série em tampão fosfato salino (PBS) seguido de chapeamento no meio de cultura apropriado (Fn: TSA contendo 0,1% L-cisteína cloridrato de). As placas são incubada 24-48 h a 37 ° C, e unidades formadora de Colônia (UFC) são enumeradas para calcular o número de células bacterianas dentro os frascos de cultura congelada (média de dois frascos).
- Preparar o inóculo bacteriano, descongelar um frasco congelado no gelo e em seguida diluir a cultura com PBS para a concentração final de 10 7 UFC/100 µ l. O inóculo deve ser em uma concentração que produzirá a desejada CFU em 100 µ l (a concentração final de glicerol dentro o inóculo não pode ser superior a 3%, para evitar asfixia do rato). Frascos de cultura congelado armazenados a-80 ° C podem ser usados por até seis meses após o preparo.
- Grow F. tularensis tensão durante a noite em placa de ágar apropriado em 37 ° C. Scrape aproximadamente 100 µ l do gramado bacteriano da placa de ágar com um estéril Inocular loop e usar para inocular um frasco de Erlenmeyer contendo 250 mL do meio de cultura líquido apropriado de 500 mL (para Fn: caldo tryptic soja (TSB) suplementado com 0,1% L-cisteína cloridrato monohidratado) e incube a tremer durante a noite a 37 ° C.
2. Rato de anestesia
- conectar-se a câmara de anestesia para o vaporizador de isoflurano corretamente o funcionamento de uma máquina de anestesia.
- Conectar o tubo sobre a câmara de anestesia para o sistema de gás gás.
- Abrir o fluxo de oxigênio sobre a máquina de anestesia para 4 L/min.
- Definir o vaporizador de isoflurano para 5%.
- Colocar o rato na câmara de anestesia.
Nota: Normalmente utilizamos ratos entre 8-10 semanas de idade (130-180 g); ratos mais jovens são difíceis inocular através desta técnica devido ao pequeno tamanho da cavidade da boca. - Quando a indução da anestesia tem tomado lugar, manter o rato no 5% de isoflurano, 2 L/min de oxigênio para o efeito. Isso leva cerca de 3-10 min.
- Determinar a profundidade da anestesia, a qualidade e a taxa de respiração e batimento cardíaco e a reação à estimulação reflexa, como o teste do beliscão do dedo do pé. Profundidade ideal da anestesia é indicada pela contagem de 1-1,5 s entre cada respiração.
3. Intratraqueal inoculação
- remover o rato da câmara de anestesia e coloque o rato dorsalmente no stand roedores intubação. Anexar os dentes da frente do rato para o titular para manter o rato no local.
Nota: Se o rato começa a despertar durante o procedimento, o cateter pode ser removido e o rato voltou para a câmara de anestesia para atingir um plano mais profundo da anestesia. - Usar a mão dominante para mover a língua para o mesmo lado que a mão de apoio com ponto largo Pinca polegar.
- Uso apoiar a mão e segura a língua com o laringoscópio contra o rato ' s abaixar a mandíbula e visualizar a traqueia e o esôfago do animal. A traqueia vai abrir e fechar como o rato respira.
- Inserir o cateter contendo uma 20 embotados-agulha, preparado na etapa 1.1, na traqueia. Pode haver resistência ligeira, e inserção na traqueia pode ser " acidentado " devido o cateter esfregando as cartilagens traqueais. Devido à umidade ou respiração superficial, a traqueia pode ser coberta pela epiglote que impede a visualização da traqueia. Suavemente, tocando a borda da cartilagem epiglote fará com que a aba de cartilagem abrir e descobrir a traqueia.
- Remover a embotados-agulha do cateter, garantindo o cateter permanece na traqueia.
- Permitir que alguns segundos passar para o rato para poderes respirar em torno do cateter inserido na traqueia.
- Assente firmemente o indicador de traqueia ao cateter de abertura. Movimento da barreira aerossol indicará o cateter é inserido corretamente na traqueia.
- Garantir que o rato está deitada no stand intubação tal que o peito do animal está enfrentando perpendicular ao plano do estande da intubação.
- Remover o indicador de traqueia e entregar 100 µ l (10 7 UFC) do inóculo contendo F. tularensis usando uma ponta de pipeta de 200 µ l, de estar firmemente a ponta contra a abertura do cateter.
- Anexar uma seringa de tuberculina ponta de deslizamento 1 mL cheia de ar e entregar 300 µ l de ar para assegurar o inóculo chega aos pulmões do rato.
- Remover o cateter da traqueia e remover o rato da plataforma cirúrgica.
- Permitir o rato despertar e voltar para a gaiola. Certifique-se de que a respiração voltou ao normal.
- Determinar o UFC na F. tularensis inóculo conforme descrito na etapa 1.3.5 para confirmar o CFU entregues na traqueia.
- Repita os passos 3.1-3,9 em animais não vacinados (ingênua) com 100 µ l PBS, no lugar de inóculo.
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Representative Results
A resposta humoral a inoculação intratraqueal de F. tularensis em ratos pode ser determinada por ensaio imunoenzimático (ELISA) contra bactérias inactivados UV, conforme descrito anteriormente,11. Total imunoglobulina G (IgG) resposta de Fischer 344 ratos bactérias inactivados celular foi avaliada post-intratraqueal inoculação com uma cepa atenuada de Fn (107 de inóculo CFU) no dia 14 e dia 28 (Figura 1). Simulação-vacinados ratos receberam intratraquealmente PBS. Aumento de anticorpos de soro contra pós-inoculação de Fn em relação ingênua simulação vacinados animais indica a eficácia da vacinação intratraqueal. Reatividade de soro baixo pode indicar posicionamento incorreto intratraqueal.
Figura 1: Total IgG respostas ao vivo atenuado Fn intratraqueal inoculação em ratos F344. Os soros de ratos de F344 (n = 5) intratraquealmente inoculado com um vivo atenuado estirpe Fn (107 UFC) foram analisados para níveis totais de IgG reactivos com toda célula Fn no dia 14 e dia 28 após inoculação. Simulação-vacinados (ingênuo) ratos (n = 5) foram inoculado intratraquealmente com PBS. Área vermelha denota a reatividade de soros ingênuo (ratos F344 mock-vacinados com PBS). As barras de erro representam o SEM. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O rato Fischer 344 está se tornando um importante modelo para tularemia vacina desenvolvimento3. Exposição a F. tularensis através da rota pulmonar é fundamental para demonstrar a eficácia contra formas como arma de F. tularensis, porque estas são entregues como aerossóis. Intratraqueal de inoculação do rato facilita a exposição dos pulmões rato a F. tularensis sem a necessidade de aerossol grande, caro e complicado, gerando o equipamento. Todos os experimentos utilizando agente selecionar formas de F. tularensis adicionalmente exigem BSL3 contenção, que normalmente ocorre no espaço severamente restrito. Assim, esta técnica minimiza a quantidade de equipamento adicional que precisa ser alojado dentro desse ambiente de trabalho.
Porque Fn foi a variedade de F. tularensis utilizada para produção de vídeo, todas as técnicas foram realizadas sob BSL2 contenção. Adaptação desta técnica para o ambiente de BSL3 inclui todos os procedimentos realizados dentro de uma armário de biossegurança por pessoal usava equipamentos de segurança biológica (capô completo, respirador purificador de ar alimentado (PAPR), capa protetora, todos com capa dupla luvas, botas), e essas adaptações reduzem a mobilidade, destreza e visibilidade. O indicador de traqueia é um importante componente que permite a confirmação de que o cateter foi colocado corretamente dentro da traqueia, Considerando que muitas vezes é difícil tornar essa determinação caso contrário quando trabalhando sob condições BSL3.
Há rato anatomicamente correto "simuladores" que têm uma traqueia e o esôfago, e estes são úteis para aperfeiçoar a técnica antes de trabalhar com animais vivos. No entanto, trabalhar com o simulador não é idêntico ao trabalhar com um rato vivo. Um dos meios para determinar se esta técnica é realizada corretamente no animal vivo é utilizar corante Trypan azul a inocular um rato anestesiados e após o procedimento de eutanásia imediatamente o animal. Dissecação do tecido do pulmão e estômago irá revelar se o corante foi entregue para os pulmões e não o esôfago. Um rato que tem sido vacinado com Fn/Ft por esta técnica pode também ser sacrificado logo após a inoculação e o tecido de pulmão chapeado para determinar o real depoimento dentro do pulmão.
Intratraqueal correta inoculação será importante para avaliação da eficácia de vacina tularemia em ratos Fischer 344, mas também pode ser útil para outras vacinas e/ou aplicações terapêuticas em ratos, incluindo biodefense. Assim, esta técnica pode ser adaptável a uma variedade de aplicações pulmonares, utilizando o modelo de rato. Enquanto entrega por um aerossol, o gerador pode ser mais semelhante a um cenário de ameaça biológica, a inoculação intratraqueal de F. tularensis representa uma alternativa relativamente simples e econômica para desenvolvimento de vacinas de tularemia.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar
Acknowledgments
Este estudo foi suportado pela Agência de defesa ameaça redução (DTRA) sob contrato HDTRA1-14-C-0116 e o centro de excelência em Genômica de infecção (DOD #W911NF-11-1-0136).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GreenLine fiber optic blade size 0 | Carefusion | 5-5231-00 | Macintosh American profile |
| GreenLight system laryngoscope handle | Carefusion | 4559GSP | |
| Exel International Safelet I.V. Catheter | EXEL INTERNATIONAL | 26743 | |
| Slip Tip Sterile Syringes 1mL | BD | 309659 | |
| Broad Point Dressing Thumb Forceps | Thermo Scientific | 76-302 | |
| 200 μL barrier tip | GeneseeScientific | 24-142 | |
| 1,000 μL pipette tip | Olympus Plastics | 24-173 | |
| Dremel 3000-2/28 Rotary tool kit | Dremel | 3000228 | |
| Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific | RIS 200 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Rodent anesthesia machine | Surgivet | VTC302 Classic T3 | |
| Rodent Anesthesia chamber | Braintree Scientific | AB 1 |
References
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