Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Opretholdelse af Aedes aegypti myg inficeret med Wolbachia

Published: August 14, 2017 doi: 10.3791/56124
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1School of BioSciences, Bio21 Institute and University of Melbourne

Summary

Aedes aegypti myg inficeret med Wolbachia frigives i naturlige populationer at undertrykke transmission af arboviruses. Vi beskriver metoder til bageste Ae. aegypti med Wolbachia infektioner i laboratoriet for eksperimenter og felt udgivelse, at tage forholdsregler for at minimere laboratorium tilpasning og udvalg.

Abstract

Aedes aegypti myg eksperimentelt inficeret med Wolbachia udnyttes i programmer til at kontrollere spredningen af arboviruses såsom dengue, chikungunya og Zika. Wolbachia-inficerede myg kan blive frigivet i feltet enten reducere befolkningen størrelser gennem uforenelig parringer eller omdanne populationer med myg, der er refraktære over for virus transmission. For disse strategier kan lykkes, skal myg frigives i feltet fra laboratoriet være konkurrencedygtige med indfødte myg. Dog kan fastholde myg i laboratoriet resultere i indavl, genetisk drift og laboratorium tilpasning, som kan reducere deres fitness i feltet og kan forvirre resultater af eksperimenter. For at teste egnetheden af forskellige Wolbachia infektioner til indsættelse i feltet, er det nødvendigt at opretholde myg i et kontrolleret laboratoriemiljø på tværs af flere generationer. Vi beskriver en enkel protokol for at opretholde Ae. aegypti myg i det laboratorium, som er velegnet til både Wolbachia-inficerede og wild-type myg. Metoderne minimere laboratorium tilpasning og gennemføre outcrossing for at forøge relevansen af eksperimenter til feltet myg. Derudover bevares kolonier under optimale betingelser for at maksimere deres egnethed til friland udgivelser.

Introduction

Aedes aegypti myg er ansvarlige for fremsendelse af nogle af de vigtigste arboviruses i verden, herunder dengue, Zika og chikungunya1. Disse vira er ved at blive en stigende trussel mod den globale sundhed, som den omfattende udbredelse af Ae. aegypti i troperne fortsætter med at udvide2,3,4. Kvindelige Ae. aegypti lever fortrinsvis af menneskeblod5 og dermed tendens til at leve tæt på mennesker, navnlig i byområderne, hvor befolkningen er mest tætte. Gennem dette nære forhold til mennesker har de også tilpasset til at yngle i kunstige levesteder, herunder dæk, gryder, tagrender og vand kampvogne6,7. AE. aegypti tilpasses også let laboratorium miljøer hvor de kan opretholdes uden særlige krav efter at være indsamlet direkte fra marken, i modsætning til nogle andre arter i Aedes slægten8, 9,10. Deres nem vedligeholdelse har set dem studerede bredt i laboratoriet i en bred vifte af områder, i sidste ende sigter mod at styre sygdomme myg kan overføre.

Traditionelt, arboviral kontrol er stærkt afhængig af anvendelsen af insekticider til at reducere mosquito befolkninger. Men der er stigende interesse i tilgange hvor modificerede myg er opdrættet i laboratoriet og derefter frigives i naturlige populationer. Frigivne myg kan være ændret genetisk11,12,13, biologisk14,15, gennem bestråling16, kemisk behandling17,18, eller med kombineret teknikker19 for at undertrykke befolkningerne i myg eller erstatte dem med myg, der er refraktære over for arboviral transmission20.

Wolbachia er bakterier, der i øjeblikket bliver brugt som en biologisk kontrol agent for arboviruses. Flere stammer af Wolbachia blev for nylig introduceret i Ae. aegypti eksperimentelt ved hjælp af embryonale mikroinjektion21,22,23,24. Disse stammer reducere kapaciteten af arboviruses at formidle og replikere i myg, faldende deres transmission potentielle23,25,26,27,28 . Wolbachia infektioner overføres fra mor til afkom, men visse stammer fremkalde sterilitet, når inficerede mænd parre sig med ikke-inficerede hundyr22. Wolbachia-inficerede hanner kan derfor blive frigivet i store mængder til at undertrykke naturlige mosquito befolkninger, som for nylig demonstreret i andre Aedes arter15,29. Da Wolbachia også hæmme arboviral transmission i Ae. aegypti, udgivet myg kan også erstatte indfødte befolkning med dårligere vektorer. Ae. aegypti inficeret eksperimentelt med Wolbachia udgives nu i feltet i flere lande, der anvender denne sidstnævnte tilgang14,30,31.

Wolbachia-baserede tilgange til arboviral kontrol stole på en god forståelse af samspillet mellem Wolbachia, myg og miljø. Wolbachia forekommer naturligt i en bred vifte af insekter, og stammer indføres i myg er forskellige i deres virkninger32. Som ny Wolbachia infektion typer er indført i Ae. aegypti24, er det nødvendigt at karakterisere hver stamme for deres effekt på myg fitness, reproduktion og arboviral interferens under en række betingelser. Streng eksperimenter i laboratoriet er derfor forpligtet til at vurdere mulighederne for Wolbachia stammer til at lykkes i feltet.

Feltet åben udgivelser af Ae. aegypti med Wolbachia infektioner kan ofte kræve tusinder eller titusinder af myg pr. udgivelse zone skal opdrættes hver uge14,30,31. Succesen med indledende udgivelser kan forbedres ved at frigive myg i en stor størrelse for at maksimere deres frugtbarhed33 og parring succes34,35. Myg bør også tilpasses til de betingelser, de vil opleve i feltet, men langsigtede laboratorium opdræt kan forårsage ændringer i adfærd og fysiologi, som kunne påvirke feltet ydeevne36,37, 38.

Vi beskriver en simpel protokol til opdræt af Ae. aegypti i laboratoriet ved hjælp af grundlæggende udstyr. Denne protokol er velegnet til både wild-type og Wolbachia-inficerede myg, hvor sidstnævnte kan kræve særlig opmærksomhed som nogle Wolbachia stammer har betydelige virkninger på myg livshistorie træk39, 40. opdræt betingelserne undgå overbefolkning og konkurrence for mad til at producere myg af en ensartet størrelse, som er afgørende for vektor kompetence og fitness eksperimenter, og sikrer, at myg er sundt for feltet release41 . Vi også tage forholdsregler for at minimere laboratorium tilpasning og indavl ved at reducere selektiv pres og at sikre, at den næste generation er samplet fra en stor, tilfældige swimmingpool. Men laboratoriet miljøer er tydeligt adskiller sig fra marken, og langsigtet vedligeholdelse under afslappede forhold kunne reducere fitness af myg ved udgivelse i felt37,42,43 . Vi krydser derfor hunner fra laboratoriet linjer til field-indsamlede hanner med jævne mellemrum, hvilket resulterer i kolonier, der er genetisk ens for eksperimenterende sammenligninger og der er tilpasset til target field befolkning39. Metoderne, der kræver ikke nogen specialiseret udstyr og kan skaleres til bageste tiere tusinde individer pr. uge for feltet udgivelser. Protokollen også prioriterer fitness af myg inden for og på tværs af generationer, en vigtig overvejelse for insekter til etablering i naturlige populationer. Protokollen er velegnet til de fleste laboratorier, der kræver vedligeholdelse af Ae. aegypti, især for eksperimenterende sammenligninger hvor en ensartet kvalitet af myg og relatability til feltet er vigtigt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Blod fodring af myg på forsøgspersoner blev godkendt af University of Melbourne menneskelige etiske komité (godkendelse #: 0723847). Alle frivillige givet informeret skriftligt samtykke.

1. larve opdræt

Bemærk: Myg er afholdt på 26 ± 0,5 ° C og 50-70% relativ luftfugtighed, med en 12:12 h (lys: mørke) lysperiode for denne koloni vedligeholdelsesprotokol. Disse betingelser er svarer til de gennemsnitlige klimaforhold i Cairns, Australien og inden for den optimale termiske område for Ae. aegypti overlevelse og udvikling44,45,46. Høje temperaturer kan resultere i tab af Wolbachia infektioner fra myg kolonier og bør undgås47. Vi opretholder mindst 500 personer pr. befolkning at minimere indavl; opretholde kolonier af en mindre størrelse kan få fitness konsekvenser [Ross et al. upubliceret]. Under disse omstændigheder, og forudsat tilstrækkelig ernæring er den gennemsnitlige generationstid 28 dage (Se tabel 1).

  1. Dykke æggene på underlaget i bakker (figur 1A) indeholdende 3 L vand (omvendt osmosevand eller alderen postevand, genereres ved at lade vand fra hanen i bakker til 24 timer inden brug), ~ 300 mg af fiskefoder (en knust tablet, se Tabel af materialer) og en par korn af tørgær til at fremkalde rugeæg48.
  2. En dag efter klækning, bruge glas pipette til at overføre ca 500 larver til bakker indeholdende 4 L vand (figur 1B), tælle bruger en clicker counter. Tilføje to knust fisk mad tabletter til hver CD-skuffe. Hvis det er nødvendigt, bruge containere af forskellig størrelse til opdræt af larver (figur 1A), men holde larve tætheder under 0,5 larver/mL at undgå overbefolkning.
  3. Kontrollere bakker dagligt for at sikre, at larverne har tilstrækkelig mad; tilføje ca to mad tabletter til magasinerne hver to dage. Give mad ad libitum , men sikre, at 0,5 mg/larve/dag er tilgængelige i løbet af denne periode for at sikre udvikling er synkron og krop størrelse er konsekvent, ellers resultater af eksperimenter kan være forvirret (Se repræsentant resultater).
  4. Vær omhyggelig med at undgå overfeeding af larver, især i mindre opdræt beholdere med vand mindre overfladeareal og volumen. Hvis vandet ser overskyet, eller hvis der er betydelig larve dødelighed, erstatte det med frisk vand; dødelighed skal være ubetydelig, hvis larver fodres optimalt.

2. voksen opståen

Bemærk: Larverne vil begynde at forpupper fra fem dage efter klækning hvis velnærede og flertallet bør forpupper af syv dage efter klækning. Voksne vil begynde nye cirka to dage efter pupation, hvis vedligeholdt optimalt ved 26 ° C (Se Repræsentant resultater). Larve udvikling er typisk upåvirket af Wolbachia infektioner, når rigelig mad tilbydes23,39,49.

  1. Syv dage efter klækning hæld hele indholdet af bakken gennem en finmasket (pore størrelse 0,4 mm). Holde den filtrerede larve vand til senere brug i ovicups (Se "Blod fodring og Oviposition" sektionen). Invertere masken og dyppe den i en plast beholder med 200 mL vand til at overføre pupper. Give ekstra mad, hvis der stadig er nogen larver.
  2. Forberede voksen opståen bure (figur 1 c) ved at give to kopper af 10% rørsukkeropløsning (figur 1F) og to kopper af fugtig vat til at forhindre udtørring (figur 1E).
  3. Hvis pupper ikke behøver at være sorteret efter sex, placere de låg beholdere af pupper ind i buret og lade låget lidt klem at tillade de voksne at komme ind i buret. Alternativt, placere en inverteret tragt over beholderen at minimere drukning. Sikre, at alle voksne er opstået før du fjerner containeren fra buret til at forhindre at vælge mod langsom udviklere.

3. puppe kønsbestemmelse for Outcrossing

  1. Hvis pupper behøver at være sorteret efter køn (f.eks.til outcrossing), afpipetteres pupper fra larve bakker og adskille køn (figur 2) i plastbeholdere (figur 1A) med 200 mL af vandet hver 24 timer indtil det ønskede antal af hvert køn er nået. Læg låg på containerne og lade dem lukket.
  2. Voksne vil dukke op i containerne; bekræfte deres sex før frigivelse til bure (figur 2 c). Fjern eventuelle voksne sexed forkert med en indsugningsventil inden for 24 timer af fremkomsten, før de når seksuel modenhed. Når kønnene er blevet bekræftet, frigive voksne i bure hver 24 timer.
  3. At opnå Wolbachia-inficerede kolonier af en lignende genetiske baggrund til en naturlig befolkning, krydses ved at tilføje Wolbachia-inficerede hundyr fra laboratoriet kolonier til bure af uinficeret hanner afledt af æg indsamlet af ovitraps i af felt39, fastholde den foreskrevne 500 individer pr. befolkning.
    1. Gentag outcrossing i mindst tre på hinanden følgende generationer til at producere kolonier, der er mindst 87,5% genetisk ligner felt befolkning39. Kritisk: Sikre, at kønnene er korrekte på dette tidspunkt (Se trin 3.1).
  4. Kvindelige Ae. aegypti er normalt ildfaste til yderligere befrugtning inden for timer efter parring50. Når outcrossing kolonier, tillade hunner og hanner modne i separate bure i to dage og derefter Aspirér hunnerne ind i mandlige buret til at give en lige muligheder til alle hanner.

4. blod fodring og Oviposition

  1. Vent i mindst tre dage efter den sidste kvindelige opstået før blod fodring for at give rigelig tid til at modnes. Blod feed hunnerne senest to uger efter fremkomsten at forhindre overdrevne dødelighed, specielt for myg med Wolbachia infektioner, der negativt påvirker levetiden22,24,49. Fjerne sukker kopper dagen før fodring for at forbedre fodring priser.
    1. Spørg en frivillig til at indsætte deres underarm ind i buret til at tillade de kvindelige myg til foder. De fleste kvinder bør foder til repletion inden for 5 min, men for at reducere udvalg mod langsom foderautomater, forlade underarmen i buret i 15 min, eller indtil alle hunnerne er synligt engorged; en latex handske beskytte hånden fra bid er valgfrit, men anbefales.
    2. To dage efter blod fodring, placere to plastikkrus indeholdende larve opdræt vand og foret med en stribe af sandpapir (figur 1 g) (eller filtrerpapir (figur 1 H)) ind i buret til hunner til at lægge æg. Delvis nedsænkes sandpapir strip i vandet for at holde det fugtig. Fjerne andre kilder af vand for at forhindre, at hunnerne lægge deres æg uden for oviposition cup.
      Bemærk: vand fra hanen kan anvendes i kopper, men larve-opdræt vand tilskynder oviposition51,52 og hunnerne vil lægge deres æg mere synkront.

5. ægudtagning og konditionering

  1. Hunnerne lægger æg på sandpapir lige over vandlinjen; indsamle og erstatte strimler af sandpapir dagligt indtil ikke flere æg er lagt. Bemærk, at oviposition kan fortsætte op til en uge.
  2. Delvis tørre sandpapir strimler af forsigtigt duppe dem på et stykke køkkenrulle for 30 s, pas på ikke for at løsne æggene. Derefter wrap strimler i en ark af tør køkkenrulle og læg det i en forseglbar plasticpose (figur 1I).
  3. Kontrollere tilstanden af æg under en dissekere mikroskop (figur 3). Hvis sandpapir strimler er for vådt, æggene kan klækkes før at blive nedsænket i vand (figur 3B), men hvis tørret alt for hårdt, æg kan skjule (figur 3 c).
  4. Æggene kan blive udklækket til enhver tid ud over tre dage efter samling; klækkes alle æg fra hver koloni, indsamlet på tværs af alle dage, i den samme beholder med vand for at sikre, at den næste generation er samplet fra en stor, tilfældig pulje af enkeltpersoner.
  5. Til langtidsopbevaring, holde æggene i en lukket beholder ved en høj (> 80%) luftfugtighed ved ca 20 ° C. Disse betingelser kan æggene uden Wolbachia opbevares i flere måneder mens opretholde høje hatch satser53,54.
  6. Som nogle Wolbachia infektioner i høj grad reducere levedygtigheden af æg med alder49,55, klækkes æggene fra Wolbachia-inficerede linjer senest en uge efter indsamling for at forhindre overdreven dødelighed for de relevante stammer. Blod feed hunnerne igen efter en uge, hvis flere æg er nødvendige.
Dag Trin
0 Luge æg
1 Antal larver i bakker
7 Overføre larver og pupper til kolonien bure
17 Blod feed-kvindelig voksne
21 Begynde at indsamle æg
25 Færdig med at indsamle æg
28 Luge æg

Tabel 1: Oversigt over Ae. aegypti koloni vedligeholdelsesplan på 26 ° C. Timingen af den kvindelige blod-fodring og klækning af æg er fleksible, men lange varigheder i disse faser bør undgås, især for myg inficeret med Wolbachia, for at minimere dødelighed. Efter dette skema minimerer udvalg mod myg, der er hurtig eller langsom til at udvikle eller modnes på alle stadier af livet, forudsat at larver fodres optimalt.

Figure 1
Figur 1: Udstyr, der anvendes til opdræt af Ae. aegypti i laboratoriet. (A) Plastic containere, der anvendes for rugeæg eller opdræt larver med mængder på 500, 750 og 5000 mL (fra venstre til højre). (B) bakker anvendes til opdræt af larver på en kontrolleret tæthed, normalt 500 larver i 4 L vand. (C) 19,7 L og (D) 3 L stolpepallerne for boliger voksne. En massefylde på 25 voksne eller mindre pr. liter bør opretholdes for at give tilstrækkelig plads. (E) 35 mL kop med fugtig vat leveres som en kilde til vand til voksne. (F) 35 mL skål med rørsukkeropløsning leveres gennem en ledning eller dental vægen som en kilde til sukker. (G-H) Kopper fyldt med larve opdræt vand og foret med en oviposition substrat sandpapir eller filtrerpapir (G og H, henholdsvis). (jeg) Zip-lock pose bruges til opbevaring af sandpapir strimler eller filtrerpapir. Sorte pletter på sandpapir er myg æg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Lateral (A) og dorsale (B) udsigt over pupper og voksen Ae. aegypti c demonstrere deres seksuelle dimorphism. Hannerne er placeret til venstre og hunner til højre i hvert panel. Når optimalt fodret, er mandlige og kvindelige pupper kendetegnet ved størrelsen; Hunnen er større end hanner (A) og har en relativt løgformet forkrop i forhold til mænd, som har fladere sider (B). Mandlige voksne kan let skelnes fra hunner på alle opdræt betingelser, primært ved deres plumose antenner og lange blækspruttearme. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Fire dage gamle Ae. aegypti æg under forskellige betingelser. (A) intakt æg på sandpapir strimler vedligeholdes på en høj (> 80%) fugtighed, men uden nogen synlig fugt. Hatch priser bør være over 90% for wild-type Ae. aegypti hvis vedligeholdes korrekt. (B) æg, der klækkes før at blive nedsænket i vand (fremmelig rugeæg) er kendetegnet ved en fritliggende æg cap og synlige larve. Dette indikerer, at sandpapir strip blev holdt for fugtig. (C) æg, der er tørret alt for hårdt kan bryde sammen, og tydeligt kan ses af deres konkav udseende. Hvis sandpapir bliver stiv indikerer dette også, at æggene kan blive for tør. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 4 viser suboptimal ernæring indvirkning på udviklingen af Ae. aegypti larver. Når beholdere leveres med 0,25 mg af mad per larve pr. dag eller mindre, udviklingstiden stigninger for både mænd og kvinder, og er mindre synkron end i containere forsynet med 0,5 mg af mad. Hvis tilstrækkelig mad ikke er fastsat i hele varigheden af larve udvikling, kunne det have en negativ indvirkning på vedligeholdelsesplanen. Langsom-udvikle individer er i fare for at blive valgt mod, blod fodring kan blive forsinket, og der er en højere risiko for voksen dødeligheden før reproduktion opstår.

Figur 5 viser Ae. aegypti voksne opdrættes under en række af ernæring regimer wing længde (et skøn af kropsstørrelse). Wing længder af både hanner og hunner falde betydeligt og bliver mere variabel, når ernæring suboptimal. Ensartet kroppen størrelser er vigtige for eksperimenterende sammenligninger som kropsstørrelse er positivt associeret med frugtbarhed, og store myg forventes at udvise større fitness under feltet betingelser33,34,35 .

Virkningerne af Wolbachia infektioner på de ovennævnte træk er beskrevet i andre undersøgelser, men generelt er der lidt at ingen effekt23,39,49.

Figure 4
Figur 4: Kumulativ andel af Ae.aegypti (A) hunner og hanner (B) udvikle til voksenalderen under forskellige fødevarer regimer på 26 ° C. 100 larver var opdrættet i beholdere i 500 mL vand (en larve tæthed af 0,2 larver pr. mL), forsynet med forskellige niveauer af mad (Se tabel af materialer) for deres udviklingstid og scorede. Kun larver, der overlevede til voksenalderen var inkluderet. Fejllinjer er standardfejl med n = 4 gentagelser pr. behandling. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Wing længde af Ae.aegypti (A) hunner og hanner (B) udvikle sig under forskellige fødevarer regimer på 26 ° C. 100 larver var opdrættet i beholdere i 500 mL vand (en larve tæthed af 0,2 larver per mL) og leveres med forskellige niveauer af mad. En delmængde af voksne blev derefter målt til deres wing længde ved hjælp af tidligere beskrevne metoder56. Fejllinjer er standardafvigelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Efter protokollen præsenteret her for vedligeholdelse af Wolbachia-inficerede Ae. aegypti bør sikre, at sunde myg af en ensartet kvalitet er produceret for eksperimenter og åbne felt udgivelser. I modsætning til andre protokoller, der prioriterer produktion af massive mængder af myg (Se reference57), er metoderne, der fokuseret på at maksimere deres fitness, både inden for generationer ved at gennemføre afslappet opdræt betingelser, og på tværs af generationer ved at minimere indavl, udvælgelse og laboratorium tilpasning. Denne protokol er også designet specielt til Ae. aegypti med Wolbachia infektioner, men bør være egnet til enhver form for Ae. aegypti. Det er imidlertid ikke egnet til opdræt af massive mængder (i størrelsesordenen millioner pr. uge), som kan være nødvendige for sterile eller inkompatibel insekt udgivelser, der kræver høje tal at opnå befolkningens undertrykkelse57,58.

Der er nogle vigtige skridt, der bør følges nøje. Det er vigtigt at fodre larverne optimalt og undgå overbelægning for varigheden af deres udvikling. Dette vil sikre, at myg udvikle synkront og er af en ensartet størrelse. Særlig omsorg bør også tages, når conditioning æg; larverne kan meget nemt klækkes for tidligt eller æg kan udtørre, hvis oviposition substrater er for våd eller tør, henholdsvis. På alle trin i protokollen anbefaler vi giver nok tid til så mange personer i kolonien som muligt at afslutte hver etape. Udvalg mod enkeltpersoner, der er langsom til at udvikle, modne, blod foder, oviposit eller udklækkes vil sandsynligvis føre til tab af genetisk variation.

Vi noterer os nogle yderligere overvejelser for vedligeholdelse af Wolbachia-inficerede myg, der ikke er beskrevet i ovennævnte protokol. Det er muligt for Wolbachia infektioner går tabt fra laboratoriet kolonier, og vi anbefaler derfor, at kolonierne overvåges rutinemæssigt for deres Wolbachia infektion status. Vi bruger kvantitativ polymerase kæde reaktion (qPCR)49,59 til test mindst 30 personer fra hvert Wolbachia-inficeret linje hver generation. Hvis nogen personer test negative for den relevante Wolbachia infektion, kan kolonier renses ved isolering så mange kvinder som muligt fra den berørte koloni og derefter bruge afkom fra smittede mødre kun, for at fundet den næste generation. Årsag til tab af nogle Wolbachia stammer fra laboratoriet kolonier er stort set ukendt, men kan forklares ved manglende temperaturstyring, da høje temperaturer kan forårsage tab af Wolbachia infektioner47, 60.

Kolonier og eksperimenter kan også blive forurenet med enkeltpersoner fra forskellige linjer hvis pleje ikke er taget når opdræt. Kontaminering kan medføre fra skødesløse Pipettering af larver, blande partier af æg, fejlmærkning bure eller forkert kønsbestemmelse pupper i krydser. Særlig pleje bør derfor tages, når du håndterer kolonier med forskellige Wolbachia infektion. Grundigt rene enhver oviposition kopper, opdræt bakker og bure før genbruge dem, rense ud pipetter før håndtering hver ny bakke af larver og rense trådnet hver gang når der overføres larver og pupper til andre containere. Desuden inspicere fingre for æg når håndtering sandpapir strimler og bruge frisk papirhåndklæder, når tørring hver strip, sikre, at voksne er den korrekte sex før slippe dem i bur, og behandle enhver undslupne hurtigt. At tage disse forholdsregler bør undgå de fleste forurening, men kolonier bør stadig rutinemæssigt overvåges ved hjælp af diagnostiske assays59.

Kvindelige Ae. aegypti kræver en blodmel for at lægge æg, og laboratorier rundt om i verden give dem i en række forskellige måder, fra membran fodring systemer57, behersket dyr61 og i mindre grad, kunstig blod62 . Men myg med eksperimentelle Wolbachia infektioner ofte klarer sig dårligt på ikke-menneskelige blod, og kan udstille nedsat frugtbarhed og hatch priser og ufuldstændige transmission af Wolbachia til deres afkom63, 64 , 65. opretholde modtageligheden af hunner til menneskelige lugte er også vigtig for myg at blive frigivet i feltet, og fodre dem gennem membraner eller andre dyr kan kompromittere denne evne37. Vi derfor vælge for at bruge underarmen af menneskers frivillige til denne koloni vedligeholdelsesprotokol, selvom andre metoder er nødvendige under nogle omstændigheder. Blod skal leveres via andre midler, når du arbejder direkte med arboviruses, og bør udvises forsigtighed ved kolonier stammer fra feltet populationer med høj viral belastninger som transovarial transmission af arboviruses kan forekomme66. Menneskers frivillige bør heller ikke blod foder, hvis de har for nylig besøgt arboviral endemiske lande, da der kan være en risiko for overførsel.

Vores vedligeholdelse protokol har til formål at minimere laboratorium tilpasning og selektiv pres, men der er plads til forbedring. Han et al. 42 giver yderligere henstillinger for vedligeholdelse myg egnethed til friland udgivelser, herunder brugen af mere mangfoldigt og naturlige larve kost, reduktion af tæthed af voksne i bure og et komplekst miljø. Disse betragtninger kan forbedre Ae. aegypti egnethed til et højere niveau, men i øjeblikket er der ingen tegn på fitness ændringer som følge af laboratoriet tilpasning under vedligeholdelse protokollen beskrevet her [Ross et al. upubliceret]. Nogle yderligere foranstaltninger må ikke være muligt for laboratorier med begrænset plads og ressourcer, men er alligevel værd at undersøge. Opretholde store befolkning størrelser, undgå store selektiv pres gennem opdræt protokoller og gennemføre bør periodiske outcrossing til feltet myg hjælpe i at sikre høj egnethed af Ae. aegypti til friland udgivelser. De principper, der er involveret i metoden kan anvendes til opdræt andre sygdom vektor arter for frigivelse til at manipulere eller undertrykke naturlige populationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi anerkender Heng Lin Yeap, Chris Paton, Petrina Johnson og Clare Doig for deres bidrag til udviklingen af vores koloni vedligeholdelse metoder og tre anonym korrekturlæsere for deres forslag, som bidrog til at forbedre håndskriftet. Vores forskning er understøttet af et program grant og fellowship til AAH fra National Health og Medical Research Council og en oversættelse tilskud fra the Wellcome Trust. PAR er en modtager af en australske regering forskning uddannelse Program Scholarship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wild type Aedes aegypti Collected from field locations in Queensland, Australia, see Yeap and others39 for details
w Mel-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to Walker and others23 for information on the strain
w AlbB-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to Xi and others21 for information on the strain
w MelPop-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to McMeniman and others22 for information on the strain
Instant dried yeast Lowan Stimulates egg hatching. Found in general grocery stores. Other brands may be used
5 L plastic tub Quadrant Q110950 Used for hatching and rearing larvae. Other products may be used
Fish Food (Tetramin Tropical Tablets) Tetra 16152 Provided to larvae as a source of food. Web address: https://www.amazon.com/Tetra-16152-TetraMin-Tropical-10-93-Ounce/dp/B00025Z6SE
Plastic containers Used for rearing larvae. Any plastic container above 500 mL should be suitable
Glass pipette Used for transferring larvae and pupae between containers. Web address: https://www.aliexpress.com/item/10Pcs-Durable-Long-Glass-Experiment-Medical-Pipette-Dropper-Transfer-Pipette-Lab-Supplies-With-Red-Rubber-Cap/32704471109.html?spm=2114.40010308.4.2.py4Kez
Clicker counter RS Pro 710-5212 Used to assist in the counting of larvae, pupae and eggs. Web address: http://au.rs-online.com/web/p/products/7105212/?grossPrice=Y
Rearing trays Gratnells Used for rearing larvae. Web address: http://www.gratnells.com
Nylon mesh Used to transfer larvae and pupae to containers of fresh water. Other brands may be used. Web address: https://www.spotlightstores.com/fabrics-yarn/specialty-apparel-fabrics/nettings-tulles/nylon-netting/p/BP80046941001-white
Cages BugDorm DP1000 Houses adult mosquitoes. Alternative products may be used. Web address: http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html
35 mL plastic cup Huhtamaki AA272225 Used to provide water or sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used
35 mL plastic cup lid Huhtamaki GB030005 Used to provide sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used
Cotton wool Cutisoft 71841-13 Moist cotton wool is provided as a source of water to adults. Other brands may be used
White Sugar Provided as a source of sugar to adult mosquitoes. Found in general grocery stores
Rope M Recht Accessories C323C/W Used to provide sucrose solution to adults. Other brands may be used. Web address: https://mrecht.com.au/haberdashery/braids-cords-and-tapes/cords/plaited-cord/cotton/
Plastic cup (large) Used as an oviposition container. Any plastic cup that holds 100 mL of water should be suitable
Sandpaper Norton Master Painters CE015962 Provided as an oviposition substrate. Alternative products may be used, but we use this brand because it is relatively odorless. Lighter colors are used for contrast with eggs. Web address: https://www.bolt.com.au/115mm-36m-master-painters-bulk-roll-p80-medium-p-9396.html
Filter paper Whatman 1001-150 Used as an alternative oviposition substrate. Other brands may be used
Latex gloves SemperGuard Z560979 Prevents mosquito bites on hands when blood feeding. Other brands may be used. Web address: http://www.sempermed.com/en/products/detail/semperguardR_latex_puderfrei_innercoated/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mayer, S. V., Tesh, R. B., Vasilakis, N. The emergence of arthropod-borne viral diseases: A global prospective on dengue, chikungunya and zika fevers. Acta Trop. 166, 155-163 (2017).
  2. Campbell, L. P., et al. Climate change influences on global distributions of dengue and chikungunya virus vectors. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 370 (1665), (2015).
  3. Kraemer, M. U., et al. The global distribution of the arbovirus vectors Aedes aegypti and Ae. albopictus. eLife. 4, (2015).
  4. Carvalho, B. M., Rangel, E. F., Vale, M. M. Evaluation of the impacts of climate change on disease vectors through ecological niche modelling. Bull Entomol Res. , 1-12 (2016).
  5. Scott, T. W., et al. Longitudinal studies of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in Thailand and Puerto Rico: population dynamics. J Med Ent. 37 (1), 77-88 (2000).
  6. Cheong, W. Preferred Aedes aegypti larval habitats in urban areas. Bull World Health Organ. 36 (4), 586-589 (1967).
  7. Barker-Hudson, P., Jones, R., Kay, B. H. Categorization of domestic breeding habitats of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in Northern Queensland, Australia. J Med Ent. 25 (3), 178-182 (1988).
  8. Watson, T. M., Marshall, K., Kay, B. H. Colonization and laboratory biology of Aedes notoscriptus from Brisbane, Australia. J Am Mosq Control Assoc. 16 (2), 138-142 (2000).
  9. Williges, E., et al. Laboratory colonization of Aedes japonicus japonicus. J Am Mosq Control Assoc. 24 (4), 591-593 (2008).
  10. Munstermann, L. E. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors. , Springer. 13-20 (1997).
  11. McDonald, P., Hausermann, W., Lorimer, N. Sterility introduced by release of genetically altered males to a domestic population of Aedes aegypti at the Kenya coast. Am J Trop Med Hyg. 26 (3), 553-561 (1977).
  12. Rai, K., Grover, K., Suguna, S. Genetic manipulation of Aedes aegypti: incorporation and maintenance of a genetic marker and a chromosomal translocation in natural populations. Bull World Health Organ. 48 (1), 49-56 (1973).
  13. Harris, A. F., et al. Field performance of engineered male mosquitoes. Nature Biotechnol. 29 (11), 1034-1037 (2011).
  14. Hoffmann, A. A., et al. Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission. Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).
  15. O'Connor, L., et al. Open release of male mosquitoes infected with a Wolbachia biopesticide: field performance and infection containment. PLoS Negl Trop Dis. 6 (11), e1797 (2012).
  16. Morlan, H. B. Field tests with sexually sterile males for control of Aedes aegypti. Mosquito news. 22 (3), 295-300 (1962).
  17. Grover, K. K., et al. Field experiments on the competitiveness of males carrying genetic control systems for Aedes aegypti. Entomol Exp Appl. 20 (1), 8-18 (1976).
  18. Seawright, J., Kaiser, P., Dame, D. Mating competitiveness of chemosterilized hybrid males of Aedes aegypti (L.) in field tests. Mosq News. 37 (4), 615-619 (1977).
  19. Zhang, D., Lees, R. S., Xi, Z., Gilles, J. R., Bourtzis, K. Combining the sterile insect technique with Wolbachia-based approaches: II- a safer approach to Aedes albopictus population suppression programmes, designed to minimize the consequences of inadvertent female release. PloS One. 10 (8), e0135194 (2015).
  20. McGraw, E. A., O'Neill, S. L. Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem. Nature Rev Microbiol. 11 (3), 181-193 (2013).
  21. Xi, Z., Khoo, C. C., Dobson, S. L. Wolbachia establishment and invasion in an Aedes aegypti laboratory population. Science. 310 (5746), 326-328 (2005).
  22. McMeniman, C. J., et al. Stable introduction of a life-shortening Wolbachia infection into the mosquito Aedes aegypti. Science. 323 (5910), 141-144 (2009).
  23. Walker, T., et al. The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations. Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).
  24. Joubert, D. A., et al. Establishment of a Wolbachia superinfection in Aedes aegypti mosquitoes as a ppotential approach for future resistance management. PLoS Pathog. 12 (2), e1005434 (2016).
  25. Ferguson, N. M., et al. Modeling the impact on virus transmission of Wolbachia-mediated blocking of dengue virus infection of Aedes aegypti. Sci Transl Med. 7 (279), 279ra237 (2015).
  26. Aliota, M. T., Peinado, S. A., Velez, I. D., Osorio, J. E. The wMel strain of Wolbachia Reduces Transmission of Zika virus by Aedes aegypti. Sci Rep. 6, 28792 (2016).
  27. van den Hurk, A. F., et al. Impact of Wolbachia on infection with chikungunya and yellow fever viruses in the mosquito vector Aedes aegypti. PLoS Negl Trop Dis. 6 (11), e1892 (2012).
  28. Moreira, L. A., et al. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium. Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).
  29. Mains, J. W., Brelsfoard, C. L., Rose, R. I., Dobson, S. L. Female Adult Aedes albopictus Suppression by Wolbachia-Infected Male Mosquitoes. Sci Rep. 6, 33846 (2016).
  30. Nguyen, T. H., et al. Field evaluation of the establishment potential of wmelpop Wolbachia in Australia and Vietnam for dengue control. Parasit Vectors. 8, 563 (2015).
  31. Garcia Gde, A., Dos Santos, L. M., Villela, D. A., Maciel-de-Freitas, R. Using Wolbachia releases to estimate Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) population size and survival. PloS One. 11 (8), e0160196 (2016).
  32. Hoffmann, A. A., Ross, P. A., Rašić, G. Wolbachia strains for disease control: ecological and evolutionary considerations. Evol Appl. 8 (8), 751-768 (2015).
  33. Briegel, H. Metabolic relationship between female body size, reserves, and fecundity of Aedes aegypti. J Insect Physiol. 36 (3), 165-172 (1990).
  34. Ponlawat, A., Harrington, L. C. Factors associated with male mating success of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti. Am J Trop Med Hyg. 80 (3), 395-400 (2009).
  35. Segoli, M., Hoffmann, A. A., Lloyd, J., Omodei, G. J., Ritchie, S. A. The effect of virus-blocking Wolbachia on male competitiveness of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti. PLoS Negl Trop Dis. 8 (12), e3294 (2014).
  36. Imam, H., Zarnigar,, Sofi, G., Seikh, A. The basic rules and methods of mosquito rearing (Aedes aegypti). Trop Parasitol. 4 (1), 53-55 (2014).
  37. Spitzen, J., Takken, W. Malaria mosquito rearing-maintaining quality and quantity of laboratory-reared insects. Proc Neth Entomol Soc Meet. 16, 95-100 (2005).
  38. Lorenz, L., Beaty, B. J., Aitken, T. H. G., Wallis, G. P., Tabachnick, W. J. The effect of colonization upon Aedes aegypti susceptibility to oral infection with Yellow Fever virus. Am J Trop Med Hyg. 33 (4), 690-694 (1984).
  39. Yeap, H. L., et al. Dynamics of the "popcorn" Wolbachia infection in outbred Aedes aegypti informs prospects for mosquito vector control. Genetics. 187 (2), 583-595 (2011).
  40. Turley, A. P., Moreira, L. A., O'Neill, S. L., McGraw, E. A. Wolbachia infection reduces blood-feeding success in the dengue fever mosquito, Aedes aegypti. PLoS Negl Trop Dis. 3 (9), e516 (2009).
  41. Yeap, H. L., Endersby, N. M., Johnson, P. H., Ritchie, S. A., Hoffmann, A. A. Body size and wing shape measurements as quality indicators of Aedes aegypti mosquitoes destined for field release. Am J Trop Med Hyg. 89 (1), 78-92 (2013).
  42. Leftwich, P. T., Bolton, M., Chapman, T. Evolutionary biology and genetic techniques for insect control. Evol Appl. 9 (16), 212-230 (2016).
  43. Calkins, C., Parker, A. Sterile Insect Technique. , Springer. 269-296 (2005).
  44. Tun-Lin, W., Burkot, T., Kay, B. Effects of temperature and larval diet on development rates and survival of the dengue vector Aedes aegypti in north Queensland, Australia. Med Vet Entomol. 14 (1), 31-37 (2000).
  45. Richardson, K., Hoffmann, A. A., Johnson, P., Ritchie, S., Kearney, M. R. Thermal sensitivity of Aedes aegypti from Australia: empirical data and prediction of effects on distribution. J Med Ent. 48 (4), 914-923 (2011).
  46. Richardson, K. M., Hoffmann, A. A., Johnson, P., Ritchie, S. R., Kearney, M. R. A replicated comparison of breeding-container suitability for the dengue vector Aedes aegypti in tropical and temperate Australia. Austral Ecol. 38 (2), 219-229 (2013).
  47. Ross, P. A., et al. Wolbachia infections in Aedes aegypti differ markedly in their response to cyclical heat stress. PLoS Pathog. 13 (1), e1006006 (2017).
  48. Gjullin, C., Hegarty, C., Bollen, W. The necessity of a low oxygen concentration for the hatching of Aedes mosquito eggs. J Cell Physiol. 17 (2), 193-202 (1941).
  49. Axford, J. K., Ross, P. A., Yeap, H. L., Callahan, A. G., Hoffmann, A. A. Fitness of wAlbB Wolbachia infection in Aedes aegypti: parameter estimates in an outcrossed background and potential for population invasion. Am J Trop Med Hyg. 94 (3), 507-516 (2016).
  50. Degner, E. C., Harrington, L. C. Polyandry depends on postmating time interval in the dengue vector Aedes aegypti. Am J Trop Med Hyg. 94 (4), 780-785 (2016).
  51. Bentley, M. D., Day, J. F. Chemical ecology and behavioral aspects of mosquito oviposition. Ann Rev Entomol. 34 (1), 401-421 (1989).
  52. Wong, J., Stoddard, S. T., Astete, H., Morrison, A. C., Scott, T. W. Oviposition site selection by the dengue vector Aedes aegypti and its implications for dengue control. PLoS Negl Trop Dis. 5 (4), e1015 (2011).
  53. Meola, R. The influence of temperature and humidity on embryonic longevity in Aedes aegypti. Ann Entomol Soc Am. 57 (4), 468-472 (1964).
  54. Faull, K. J., Williams, C. R. Intraspecific variation in desiccation survival time of Aedes aegypti (L.) mosquito eggs of Australian origin. J Vector Ecol. 40 (2), 292-300 (2015).
  55. McMeniman, C. J., O'Neill, S. L. A virulent Wolbachia infection decreases the viability of the dengue vector Aedes aegypti during periods of embryonic quiescence. PLoS Negl Trop Dis. 4 (7), e748 (2010).
  56. Ross, P. A., Endersby, N. M., Hoffmann, A. A. Costs of three Wolbachia infections on the survival of Aedes aegypti larvae under starvation conditions. PLoS Negl Trop Dis. 10 (1), e0004320 (2016).
  57. Carvalho, D. O., et al. Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil. J Vis Exp. (83), e3579 (2014).
  58. Benedict, M. The first releases of transgenic mosquitoes: an argument for the sterile insect technique. Trends Parasitol. 19 (8), 349-355 (2003).
  59. Lee, S. F., White, V. L., Weeks, A. R., Hoffmann, A. A., Endersby, N. M. High-throughput PCR assays to monitor Wolbachia infection in the dengue mosquito (Aedes aegypti) and Drosophila simulans. Appl Environ Microbiol. 78 (13), 4740-4743 (2012).
  60. Corbin, C., Heyworth, E. R., Ferrari, J., Hurst, G. D. Heritable symbionts in a world of varying temperature. Heredity. 118 (1), 10-20 (2017).
  61. Day, J. F., Edman, J. D. Mosquito engorgement on normally defensive hosts depends on host activity patterns. J Med Ent. 21 (6), 732-740 (1984).
  62. Gonzales, K. K., Hansen, I. A. Artificial diets for mosquitoes. Int J Environ Res Public Health. 13 (12), (2016).
  63. McMeniman, C. J., Hughes, G. L., O'Neill, S. L. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti disrupts mosquito egg development to a greater extent when mosquitoes feed on nonhuman versus human blood. J Med Ent. 48 (1), 76-84 (2011).
  64. Caragata, E. P., Rances, E., O'Neill, S. L., McGraw, E. A. Competition for amino acids between Wolbachia and the mosquito host, Aedes aegypti. Microb Ecol. 67 (1), 205-218 (2014).
  65. Suh, E., Fu, Y., Mercer, D. R., Dobson, S. L. Interaction of Wolbachia and bloodmeal type in artificially infected Aedes albopictus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. , (2016).
  66. Thangamani, S., Huang, J., Hart, C. E., Guzman, H., Tesh, R. B. Vertical transmission of Zika virus in Aedes aegypti mosquitoes. Am J Trop Med Hyg. 95 (5), 1169-1173 (2016).

Tags

Grundlæggende protokol sag 126 insekt opdræt myg Aedes aegypti denguefeber Zika Wolbachia fitness blod fodring
Opretholdelse af <em>Aedes aegypti</em> myg inficeret med <em>Wolbachia</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ross, P. A., Axford, J. K.,… More

Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia. J. Vis. Exp. (126), e56124, doi:10.3791/56124 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter